CZ20004159A3

CZ20004159A3 - Combination suitable for use when treating tumor dependent on gastrin and use thereof

Info

Publication number: CZ20004159A3
Application number: CZ20004159A
Authority: CZ
Inventors: Philip C. Gevas; Stephan Grimes; Stephen L. Karr; Susan A. Watson; Dov Michaeli
Original assignee: Aphton Corporation
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2001-07-11

Abstract

Kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu, která obsahuje i) imunogen zaměřený proti růstu tohoto nádoru a ii)jedno nebo více chemotherapeutických činidel pro jeho léčbu. Použití této kombinace pro výrobu přípravku pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu.A combination suitable for use in the treatment of a tumor dependent tumor gastrin, which comprises i) an anti-growth immunogen and (ii) one or more chemotherapeutic agents agents for its treatment. Use of this combination for production for use in the treatment of a gastrin-dependent tumor.

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká kombinace vhodné pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu a jejího použití pro výrobu farmaceutického přípravku. Při léčení pomocí kombinace podle vynálezu dochází k neutraliozaci peptidových hormonů stimu1jících růst v kombinaci s chemotherapií.The invention relates to a combination suitable for use in the treatment of a gastrin-dependent tumor and its use for the manufacture of a pharmaceutical composition. Treatment with the combination of the invention results in the neutralization of growth stimulating peptide hormones in combination with chemotherapy.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Gastrin je peptidový hormon, který se vyskytuje ve dvou zralých formách, jako tetratriacontagastrin (G34) a heptadekagastrin (G17), a je syntetizován a secernován specializovanými buňkami, které se vyskytují v antru žaludku. V buňkách produkujících gastrin jsou tyto gastrinové hormony postratslačně zpracovávány ze společné prekursorové molekuly označované jako preprogastrin, která obsahuje signální peptid. Signální peptid pre je odstraněn v endoplasmatickém retikulu buněk, což vede ke vzniku progastrinového peptidu, který je buňkami dále zpracováván za vzniku zralých gastrinů G34 a G17 před tím, než je secernován do krevního řečiště (Dickinson, 1991) (úplné Odkazy jsou uvedeny v části Odkazy před patentovými nároky) . Obě zralé formy G34 a G17 jsou amidované na svých karboxy-koncích (-NH2) . U člověka byly zjištěny mnohé formy G17, které vznikají v důsledku různého zpracování prekursorové molekuly, a každá z nich má různé biologické aktivity (Dickinson, 1995, a Ciccotosto et al.,Gastrin is a peptide hormone that occurs in two mature forms, tetratriacontagastrin (G34) and heptadekagastrin (G17), and is synthesized and secreted by specialized cells that occur in the anterior stomach. In gastrin-producing cells, these gastrin hormones are post-compressed from a common precursor molecule termed preprogastrin, which contains a signal peptide. The pre signaling peptide is removed in the endoplasmic reticulum of the cells, resulting in the progastrin peptide, which is further processed by the cells to produce mature G34 and G17 gastrins before it is secreted into the bloodstream (Dickinson, 1991). References before claims). Both mature forms of G34 and G17 are amidated at their carboxy termini (-NH 2). Many forms of G17 have been identified in humans due to different processing of a precursor molecule, each having different biological activities (Dickinson, 1995, and Ciccotosto et al.,

1995). Při post-translačním zpracování gastrinu je to zralá karbóxy-terminálně amidovaná forma, která se váže na specifický buněčný receptor, takzvaný CCK-B/gastrinový receptor, prostřednictvím karboxy-konce peptidu (Kopin et al.,1995). In post-translational processing of gastrin, it is a mature carboxy-terminally amidated form that binds to a specific cell receptor, the so-called CCK-B / gastrin receptor, via the carboxy-terminus of the peptide (Kopin et al.,

1992) .1992).

• · • ·• · • ·

Gastrinové hormony jsou secernovány do cirkulující krve a váží se na specifické buňky v žaludku, konkrétně na enterochromafinním buňkám podobné buňky (ECL) a na parietální buňky, které nepřímo nebo přímo ovlivňují produkci žaludeční kyseliny. Historicky byly oba gastrinové hormony asociovány se stimulací sekrece kyseliny v žaludku (Edkins, J.S., 1905). V posledních letech byly nahromaděny důkazy, že gastrin působí také jako trofický faktor v gastrointestinálním traktu (Johnson, L., 1997) a že podporuje růst nádorů gastrointestinálního traktu (Watson et al., 1989, Dickinson, C.J., 1995), stejně jako nádorů mino gastrointestinální trakt, včetně malobuněčného karcinomu plic (Rehfeld et al., 1989).Gastrin hormones are secreted into the circulating blood and bind to specific cells in the stomach, namely enterochromaffin-like cells (ECL) and parietal cells that indirectly or directly affect gastric acid production. Historically, both gastrin hormones have been associated with stimulation of acid secretion in the stomach (Edkins, J.S., 1905). In recent years, evidence has been accumulated that gastrin also acts as a trophic factor in the gastrointestinal tract (Johnson, L., 1997) and that it supports the growth of gastrointestinal tract tumors (Watson et al., 1989, Dickinson, CJ, 1995) as well as tumors. other than the gastrointestinal tract, including small cell lung cancer (Rehfeld et al., 1989).

Několik typů nádorů, včetně kolorektálního adenokarcinomu a adenokarcinomů žaludku, pankreasu a hepatocelulárního karcinomu, obsahuje CCK-B/gastrinové receptory na svých plasmatických membránách a nádorové buňky reagují na gastrin významnou proliferaci (Rehfeld, J.F., 1972, Upp et al., 1989 a Watson et al., 1993). Zvýšené plasmatické koncentrace celkového gastrinu se vyskytují u pacientů s kolorektálním karcinomem, a vysoká množství hormonálního prekursoru progastrinu byla detekována v mnoha kolorektálních karcinomech pomocí antiséra proti gastrinu (Ciccotosto et al., 1995). Nověji bylo zjištěno, že mnoho z těchto nádorových buněk také secernuje gastrin a tak způsobuje autonomní proliferační stimulaci (Van-Solinge et al., 1993, Nemeth et al., 1993, a Seva et al., 1994).Several types of tumors, including colorectal adenocarcinoma and adenocarcinomas of the stomach, pancreas and hepatocellular carcinoma, contain CCK-B / gastrin receptors on their plasma membranes and tumor cells respond to gastrin significant proliferation (Rehfeld, JF, 1972, Upp et al., 1989 and Watson). et al., 1993). Elevated plasma concentrations of total gastrin occur in colorectal cancer patients, and high levels of the hormone progastrin precursor have been detected in many colorectal cancers using gastrin antisera (Ciccotosto et al., 1995). More recently, it has been found that many of these tumor cells also secrete gastrin and thus cause autonomous proliferative stimulation (Van-Solinge et al., 1993, Nemeth et al., 1993, and Seva et al., 1994).

Peptidové hormony G17 a G34 se váží na CCK-B/gastrinové receptory na buněčných membránách normálních buněk. Nicméně, bylo zjištěno, že G17, ale ne G34, stimuluje gastrindependentní nádorové buňky. Zejména sérový G17 má potenciál endokrinně stimulovat růst kolorektálních nádorů prostřednictvím CCK-B/gastrinových receptorů na nádorových • ·· · · ···· • · · ·· · · ···· ···· · · · · · · • · · · · ······ • · · · · ···· • ·· ·· ··· · ·· · · ·· buňkách (Watson et al., 1993). Zejména se předpokládá účast G17 ve stimulaci růstu kolorektálních adenokarcinomů z důvodu zvýšené afinity CCK-B/gastrinových receptorů na nádorových buňkách, ve srovnání s jinými typy gastrinu (Rehfeld, 1972, a 1993). Bylo zjištěno, že CCK-B/gastrinové receptory jsou exprimovány ve vysoce afinitní formě na 56,7% lidských primárních kolorektálních nádorů (Upp et al., 1989).Peptide hormones G17 and G34 bind to CCK-B / gastrin receptors on the cell membranes of normal cells. However, G17, but not G34, was found to stimulate gastrindependent tumor cells. In particular, serum G17 has the potential to endocrine stimulate the growth of colorectal tumors through CCK-B / gastrin receptors at tumor tumors. · · ···· · ··········· The cells (Watson et al., 1993). In particular, G17 is implicated in stimulating the growth of colorectal adenocarcinomas due to the increased affinity of CCK-B / gastrin receptors on tumor cells compared to other types of gastrin (Rehfeld, 1972, and 1993). CCK-B / gastrin receptors have been found to be expressed in high affinity form to 56.7% of human primary colorectal tumors (Upp et al., 1989).

Mnoho studií ukázalo, že kromě toho, že jsou schopné reagovat na exogenní gastrin, jsou buňky lidských kolorektálních a žaludečních nádorů schopné produkovat gastrin a jeho prekursory (Ciccotosto et al., 1995; Finley et al., 1993; Kochman et al., 1992; Nemeth et al., 1993; Van Solinge et al., 1993), a tak autokrinně stimulovat růst. Produkce gastrinu v nádorových buňkách se liší od produkce v endokrinních G buňkách. Přesněji, tyto nádorové buňky obsahují vyšší poměr prekursorového progastrinu spolu s nižšími koncentracemi zralého peptidu. Předpokládá se, že tento abnormální poměr je způsoben trvalým neregulovaným uvolňováním gastrinu spolu s omezenou aktivitou peptidoglycin-ci-amidující monoxygenasy (Ciccotosto et al., 1995; Kelly, 1985). Tak vede neregulované uvolňování gastrinu k abnormální produkci a sekreci různých molekulových forem hormonu. Konkrétně, buňky nádoru tlustého střeva nezpracovávají gastrin účinně, což vede k menší konversi gastrinu na zralé peptidy a tak k produkci většinou nekompletního nebo aberantního gastrinu (Dickinson, 1993, a Rehfeld et al., 1993). Kromě toho, zvýšené koncentrace gastrinu v kolorektálních nádorech jsou částečně způsobeny aberantní expresí genu pro gastrin v buňkách kolorektálních nádorů (Hoosein et al., 1990, Baldwin et al., 1992 a Finley et al., 1993). V těchto buňkách byly identifikovány peptidy podobné gastrinu (Hoosein et al., 1988, Watson et al., 1991) a bylo potvrzeno, že se jedná o prekursory gastrinu (Van Solinge et al., 1993, a Nemeth et al., 1993).Many studies have shown that, in addition to being able to respond to exogenous gastrin, human colorectal and gastric tumor cells are capable of producing gastrin and its precursors (Ciccotosto et al., 1995; Finley et al., 1993; Kochman et al., 1992 Nemeth et al., 1993; Van Solinge et al., 1993) and thus autocrine stimulate growth. Gastrin production in tumor cells differs from that in endocrine G cells. More specifically, these tumor cells contain a higher ratio of precursor progastrin together with lower concentrations of the mature peptide. This abnormal ratio is believed to be due to sustained unregulated gastrin release along with limited peptidoglycine-amidating monoxygenase activity (Ciccotosto et al., 1995; Kelly, 1985). Thus, unregulated gastrin release results in abnormal production and secretion of various molecular forms of the hormone. Specifically, colon tumor cells do not process gastrin efficiently, resulting in less conversion of gastrin to mature peptides and thus produce mostly incomplete or aberrant gastrin (Dickinson, 1993, and Rehfeld et al., 1993). In addition, increased gastrin concentrations in colorectal tumors are partly due to aberrant expression of the gastrin gene in colorectal tumor cells (Hoosein et al., 1990, Baldwin et al., 1992 and Finley et al., 1993). Gastrin-like peptides have been identified in these cells (Hoosein et al., 1988, Watson et al., 1991) and confirmed to be gastrin precursors (Van Solinge et al., 1993, and Nemeth et al., 1993) .

··· ·· «· ···« • · · · · · 9 · 9 ···· ·· «· ···« • · · · · · · · · ·

Přítomnost amidovaného G17 (G17-NH2) v některých kolorektálních nádorech (Ciccotosto et al., 1995; Van Solinge et al., 1993) dokazuje, že některé nádory si zachovávají intaktní dráhu zpracování, protože amidace gastrinu probíhá pouze v sekrečních granulích (Varro et al., 1994). Endogenně produkovaný gastrin působí také jako autokrinní růstový faktor, protože byla pozorována inhibice bazálního růstu kolorektální buněčné linie pomocí anti-gastrinové protilátky (Hoosein et al., 1988). Toto bylo potvrzeno ve druhé studii, ve které byla pomocí northernova přenosu zjištěna přítomnost gastrinové mRNA v některých buněčných liniích a radioimunotest ukázal gastrinu-podobnou imunoreaktivitu v supernatantu buněčných kultur (Hoosein et al., 1990). Gastrinové peptidy mají také parakrinní úlohu (Watson et al., 1991b), která byla potvrzena v pokusech (Finley et al., 1993) ukazujících gastrinovou imunoreaktivitu především v subpopulacích maligních kolorektálních slizničních buněk.The presence of amidated G17 (G17-NH2) in some colorectal tumors (Ciccotosto et al., 1995; Van Solinge et al., 1993) demonstrates that some tumors retain an intact processing pathway because gastrin amidation occurs only in secretory granules (Varro et al. al., 1994). Endogenously produced gastrin also acts as an autocrine growth factor because inhibition of the basal growth of the colorectal cell line by an anti-gastrin antibody has been observed (Hoosein et al., 1988). This was confirmed in a second study in which the presence of gastrin mRNA in some cell lines was detected by northern blotting and the radioimmunoassay showed gastrin-like immunoreactivity in cell culture supernatant (Hoosein et al., 1990). Gastrin peptides also have a paracrine role (Watson et al., 1991b), which has been confirmed in experiments (Finley et al., 1993) showing gastrin immunoreactivity, particularly in subpopulations of malignant colorectal mucosal cells.

Po vazbě G17 na jeho receptor vznikne komplex G17/receptor, který stimuluje růst buněk prostřednictvím druhých poslů regulujících funkce buněk (Ullrich et al., 1990). vazba G17 na CCK-B/gastrinové receptory vede k aktivaci fosfatidylinositolové dráhy, k aktivaci proteinkinasy C s následným zvýšením nitrobuněčné koncentrace vápníkových iontů a k indukcí c-fos a c-jun protoonkogenů prostřednictvím mitogenem-aktivované proteinkinasy, o které se předpokládá, že se účastní regulace buněčné proliferace (Tadisco et al.,Upon binding of G17 to its receptor, a G17 / receptor complex is formed which stimulates cell growth through second messengers regulating cell functions (Ullrich et al., 1990). G17 binding to CCK-B / gastrin receptors leads to activation of the phosphatidylinositol pathway, activation of protein kinase C with subsequent increase in intracellular calcium ion concentration and induction of c-fos and c-jun proto-oncogenes via mitogen-activated protein kinase, which is believed to be involved regulation of cell proliferation (Tadisco et al.,

1995). Kromě toho, vazba gastrinu na CCK-B/gastrinové receptory je spojena s následným zvýšením fosforylace tyrosinkinasou, ppl25FADK (fokální adhesní kinasa), která může mít také úlohu v přenosu mitogenních signálů (Tanaguchi et al., 1994) .1995). In addition, binding of gastrin to CCK-B / gastrin receptors is associated with a subsequent increase in tyrosine kinase phosphorylation, ppl25FADK (focal adhesion kinase), which may also play a role in mitogenic signal transduction (Tanaguchi et al., 1994).

• · • · ·• · · · ·

Kolorektální nádory zůstávají špatným onemocněním pro léčbu, protože za poslední roky bylo dosaženo pouze malých zlepšení přežití. Chirurgie je účinnou léčbou pro primární onemocnění, ale je neúčinná pro léčbu zbytkového onemocnění, které je často přítomné. Radioterapie po chirurgické výkonu je obvykle doporučována pro pacienty s nádory konečníku pro snížení rizika recidivy onemocnění. Chemoterapie 5fluorouracilem (5-FU) je nejčastější účinnou terapií po chirurgickém zákroku u pacientů s pokročilejšími kolorektálními karcinomy. Nicméně, bylo prokázáno, že terapie 5-FU má pouze malý přínos pro pacienty, protože 5-FU je vysoce toxický a terapie je nákladná a nezdá se, že by - samostatně nebo v kombinaci s jinými cytotoxickými léky - významně prodlužovala přežití. Ve většině případů neodpovídají okultní nebo inoperabilní kolorektální nádory dobře na chemoterapii a ozáření a jsou potřeba nové způsoby léčby, které doplní dosavadní postupy.Colorectal tumors remain a poor disease for treatment because little improvement in survival has been achieved in recent years. Surgery is an effective treatment for a primary disease but is ineffective for treating a residual disease that is often present. Radiotherapy after surgery is usually recommended for patients with rectal cancer to reduce the risk of recurrence. Chemotherapy with 5fluorouracil (5-FU) is the most common effective therapy after surgery in patients with more advanced colorectal cancers. However, 5-FU therapy has been shown to have little benefit to patients because 5-FU is highly toxic and costly and does not appear to significantly prolong survival alone or in combination with other cytotoxic drugs. In most cases, occult or inoperable colorectal tumors do not respond well to chemotherapy and radiation, and new therapies are needed to complement existing procedures.

Nedávno několik studií ukázalo, že adjuvantní kombinovaná chemoterapie 5-FU a leukovorinem zvyšuje účinnost 5-FU u pacientů s pokročilými kolorektálními karcinomy. Leukovorin je derivát kyseliny listové, také známý jako kyselina folinová, citrovorum faktor nebo kyselina 5-formyl-5,6,7,8tetrahydrolistová. Studie ukázaly, že u pacientů se stadiem Dukes C může kombinovaná terapie 5-FU/leukovorin snížit mortalitu o 10-15% (Moertel, 1994). Ve stejné skupině pacientů vedla kombinovaná intravenosní a intraperitoneální terapie 5-FU/leukovorinem k nesignifikantnímu trendu ke zlepšení přežívání bez známek onemocnění a celkového přežívání (Scheithauer et al., 1995). U pokročilého onemocnění může stejná kombinace léků zlepšit přežívání (Taylor, 1993), které bylo 13,5 měsíců (medián) ve skupině léčené kombinací ve srovnání s 7,5 měsíci ve skupině léčené 5-FU (Petrioli et al., 1995). Nicméně, tato kombinovaná chemoterapie není bez významné morbidity a způsobuje závažné nežádoucí účinky včetně stomatitidy, průjmu a myelosuprese (Mahhod et al., 1991; Erlichman et al., 1988; Pietnelli et al., 1989), což vyvolává otázku kvality života, zejména u pacientů s pokročilým onemocněním.Recently, several studies have shown that adjuvant combination chemotherapy of 5-FU and leukovorin increases the efficacy of 5-FU in patients with advanced colorectal cancers. Leucovorin is a folic acid derivative, also known as folinic acid, citrovorum factor or 5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid. Studies have shown that in patients with Dukes C stage, 5-FU / leukovorin combination therapy can reduce mortality by 10-15% (Moertel, 1994). In the same group of patients, combined intravenous and intraperitoneal 5-FU / leukovorin therapy led to a non-significant trend towards improved disease-free and overall survival (Scheithauer et al., 1995). In advanced disease, the same drug combination can improve survival (Taylor, 1993), which was 13.5 months (median) in the combination group compared to 7.5 months in the 5-FU group (Petrioli et al., 1995). However, this combination chemotherapy is not free from significant morbidity and causes serious adverse events including stomatitis, diarrhea and myelosuppression (Mahhod et al., 1991; Erlichman et al., 1988; Pietnelli et al., 1989), raising the issue of quality of life, particularly in patients with advanced disease.

Mnoho vysoce afinitních antagonistů CCK-B/gastrinových receptorů bylo testováno na terapeutický účinek jak in vitro, tak in vivo, na mnoha experimentálních nádorech gastrointestinálního traktu. Například bylo prokázáno že, proglumid, derivát kyseliny glutamové (Seva et al., 190; Harrison et al., 1990; a Watson et al., 1991a); benzotript, N-acylový derivát tryptofanu; L365260, derivát aspercillinu (Bock et al., 1989) a CI-988, molekula, která napodobuje Ckoncovou pentapeptidovou sekvenci CCK (Hughes et al., 1990), účinně neutralizují efekty exogenního gastrinu na růst gastrointestinálních nádorů jak in vitro, tak in vivo (Watson et al., a Romani et al., 1994).Nicméně, tyto antagonisté mají významné toxické nežádoucí účinky a chybí jim specificita, protože blokují působení všech potenciálních ligandů receptorů, jako je G34 a CCK, na normálních buňkách. Nově byly také popsány vysoce účinné a selektivní molekuly antagonizující CCK-B/gastrinové receptory, jako je YM022 (Yuki et al., 1997) a YF476 (Takinami et al., 1997).Many high affinity CCK-B / gastrin receptor antagonists have been tested for therapeutic effect both in vitro and in vivo on many experimental gastrointestinal tract tumors. For example, proglumide has been shown to be a glutamic acid derivative (Seva et al., 190; Harrison et al., 1990; and Watson et al., 1991a); benzotript, an N-acyl derivative of tryptophan; L365260, an aspercillin derivative (Bock et al., 1989) and CI-988, a molecule that mimics the CCK terminal pentapeptide sequence (Hughes et al., 1990), effectively neutralize the effects of exogenous gastrin on gastrointestinal tumor growth both in vitro and in vivo (Watson et al., And Romani et al., 1994). However, these antagonists have significant toxic side effects and lack specificity because they block the action of all potential receptor ligands, such as G34 and CCK, on normal cells. Recently, highly potent and selective CCK-B / gastrin receptor antagonist molecules such as YM022 (Yuki et al., 1997) and YF476 (Takinami et al., 1997) have also been described.

Proglumid a benzotript byly důkladně testovány v preklinických studiích. Hlavním problémem těchto sloučenin je jejich nedostatečná účinnost, která vyžaduje dosažení relativně vysokých koncentrací proo odstranění G17 (Watson et al., 1992a; Watson et al., 1992b). I přesto inhibují proglumid a benzotript bazální a gastrinem-stimulovanou proliferaci mnoha buněčných linií (Seva et al., 1990; Watson et al.,Proglumide and benzotript have been extensively tested in preclinical studies. A major problem with these compounds is their lack of efficacy, which requires relatively high concentrations for G17 removal (Watson et al., 1992a; Watson et al., 1992b). Nevertheless, proglumide and benzotript inhibit the basal and gastrin-stimulated proliferation of many cell lines (Seva et al., 1990; Watson et al.,

1991a). Kromě toho, proglumid zvyšuje přežívání xenotransplantovaných myší nesoucích gastrin-sensitivní buňky1991a). In addition, proglumide increases survival of xenotransplanted mice carrying gastrin-sensitive cells

Ί « · · · · 9 9 ···· • · · · · 9 9 9 99 · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · ·«···« • · · · · · ·· · ··· 9· 999 ··· ·· ·* myších střevních nádorů MC26 na 39 dnů ve srovnání s 25 dny pro kontrolní zvířata.9 9 999 MC26 mouse intestinal tumor tumors for 39 days compared to 25 days for control animals.

Z důvodu nízké specificity této třídy činidel antagonizujících gastrin pro gastrin/CCK-B receptor se předpokládá, že inhibice růstu je také indukována působením nezávislým na gastrinových receptorech. Kromě toho, buněčné receptory, které rozpoznávají a váží gastrin neváží všechny testované inhibitory (Seva et al., 1994). Proto platí, že pokud nedojde k úplné inhibici vazby gastrinu na receptory v autokrinní růstové kaskádě, mohou být antagonisté gastrinu neschopni blokovat tento mechanismus stimulace růstu.Because of the low specificity of this class of gastrin antagonists for the gastrin / CCK-B receptor, it is believed that growth inhibition is also induced by gastrin receptor independent action. In addition, cellular receptors that recognize and bind gastrin do not bind all tested inhibitors (Seva et al., 1994). Therefore, unless gastrin binding to receptors is fully inhibited in an autocrine growth cascade, gastrin antagonists may be unable to block this mechanism of growth stimulation.

Proto existuje potřeba nových terapeutických přístupů, jak pro samostatnou terapii, tak pro kombinované terapeutické strategie s chemoterapií. Kombinovaná léčba může zvýšit terapeutický index a/nebo snížit nutné dávky chemoterapie, což omezí nepříznivé nežádoucí účinky.Therefore, there is a need for new therapeutic approaches, both for single therapy and for combined therapeutic strategies with chemotherapy. Combination therapy may increase the therapeutic index and / or reduce the necessary doses of chemotherapy, reducing adverse side effects.

Terapeutický způsob selektivní imunologické neutralizace biologické aktivity gastrinového hormonu bude účinným prostředkem pro kontrolu a nebo prevenci patologických změn vznikajících v důsledku nadměrné produkce gastrinového hormonu, které jsou spojeny s kolorektálními karcinomy.A therapeutic method for selectively immunologically neutralizing the biological activity of gastrin hormone will be an effective means of controlling or preventing pathological changes resulting from over-production of gastrin hormone that are associated with colorectal cancers.

Související U.S. patenty č. 5023077; 5468494; 5607676; 5609870 a 5622702 popisují imunogeny a imunogenní prostředky použitelné pro kontrolu koncentrace G17 a G34 u pacientů pomocí tvorby anti-gastrinových protilátek a také popisují použití takových prostředků pro léčbu žaludečních a dvanáctnikových vředů a nádorů indukovaných gastrinem.Related U.S. Pat. U.S. Pat. Nos. 5023077; 5,468,494; 5607676; 5609870 and 5622702 disclose immunogens and immunogenic compositions useful for controlling the concentration of G17 and G34 in patients by generating anti-gastrin antibodies, and also disclosing the use of such compositions for the treatment of gastric and duodenal ulcers and tumors induced by gastrin.

Předkládaný vynález se týká použití anti-G17 imunogenu a imunogenních prostředků popsaných v patentech č. 5023077;The present invention relates to the use of the anti-G17 immunogen and immunogenic compositions described in patents 5023077;

5468494; 5607676; 5609870 a 5622702 v kombinované terapii s ···· ·· ·* ·· ·· ··· chemoterapeutickými činidly pro léčbu kolorektálních karcinomů závislých na gastrinu.5,468,494; 5607676; 5609870 and 5622702 in combination therapy with chemotherapeutic agents for the treatment of gastrin-dependent colorectal cancers.

Popsaný způsob protinádorové terapie má vůči dosavadním způsobům léčby kolorektálních karcinomů několik výhod. AntiG17 imunizace, v kombinaci s chemoterapeutickými činidly, jako je 5-FU a leukovorin, zvyšuje terapeutické účinky v kontrole nebo inhibici růstu kolorektálních nádorů, ve srovnání s chemoterapií samotnou.The described anti-tumor therapy has several advantages over the prior art treatments for colorectal cancer. AntiG17 immunization, in combination with chemotherapeutic agents such as 5-FU and leucovorin, enhances the therapeutic effects in controlling or inhibiting the growth of colorectal tumors as compared to chemotherapy alone.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předmětem vynálezu je kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahujeThe present invention provides a combination suitable for use in the treatment of a gastrin-dependent tumor comprising

i) imunogen zaměřený proti růstu tohoto nádoru a ii) jedno nebo více chemotherapeutických činidel pro jeho léčbu.(i) an immunogen directed against the growth of the tumor; and (ii) one or more chemotherapeutic agents for its treatment.

Předmětem vynález je dále kombinace uvedená výše pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu u pacienta.The invention further provides the combination set forth above for use in treating a gastrin-dependent tumor in a patient.

Konečně je předmětem vynálezu také použití kombinace uvedené výše pro výrobu přípravku pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu.Finally, the invention also provides the use of the combination mentioned above for the manufacture of a composition for use in the treatment of a gastrin dependent tumor.

•ttt 9·• ttt 9 ·

Předkládaný vynález poskytuje kombinovanou terapii pro léčbu nádorů, která obsahuje imunologickou neutralizaci peptidových hormonů a faktorů podporujících dělení buněk v kombinaci s chemoterapií. Přesněji, předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nádorů závislých na gastrinu, jako je kolorektální karcinomy. Způsob obsahuje kombinovanou terapii obsahující anti-G17 imunizaci pacienta, který potřebuje terapii, spolu s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel. Anti-G17 imunizace pro léčbu nádorů závislých na gastrinu je překvapivě účinná ve vyvolání tvorby anti-G17 protilátek, i přes známé myelosupresivní účinky použitých chemoterapeutických činidel.The present invention provides a combination therapy for the treatment of tumors comprising immunologically neutralizing peptide hormones and cell division promoting factors in combination with chemotherapy. More specifically, the present invention provides a method of treating gastrin-dependent tumors, such as colorectal cancers. The method comprises combination therapy comprising anti-G17 immunization of a patient in need of therapy, together with the administration of one or more chemotherapeutic agents. Surprisingly, anti-G17 immunization for the treatment of gastrin-dependent tumors is effective in inducing the production of anti-G17 antibodies, despite the known myelosuppressive effects of the chemotherapeutic agents used.

Anti-Gl7 imunizace obsahuje aktivní nebo pasivní imunizaci pacienta anti-Gl7 imunogenem proti hormonu G17, která má za cíl kontrolu koncentrací G17 u pacienta. V důsledku indukce anti-G17 protilátek u pacienta je hormon G17 neutralizován in vivo a jeho fyziologické účinky jsou inhibovány, což inhibuje růst G17-dependentních nádorových buněk.Anti-Gl7 immunization comprises active or passive immunization of a patient with an anti-Gl7 immunogen against the G17 hormone, which is intended to control the patient's G17 concentrations. Due to the induction of anti-G17 antibodies in the patient, the G17 hormone is neutralized in vivo and its physiological effects are inhibited, which inhibits the growth of G17-dependent tumor cells.

Dále, anti-Gl7 imunizace v kombinaci se standardní chemoterapií zvyšuje účinnost léčby kolorektálních karcinomů, ♦ · ♦ • · * • · 0 • · ·Furthermore, anti-Gl7 immunization in combination with standard chemotherapy enhances the effectiveness of treatment for colorectal cancers.

protože při použití kombinace mohou být použity nižší dávky chemoterapeutických činidel, což snižuje jejich toxické účinky na normální tkáně. Kromě toho může být zlepšena kvalita života pacienta a doba jeho přežití.since lower dosages of chemotherapeutic agents can be used with the combination, reducing their toxic effects on normal tissues. In addition, the patient's quality of life and survival may be improved.

Ve výhodném provedení způsob obsahuje aktivní imunizaci savce s nádorem závislým na gastrinu pomocí anti-Gl7 imunogenu, v kombinaci s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel, jako je 5-fluorouracil, leukovorin, levamisol, cis-platina, faktor nekrosy nádorů a proglumid. Anti-G17 imunogen může být podán pacientovi při zahájení terapie a potom v určených intervalech. Anti-G17 protilátky tvořené u pacienta po imunizaci se mohou vázat na G17 a mohou neutralizovat G17 v jeho zralé, amidované, stejně jako prekursorové formě, například G17-Gly, in vivo, a mohou bránit vazbě G17 na jeho receptory, což brání růstu gastrindependentních nádorových buněk. Titry anti-G17 protilátek tvořených u imunizovaného pacienta mohou být sledovány v předem určených intervalech za použití standardních technik. Dále, chemoterapeutická činidla mohou být podána ve standardních dávkách nebo v nižších dávkách, podle potřeb pacienta.In a preferred embodiment, the method comprises actively immunizing a mammal with a gastrin-dependent tumor with an anti-Gl7 immunogen, in combination with the administration of one or more chemotherapeutic agents such as 5-fluorouracil, leucovorin, levamisole, cisplatin, tumor necrosis factor and proglumide. The anti-G17 immunogen may be administered to a patient at initiation of therapy and thereafter at specified intervals. Anti-G17 antibodies produced in a patient after immunization can bind to G17 and can neutralize G17 in its mature, amidated, as well as precursor form, for example, G17-Gly, in vivo, and can prevent the binding of G17 to its receptors, preventing growth of gastrindependent tumor cells. Anti-G17 antibody titers generated in an immunized patient can be monitored at predetermined intervals using standard techniques. Further, the chemotherapeutic agents may be administered at standard doses or at lower doses, as required by the patient.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob léčby nádorů závislých na gastrinu, který obsahuje pasivní imunizaci savce s nádorem závislým na gastrinu pomocí anti-G17 protilátek, v kombinaci s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel, jako je 5-fluorouracil, leukovorin, levamisol, cisplatina, faktor nekrosy nádorů a proglumid. Ve výhodném aspektu tohoto provedení vynálezu mohou být protilátky chimérické, humanizované nebo lidské monoklonální protilátky, které mohou být připraveny metodami dobře známými v oboru. Protilátky mohou být podány pacientovi při zahájení terapie a potom v určených intervalech, podle potřeb pacienta.In another embodiment, the invention provides a method of treating gastrin-dependent tumors comprising passively immunizing a mammal with a gastrin-dependent tumor with anti-G17 antibodies, in combination with administration of one or more chemotherapeutic agents such as 5-fluorouracil, leucovorin, levamisole, cisplatin, tumor necrosis factor and proglumide. In a preferred aspect of this embodiment, the antibodies may be chimeric, humanized or human monoclonal antibodies, which may be prepared by methods well known in the art. Antibodies may be administered to a patient at initiation of therapy and thereafter at specified intervals as appropriate to the patient.

Popis obrázků na připojených výkresechDescription of the figures in the attached drawings

Obr. 1 je graf ukazující časový průběh titrů sérových protilátek po imunizaci krys 500 pg/ml krysím anti-G17 (1-9)-DT imunogenem.Giant. 1 is a graph showing the time course of serum antibody titers after immunization of rats with 500 µg / ml rat anti-G17 (1-9) -DT immunogen.

Obr. 2 je graf ukazující vliv léčby 5-FU/leukovorinem v dávce 30 mg/kg na titry anti-G17(1-9) protilátky u krys imunizovaných imunogenem podle předkládaného vynálezu.Giant. 2 is a graph showing the effect of treatment with 5-FU / leukovorin at 30 mg / kg on anti-G17 (1-9) antibody titers in immunogen-immunized rats of the present invention.

Obr. 3 je Scatchardův graf ukazující vliv léčebných cyklů 30 mg/kg 5-FU/leukovorinu na průměrné hodnoty leukocytů u BDIX krys.Giant. 3 is a Scatchard plot showing the effect of treatment cycles of 30 mg / kg 5-FU / leukovorin on mean leukocyte levels in BDIX rats.

Obr. 4 je sloupcový graf ukazující medián hmotnosti nádoru u neléčených krys, krys léčených anti-G17(1-9)-DT a DT-samotným.Giant. 4 is a bar graph showing the median tumor weight of untreated rats, rats treated with anti-G17 (1-9) -DT, and DT-alone.

Obr. 5 je sloupcový graf ukazující medián hmotnosti nádoru u krys léčených 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem; 30 mg/kg 5FU/leukovorinem a DT imunogenem; 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 25 mg/kg 5-FU/leukovorinem a DT imunogenem;Giant. 5 is a bar graph showing the median tumor weight of rats treated with 30 mg / kg of 5-FU / leukovorin; 30 mg / kg 5FU / leukovorin and DT immunogen; 30 mg / kg 5-FU / leukovorin and anti-G17 (1-9) -DT; 25 mg / kg 5-FU / leukovorin and DT immunogen;

mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 20 mg/kg 5FU/leukovorinem a DT imunogenem; 20 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 12,5 mg/kg 5-FU/leukovorinem a DT imunogenem; a 12,5 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT.mg / kg of 5-FU / leukovorin and anti-G17 (1-9) -DT; 20 mg / kg 5FU / leukovorin and DT immunogen; 20 mg / kg 5-FU / leukovorin and anti-G17 (1-9) -DT; 12.5 mg / kg 5-FU / leukovorin and DT immunogen; and 12.5 mg / kg 5-FU / leukovorin and anti-G17 (1-9) -DT.

Předkládaný vynález poskytuje způsob pro léčbu nádorů, zejména kolorektálních karcinomů závislých na gastrinu, pomocí kombinované terapie obsahující imunizaci pacienta anti-G17 imunogenem a léčbu pacienta chemoterapeutickými činidly, jako je 5-FU a leukovorin. Překvapivě bylo zjištěno, že kombinovaná terapie anti-G17 imunizací/5-FU/leukovorinem je účinnější než dřívější způsoby léčby kolorektálních karcinomů. Chemoterapeutická činidla použitá v kombinované terapii neinhibuji významně produkci anti-G17 protilátek u imunizovaných pacientů a pro léčbu nádorů mohou být použity nižší dávky chemoterapeutických činidel. Kromě toho, titry anti-G17 protilátek vyvolaných imunizací jsou účinné pro neutralizaci všech forem G17 hormonu.The present invention provides a method for treating tumors, particularly gastrin-dependent colorectal cancers, by combining therapies comprising immunizing a patient with an anti-G17 immunogen and treating the patient with chemotherapeutic agents such as 5-FU and leukovorin. Surprisingly, it has been found that combination therapy with anti-G17 immunization (5-FU) with leukovorin is more effective than prior treatments for colorectal cancers. The chemotherapeutic agents used in combination therapy do not significantly inhibit the production of anti-G17 antibodies in immunized patients, and lower doses of chemotherapeutic agents may be used to treat tumors. In addition, anti-G17 antibody titers induced by immunization are effective for neutralizing all forms of G17 hormone.

Ve výhodném provedení způsob obsahuje aktivní imunizaci pacienta s kolorektálním karcinomem závislým na gastrinu pomocí podání anti-G17 imunogenního prostředku spolu s podáním chemoterapeutických činidel. Následné dosycovací anti-G17 imunizace mohou být podány v případě potřeby, jak je určeno analýzou titrů sérových anti-G17 protilátek po imunizaci u pacienta, za použití standardních technik a standardního radiologického hodnocení nádorů. Anti-G17 imunizace může být také provedena u pacienta před chirurgickým odstraněním nádoru.In a preferred embodiment, the method comprises actively immunizing a gastrin-dependent colorectal cancer patient by administering an anti-G17 immunogenic composition together with the administration of chemotherapeutic agents. Subsequent boosting anti-G17 immunizations may be administered as necessary, as determined by analyzing serum anti-G17 antibody titers after immunization in a patient using standard techniques and standard radiological tumor evaluation. Anti-G17 immunization may also be performed in a patient prior to surgical removal of the tumor.

Anti-G17 imunogeny obsahují přirozené nebo syntetické peptidové fragmenty N-koncových aminokyselin G17 jako imunogenní část imunogenu. Tento peptidový fragment je konjugován s imunogenním nosičem, jako je difterický toxoid (DT). Ve výhodném provedení tohoto aspektu vynálezu obsahuje anti-G17 imunogen amino-koncové aminokyseliny G17 od pozice 1 do pozice 9, které mají aminokyselinovou sekvenci pyroGlu-GlyPro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu, který je konjugovaný s difterickým toxoidem. Mezi další vhodné imunogenní proteinové nosiče patří hovězí sérový albumin, přílipkový hemokyanin, hemokyanin a tetanický toxoid.Anti-G17 immunogens comprise natural or synthetic peptide fragments of the N-terminal amino acids of G17 as the immunogenic portion of the immunogen. This peptide fragment is conjugated to an immunogenic carrier such as diphtheria toxoid (DT). In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the anti-G17 immunogen comprises the amino-terminal amino acid G17 from position 1 to position 9 having the amino acid sequence pyroGlu-GlyPro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu that is conjugated to diphtheria toxoid. Other suitable immunogenic proteinaceous carriers include bovine serum albumin, pancreatic hemocyanin, hemocyanin, and tetanus toxoid.

Imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat prodloužení nebo oddělující peptidovou sekvenci, která vysunuje imunogenní peptid z proteinového nosiče a kteráThe immunogens of the present invention may comprise an extension or a separating peptide sequence that ejects the immunogenic peptide from the carrier protein and which

• · · • · · ♦ · ♦ · ·· ·· ·· ·· • · · • · · • · • · • · • · • • • • • • • • • · ·· • · ·· • • • • • • • • • • • • • • • · · • · · • • • • • • • • • • • • • · · · * • · · · ··· ··· • · · • · · • · • · ·« · «

zvyšuje jeho kapacitu vazby na lymfocytární receptory. Vhodnou oddělující peptidovou sekvencí je aminokyselinová sekvence SSPPPPC (SEQQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí). Nicméně, mohou být použity I jiné oddělující peptidy. Ve výhodném provedení tohoto aspektu vynálezu je oddělující peptidová sekvence navázána na karboxylový konec imunogenního peptidu. Imunogeny podle předkládaného vynálezu jsou připraveny standardními technikami a jsou popsány v U.S. patentech č. 5023077;increases its capacity to bind to lymphocyte receptors. A suitable separating peptide sequence is the amino acid sequence SSPPPPC (SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing). However, other separating peptides may also be used. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the separating peptide sequence is linked to the carboxyl terminus of the immunogenic peptide. The immunogens of the present invention are prepared by standard techniques and are described in U.S. Pat. U.S. Patent Nos. 5023077;

5468494; 5607676; 5609870; 5688506 a 5622702, jejichž objevy jsou zde uvedeny jako odkazy. Po imunizaci vyvolávají imunogeny podle předkládaného vynálezu tvorbu vysoce afinitních, neutralizačních protilátek pro inhibici působení G17 ve zralé a prekursorové formě na růst nádorů u imunizovaných zvířat. Produkované anti-G17 protilátky se váží na a neutralizují zralý a prekursorový G17, což brání vazbě G17 na receptory na nádorových buňkách a v konečném důsledku inhibuje růst nádorových buněk. Imunogeny vyvolávají vznik protilátek, které neutralizují jak karboxy-amidovaný, tak glycinem-prodloužený G17, a nemají žádnou zkříženou reaktivitu s G34 nebo CCK.5,468,494; 5607676; 5609870; 5,688,506 and 5,622,702, the disclosures of which are incorporated herein by reference. Upon immunization, the immunogens of the present invention induce the generation of high affinity, neutralizing antibodies to inhibit the action of G17 in mature and precursor form on tumor growth in immunized animals. The produced anti-G17 antibodies bind to and neutralize mature and precursor G17, preventing binding of G17 to receptors on tumor cells and ultimately inhibiting tumor cell growth. Immunogens elicit antibodies that neutralize both carboxy-amidated and glycine-extended G17, and have no cross-reactivity with G34 or CCK.

Prostředky, ve kterých jsou imunogeny pro aktivní imunizaci podány pro léčbu nádorů závislých na gastrinu pacientům, mohou být v různých formách. Mezi tyto formy patří, například, solidní, semi-solidní a kapalné dávkové formy, jako jsou prášky, kapalné roztoky, suspenze, čípky a injekční nebo infusní roztoky. Výhodná forma závisí na vybraném způsobu podání a terapeutické aplikaci. Prostředky obsahují imunogeny podle předkládaného vynálezu a vhodné farmaceuticky přijatelné složky a mohou obsahovat jiná medicinální činidla, nosiče, pomocné přísady atd., které mohou být smíseny za použití standardních způsobů. Výhodně jsou prostředky ve formě dávkových jednotek. Dávka aktivní sloučeniny podaná pro imunizaci nebo jako lék při jedné aplikaci nebo za určitý čas • · závisí na léčeném jedinci, způsobu a formě podání a na úvaze ošetřujícího lékaře.Compositions in which immunogens for active immunization are administered to treat gastrin-dependent tumors in patients may take various forms. Such forms include, for example, solid, semi-solid and liquid dosage forms such as powders, liquid solutions, suspensions, suppositories and injectable or infusible solutions. The preferred form depends on the selected route of administration and therapeutic application. The compositions comprise the immunogens of the present invention and suitable pharmaceutically acceptable ingredients, and may contain other medicinal agents, carriers, adjuvants, etc., which can be mixed using standard methods. Preferably, the compositions are in unit dosage form. The dose of the active compound administered for immunization or as a medicament by a single administration or over a period of time depends on the subject being treated, the mode and form of administration, and the judgment of the attending physician.

Při léčbě gastrointestinálních nádorů je pacientovi podána dávka v rozsahu 0,001 až 2 mg imunogenního prostředku. Účinná dávka imunogenního prostředku je schopna vyvolat imunitní odpověď u pacienta, která spočívá v tvorbě účinných titrů protilátek pro vazbu a neutralizaci zralého a prekursorového G17 během 1-3 měsíců po imunizaci. Po imunizaci a chemoterapii, například 5-FU/leukovorinem, u pacienta s kolorektálním karcinomem, se účinnost terapie na růst nádoru hodnotí standardními klinickými postupy, jako je ultrazvukové vyšetření a vyšetření magnetickou rezonancí (MRI), pro detekci přítomnosti a velikosti nádoru. Titry anti-G17 protilátky mohou být také sledovány z vzorků krve od pacienta.For the treatment of gastrointestinal tumors, the patient is administered a dose ranging from 0.001 to 2 mg of the immunogenic composition. An effective dose of an immunogenic composition is capable of eliciting an immune response in a patient by generating effective antibody titers to bind and neutralize mature and precursor G17 within 1-3 months of immunization. Following immunization and chemotherapy, such as 5-FU / leukovorin, in a patient with colorectal cancer, the efficacy of tumor growth therapy is evaluated by standard clinical procedures such as ultrasound and magnetic resonance imaging (MRI) to detect the presence and size of the tumor. Anti-G17 antibody titers can also be monitored from blood samples from a patient.

Pokud je to nutné, měla by být pro udržení účinného titru protilátek podána dosycovací dávka. Účinná léčba kolorektálního adenokarcinomu závislého na gastrinu a jiných karcinomů závislých na gastrinu, jako je karcinom žaludku, jater, slinivky břišní a malobuněčný karcinom plic, pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu by měla vést k inhibicí růstu nádoru a zmenšení velikosti nádoru.If necessary, a saturation dose should be administered to maintain an effective antibody titer. Effective treatment of gastrin-dependent colorectal adenocarcinoma and other gastrin-dependent cancers such as stomach, liver, pancreas, and small cell lung cancer by the method of the present invention should result in inhibition of tumor growth and reduction in tumor size.

Pro pasivní imunizaci jsou anti-G17 protilátky podány pacientovi intravenosně za použití farmaceuticky přijatelného nosiče, jako je salinický roztok, například fosfatem-pufrovaný salinický roztok.For passive immunization, anti-G17 antibodies are administered to a patient intravenously using a pharmaceutically acceptable carrier such as a saline solution, for example a phosphate-buffered saline solution.

Chemoterapeutická činidla jsou podána v dávkách doporučovaných ve standardních režimech a mohou být podána při zahájení terapie současně s anti-G17 imunogenem, před imunizací nebo po imunizaci. V některých případech může být výhodné podání chemoterapeutického činidla jak před, tak po • · • tftf · · tftftftf •tftf tf tf . · tftftf • tftf · tf·· tftftf • tf · · tftftf tf • tf tftftf «tftf tftf tftf imunizaci. Další série chemoterapie mohou být také podány, podle potřeb pacienta, jak jsou zhodnoceny MRI a ultrazvukem.The chemotherapeutic agents are administered at the dosages recommended in standard regimens and can be administered at the start of therapy concurrently with the anti-G17 immunogen, before or after immunization. In some cases, it may be advantageous to administer the chemotherapeutic agent both before and after tftfft tftfft tftf. · Tftftf • tftf · tf ·· tftftf • tf · · tftftf tf • tf tftftf «tftf tftf tftf immunization. Other series of chemotherapy may also be administered, according to the patient's needs, as evaluated by MRI and ultrasound.

Následující pokusy byly provedeny pro prokázání účinků kombinované terapie podle předkládaného vynálezu na kolorektální karcinomy.The following experiments were performed to demonstrate the effects of the combination therapy of the present invention on colorectal cancers.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Následující pokusy byly provedeny pro určení potenciálního klinického přínosu anti-G17(1-9)-DT. Cíle studie byly následuj ící:The following experiments were performed to determine the potential clinical benefit of anti-G17 (1-9) -DT. The objectives of the study were as follows:

(a) stanovit dlouhodobý efekt specifické anti-G17(1-9)-DT imunizace krys na histologický nález v Gl traktu krys;(a) determine the long-term effect of specific anti-G17 (1-9) -DT immunization of rats on histology in the GI tract of rats;

(b) zhodnotit vliv kombinace 5-FU/leukovorin na titry protilátek proti anti-G17(1-9)-DT; a (c) stanovit terapeutický účinek kombinace anti-G17(1-9)-DT a 5-FU/leukovorinu na krysím modelu.(b) evaluate the effect of the 5-FU / leukovorin combination on anti-G17 (1-9) -DT antibody titers; and (c) determine the therapeutic effect of the combination of anti-G17 (1-9) -DT and 5-FU / leukovorin in the rat model.

Buněčná linieCell line

DHDK12 je krysí buněčná linie epitelového nádoru tlustého střeva (Martin, 1983). Buněčná linie byla kultivována v RPMI 1640 kultivačním mediu (Gibco, Paisley, Scotland) obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS, Sigma, Poole, UK) ve zvlhčovaném prostředí při 37 °C a 5% CO2.DHDK12 is a rat colon epithelial tumor cell line (Martin, 1983). The cell line was cultured in RPMI 1640 culture medium (Gibco, Paisley, Scotland) containing 10% fetal calf serum (FCS, Sigma, Poole, UK) in a humidified environment at 37 ° C and 5% CO 2.

ImunogenImmunogen

Anti-G17(1-9)-DT imunogen se skládal z aminokyselinových zbytků 1-9 G17 navázaných na svém karboxylovém konci na oddělovací peptid SSPPPPC (SEQ ID NO: 1 v seznamu sekvencí), «· 9 · ·· • · · * · ···· ··· ♦ · · « * · • · ♦ · «····» • · · · · · · · • ·· ··· ··· ·· ·· který byl potom konjugován na DT. Imunogen použitý v těchto pokusech byl upraven tak, aby byl specifický pro krysí G17, pomocí nahrazení lidského G17 epitopu amino-koncovými 9 aminokyselinami krysího G17 navázanými prostřednictvím oddělovacího peptidu na difterický toxoid (DT). Antisérum proti krysímu anti-G17(1-9)-DT bylo označeno jako anti-krysí G17(1-9)-DT.The anti-G17 (1-9) -DT immunogen consisted of amino acid residues 1-9 of G17 bound at its carboxyl terminus to the SSPPPPC spacer peptide (SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing), · · Který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který který DT. The immunogen used in these experiments was engineered to be specific for rat G17 by replacing the human G17 epitope with the amino-terminal 9 amino acids of rat G17 bound via a diphtheria toxoid (DT) spacer peptide. Anti-rat anti-G17 (1-9) -DT antiserum has been designated as anti-rat G17 (1-9) -DT.

Pokusná zvířataExperimental animals

Samci a samice BDIX krys byly získány od Cancer Studies Unit, University of Nottingham, UK, a byly stáří 6-10 týdnů, hmotnosti 340-420 g. Krysy byly chovány v párech za cyklů 12 hodin světla a 12 hodin tmy při 25 °C a 50% vlhkosti.Male and female BDIX rats were obtained from Cancer Studies Unit, University of Nottingham, UK, and were 6-10 weeks of age, weighing 340-420 g. The rats were kept in pairs for 12 hours of light and 12 hours of dark at 25 ° C. and 50% humidity.

Před každým pokusem byla zvířata rozdělena do skupin se stejnou distribucí hmotnosti. Velikost skupin byla 6-13 zvířat. UK Coordinatig Committee for Cancer Research (UKCCCR) schválila všechny pokusy na zvířatech.Prior to each experiment, the animals were divided into groups with the same weight distribution. The size of the groups was 6-13 animals. The UK Coordinatig Committee for Cancer Research (UKCCCR) approved all animal experiments.

ImunizaceImmunization

Krysí anti-G17(1-9)-DT se rozpustil v sterilním salinickém roztoku (0,9%), pH 7,3, v koncentraci 1 mg/ml. Adjuvantní, nor-muramylový peptid (Penisula Labs, Belmont, CA, USA) byl přidán do roztoku konjugátu za dosažení konečné koncentrace konjugátů mezi 200 a 500 gg/ml. Vodný roztok byl připraven s olejovým vehikulem (montanide ISA 703; AMS Seppic lne., Paris, France) v poměru 1:2 (obj./obj.) emulgací. Po umístění do skleněné injekční stříkačky, která byla napojena na druhou stříkačku prostřednictvím troj čestného kohoutu, byla směs 40krát vytlačena a natáhnuta do stříkačky, za zisku emulse. Pro kontrolní krysy byla stejným způsobem připravena emulse obsahující DT peptid a muramyl-dipeptid. 200 μΐ emulse (50 • ·· · 9Rat anti-G17 (1-9) -DT was dissolved in sterile saline (0.9%), pH 7.3, at a concentration of 1 mg / ml. Adjuvant, nor-muramyl peptide (Penisula Labs, Belmont, CA, USA) was added to the conjugate solution to achieve a final conjugate concentration between 200 and 500 gg / ml. The aqueous solution was prepared with an oil vehicle (montanide ISA 703; AMS Seppic Inc, Paris, France) at a ratio of 1: 2 (v / v) by emulsification. After being placed in a glass syringe which was connected to the second syringe via a three way cock, the mixture was extruded 40 times and withdrawn into the syringe to obtain an emulsion. An emulsion containing DT peptide and muramyl dipeptide was prepared in the same manner for control rats. 200 μΐ emulsion (50 • ·· · 9

99999999

9 4 9 9 · 4 4 4 « • · 0 4 0 • 949 00 «09 4 9 9 · 4 4 4 • · 0 4 0 9 949 00 0 0

Hg/krysu) bylo podáno s.c. injekcí (na pravém boku pokusných zvířat). Zvířata byla imunizována buď jedinou injekcí, nebo opakovaně v 21-denních intervalech, jak je popsáno dále.Hg / rat) was administered s.c. injections (on the right side of the test animals). Animals were immunized either with a single injection or repeated at 21-day intervals as described below.

Cytotoxická léčbaCytotoxic treatment

Krysám bylo intravenosně podáno 12,5 a 25 mg/kg 5fluorouracilu (5-FU, David Bull Labs., Warwick, UK) a 12,5-25 mg/kg leukovorinu (Lederle Labs., Gosport, Hants, UK) v den 1, 3 a 5 v cyklu, který byl opakován po 4 týdnech během testovaného období (Asao, 1992). Cytotoxická kombinace byla podána krysám před nebo po anti-G17(1-9)-DT imunizaci (200 Hg/kg).Rats were injected intravenously with 12.5 and 25 mg / kg 5fluorouracil (5-FU, David Bull Labs., Warwick, UK) and 12.5-25 mg / kg leukovorin (Lederle Labs., Gosport, Hants, UK) on day. 1, 3 and 5 in a cycle that was repeated after 4 weeks during the test period (Asao, 1992). The cytotoxic combination was administered to rats before or after anti-G17 (1-9) -DT immunization (200 Hg / kg).

Iniciace nádorového růstuInitiation of tumor growth

DHDK 12 buňky byly suspendovány ve sterilním fosfátem pufrovaném salinické roztoku (PBS, Oxoid, Hants, UK) v koncentraci buněk 2,5 x 10⁷/ml. Krysy byly uvedeny do anestesie pomocí intraperitoneální injekce 1 ml Hypnormu (0,315 ng/ml fentanylcitratu a 10 mg/ml fluanisolu; Jannsen, Berrse,DHDK 12 cells were suspended in sterile phosphate buffered saline (PBS, Oxoid, Hants, UK) at a cell concentration of 2.5 x 10 ⁷ / ml. The rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 1 ml Hypnorm (0.315 ng / ml fentanyl citrate and 10 mg / ml fluanisole; Jannsen, Berrse,

Belgium), Hypnovelu (5 ng/ml midazolamu; Roche, Basel, Switzerland) a sterilní destilované vody v poměru 1:1:5. Po subkutánní injekci na pravém boku bylo 200 μί buněčné suspenze injikováno do svaloviny břišní stěny a chirurgická incise byla uzavřena klipy. Každá pokusná skupina se skládala z 6 až 13 zvířat.Belgium), Hypnovel (5 ng / ml midazolam; Roche, Basel, Switzerland) and sterile distilled water in a 1: 1: 5 ratio. Following subcutaneous injection on the right flank, 200 μί of cell suspension was injected into the abdominal wall muscle and the surgical incision was closed with clips. Each experimental group consisted of 6 to 13 animals.

Stanovení koncentrací specifických protilátek u krys imunizovaných krysím anti-G17(1-9)-DTDetermination of specific antibody concentrations in rats immunized with anti-G17 (1-9) -DT rats

Pro získání vzorků krve pro analýzu byla krysám odebírána krev z ocasu v různých časech pokus a na konci pokusu byla při terminální anestesii odebrána krev punkcí srdce. SérovéTo obtain blood samples for analysis, rats were drawn from the tail at various times and at the end of the experiment, under terminal anesthesia, blood was collected by heart puncture. Serum

* 0* 0 * 0 * 0 • 00 • 00 • 0 • 0 * · 0 * · 0 • · • · 0 · 0 · • 0 • 0 0 · 0 · • 09« • 09 « • • • ' 0 • '0 0 · 0 · 0 · · 0 0 · · 0 • • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · • · · • • • • 0 0 0 0 0 0 0 0 >00 00 > 00 00 000 000 000 000 00 00 00 00

koncentrace protilátek proti krysímu G17 byly stanoveny enzymovým imunosorbentním testem (ELISA). Konjugát krysího G17-hovězího sérového albuminu (BSA) byl rozpuštěn na koncentraci 2 pg/ml v O,1M glycinovém pufru (pH 9,5) a byl vnesen v množství 25 pl na jamku do 96-jamkových Immunolon U ploten (Dynatech Labs., Sussex, UK). Jamky byly inkubovány přes noc při 4 °C, potom byl neadsorbovaný konjugát odstraněn a jamky byly promyty pufrem (0,9% salinický roztok, 0,5% Tween20 (Sigma), 0,02% NaN3 (Sigma), pH 7,3). Tento pufr byl použit pro všechny výplachy a ředění činidel. Sérum bylo zpracováváno při 10-násobných sériových ředěních, od ředění 1:100.concentrations of anti-rat G17 antibodies were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Rat G17-bovine serum albumin (BSA) conjugate was dissolved to a concentration of 2 µg / ml in 0.1 M glycine buffer (pH 9.5) and was introduced at 25 µl per well into 96-well Immunolon U plates (Dynatech Labs. , Sussex, UK). The wells were incubated overnight at 4 ° C, then the unadsorbed conjugate was removed and the wells were washed with buffer (0.9% saline, 0.5% Tween20 (Sigma), 0.02% NaN 3 (Sigma), pH 7.3). ). This buffer was used for all washes and reagent dilutions. Serum was run at 10-fold serial dilutions, starting at 1: 100.

Pozitivní kontrolou bylo anti-krysí-G17(1-9)-DT antisérum od předem imunizovaných zvířat a negativními kontrolami byly normální krysí sérum a sérum od zvířat imunizovaných pouze DT. Všechna kontrolní séra byla použita ve stejných ředěních jako testovaná séra. Naředěná séra byla přidána do jamek ve 25 pl alikvotách za přítomnosti nebo nepřítomnosti 25 pl/jamku krysího G17-BSA v koncentraci 100 pg/ml (jako rozpustného inhibitoru). Základním kontrolám bylo podáno pouze 25 pl testového pufru. Plotny byly inkubovány po dobu 60 minut při teplotě okolí a potom byly promyty testovacím pufrem. Kozí anti-krysí imunoglobulin (H+L)-biotin (Zymed, San Francisco,Positive controls were anti-rat-G17 (1-9) -DT antisera from pre-immunized animals and negative controls were normal rat serum and serum from animals immunized with DT only. All control sera were used at the same dilutions as the test sera. Diluted sera were added to the wells in 25 µl aliquots in the presence or absence of 25 µl / well of rat G17-BSA at a concentration of 100 µg / ml (as soluble inhibitor). Only 25 µl assay buffer was administered to the baseline controls. Plates were incubated for 60 minutes at ambient temperature and then washed with assay buffer. Goat anti-rat immunoglobulin (H + L) -biotin (Zymed, San Francisco,

CA, USA) byl přidán do jamek v ředění 1:500, 50 pl/jamku a byla provedena inkubace po dobu 60 minut ve tmě při teplotě okolí.CA, USA) was added to the wells at a dilution of 1: 500, 50 µl / well and incubated for 60 minutes in the dark at ambient temperature.

Po promytí se přidala avidin-alkalická fosfatasa (Zymed) v ředění 1:100 (50 pl/jamku) a plotny se inkubovaly po dobu 60 minut při teplotě okolí. Po dalším promytí se do jamek přidal p-nitrofenylfosfatový (pNPP) substrát (Sigma) v množství 50 pl/jamku a po 5-minutovém vyvíjení se odečítala absorbance při 405 nm. Rozdíl absorbance mezi neošetřeným sérem a sérem inkubovaným s krysím G17-BSA byl vypočítán jako specifická absorbance.After washing, avidin-alkaline phosphatase (Zymed) was added at a 1: 100 dilution (50 µl / well) and the plates were incubated for 60 minutes at ambient temperature. After a further wash, p-nitrophenylphosphate (pNPP) substrate (Sigma) was added to the wells at 50 µl / well and after 5 minutes of development absorbance at 405 nm was read. The difference in absorbance between untreated serum and serum incubated with rat G17-BSA was calculated as specific absorbance.

• ·• ·

Stanovení počtu leukocytůDetermination of leukocyte count

Heparinizovaná krev od krys byly během pokusu odebírána z ocasu a na konci pokusu punkcí srdce. Počet leukocytů byl analyzován v Hematology Department na University Hospital, Nottingham, za použití FACScan.Heparinized blood from rats was collected from the tail during the experiment and by heart puncture at the end of the experiment. Leukocyte counts were analyzed at the Hematology Department at University Hospital, Nottingham, using FACScan.

HistologieHistology

Po utracení dlouhodobě anti-G17(1-9)-DT-imunizovaných krys byly odebrány representativní oblasti žaludku, tlustého střeva a rekta od imunizovaných krys a věkově odpovídajících kontrol a byly fixovány ve formalinu. Řezy byly potom ponořeny do parafinu a za použití mikrotomu byly připraveny 4 gm řezy. Tyto řezy byly barveny hematoxylinem a eosinem a byly vyšetřovány histopatologem, který neměl žádné údaje o léčebných skupinách.After sacrifice of long-term anti-G17 (1-9) -DT-immunized rats, representative areas of the stomach, colon and rectum were collected from immunized rats and age-matched controls and were fixed in formalin. The sections were then immersed in paraffin and 4 gm sections were prepared using a microtome. These sections were stained with hematoxylin and eosin and were examined by a histopathologist who had no treatment group data.

Rychlost proliferace buněk kryptCrypt cell proliferation rate

Jednu hodinu před utracením zvířat byl intraperitoneálně injikován vincristin (2 mg/kg, Sigma) pro indukci zástavy buněčného cyklu v metafázi v střevním epitelu před hodnocením proliferace buněk krypt tlustého střeva (CCPR). Byl určen počet buněk v metafázi na kryptu. Tlusté střevo a rektum byly vyjmuty z každé krysy, byly podélně rozstřiženy a jejich sliznice byly fixovány v Carnoysově roztoku. Krypty byly opatrně rozdrceny pod disekačním mikroskopem a byl stanoven počet buněk v metafázi (při 25-násobném zvětšení).One hour prior to sacrifice, vincristine (2 mg / kg, Sigma) was injected intraperitoneally to induce cell cycle arrest in metaphase in the intestinal epithelium before assessing the proliferation of colon crypt cells (CCPR). The number of cells in the metaphase per crypt was determined. The colon and rectum were removed from each rat, cut longitudinally, and their mucous membranes were fixed in Carnoys solution. The crypts were carefully crushed under a dissecting microscope and the number of cells in the metaphase (at a 25-fold magnification) was determined.

Statistické analýzyStatistical analysis

Výsledky testů in vivo byly analyzovány Mann-Whitney neparametrickým testem za použití SPSS statistického balíčku pro IBM PC.In vivo test results were analyzed by Mann-Whitney non-parametric test using the SPSS statistical package for IBM PC.

• · • ·• · • ·

99 9 999 9 9

Studie dlouhodobé anti-G17(1-9)-DT samců krys bylo imunizováno krysím anti-G17(1-9)-DT imunogenem způsobem popsaným výše a jejich protilátkové titry byly měřeny po dobu 34 týdnů po jediné imunizaci. V tuto dobu byla zvířatům podána druhá dosycovací injekce krysího antiG17(l-9)-DT. Výsledky jsou uvedeny na obr. 1. Obr. 1 ukazuje titry protilátek od krys imunizovaných 500 μρ/τηΐ krysího antiG17(l-9)-DT v závislosti na čase do 40 týdnů. Každý bod představuje jedno zvíře. Titry protilátek byly měřeny pomocí ELISA, jak byl popsán výše, za použití ředění séra 1:100. Imunizace jsou znázorněny šipkou. Po primární imunizaci odpověděli 4 z 5 krys na krysí anti-G17(1-9)-DT imunogen. Protilátky byly, po této jediné injekci, detekovatelné v týdnu 7 u 3 z 5 krys a v týdnu 9 u 4 z 5 krys. Po počátečním vzestupu protilátek následoval druhý vzestup mezi 15-20 týdnem, a potom titry protilátek postupně klesaly a dosáhly nuly v týdnu 34. V tuto dobu obr. 1 také ukazuje, že po druhé imunizaci krysím anti-Gl7(1-9)-DT měly všechny krysy detekovatelné titry protilátek proti krysímu G17 během 1-2 týdnů po imunizaci.Long-term anti-G17 (1-9) -DT male rat studies were immunized with a rat anti-G17 (1-9) -DT immunogen as described above and their antibody titers were measured for 34 weeks after a single immunization. At this time, animals were given a second boost injection of rat antiG17 (1-9) -DT. The results are shown in Figure 1. 1 shows antibody titers from rats immunized with 500 μρ / τηΐ of rat antiG17 (1-9) -DT versus time up to 40 weeks. Each point represents one animal. Antibody titers were measured by ELISA as described above using a 1: 100 dilution of serum. Immunizations are indicated by an arrow. After primary immunization, 4 out of 5 rats responded to the rat anti-G17 (1-9) -DT immunogen. Antibodies were, after this single injection, detectable at week 7 in 3 out of 5 rats and at week 9 in 4 out of 5 rats. The initial rise in antibodies was followed by a second rise between 15-20 weeks, and then antibody titers gradually decreased to zero at week 34. At this time, Figure 1 also shows that after a second immunization with rat anti-Gl7 (1-9) -DT all rats had detectable antibody titers against rat G17 within 1-2 weeks after immunization.

Příklad 2: Histologická analýza krys dlouhodobě imunizovaných anti-G17(1-9)-DTExample 2: Histological analysis of long-term immunized anti-G17 (1-9) -DT rats

Vzorky z žaludku, tlustého střeva a rekta byly histologicky vyšetřovány po barvení hematoxylinem a eosinem, jak je popsáno v příkladu 1. Tyto vzorky byly srovnávány se vzorky od kontrolních krys odpovídajícího věku a pohlaví. Všechny hodnocené oblasti Gl traktu byly identické u krys léčených anti-G17(1-9)-DT a věkově odpovídajících kontrol s hlediska délky klků/krypt/výšky sliznice. V žaludku měly buňky podobné enterochromafinním buňkám (ECL) podobný vzhled a počet v obouSamples from the stomach, colon and rectum were histologically examined after hematoxylin and eosin staining as described in Example 1. These samples were compared to samples from age and sex control rats. All GI tract regions evaluated were identical in rats treated with anti-G17 (1-9) -DT and age-matched controls in terms of villus length / crypt / mucosal height. In the stomach, cells similar to enterochromaffin cells (ECL) had a similar appearance and count in both

skupinách zvířat. Nicméně, byly patrné určité známky granulaci v G buňkách žaludeční sliznice krys léčených anti-G17(1-9)-DT.groups of animals. However, there were some signs of granulation in the gastric mucosal G cells of rats treated with anti-G17 (1-9) -DT.

Příklad 3: Rychlost proliferace buněk krypt (CCPR) střevního epitelu krys dlouhodobě imunizovaných anti-Gl7(1-9)-DTExample 3: Crypt Cell Proliferation Rate (CCPR) of intestinal epithelium of rats immunized long term with anti-Gl7 (1-9) -DT

CCPR epitel tlustého střeva a titry protilátek proti krysímu G17 byly analyzovány způsobem popsaným výše. Tabulka I ukazuje výsledky získané od 4 z 5 hodnocených krys srovnávající CCPR a titry protilátek proti krysímu G17. Průměr CCPR pro kontrolní krysy byl 18,93 (standardní odchylka 3,2) a pro krysy imunizované anti-G17(1-9)-DT byl 23,7 (standardní odchylka 7,9). Nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v CCPR mezi krysami imunizovanými anti-G17(1-9)-DT a kontrolními krysami odpovídajícího věku. Tyto výsledky naznačují, že rychlost dělení buněk v kryptách střevního epitelu je stejná pro kontrolní krysy i krysy imunizované anti-G17(1-9)-DT.The colon epithelial CCPR and antibody titers against rat G17 were analyzed as described above. Table I shows the results obtained from 4 out of 5 rats evaluated comparing CCPR and anti-rat G17 antibody titers. The mean CCPR for control rats was 18.93 (standard deviation 3.2) and for rats immunized with anti-G17 (1-9) -DT was 23.7 (standard deviation 7.9). No statistically significant difference in CCPR was observed between rats immunized with anti-G17 (1-9) -DT and age-matched control rats. These results indicate that the cell division rate in the intestinal epithelial crypts is the same for both control and immunized anti-G17 (1-9) -DT rats.

• ·• ·

Tabulka 1: Srovnání titrů protilátek proti G17:DT s proliferaci buněk krypt v tlustém střevuTable 1: Comparison of anti-G17: DT antibody titers to colon cell proliferation

Krysa Rat Specifická absorbance pro anti-krysí G17:DT protilátky (ředění 1:1000) Specific absorbance for anti-rat G17: DT antibody (dilution) 1: 1000) Rychlost proliferace buněk krypt (průměr metafází/kryptu za 2 hodiny po podání vincristinu Speed cell proliferation crypt (average metaphase / crypt beyond 2 hours after administration vincristine Kontrola 1 Control 1 0 0 21, 9 21, 9 Kontrola 2 Control 2 0 0 19, 4 19, 4 Kontrola 3 Control 3 0 0 14,4 14.4 Kontrola 4 Control 4 0 0 20, 0 20, 0 Imunizovaná krysa 1 Immunized rat 0,280 0.280 29,7 29.7 Imunizovaná krysa 2 Immunized rat 2 0,340 0.340 30, 3 30, 3 Imunizovaná krysa 3 Immunized rat 3 0,415 0.415 13, 6 13, 6 Imunizovaná krysa 4 Immunized rat 4 0, 420 0, 420 21,1 21.1

Příklad 4: Vliv pre- a post-cytotoxické léčby na titry protilátek vyvolaných anti-G17(1-9)-DTExample 4: Effect of pre- and post-cytotoxic treatment on anti-G17 (1-9) -DT-induced antibody titers

Krysám byl intravenosně podán poměr 1:1 5-FU/leukovorinu v dávce 30 mg/kg, jak je popsáno v příkladu 1, před nebo po imunizaci anti-G17(1-9)-DT. Každá skupina se skládala z 6 samců a 6 samic a průměrné titry protilátek byly měřeny ELISA technikou za použití ředění séra 1:100. Titr protilátek u každé krysy byl měřen ze vzorku krve způsobem popsaným v příkladu 1.Rats were intravenously administered a 1: 1 ratio of 5-FU / leukovorin at a dose of 30 mg / kg as described in Example 1, before or after immunization with anti-G17 (1-9) -DT. Each group consisted of 6 male and 6 female, and the average antibody titers were measured by ELISA using a 1: 100 serum dilution. The antibody titer in each rat was measured from a blood sample as described in Example 1.

Obr. 2 ukazuje vliv pre- a post-cytotoxické léčby cyklů 30 mg/kg 5-FU/leukovorinu na titry protilátek vyvolaných imunizací anti-G17(1-9)-DT (500 gg/ml). V tomto obrázku jsou data uvedena následovně: žádná cytostatika, 7 imunizací;Giant. 2 shows the effect of pre- and post-cytotoxic treatment of 30-mg / kg cycles of 5-FU / leukovorin on antibody titers induced by immunization with anti-G17 (1-9) -DT (500 gg / ml). In this figure, data is presented as follows: no cytostatics, 7 immunizations;

« · · • ·«· · · ·

99 imunizace před 4 cykly cytostatické léčby; -Ο-, 1 imunizace před 4 cykly cytostatické léčby; -Δ-, 1 cytostatické léčba před 4 imunizacemi (2 cytotoxické léčbě během imunizací); -ffi-, 2 cytostatické léčby před 4 imunizacemi;99 immunization prior to 4 cycles of cytostatic treatment; -Ο-, 1 immunization prior to 4 cycles of cytostatic treatment; -Δ-, 1 cytostatic treatment prior to 4 immunizations (2 cytotoxic treatments during immunizations); -fi-, 2 cytostatic treatments prior to 4 immunizations;

cytostatické léčby před 3 imunizacemi; 4 cytostatické léčby před 2 imunizacemi .cytostatic treatments prior to 3 immunizations; 4 cytostatic treatments before 2 immunizations.

Obr. 2 ukazuje průměr 6 samic a 6 samců na skupinu. Standardní odchylky jsou přibližně 10% průměru. Nebyl pozorován žádný významný vliv na titry protilátek způsobený předléčením kombinací 5-FU/leukovorin pro titry protilátek ani pro dobu vzestupu jejich hladin, ve srovnání s neléčenými krysami imunizovanými anti-G17(1-9)-DT. Maximální počet hodnocených léčebných cyklů byl 4 cytotoxické terapie následované 2 imunizacemi.Giant. 2 shows the average of 6 females and 6 males per group. Standard deviations are approximately 10% of the mean. No significant effect on antibody titers due to pretreatment with 5-FU / leukovorin was observed for antibody titers or their rise time compared to untreated anti-G17 (1-9) -DT immunized rats. The maximum number of treatment cycles evaluated was 4 cytotoxic therapies followed by 2 immunizations.

Obr. 3 ukazuje vliv léčby na průměrný počet leukocytů u BDIX krys.Giant. 3 shows the effect of treatment on the average leukocyte count in BDIX rats.

Vliv cytotoxické léčby 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem na průměrný počet leukocytů (WBC) u BDIX krys, kterým byly podány cykly cytotoxické léčby před 2 imunizacemi, je uveden na obr. 3. Jak je uvedeno na tomto obrázku, je patrné významné snížení počtu WBC u representativních hodnocených krys po cytotoxické léčbě (p<0,005, Students' t-test). Počty se snižovaly s počtem cyklů cytotoxické léčby, což ukazuje na určitou myelosupresi. Nicméně, nebyl zaznamenám žádný vliv na protilátkovou odpověď na anti-G17(1-9)-DT u těchto krys, jak je uvedeno na obr. 2.The effect of cytotoxic treatment with 30 mg / kg 5-FU / leukovorin on the average leukocyte count (WBC) in BDIX rats given cycles of cytotoxic treatment prior to 2 immunizations is shown in Figure 3. As shown in this figure, significant reduction of WBC in representative rats evaluated after cytotoxic treatment (p <0.005, Students' t-test). The numbers decreased with the number of cycles of cytotoxic treatment, indicating some myelosuppression. However, there was no effect on the antibody response to anti-G17 (1-9) -DT in these rats as shown in Figure 2.

Příklad 5: Vliv kombinované terapie 5-FU/leukovorinem a antiGl7(l-9)-DT na růst DHDK12 nádorů in vivo • · · « · ·Example 5: Effect of Combination Therapy with 5-FU / Leukovorin and AntiG17 (1-9) -DT on Growth of DHDK12 Tumors in Vivo

Vliv kombinované terapie 5-FU/leukovorinem (12,5-30 mg/kg) a krysím anti-G17(1-9)-DT (200 gg/ml) na růst DHDK12 buněčné linie nádoru tlustého střeva krys ve svalové vrstvě břišní stěny BDIX krys byl testován srovnáním s nádory u kontrolních zvířat, jak bylo popsáno v předešlých příkladech, na konci léčby byla zvířata utracena a jejich nádory byly excidovány a zváženy za použití standardních postupů. Každá skupina se skládala z 10/12 krys smíšeného pohlaví. Jsou uvedeny mediány hmotnosti nádorů s rozsahy hodnot čtvrtiny proměnné nad sloupci. Statistické hodnocení bylo provedeno za použití MannWhitleyova U neparametrického testu, jak je popsán v příkladu 1.Effect of combination therapy with 5-FU / leukovorin (12.5-30 mg / kg) and rat anti-G17 (1-9) -DT (200 gg / ml) on the growth of the DHDK12 colon tumor cell line of rats in the abdominal wall muscle layer BDIX rats were tested by comparison with tumors in control animals as described in the previous examples, at the end of treatment the animals were sacrificed and their tumors excised and weighed using standard procedures. Each group consisted of 10/12 mixed sex rats. Tumor mass medians are presented with ranges of quarter variable values above the columns. Statistical evaluation was performed using the MannWhitley U nonparametric test as described in Example 1.

Obr. 4 a 5 ukazují vliv anti-G17(1-9)-DT imunizace na medián konečné hmotnosti nádorů od BDIX krys, kterým byly implantovány DHDK12 nádorové buňky do svaloviny břišní stěny. Tento způsob implantace vede ke vzniku dobře vaskularizovaných nádorů vhodných pro léčbu podávanou do cirkulace (Watson,Giant. 4 and 5 show the effect of anti-G17 (1-9) -DT immunization on the median final weight of tumors from BDIX rats implanted with DHDK12 tumor cells into the abdominal wall muscle. This method of implantation leads to the formation of well vascularized tumors suitable for circulation therapy (Watson,

1996). Již dříve bylo prokázáno, že krysí anti-G17(1-9)-DT snižuje konečnou hmotnost DHDK12 nádorů o 56,5%, je-li podán v dávce 500 gg/ml (Watson, 1996) . V těchto pokusech prováděných za účelem detekce jakéhokoliv přínosu kombinované terapie s 5FU/leukovorinem byla dávka anti-G17(1-9)-DT snížena na 200 μg/ml, což vedlo ke významné inhibici nádorového růstu o 25,7%, jak je uvedeno na obr. 4. Obr. 4 ukazuje data pro nádory excidované od neléčených kontrolních krys, krys imunizovaných anti-G17(1-9)-DT a krys imunizovaných DT. Po 50 dnech měly neléčené krysy nádory s mediánem hmotnosti 4,43 g. Krysy imunizované DT měly medián hmotnosti nádorů 4,7 g, což není statisticky významně odlišné od hmotností nádorů neléčených krys, ale což je významně vyšší než medián hmotnosti nádorů od krys imunizovaných anti-G17(1-9)-DT (3,49 g, p=0,034, Mann Whitney).1996). Rat anti-G17 (1-9) -DT has been shown to reduce the final weight of DHDK12 tumors by 56.5% when administered at a dose of 500 gg / ml (Watson, 1996). In these experiments conducted to detect any benefit of combination therapy with 5FU / leukovorin, the anti-G17 (1-9) -DT dose was reduced to 200 µg / ml, resulting in a significant inhibition of tumor growth of 25.7% as shown. FIG. 4 shows data for tumors excised from untreated control rats, rats immunized with anti-G17 (1-9) -DT, and rats immunized with DT. After 50 days, untreated rats had tumors with a median weight of 4.43 g. DT immunized rats had a median tumor weight of 4.7 g, which is not statistically significantly different from the tumor weights of untreated rats, but significantly higher than the median tumor weight of the immunized rats. anti-G17 (1-9) -DT (3.49 g, p = 0.034, Mann Whitney).

·· ·· ♦ · · · • · · « • · · · • * · ··· ·· ♦ · · · · · · · · · ·

Obr. 5 ukazuje, že 5-FU/leukovorin samostatně, podané v dávce 30 mg/kg, významně snižují medián hmotnosti nádorů na 1,01 g (p=0,0106 ve srovnání s neléčenými kontrolními krysami). Když byly krysy léčeny stejnou cytotoxickou dávkou 5-FU/leukovorinu společně s imunizací DT, nebyl medián hmotnosti nádorů významně odlišný (0,945 g).Giant. 5 shows that 5-FU / leukovorin alone, administered at 30 mg / kg, significantly reduced the median tumor weight to 1.01 g (p = 0.0106 compared to untreated control rats). When rats were treated with the same cytotoxic dose of 5-FU / leukovorin together with immunization with DT, the median tumor weight was not significantly different (0.945 g).

Kombinace 5-FU/leukovorinu (30 mg/kg) a imunizace krysím anti-G17(1-9)-DT vedla k mediánu hmotnosti nádorů 0,68 g, což není statisticky významně odlišné od skupiny léčené 5FU/leukovorinem/DT (p=0,27). Kombinace 5-FU/leukovorinu (25 mg/kg) a imunizace DT vedla k mediánu hmotnosti nádorů 0,96 g, oproti mediánu hmotnosti nádorů 0,68 ve skupině léčené imunizací anti-G17(1-9)-DT v kombinaci s 5-FU/leukovorinem, což není statisticky významně odlišné (p=0,409). Když byla dávka 5-FU/leukovorinu snížena na 20 mg/kg, tak vedla kombinace 5-FU/leukovorinu/DT k mediánu hmotnosti nádorů 1,23 g. Medián hmotnosti nádorů byl významně snížen na 0,71 g při kombinování 20 mg/kg 5-FU/leukovorinu s anti-G17(1-9)-DT imunizací (p=0,027, Mann Whitney).The combination of 5-FU / leukovorin (30 mg / kg) and immunization with rat anti-G17 (1-9) -DT resulted in a median tumor weight of 0.68 g, which is not statistically significantly different from the 5FU / leukovorin / DT treatment group (p). = 0.27). The combination of 5-FU / leukovorin (25 mg / kg) and DT immunization resulted in a median tumor weight of 0.96 g, compared to a median tumor weight of 0.68 in the anti-G17 (1-9) -DT immunization group in combination with 5 -FU / leukovorin, which is not statistically significantly different (p = 0.409). When the 5-FU / leukovorin dose was reduced to 20 mg / kg, the 5-FU / leukovorin / DT combination resulted in a median tumor weight of 1.23 g. The median tumor weight was significantly reduced to 0.71 g when combined with 20 mg / kg. kg of 5-FU / leukovorin with anti-G17 (1-9) -DT immunization (p = 0.027, Mann Whitney).

Obr. 5 nakonec ukazuje, že dávka 12,5 mg/kg 5FU/leukovorinu v kombinaci s anti-G17(1-9)-DT imunizací (p=0,015, Mann Whitney) snižuje medián hmotnosti nádorů z 1,34 na 0,41 g. Byly srovnávány kombinace 5-FU/leukovorin/DT a nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly mezi antiG17(l-9)-DT podaným v kombinaci s 12,5, 20 nebo 30 mg/kg 5FU/leukovorinu.Giant. 5 finally shows that the 12.5 mg / kg dose of 5FU / leukovorin in combination with anti-G17 (1-9) -DT immunization (p = 0.015, Mann Whitney) reduces the median tumor weight from 1.34 to 0.41 g The 5-FU / leukovorin / DT combinations were compared and no statistically significant differences were found between antiG17 (1-9) -DT given in combination with 12.5, 20 or 30 mg / kg 5FU / leukovorin.

Vzhledem k omezenému přínosu kombinované chemoterapie 5FU/leukovorinem jak u pokročilých stavů, tak při adjuvantním podání (Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993;Due to the limited benefit of combined 5FU / leukovorin chemotherapy in both advanced and adjuvant administration (Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993;

Petrioli, 1995) by měly být nové terapeutické modality podány buď společně s 5-FU/leukovorinem pro zvýšení terapeutickéhoPetrioli, 1995), new therapeutic modalities should be administered with either 5-FU / leukovorin to enhance therapeutic

indexu (a snad sníženi dávek chemoterapeutických činidel pro omezení toxicity), nebo jako druhá linie léčby po selhání chemoterapie. Takové nové léčebné modality musí být vhodné pro takové použití. Imunoterapie v kombinaci s chemoterapií se dříve považovala za problematickou z důvodu myelosuprese spojené s podáním chemoterapeutických činidel, jako je například 5-FU/leukovorin (Mahood, 1991). V předkládaných studiích však myelosuprese u krys indukovaná kombinací 5FU/leukovorinu (30 mg/kg), podanou podle Asao et al. v maximálních tolerovaných dávkách, neovlivňovala titry a časy vzniku protilátek proti krysímu G17:DT po imunizaci antiG17(l-9)-DT imunogenem.index (and perhaps reduced doses of chemotherapeutic agents to reduce toxicity), or as a second line treatment after chemotherapy failure. Such new therapeutic modalities must be suitable for such use. Immunotherapy in combination with chemotherapy was previously considered problematic due to myelosuppression associated with the administration of chemotherapeutic agents such as 5-FU / leukovorin (Mahood, 1991). However, in the present studies, myelosuppression in rats induced by the 5FU / leukovorin (30 mg / kg) combination, administered by Asao et al. at the maximum tolerated doses, did not affect titers and times of antibody formation to rat G17: DT after immunization with antiG17 (1-9) -DT immunogen.

Ve studiích terapie 5-FU/leukovorinem v kombinaci s antiG17(l-9)-DT bylo dosaženo potenciace dávek 20 mg/kg a 12,5 mg/kg. Dávka 20 mg/kg byla při kombinaci s anti-G17(1-9)-DT stejně účinná jako maximální tolerovaná dávka a dávka 12,5 mg/kg vykazovala trend k vyššímu terapeutickému účinku.In 5-FU / leukovorin therapy studies in combination with antiG17 (1-9) -DT, potentiation of doses of 20 mg / kg and 12.5 mg / kg was achieved. The 20 mg / kg dose when combined with anti-G17 (1-9) -DT was as effective as the maximum tolerated dose and the 12.5 mg / kg dose showed a trend towards a higher therapeutic effect.

Příčina tohoto trendu není známá, ale může jí být to, že tato dávka cytostatika působí na imunitní systém méně než vyšší dávky, což může přispět k celkové zánětlivé reakci na nádor. 5-FU/leukovorin podané podaný v kontinuálních cyklech vykazuje efekt všechno nebo nic na nádorový růst, protože snížení dávky na 1 mg/kg nezpůsobuje žádnou inhibici růstu. Terapeutický efekt může být titrován postupněji snížením počtu toxických cyklů (Watson, osobní sdělení). Proto mohou být v kombinační terapii podle předkládaného vynálezu podány nižší než obvyklé dávky 5-FU/leukovorinu, což sníží nežádoucí účinky léku, za současného dosažení účinného usmrcování nádorových buněk, protože imunitní systém je při takové léčbě minimálně narušen. Tak je zesílen inhibiční efekt imunizace anti-G17(l9)-DT na růst. Tyto charakteristiky kombinované terapie jsou neočekávané z hlediska myelosupresivních účinků chemoterapeutických činidel.The cause of this trend is unknown, but it may be that this dose of the cytostatic acts on the immune system less than the higher doses, which may contribute to the overall inflammatory response to the tumor. 5-FU / leukovorin administered in continuous cycles shows an effect of all or nothing on tumor growth, since reducing the dose to 1 mg / kg does not cause any growth inhibition. The therapeutic effect may be titrated more gradually by reducing the number of toxic cycles (Watson, personal note). Therefore, lower than usual doses of 5-FU / leukovorin may be administered in the combination therapy of the present invention, which will reduce adverse drug effects while achieving effective killing of the tumor cells since the immune system is minimally impaired in such treatment. Thus, the inhibitory effect of anti-G17 (19) -DT immunization on growth is enhanced. These characteristics of the combination therapy are unexpected in view of the myelosuppressive effects of the chemotherapeutic agents.

Dále, z důvodu nepřítomnosti nežádoucích účinků pro pacienta je imunizace anti-G17(1-9)-DT pravděpodobně dlouhodobou léčbou, jak je doloženo dobou, po kterou byly po jediné imunizaci přítomny protilátky u krys. První imunizace byla účinná z 80%, z hlediska indukce anti-gastrinových protilátek, a druhá imunizace byla účinná ve 100% s okamžitým vzestupem titrů protilátek. Ačkoliv může být potenciace chemoterapie provedena jedinou injekcí anti-G17(1-9)-DT, u většiny pacientů za nepřítomnosti nežádoucích účinků, naznačuje charakter anti-G17(1-9)-DT imunizace a rychlost odpovědi po dosycovací dávce, že je vhodný režim více dávek. I přes dobu, po kterou zůstávají anti-krysí-G17 protilátky v cirkulaci se zdá, že nemají škodlivé účinky na GI trakt, jak bylo hodnoceno jednoduchým histologickým vyšetřením. Dále, index proliferace buněk krypt sliznice v tlustém střevu neukázal významný vliv na jejich růst.Furthermore, due to the absence of adverse events for the patient, immunization with anti-G17 (1-9) -DT is likely to be a long-term treatment, as evidenced by the time during which antibodies were present in rats after a single immunization. The first immunization was 80% effective in terms of induction of anti-gastrin antibodies, and the second immunization was 100% effective with an immediate increase in antibody titers. Although potentiation of chemotherapy can be done with a single injection of anti-G17 (1-9) -DT, in the majority of patients in the absence of adverse reactions, the nature of anti-G17 (1-9) -DT immunization and the rate of response after a saturation dose suggest that it is appropriate multidose regimen. Despite the time that anti-rat-G17 antibodies remain circulating, they do not appear to have deleterious effects on the GI tract, as assessed by simple histological examination. Furthermore, the proliferation index of mucosal crypt cells in the colon did not show a significant effect on their growth.

Příklad 6: Léčba lidských pacientů s nádorem tlustého střeva kombinací 5-FU/leukovorinu a anti-G17(1-9)-DTExample 6: Treatment of human colon cancer patients with a combination of 5-FU / leukovorin and anti-G17 (1-9) -DT

Již dříve bylo uvedeno, že imunizace anti-G17(1-9)-DT samotná je hodnotnou a bezpečnou terapeutickou volbou pro léčbu nádorů závislých na gastrinu. Kombinace anti-G17 imunogenu a 5-FU/leukovorinu podle předkládaného vynálezu zvyšuje účinnost protinádorové léčby, zejména při léčbě karcinomu tlustého střeva, a patrně redukuje dávky chemoterapeutických činidel v kombinaci, což snižuje nežádoucí účinky cytostatické léčby jakéhokoliv z chemoterapeutických činidel, které jsou v současnosti používány. Kombinace imunogenu s chemoterapeutickými činidly podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako druhá linie terapie u pacientů, kteří nereagují na chemoterapii samotnou.It has previously been reported that immunization with anti-G17 (1-9) -DT alone is a valuable and safe therapeutic option for the treatment of gastrin-dependent tumors. The combination of the anti-G17 immunogen and 5-FU / leukovorin of the present invention increases the efficacy of antitumor therapy, particularly in the treatment of colon cancer, and presumably reduces the doses of the chemotherapeutic agents in combination, reducing the adverse effects of cytostatic treatment of any of the chemotherapeutic agents currently used. Combinations of the immunogen with the chemotherapeutic agents of the present invention can also be used as a second line of therapy in patients who do not respond to chemotherapy alone.

• ·» * »· · 0 · · • ··♦ 0 • 0 ♦ 0 · • · · * ··· 0· ··· *• 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0 · 0

Kolorektální nádory u člověka nebo pacienti s nádory tlustého střeva jsou léčeni kombinací chemoterapie a imunoterapie.Colorectal tumors in humans or patients with colon tumors are treated with a combination of chemotherapy and immunotherapy.

Přesněji, pacienti s kolorektálními karcinomy reagujícími na gastrin nebo s karcinomy tlustého střeva mohou být léčeni současným podáním 5-FU/leukovorinu a anti-Gl7 imunogenního prostředku nebo anti-G17 protilátek.More specifically, patients with gastrin-responsive colorectal cancers or colon cancers may be treated by co-administration of 5-FU / leukovorin and an anti-Gl7 immunogenic composition or anti-G17 antibodies.

Konkrétně, výhodná imunoterapie poskytuje imunogenní prostředek obsahující aminoterminální G17(1-9):DT konjugát ve farmaceuticky přijatelném nosiči, který může obsahovat adjuvans pro další stimulaci imunitní odpovědi.In particular, preferred immunotherapy provides an immunogenic composition comprising an amino-terminal G17 (1-9): DT conjugate in a pharmaceutically acceptable carrier, which may contain an adjuvant to further stimulate the immune response.

Výhodný imunoterapeutický režim může začít před, během nebo po chemoterapii, v závislosti na klinických okolnostech. Například, pro pacienta s objemným nádorem může být výhodné začít léčbu několika cykly chemoterapie pro zmenšení objemu nádoru a potom zahájit imunoterapii.The preferred immunotherapeutic regimen may begin before, during, or after chemotherapy, depending on the clinical circumstances. For example, for a patient with a bulky tumor, it may be advantageous to start treatment with several cycles of chemotherapy to reduce the volume of the tumor and then initiate immunotherapy.

Alternativně, u pacienta s malým nádorem nebo po kurativním chirurgickém zákroku může být imunoterapie zahájena před nebo během chemoterapie.Alternatively, in a patient with a small tumor or after curative surgery, immunotherapy may be initiated before or during chemotherapy.

Dávky při aktivní imunizaci mohou být v rozsahu mezi 300 gg a 1200 gg anti-G17 imunogenu, podle stavu imunity pacienta (nebo kapacity imunitní odpovědi). Injekce mohou být podány ve dny 1, 7 a 14 nebo 1, 14 a 21 nebo 1, 14 a 28 a 56. Všechny protokoly podání vedou k dosažení podobných titrů protilátek. Akcelerované protokoly imunizace snad umožní časnější nástup imunitní odpovědi.The doses for active immunization may range between 300 gg and 1200 gg of the anti-G17 immunogen, depending on the patient's immune status (or immune response capacity). Injections may be given on days 1, 7 and 14 or 1, 14 and 21 or 1, 14 and 28 and 56. All administration protocols result in similar antibody titers. Accelerated immunization protocols will perhaps allow an earlier onset of the immune response.

• ·• ·

Ve výhodném způsobu anti-gastrinové terapie jsou dosycovací dávky podávány každých 6 měsíců po počáteční imunizaci, bez ohledu na použitý protokol.In a preferred method of anti-gastrin therapy, feed doses are administered every 6 months after the initial immunization, regardless of the protocol used.

Ještě jinou výhodnou metodou pro účinnou neutralizaci G17, GlyG17 a G17-HN2 je pasivní imunizace anti-G17 protilátkami, výhodně v přečištěné formě. Přesněji, 10-1000 μg anti-G17(1-9) protilátek je podáno před, během a/nebo po cyklech chemoterapie, za účelem kontroly gastrinové aktivity. Pasovní imunizace může být podávána denně, jednou týdně nebo jednou za dva týdny. Mohou být použity jiné protokoly, podle účinnosti léčby.Yet another preferred method for effectively neutralizing G17, GlyG17 and G17-HN2 is passive immunization with anti-G17 antibodies, preferably in purified form. Specifically, 10-1000 µg of anti-G17 (1-9) antibodies are administered before, during and / or after chemotherapy cycles to control gastrin activity. Passive immunization can be given daily, once a week or once every two weeks. Other protocols may be used, depending on the effectiveness of the treatment.

Další terapeutickou kombinací je počáteční pasivní imunizace před a/nebo během prvního cyklu chemoterapie, po které následuje aktivní imunizace popsaná výše.Another therapeutic combination is an initial passive immunization before and / or during the first cycle of chemotherapy, followed by the active immunization described above.

Používá se mnoho chemoterapeutických režimů. Tyto známé režimy, ačkoliv zde nejsou uvedeny, nejsou vyloučeny z kombinované léčby podle předkládaného vynálezu. Jedním výhodným chemoterapeutickým režimem je bolusová i.v. dávka 425 mg/m 5-FU s i.v. infusí leukovorinu (kyseliny listové, FA, 20 2 mg/m ) ve dny 1-5 s opakováním za 4 týdny.Many chemotherapeutic regimens are used. These known regimens, although not mentioned herein, are not excluded from the combination therapy of the present invention. One preferred chemotherapeutic regimen is bolus i.v. dose 425 mg / m 5-FU with i.v. infusion of leucovorin (folic acid, FA, 20 2 mg / m) on days 1-5 with a repeat of 4 weeks.

Jiným výhodným režimem je 200 mgm² FA během 2 hodin a potom 5-FU i. v. bolusovou dávkou 4 00 mg/m² + 5-FU 600 mg/m² během 22 hodin ve dny 1 a 2, s opakováním za 2 týdny.Another preferred regimen is 200 mgm ² FA over 2 hours and then a 5-FU iv bolus dose of 400 mg / m ² + 5-FU 600 mg / m ² over 22 hours on days 1 and 2, with a repeat of 2 weeks.

Ještě jiným výhodným režimem je kontinuální i.v infuse 5-FU (250-300 mg/m ) po dobu 4-6 týdnů, po kterých následuje 2týdenní pauza.Yet another preferred regimen is a continuous i.v. infusion of 5-FU (250-300 mg / m 2) for 4-6 weeks followed by a 2-week pause.

• ·• ·

9999

Odkazy:Links:

ASAO T, TAKAYUKI A, SHIBATA HR, BATIST G and BRODT P. Eradication of Hepatic Metastases of Carcinoma H-59 combination chemoimmunotherapy with Liposomal Muramyl Tripeptide, 5-Fluorouracil, and Leucovorin. Cancer Research 52: 6254-6257, 1992 BALD WIN G. Binding of the progastrin fřagments to the 78kDa gastrin-binding protein. FEBS Ze// 1995; 359: 97-100.ASAO T, TAKAYUKI A, SHIBATA HR, BATIST G, and BRODT P. Eradication of Hepatic Metastases of Carcinoma H-59 Combination Chemoimmunotherapy with Liposomal Muramyl Tripeptide, 5-Fluorouracil, and Leucovorin. Cancer Research 52: 6254-6257, 1992 BALD WIN G. Binding of progastrin proteins to the 78kDa gastrin-binding protein. FEBS Ze // 1995; 359: 97-100.

ERLICHMAN C, FINE S, WONG A, ELHAKEIM T. A randomized trial of fluorouracil and folinic acid in patients with metastatic CRC. J Clin Oncol 1988; 6: 496-475.ERLICHMAN C, FINE S, WONG A, ELHAKEIM T. A randomized trial of fluorouracil and folinic acid in patients with metastatic CRC. J Clin Oncol 1988; 6: 496-475.

MAHOOD DJ, DOSE AM, LOPNIZ CC. Inhibition of Fluorouracil stomatitis by oral cryotherapy. J Clin Oncol 1991; 9: 449-452.MAHOOD DJ, DOSE AM, LOPNIZ CC. Inhibition of Fluorouracil stomatitis by oral cryotherapy. J Clin Oncol 1991; 9: 449-452.

MAKISHEMLA R, LARKIN D, MICHAELI D, GAGINELLA TS. Active immunization against gastrin-17 with an N-terminal derived immunogen inhibits gastrin and duodenal lesions in rats. Gastroenterol 1995; 106: A824.MAKISHEMLA D, LARKIN D, MICHAELI D, GAGINELLA TS. Active immunization against gastrin-17 with N-terminal derived immunogen inhibits gastrin and duodenal lesions in rats. Gastroenterol 1995; 106: A824.

MARTIN F, CAIGNARD A, JEANNIN JF, LECLERC A, MARTIN M. Selection of trypsin of 2 sublines of rat colon cancer cells forming Progressive or regressive tumors. Int J Cancer 1983; 32: 623-627.MARTIN F, CAIGNARD A, JEANNIN JF, LECLERC A, MARTIN M. Selection of trypsin of 2 colon cancer cells forming Progressive or regressive tumors. Int J Cancer 1983; 32: 623-627.

MOERTEL GG. Chemotherapy CRC. NEJM1994; 330: 1136-1142.MOERTEL GG. Chemotherapy CRC. NEJM1994; 330: 1136-1142.

PETRIOLIR, LORENZIM, AQUINO A, MARSELI S, FREDIANIB, PALAZZUOLI V, MARZOCCA G. Treatment of advanced colorectal cancer with high-dose intensity folinic acid and 5-Fluorouracil plus supportive care. Eur J Cancer 1995; 31A: 2105-2108.PETRIOLIR, LORENZIM, AQUINO A, MARSELI S, FREDIANIB, PALAZZUOLI V, MARZOCCA G. Treatment of advanced colorectal cancer with high-dose intensity folinic acid and 5-Fluorouracil plus supportive care. Eur J Cancer 1995; 31A: 2105-2108.

PIETNELLIN, DOUGLAS HO, HARRAVA L . The modulation of Fluorouracil with leucovorin in metastatic CRC: a prospective randomized phase III trial. JClin Oncol 1989; 7: 1419-1426.PIETNELLIN, DOUGLAS HO, HARRAVA L. The modulation of Fluorouracil with leucovorin in metastatic CRC: a prospective randomized phase III trial. JClin Oncol 1989; 7: 1419-1426.

SCHEITHAUER W, KORNEK G, ROSEN H, SEBESTA C, MARCELL A, KWASNY W, KARALL M, DEPISCH D. Combined intraperitoneal plus intravenous chemotherapy after curative resection for colonic adenocarcinoma. Eur J Cancer 1995; 31A: 1981-1986.SCHEITHAUER W, KORNEK G, ROSEN H, SEBESTA C, MARCELL A, KWASNY W, KARALL M, DEPISCH D. Combined intraperitoneal plus intravenous chemotherapy after curative resection for colonic adenocarcinoma. Eur J Cancer 1995; 31A: 1981-1986.

SEVA C, DICKINSON CJ, SAWADA M, YAMADA T. Characterization of the glycineextended gastrin (G-gly) receptor on AR4-2J cells. Gastroenterol 1995; 108: A742.SEVA C, DICKINSON CJ, SAWADA M, and YAMADA T. Characterization of the glycineextended gastrin (G-gly) receptor on AR4-2J cells. Gastroenterol 1995; 108: A742.

TAYLOR, I. Chemotherapy, radiotherapy and immunology of colorectal neoplasia. Current opinion in Gastroenterology 1993; 9: 28-33TAYLOR, I. Chemotherapy, radiotherapy and immunology of colorectal neoplasia. Current Opinion in Gastroenterology 1993; 9: 28-33

WATSON SA and STEELE RJC. Gastrin receptors in gastrointestinal tumors. WG LandesWATSON SA and STEELE RJC. Gastrin receptors in gastrointestinal tumors. WG Landes

Company, Austin, USA, 1993.Company, Austin, USA, 1993.

• ··• ··

WATSON SA, MICHAELI D, GRIMES S, MORRIS T, ROBINSON G, VARRO A, JUSTINWATSON SA, MICHAELI D, GRIMES, MORRIS T, ROBINSON G, VARRO A, JUSTIN

TA, HARDCASTLE JD. Gastrimmune raises antibodies that neutralize amidated and glycineextended gastrin-17 and inhibit the growth of colon cancer. Cancer Res 1996; 56: 880-885.TA, HARDCASTLE JD. Gastrimmune raises antibodies that neutralize amidated and glycineextended gastrin-17 and inhibit the growth of colon cancer. Cancer Res 1996; 56: 880-885.

tf • tftf • * · • · • tf • tf tftf » · ♦ » • ♦ · ♦ • · · * • tftf · ♦ tf ·«tf tff tf tff tff tff tff tff tff

Seznam sekvencí <110> Apthon Corporation <120> Kombinovaná terapie pro léčbu nádorů <130> 1102865-0034 <140> US <141> 1999-05-14 <150> US 60/085687 <151> 1998-05-15 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Lidský nebo syntetický peptid <220>Sequence Listing <110> Apthon Corporation <120> Combination Therapy for Tumor Treatment <130> 1102865-0034 <140> US <141> 1999-05-14 <150> US 60/085687 <151> 1998-05-15 <160 > 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human or synthetic peptide <220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> kyselina pyroglutamová <400> 1<221> MOD_RES <222> (1) <223> Pyroglutamic acid <400> 1

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequences <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: Syntetický peptid <400> 2<223> Artificial sequence description: Synthetic peptide <400> 2

Ser Ser Pro Pro Pro Pro CysSer Ser Pro Pro Pro Cys

Claims

PATENT CLAIMS

A combination suitable for use in the treatment of a gastrin-dependent tumor comprising

(i) an immunogen directed against the growth of the tumor; and (ii) one or more chemotherapeutic agents for its treatment.

The combination of claim 1, wherein the immunogen comprises an immunogen comprising an anti-gastrin G17 peptide.

The combination according to claim 2 or 3, wherein the anti-gastrin G17 peptide is conjugated to a diphtheria toxoid carrier.

4. The combination of claim 2, wherein the immunogen comprising the anti-gastrin G17 peptide comprises the anti-gastrin G17 peptide, a protein carrier, and a spacer peptide suitable for detaching the anti-gastrin G17 peptide from the protein carrier and increasing its capacity for lymphocyte receptor binding.

The combination of claim 2, 3 or 4, wherein the anti-gastrin G17 peptide has the sequence of SEQ ID NO: 1.

The combination of any one of claims 2 to 5, wherein the chemotherapeutic agent or agents is selected from the group consisting of 5-fluorouracil, leucovorin, levamisole, cisplatin, tumor necrosis factor and proglumide.

······· · · ··· · ·

A combination according to any preceding claim, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.

The combination of any preceding claim for use in treating a gastrin-dependent tumor in a patient.

The combination of claim 6 comprising as chemotherapeutic agents 5-fluorouracil and leucovorin for use in the treatment of a gastrin-dependent colorectal tumor in a patient.

Use of a combination according to any one of claims 1 to 7 for the manufacture of a composition for use in the treatment of a gastrin-dependent tumor.