CZ121599A3 - Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu - Google Patents

Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu Download PDF

Info

Publication number
CZ121599A3
CZ121599A3 CZ991215A CZ121599A CZ121599A3 CZ 121599 A3 CZ121599 A3 CZ 121599A3 CZ 991215 A CZ991215 A CZ 991215A CZ 121599 A CZ121599 A CZ 121599A CZ 121599 A3 CZ121599 A3 CZ 121599A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
cell
molecule
single chain
antigen binding
Prior art date
Application number
CZ991215A
Other languages
English (en)
Inventor
Roland Dr. Kontermann
Hans-Harald Prof. Dr. Sedlacek
Rolf Prof. Dr. Müller
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26045416&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ121599(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE19816141A external-priority patent/DE19816141A1/de
Priority claimed from DE19827239A external-priority patent/DE19827239A1/de
Application filed by Aventis Pharma Deutschland Gmbh filed Critical Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Publication of CZ121599A3 publication Critical patent/CZ121599A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká jednořetězcové molekuly vázající různé antigeny s odlišnými variabilními doménami těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, které jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL, přičemž jsou spojeny po řadě dohromady prostřednictvím peptidu, a dále se týká přípravy této molekuly a jejího použití jako léčiva nebo diagnostického prostředku.
Dosavadní stav techniky
Protilátky s dvojí specifitou (dále v textu uváděny pro stručnost jako bispecifické protilátky), které rozpoznávají dva odlišné antigeny, například povrchový antigen nádorové buňky a efektorovou molekulu, jsou široce využívány v experimentální imunoterapii (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol., 12, 101-124, 1992, van de Winkel et al., Immunol.
Efektorová činnost prováděná
Today, 18, 562-564, 1997).
bispecifickými protilátkami vyskytují v těle přirozeně, vykonávají cytotoxické a komplementu, cytokiny a zahrnuje funkce, které se jako například ty, které fagocytární buňky, složky trombolytické a fibrinolytické enzymy, a také exogenní efektorové molekuly, jako jsou konvertující předléky injekce bispecifických například toxiny, enzymy a radionuklidy. Tak například protilátek proti antigenu CD30 spojenému s Hodgkinovým tumorem a antigenům CD3 a CD28 T buněk v případě nádorů transplantovaných formou xenotransplantátů vede k mobilizaci a stimulaci cytotoxických T buněk a k indukci tumoricidní aktivity (Renner et al., Science, 264, 833, 1994). V dalším postupu byla použita bispecifická protilátka proti CD30 a alkalické fosfatáze pro zavedení enzymu do místa nádoru, a tím byl přeměněn netoxický prekurzor léku na toxický lék (Sahin et al., Cancer Res., 50, 6944-6948, 1990).
Alternativou k injekci purifikované bispecifické protilátky je exprese a sekrece těchto bispecifických protilátek buňkami transfekovanými in vitro nebo in vivo. Výhoda této strategie je, že produkce bispecifických protilátek transdukovanými buňkami probíhá in vivo, a tedy není potřeba komplikované produkce a purifikace bispecifické protilátky před injekcí. Kromě toho je možné výběrem vhodných expresních systémů kontrolovat expresi bispecifické protilátky lokálně, v orgánech nebo tumoru, nebo systémově.
Bispecifické protilátky mohou být připraveny například chemickým zesítěním (Nisonoff et al., Nátuře, 194, 355, 1962) . Při chemickém zesítění molekul monoklonálních nebo polyklonálních protilátek zvířecího původu může dojít k inaktivaci značného rozsahu. Kromě toho, tvoří se jak heterodimery tak i homodimery. Homodimery se' musí oddělit od požadovaných heterodimerů komplikovaným procesem. Hybridomové buňky, které produkují bispecifické protilátky, nazývané hybridní hybrídomy, mohou být připraveny pouze relativně složitým způsobem, protože je nezbytné fúzovat dva odlišné hybridomy (Milstein et al., Nátuře, 305, 537, 1983). Podíl funkčních heterodimerů je relativně nízký, teoreticky pouze 10 %, protože těžké a lehké řetězce dvou protilátkových molekul se mohou spojit dohromady jakkoliv. Převážně používaný počáteční materiál zahrnuje myší monoklonální protilátky, které jsou imunogenní pro člověka.
- 3 • » ·· · ·
Různé bivalentní nebo bispecifické protilátkové molekuly mohou být také připraveny rekombinantně a exprimovány v bakteriích nebo eukaryotických buňkách (WO 93/06217). Pro všechny rekombinantní protilátkové molekuly je společné to, že pro jejich přípravu mohou být použity jak myší tak i lidské výchozí molekuly. Byly vyvinuty různé metody, které umožňují co nejúčinnější přípravu bispecifických rekombinantních protilátkových molekul. Použitím těchto metod mohou být připraveny různé skupiny molekul.
V jedné skupině molekul jsou variabilní části protilátek fúzovány s konstantními doménami imunoglobulinů (Fc, CH3, CL), aby se dosáhlo dimerizace (Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1994, Hayden et al., Ther. Immunol., 1, 3-15, 1994). V tomto případě ale není žádná selekce heterodimerických molekul, takže se tímto způsobem vytvoří převážně bivalentní homodimery. Exprese těchto molekul ve funkční formě je kromě toho omezena na eukaryotické buňky.
V další skupině molekul jsou variabilní části protilátek fúzovány k peptidovým nebo proteinovým doménám jiných proteinů, čímž se připraví bivalentní nebo bispecifické molekuly (Plúckthun a Pack, Immunotechnol., 3, 83-105, 1997). V tomto případě je také obvyklá tvorba homodimerů a heterodimerů náhodnou asociací. Kromě toho tyto molekuly obsahují podíl cizích sekvencí, který je v některých případech značný, takže lze očekávat výraznou imunogenicitu.
Ve třetí skupině molekul jsou použity slabé modifikace rekombinantních fragmentů Fv, zpravidla jednořetězcové fragmenty Fv (scFv), pro přípravu bivalentních nebo bispecifických molekul (Holliger a Winter, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 446-449, 1993). Ty zahrnují dimerizaci prostřednictvím dodatečně přidaných cysteinů na C-koncové části řetězců scFv (MacCartney et al., Protein Engin., 8, • · • · · · • · * · · · · • · ··· ···· • · · » · · 9 9 9 9
999 9999 9 999 999
9 9 9 9 9 9
301-314, 1994) . Ale to vede ke vzniku jak homodimerů tak heterodimerů a při expresi v bakteriálních buňkách se tvoří nefunkční agregáty. Tandemové molekuly scFv se strukturou scFv(A)-spojka-scFv(B) (Mallender a Voss, J. Biol. Chem., 269, 199-206, 1994) mohou být exprimovány jak v bakteriích, tak v eukaryotických buňkách. Avšak v některých případech se mohou také objevit nefunkční spojení těchto čtyř variabilních domén.
Technologie rekombinantních protilátek vedla v posledních letech k vývoji nových malých, bivalentních nebo bispecifických protilátkových fragmentů. Příklady molekul tohoto typu jsou „diabodies (protože neexistuje český ekvivalent, bude v textu nadále užíván původní termín) (Holliger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448,
1993). Tyto diabodies obsahují variabilní domény VH a VL imunoglobulinů, které jsou spojeny velmi krátkou spojkou.· Tato spojka je příliš malá na to, aby vyvolala asociaci VH a VL domén řetězce, jak se stává u jednořetězcových fragmentů Fv. To znamená, že VH a VL domény dvou řetězců asociují a vytvářejí dimery, takže se tvoří molekuly se dvěma vazebnými místy (Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226,
1994:
Bispecifické „diabodies jsou tvořeny expresí dvou řetězců se
VH(B)-VL(A) v jedné strukturou VH(A)-VL(B) tomto případě VL znamená variabilní (V) doménu (L) řetězce a VH znamená variabilní doménu (V) H) řetězce imunoglobulinu, tyto variabilní domény vážou antigen (A) nebo (B) . Spojení částí VH s částmi VL tvoří heterodimerické fragmenty s funkčně aktivními vazebnými místy. Bakteriálně exprimované bispecifické „diabodies již byly úspěšně použity pro zavedení různých efektorových molekul, imunoglobulinů, Clq nebo enzymů nebo efektorových buněk, jako jsou například cytotoxické T lymfocyty • · · · · · • · • · · · · · ···· ·· · ···· · · · · • · · · · · ···· 9 999 999
9 9 9 9 9 · · • 9 9 9 9 9 99 9 9
- 5 (Kontermann et al., Nátuře Biotechnol., 15, 629, 1997,
Holliger et al., Protein Engin., 9, 299, 1996, Nátuře
Biotechnol., 15, 632, 1997, Zhu et al., BioTechnol., 14, 192, 1996, FitzGerald et al., Protein Engin., 10, 1221, 1997,
Krebs et al., J. Biol. Chem., 273, 2858, 1998).
Avšak „diabodies mají také nevýhody, a sice následuj ící:
Protože dva řetězce VH(A)-VL(B) a VH(B)-VL(A) nejsou již nadále fyzicky spojeny, mohou se rovným dílem tvořit homodimery a heterodimery, tudíž pro získání heterodimerů je nezbytný velmi komplikovaný purifikační proces. Kromě toho se vyskytuje disociace dimerů, jak již bylo prokázáno pro fragmenty scFv (Glockshuber et al., Biochem., 29, 1362-1367,
1990) . Aby se vyřešil tento problém, byly vyvinuty „diabodies stabilizované disulfidem (FitzGerald et al., Protein Engin., 10, 1221-1225, 1997) nebo „diabodies nazývané „klíč v zámku (Zhu et al., Protein Sci., 6, 781-788, 1997). Ale jejich příprava je značně složitá. Kromě toho exprese bispecifických „diabodies metodami genetického inženýrství vyžaduje signální sekvenci a ribozomální vazebné místo pro každý řetězec, což je velmi komplikované. Navíc je možné, že se variabilní domény exprimují v neekvimolárním množství, což zvyšuje podíl nefunkčních homodimerů.
Cílem předkládaného vynálezu bylo proto nalézt molekuly vázající několik antigenu, které nemají výše uvedené nevýhody takzvaných „diabodies a které mohu být jednoduše připraveny v převážně homogenní formě.
• · · ·
- 6 Podstata vynálezu
Prvním aspektem předkládaného vynálezu je jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, která obsahuje následující složky:
a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) s první specifitou (A) a její funkční části,
b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) s druhou specifitou (B) a její funkční části,
c) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) se specifitou (B) a její funkční části, a
d) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) se specifitou (A) a její funkční části, kde VH a VL domény jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL nebo konstruktu VL-VH a dva konstrukty VH-VL jsou spojeny prostřednictvím peptidu (P).
V-dalším-provedení molekula podle vynálezu obsahuje více než dva uvedené konstrukty VH-VL (např. VH(B)-peptid-VL(B)). To umožňuje získat molekuly, které obsahují několik specifit (A) , (Β) , (C) apod.
Ve výhodném provedení jsou jednotlivé konstrukty VH-VL spojeny prostřednictvím svých variabilních domén s toutéž specifitou. Obzvláště výhodná struktura molekuly podle vynálezu je zobrazena na obr. 1.
V dalším výhodném provedení jsou jednotlivé specifity v podstatě identické. Termín „v podstatě identické znamená podle předkládaného vynálezu, že je velmi dobře možné, aby se domény lišily v molekulové struktuře, ale podržely si svou specifitu, tj. specifickou vazbu antigenu. Výsledek toho je, že molekula podle vynálezu nemusí obsahovat pouze kompletní variabilní doménu těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu, ale může také obsahovat jejich funkční části, tj. části, které si podržely své vlastnosti pro specifickou ······ ·· · flfl ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · flflflfl • · · · · · ···· fl flflfl flfl* • flfl flflfl · · • flfl flfl · flflflfl
- 7 vazbu antigenu. Například do rámce předkládaného vynálezu spadají také umělé konstrukty složené z jednotlivých částí CDR („complementary determining regions - oblasti určující komplementaritu) variabilních domén imunoglobulinu (Jones, P.T. et al., Nátuře, 321, 522, 1986, Riechmann, L. et al.,
Nátuře, 332, 323, 1988, Verhoyen, M. et al., Science, 239, 1534, 1988) .
Ve výhodném provedení jsou domény VH a VL spojeny prostřednictvím peptidového linkeru-spojky (L) ve formě konstruktu VH-L-VL nebo konstruktu VL-L-VH. Spojka by v tomto případě obecně měla být co nej kratší, výhodně je spojka dlouhá přibližně 1 až 20 aminokyselin, nejlépe přibližně 1 až 5 aminokyselin. Obzvláště výhodná spojka má sekvencí GGGGS.
Na rozdíl od spojky (L) může mít spojovací peptid (P) jakoukoliv vhodnou délku. Ale výhodně-- obsahuje peptid (P) přibližně 12 až 40 aminokyselin, nejlépe-. přibližně 12 až 20 aminokyselin, zejména 14 aminokyselin. Obzvláště výhodný peptid (P) obsahuje aminokyselinovou sekvenci GGGGSGGRASGGGS nebo GGGGSGGRASGGGGS, a je především peptidem (P) skládajícím se z uvedené aminokyselinové sekvence.
V dalším výhodném provedení obsahuje molekula podle vynálezu jako další složku efektor (E) . Tento efektor může být k molekule podle vynálezu připojen přímo, nebo kde je to vhodné, prostřednictvím konektoru (B) . Je zejména výhodné, aby konektor obsahoval proteázovou štěpnou sekvenci, výhodně štěpnou sekvenci PSA (prostatický specifický antigen) , katepsinu, plazminogenu a/nebo aktivátoru plazminogenu.
Proteázová štěpná sekvence je obzvláště výhodná, protože umožňuje oddělit efektor od molekuly podle vynálezu použitím proteázy. Separace je výhodná zejména když je aktivita efektoru inhibována kvůli tomu, že je efektor navázán přímo
- 8 • · · · · 4 • · 4 • · · • · · nebo nepřímo prostřednictvím konektoru k molekule podle vynálezu.
Protože proteázy se vyskytují zejména v oblastech zánětu nebo v tumorech, efektory, které jsou výhodně inaktivovány kvůli své vazbě k molekule podle vynálezu prostřednictvím štěpné sekvence, se zde lokálně rozsáhle uvolňují. Kromě toho je možné výběrem vhodných cílových struktur pro molekulu podle vynálezu, například která má specifitu pro antigeny na nádorových buňkách, jako jsou například lymfocyty nebo makrofágy, aby se například· dosáhla akumulace molekuly podle vynálezu s efektorem v oblasti zánětu nebo tumoru.
Podle předkládaného vynálezu je také možné, že na molekulu podle vynálezu může být navázáno přímo nebo nepřímo několik efektorů.
Proteázy nebo relevantní štěpné sekvence jsou detailně popsány například v patentové přihlášce DE1970430.1.
Jeden příklad výhodné molekuly podle vynálezu, která má efektor navázaný prostřednictvím konektoru k molekule, je schematicky zobrazen na obr. 2.
Výběr jednotlivých složek molekuly podle vynálezu obecně závisí na oblasti aplikace.
Jestliže má být molekula podle vynálezu použita jako diagnostický prostředek, pak, například v dalším provedení, je první specifita (A) namířena proti molekule, která má být analyzována, a druhá specifita (B) přímo nebo nepřímo proti analytu. Analyt může být například radioaktivní molekula, fluorescenční molekula nebo enzym, který konvertuje svou enzymatickou aktivitou prekurzor analytu do aktivního analytu.
V dalším výhodném provedení je první specifita (A) namířena proti molekule, která má být analyzována, druhá specifita (B) proti další molekule, která má být analyzována • · φ · φ φ
- 9 a efektor (E) je analyt, například radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym, jak již bylo detailněji vysvětleno výše.
Molekula podle vynálezu může být ale použita také jako ligand pro specifickou vazbu virového nebo nevirového vektoru k cílové buňce. Ve výhodném provedeni může být molekula podle vynálezu použita jako takzvaný multifunkční ligand. Pro tento účel je výhodné, jestliže peptid (P) a/nebo efektor (E) obsahuje fúzogenní peptid. Multifunkční ligand slouží pro přenos nukleotidových sekvencí specifický pro cílovou buňku a je to obecně protein, který obsahuje ligand specifický pro cílovou buňku, ligand specifický pro genový konstrukt a fúzogenní peptid. Multifunkční ligandy tohoto typu mohou být použity pro specifickou vazbu genových konstruktů, tj . konstruktů nukleových kyselin, k cílové buňce, přičemž fúzogenní peptid umožňuje konstruktu nukleové kyseliny proniknout přes buněčnou membránu do buněčného jádra a být také uvolněn z endozomu.
Při použití molekuly podle vynálezu jako ligandu pro vektor .nebo jako multifunkčního ligandu je výhodné, aby první specifita (A) byla namířena proti cílové buňce a druhá specifita (B) proti vektoru. Vektor je obecně nukleová kyselina, kationtový peptid nebo protein, kationtový lipid, kationtový peptid nebo kationtový porfyrin. V konkrétním provedení tohoto vynálezu je vektor virový vektor pocházející například z adenovirů (AdV) , virů přidružených k adenovirům (AAV), viru vakcinie, RSV, HSV, viru chřipky nebo lentiviru.
Příklady ligandů specifických pro cílovou buňku, membránových struktur na cílové buňce, ligandů specifických pro cílovou buňku a ligandů specifických pro genový konstrukt, které jsou odvozeny z imunoglobulinů, tj. obsahují •· ··»· ·· 9 nádorovým proteinům domény VH a VL, a také peptidů s fúzogenními vlastnostmi, jsou popsány detailně v patentové přihlášce DE19649645.4.
Molekula podle vynálezu je také vhodná pro profylaxi a/nebo jako léčebný přípravek.
Pro tyto účely je například první specifita (A) namířena proti buněčné membráně, jako například proti lymfocytům, makrofágům, monocytům, granulocytům, hematopoetickým buňkám, endoteiovým buňkám, buňkám hladkého svalstva, buňkám příčně pruhovaného svalstva, epitelovým buňkám, jaterním buňkám, buňkám ledvin, glíovým buňkám, buňkám podpůrných tkání, leukemickým buňkám, nebo proti hmoty, komplementového systému, koagulačního systému, kininového systému, krevní plazmy, podpůrné tkáně, nebo proti cytokinům či chemokinům, nebo proti endogenním či exogenním toxinům, nebo proti léčivům, jako je například digitalis, a/nebo proti patogenům, jako buňkám nebo mezibuněčné jsou například bakteriální, patogeny.
Druhá specifita (B) může virové a/nebo parazitární být například namířena proti buněčné membráně, například lymfocytů, makrofágů, monocytů nebo granulocytů s tím cílem, že její navázání na cílovou strukturu může zde vést k cytotoxickým, imunomodulačním nebo zánětlívým procesům.
Může být také namířena proti cytokinům, chemokinům nebo růstovým faktorům s takovým cílem, že její navázání na cílovou strukturu může indukovat ímunomodulační nebo proliferační procesy. Může být také namířena proti proteinům komplementového systému, které iniciují, zesilují nebo inhibuji jeho aktivaci. Navázání proteinu tohoto typu na cílovou strukturu může zde, v závislosti na výběru proteinu, indukovat zánětlivou a cytolytickou nebo protizánětlivou a cytoprotektivní reakci. Může být' také namířena proti • · ····
- 11 struktuře, hormonům, proti proti proteinům koagulačního systému, které iniciují, zesilují nebo inhibují jeho aktivaci. Navázání proteinu tohoto typu na cílovou strukturu může zde, v závislosti na výběru proteinu, vyvolat nebo zamezit trombóze. Může být dále namířena proti f ibrinolytickým. proteinům, které vedou k rozpuštění fibrinové sraženiny v cílové struktuře, proti enzymům, které jsou schopné konvertovat inaktivní prekurzor léčiva na aktivní například cytotoxický lék na cílové peptidovým hormonům nebo steroidním konstantní části imunoglobulinu, proti mediátoru, jako je například histamin, serotonin, leukotrien, prostacyklin nebo kinin, proti patogenům jako např. bakteriálním, virovým a/nebo parazitárním patogenům, nebo proti nádorovým buňkám.
Cytokiny jako cílové struktury nebo monocyty, makrofágy a/nebo lymfocyty jako cílové struktury mohou být obsazeny molekulou podle vynálezu s infekčními _ nebo nádorovými antigeny, a tím vyvolat ín vivo- zesílenou imunitní odpověď proti antigenů. V tomto spojení je výhodné přidat k molekule podle vynálezu konkrétní antigen patogenu nebo tumoru a tam, kde je to vodné, také cytokin, a podávat nebo injikovat lokálně navázaný a obsazený komplex.
Druhá specifita (B) může být také namířena proti endogenním nebo exogenním toxinům, takže může být vyvolána buď neutralizace toxinu a fagocytóza nebo jiná toxická reakce na cílové struktuře. Může být dále namířena proti léčivům, jako je například digitalis, takže může být vytvoření komplexu a vyloučení léčiva.
V dalším výhodném provedení molekula podle s efektorem umožňuje zesítění dvou identických nebo odlišných cílových struktur jedním nebo více efektory.
Příklady vhodných efektorů jsou transmembránová doména, glykofosfolipidová kotva, ligand vázající část receptorů, ligand pro receptor nebo částečná sekvence ligandu vázající vyvoláno vynálezu ·· 4 ···
«
• 4 · receptor, peptidový hormon, cytokin, růstový faktor, inhibitor růstového faktoru, chemokin, interferon, mediátor, peptid mající vliv na cirkulaci, enzym, který konvertuje inaktivní prekurzor léku na aktivní lék, protein, který aktivuje nebo inhibuje koagulaci, protein, který aktivuje nebo inhibuje fibrinolýzu, protein, který aktivuje nebo inhibuje komplementový systém, jedna nebo více konstantních domén imunoglobulinu, cytotoxický peptid nebo jiná jednořetšzcová, jeden nebo několik, konkrétně dva antigeny vázající molekula, nádorový antigen nebo antigen patogenu, jako je například bakteriální antigen nebo virový antigen, peptid obsahující cystein k tvorbě dimerů molekuly podle vynálezu, a/nebo dimerizující nebo multimerizující peptid (Pluckthun a Pack, Immunotechnol., 3, 83-105, 1997).
Dalším aspektem předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující molekulu podle vynálezu. Nukleová kyselina je obecně DNA nebo RNA, výhodně dvoj vláknová DNA.
Pro sekreci, která je vyžadována kde je to vhodné, expresního produktu podle vynálezu, obsahuje nukleová kyselina podle vynálezu na 5'-konci nukleotidovou sekvenci kódující signální nebo transmembránovou sekvenci (viz například patentové přihlášky DE 19639103.2 nebo DE 19651443.6). Jedním příkladem vhodných signálních nebo transmembránových sekvencí je signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA < 63 až > 107), signální sekvence pro CEA (pozice DNA < 33 až > 134) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyselinové sekvence < 38 až > 50 nebo 48 až 65).
V dalším provedení předkládaného vynálezu nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje na svém 5'-konci promotor a/nebo aktivátor. Aktivátor může být výhodně aktivován, nebo suprimován buněčně specificky, specificky pro buněčný cyklus,
- 13 • to toto·· • to · toto toto • · · · · · to • · · · to ' to · · • to · ···· · ·«· ··· • · · · · ·· * ·· ·· v patentových DE 19639103.2, a DE 19710643.9.
DE 19617851.7, EP 97102547.3 metabolicky specificky a/nebo léčivem. Aktivátorové sekvence tohoto typu včetně jejich kombinací, jsou popsány přihláškách EP 97101507.8,
DE 19651443.6,' DE 19704301.1,
Obzvláště výhodné konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou schematicky zobrazeny na obr. 3 a obr. 4.
Ve výhodném provedení obsahuje nukleová kyselina podle vynálezu na 5'-konci startovacího kodonu. sekvenci GCCACC nebo GCCGCC, které mohou vyvolat zesílení translace.
Další provedení předkládaného vynálezu se týká vektoru obsahujícího nukleovou kyselinu podle vynálezu. Vektor může být v tomto případě virový nebo nevirový vektor, výhodně nevirový vektor, který je vybrán zejména z kationtového lipidu, kationtového polymeru, kationtového peptidu nebo kationtového porfyrinu.
Aby se připravily molekuly podle vynálezu, je popsaná nukleová kyselina klonována do expresního vektoru, například vhodného plazmidu, a zavedena do vhodné buňky, například do bakterie, kvasinky, hmyzí nebo savčí buňky, a dále buňka transformovaná nebo transfekovaná tímto způsobem je kultivována a expresní produkt je izolován, když je to vhodné. Obecně jsou metody odborníkovi známy a jsou detailně popsány například v Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press .
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu tyto buňky exprimují molekulu podle vynálezu, která má efektor, a tento efektor je výhodně transmembránové doména.
Tak například DNA sekvence kódující transmembránovou sekvenci lidského faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (pozice DNA < 1485 až > 1554) nebo sekvence DNA kódující
* · · · · « · · · · · ···· β ··· · · · · · · · · ·
- 14 signální a transmembránovou oblast glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo z toho částečná sekvence aminokyselin 38 až 63) nebo sekvence DNA kódující signální a transmembránovou oblast neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyselin 7 až 27) může být vložena mezi promotorovou sekvenci a DNA sekvenci molekuly podle vynálezu nebo jinou na 3'-konci genu.
Avšak pro ukotvení léčiva v buněčné membráně· buněk exprimujících molekulu podle vynálezu, je také možné vložit nukleotidovou sekvenci kódující glykofosfolipidovou kotvu do konstruktu nukleové kyseliny.
Inzerce glykofosfolipidové kotvy se obecně provádí na 3'-konci nukleotidové sekvence kódující molekulu podle vynálezu a můře se také uskutečnit navíc ještě kromě vložení signální sekvence.
Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA, pro N-CAM a pro další membránové proteiny, jako je například Thy-1.
Díky této transmembránové oblasti exprimuje konkrétní buňka molekulu podle vynálezu na buněčné membráně a tak získá „receptor, který je specifický pro cílové nebo efektorové struktury, které jsou rozpoznávány částmi vázajícími antigen molekuly podle vynálezu.
Jiný výhodný receptor je transmembránová nebo signál převádějící doména receptoru, například receptor T buňky nebo receptor M-CSF. To umožňuje buňce exprimující molekulu podle vynálezu na buněčné membráně, že je vazbou na cílové struktury aktivována pro specifickou činnost. Specifická činnost tohoto typu může být například cytotoxická reakce T lymfocytů, fagocytóza makrofágů a granulocytů nebo exocytóza granulocytů, monocytů a makrofágů.
• · • · · · · · • · '» · · * · ····· 9 ··· · · · • : ..· ..·
- 15 Dalším aspektem předkládaného vynálezu je proto buňka obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu, zejména bakteriální, hmyzí, nebo savčí buňka nebo kvasinka. Vhodné savčí buňky jsou kromě všeobecně známých buněk pro expresi nukleových kyselin, jako jsou například buňky CHO nebo BHK, také lymfocyt, makrofág, gliová buňka, epitelová buňka, jaterní buňka, buňky ledvin, buňky kostní dřeně, endotelová buňka, buňka hladkého nebo příčně pruhovaného svalstva nebo fibroblast.
Posledně zmíněné buňky jsou zejména vhodné pro aplikaci v genové terapii, protože tyto buňky, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu, mohou být injikovány pacientovi lokálně nebo parenterálně, například intravenózně, intraarteriálně, do tělesné sutiny, do orgánu nebo subkutánně pro profylaxi nebo .léčbu poruchy.
Ale pro léčbu poruch zdraví .genovou terapií je také možné podávat konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu pacientovi přímo lokálně, do tělesné sutiny, do orgánu, do oběhového systému, subkutánně nebo intramuskulárně.
Další aspekt předkládaného vynálezu je proto také léčivo obsahující molekulu podle vynálezu, nukleovou kyselinu podle vynálezu, vektor podle vynálezu nebo buňku podle vynálezu, a diagnostický prostředek obsahující molekulu podle vynálezu, který je také namířen proti analytu, jak již bylo detailně popsáno výše.
Molekula podle předkládaného vynálezu, nukleová kyselina podle vynálezu, vektor podle vynálezu nebo buňka podle vynálezu jsou také vhodné pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu např. onkologických onemocnění, autoimunitních chorob, zánětlivých nemocí, krevních poruch, zejména krevní koagulace a/nebo oběhového systému, poruch nervového systému a/nebo infekčních nemocí.
- 16 Výběr jednotlivých složek v tomto spojení obecně závisí na použití prvků podle vynálezu. Jednotlivé složky a jejich užití jsou detailně popsány dále obecnou formou a pomocí příkladů.
Pro přípravu prvku podle vynálezu je možné, jak je uvedeno formou příkladu na obrázcích 3 a 4, spojit konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu na jeho 5'-konci ke 3'-konci nukleové kyseliny kódující signální sekvenci, a druhý prvek opět spojit na jeho 5'-konci ke 3'-konci promotorové sekvence.
Promotorové sekvence, které mohou být vybrány zahrnují například promotor RNA polymerázy III, promotor RNA polymerázy II, promotor a/nebo zesilovač CMV, promotor SV40, nebo virové promotorové a aktivátorové sekvence, jako jsou například sekvence z HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV.
Když je použit promotor z HIV, preferuje se použití cele sekvence LTR včetně sekvence TAR (pozice < -453 až > -80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985) jako virově specifického promotoru.
Další promotorové sekvence pro výběr jsou například promotorové a zesilovací (enhancerové) sekvence, které mohou být aktivovány metabolicky, jako je například zesilovač indukovatelný hypoxií, promotory aktivovatelné specificky pro buněčný cyklus, jako například promotor genu cdc25C, genu cdc25B, genu cyklinu A, genu cdc2, genu B-myb, genu DHFR nebo genu E2F-1, nebo jiné vazebné sekvence pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány specificky pro buněčný cyklus. Tyto vazebné sekvence zahrnují například vazebné sekvence pro proteiny c-myc. V těchto vazebných sekvencích jsou zahrnuty také monomery nebo multimery nukleotidové sekvence označované jako box E Myc (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3') .
Další promotorové sekvence pro výběr jsou například promotory aktivovatelné tetracyklinem, jako je například tetracyklinový operátor v kombinaci s příslušným represorem, nebo chimérické promotory. Chimérický promotor je kombinace aktivátorové sekvence, která může být aktivována buněčně specificky, metabolický nebo virově specificky, a je lokalizována v protisměru čtení (upstream), s promotorovým modulem, a který který je obsahuj e lokalizován po směru nukleotidovou sekvenci E2FBS-CHR, ke které se váží supresorové proteiny, a je tedy schopná inhibovat aktivaci protisměrné aktivátorové sekvence v Go fázi a Gi fázi buněčného cyklu (W096/06943, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).
Jiné promotorové sekvence pro výběr jsou například promotory, které mohou být aktivovány buněčně specificky, jako jsou výhodně promotory nebo aktivátorové sekvence z promotorů nebo zesilovačů těch genů, které kódují proteiny, které jsou přednostně tvořeny ve vybraných buňkách.
Například promotory pro následující proteiny jsou výhodné pro použití pro účel vynálezu v následujících buňkách:
Promotorové a aktivátorové sekvence, které aktivovány v endotelových buňkách, jsou a aktivátorové sekvence genů, které kódují proteiny: pro mozek specifický endotelový přenašeč glukózy 1, endoglin, receptor VEGF 1 (flt-1), receptor VEGF 2 (flk-1,
KDR), til-1 nebo til-2, receptor B61 (receptor Eck), B61, endotelin, zejména endotelin B nebo endotelin 1, receptory endotelinu, zejména receptor endotelinu B, receptory manózo-6-fosfátu, von Willebrandův faktor, IL-la, IL-Ιβ, receptor IL-1, adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1) nebo syntetické aktivátorové sekvence, které obsahují downstream) , CDE-CHR nebo sou promotorové následuj ící • 9 « 99
9 9 9
9· 9 9 9
999 9 9 99 9 9 9 • ·
9· · I
- lí oligomerizovaná místa pro vazbu transkripčních faktorů, které jsou přednostně nebo selektivně aktivní například v endotelových buňkách GATA 2, jehož vazebné 5'-TTATCT-3'.
Promotorové nebo
Příkladem je transkripční faktor místo v genu endotelinu 1 je aktivátorové sekvence aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk jsou genově regulační sekvence genů, které kódují například následující proteiny: VEGF, přičemž genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou 5'-hraniční oblast, 3'-hraniční oblast, gen c-Src nebo gen v-Src, nebo receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky, zejména promotor viru myšího nádoru mléčné žlázy.
Promotorové nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva, jsou genově regulační sekvence genů, které kódují například následující proteiny: tropomyozin, a-aktin, α-myozin, receptor pro PDGF, receptor pro FGF, MRF-4, fosfofruktokinázu A, fosfoglycerátmutázu, troponin C, myogeny, receptory pro endotelin A, dezmin, VEGF (viz výše), syntetické promotory nebo promotory svalově specifických transkripčních faktorů, jako jsou faktory rodiny šroubovice-smyčka-šroubovice (helix-loop-helix, HLH) (MyoD, Myf-5, myogeny, MRF4) nebo protein „zinkového prstu GATA-4.
Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci svalově specifickou nejenom s promotory genů specifických pro svaly, ale také v heterologním kontextu, a tedy také se syntetickými promotory. Příklady syntetických promotorů tohoto typu jsou mnohonásobné kopie vazebného místa (DNA) pro svalově specifické proteiny HLH, jako je box E (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC) nebo mnohonásobné kopie DNA
I» · · · » * · · • · · ·
- 19 « · ·· · β · « · · 9 4 4 9 £ ζ φ « · ·♦··»* 44 9 994 «·· · · · * * — » I» 9 9949 kyselý protein - GFAP), CNTF, receptory 5-HT, vazebného místa pro GATA-4 genu těžkého řetězce cc-myozinu (např. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCA GATAGAGG-3') .
Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v gliových buňkách, jsou například genově regulační sekvence genů, které například kódují následující proteiny: protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky, glutaminsyntetázu, protein specifický pro gliové buňky, (gliový vláknitý protein SlOOb gliové buňky, IL-6, TNFa, IL-10, receptor růstového faktoru podobného inzulínu I a II nebo VEGF (viz výše).
Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou. aktivovány v hematopoetických buňkách, jsou například promotorové sekvence pro geny cytokinu nebo jeho receptoru, které jsou exprimovány v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou například buňky stromatu.
Sem patří promotorové .sekvence- genů, které například kódují následující cytokiny a jejich receptory: receptor faktoru kmenové buňky, faktor kmenové buňky, IL-Ια, receptor IL-1, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka a), receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-6, receptor IL-6, GM-CSF, -receptor
GM-CSF (řetězec a), interferonový regulační faktor 1 (IRF-1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 a IFNy nebo IFNp, erytropoetin nebo receptor erytropoetinu.
Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v lymfocytech a/nebo makrofázích, jsou například promotorové a aktivátorové sekvence genů kódujících cytokiny, cytokinové receptory a adhezivní molekuly a receptory pro Fc fragment protilátek, jako jsou například receptor IL-1, IL-la, IL-Ιβ, IL-2, receptor IL-2, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka α) , receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-4, receptor IL-4, IL-5,
IL-6, receptor IL-6, interferonový regulační faktor 1 (IRF1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 jako IFNy nebo ΙΕΝβ, promotor responzivní na IFNy, IL-7, IL8, IL-10, IL-11, IFNy, GM-CSF, receptor GM-CSF (řetězec a), IL-13, LIF, receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF) , receptory makrofága I a II, MAC-1 (leukocytární funkční antigen), LFA-Ια (leukocytární funkční antigen) nebo pl50,95 (leukocytární funkční antigen).
Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v synoviálních buňkách, jsou například promotorové sekvence genů kódujících metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například MMP-1 (intersticiální kolagenáza) nebo MMP-3 (stromelyzin/tranzin) nebo tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), jako TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3.
Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v leukemických buňkách, jsou například promotory genů, které kódují následující proteiny: HSP-70, bcl-l/cyklin D-l, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFa, TNFp, H0X11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML-RARA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové) nebo c-myc, přičemž proteiny c-myc se váží na multimery nukleotidové sekvence nazývané box E Myc (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3') a aktivují je.
Promotory nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v nádorových buňkách, jsou například genově regulační nukleotidové sekvence, se kterými interagují transkripční faktory, které se tvoří nebo jsou aktivní v nádorových buňkách.
Pro účel tohoto vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence nebo prvky genů, které kódují zejména proteiny, které jsou tvořeny v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů. Tedy pro malobuněčné bronchiální karcinomy je výhodně použit promotor proteinu N-CAM, pro ovariální karcinomy je promotor receptorů růstového faktoru hepatitidy nebo L-plastinu, a pro
• · · »·
4 · • · '· ·
4 4 9 9 9 49
9 .·» ·· « ··
- 21 pankreatické karcinomy je promotor L-plastinu nebo polymorfního epitelového mucinu (PEM).
Značnou výhodou předkládaného vynálezu je, že vazba jednotlivých složek podporuje heterodimerovou asociaci, takže se převážně tvoří jednořetězcové molekuly vázající různé antigeny. Je zde také snížení disociace dimerů, jak bylo ukázáno pro fragmenty scFv (viz například Glockshuber et al., Biochem., 29, 1362-1357, 1990). Je tedy možné připravit molekuly podle předkládaného vynálezu podstatně jednodušeji a v homogennější formě, než to umožňují takzvané „diabodies, dokonce i když jsou stabilizovány disulfidem nebo ve formě „klíč v zámku.
Kromě toho jsou pro přípravu molekuly podle vynálezu nezbytné pouze jedna signální sekvence a jedno ribozomální vazebné místo (RBS). Na rozdíl od toho pro každý řetězec v „diabodies je vyžadována signální sekvence i RBS. Další výhoda předkládaného vynálezu je, že u molekul podle vynálezu se exprimují v ekvimolárních množstvích variabilní domény, zatímco při expresi dvou řetězců „diabodies se mohou tvořit neekvimolární množství, a je tedy zvýšen podíl nefunkčních homodimerů.
Další výhodou molekuly podle vynálezu je, že může být exprimována jednoduše a ve funkční formě jak v bakteriích, tak i v kvasinkách, baculovirech a eukaryotických buňkách. Navíc kromě sekrece molekul podle vynálezu je také možnost exprimovat je uvnitř buněk nebo ve spojení s membránami (viz například Biocca & Cattaneo, Trends Cell Biol., 5, 248252,1995).
Další výhodou molekul podle vynálezu je, že mohou být široce použity jako diagnostický prostředek a jako léčivo pro profylaxi a/nebo léčbu poruch, jako bispecifické protilátky.
- 22 • 9 9 9 99
99 » · · ♦ » · · · ttt »9 9
Geny efektorů a promotorových sekvencí jsou vybrány se zřetelem na požadované použití a berou do úvahy cílovou buňku, která má být transdukována. V následujícím textu jsou uvedeny příklady kombinací promotorových sekvencí a genů pro efektory, které mohou být vybrány pro určité poruchy.
Léčba nádorů
Cílové buňky pro léčbu nádorů jsou například proliferující endotelové buňky nebo buňky stromatu a svalové buňky sousedící s endotelovými buňkami, nebo nádorové nebo leukemické buňky, použité promotory jsou například specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro nádorové buňky (solidní nádory a leukémie) a specifické pro buněčný cyklus, a použité efektory jsou například následující geny:
Geny inhibitorů buněčné proliferace jsou například protein retinoblastomu (pRb=pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30. Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Dává se přednost použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které, projevují mutace pro inaktivační místa exprimováných proteinů, aniž by se tím zhoršila funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány pro pllO. Sekvence DNA proteinu pl07 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky. Je také vhodný gen proteinu p53. V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na specifické proteiny, jako je například MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu na C-koncové části. Proto se dává přednost použití sekvence DNA pro protein p53, který byl na C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392. Další vhodné • · t • · 9
- 23 geny jsou gen p21 (WAF-1) , proteinu pl6, dalších inhibitorů cdk, proteinu GADD45 nebo proteinu bak.
Geny faktorů vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze jsou například geny pro inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1) , PAI-2, PAI-3, angiostatin, interferony (IFNa, IFNfl nebo IFNy) , destičkový faktor 4, IL12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, leukemický inhibiční faktor (LIF) nebo tkáňový faktor (TF) a jeho fragmenty podporující koagulaci.
Geny cytostatických a cytotoxických proteinů jsou například geny pro perforin, granzym, IL-2, IL-4, IL-12, interferony, jako je například IFNa, IFN3 nebo IFNy, TNF, jako je TNFa nebo TNFfl, onkostatin M, sfingomyelináza nebo magainin a deriváty magaininu.
Geny induktorů zánětů jsou například geny pro IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2), monocytářní chemotaktický a aktivační faktor (MCAF), IL-8, makrofágový zánětlivý protein 1 (ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β) , neutrofilový aktivační protein 2 (NAP-2) , IL-3, IL-5, lidský leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3b, tj . které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D, lidský komplementový faktor C3 nebo jeho částečná sekvence C3b, štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturně podobné CVF, nebo bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, například poriny ze Salmonella typhimurium, srážlivé faktory ze Staphylococcus aureus, moduliny, zejména z gramnegativních bakterií, hlavní vnější membránový protein legionel nebo z Haemophilus
- 24 influenzae typu B nebo z klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.
Geny enzymů pro aktivaci prekurzorů cytostatických agens jsou například geny pro enzymy, které štěpí inaktivní prekurzory (předléky) na aktivní cytostatické léky. Látky tohoto typu a příslušné předléky a léky již byly uvedeny v přehledech autorů: Deonarain et al., (Br. J. Cancer, 70, 786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199, 1994) a Harris et al. (Gene Ther., 1, 170, 1994) . Například mohou být použity sekvence DNA pro jakýkoliv z následujících enzymů: thymidinkináza viru herpes simplex, thymidinkináza viru varicella zoster, bakteriální nitroreduktáza, bakteriální β-glukuronidáza, rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale, lidská β-glukuronidáza, lidská karboxypeptidáza (CB) , například CB-A mastocytů, pankreatická CB-B nebo bakteriální karboxypeptidáza, bakteriální β-laktamáza, - .bakteriální cytosindeamináza, lidská kataláza nebo peroxidáza, fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá prostatická fosfatáza nebo kyselá fosfatáza typu 5, oxidáza, zejména lidská lysyloxidáza nebo lidská kyselá D-aminooxidáza, peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilní peroxidáza nebo lidská thyroidní peroxidáza, β-galaktosidáza nebo α-galaktosidáza. Obzvláště je výhodná β-galaktosidáza, protože konvertuje předlék daunomycin β-D-galaktopyranosid na cytostatikum daunomycin.
Léčba autoimunitních nemocí a zánětů
Cílové buňky pro léčbu autoimunitních nemocí a zánětů jsou například proliferující endotelové buňky nebo makrofágy a/nebo lymfocyty nebo synoviální buňky, použité promotory jsou například specifické pro endotelové buňky a specifické • ·
- 25 pro buněčný cyklus nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:
Geny pro léčbu alergií jsou například geny pro ΙΕΤίβ, IFNy, IL-10, protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4, rozpustným receptorům IL-4, IL-12 nebo TGFp.
Geny pro prevenci odvržení (rejekce) transplantovaných orgánů jsou například geny pro IL-10, TGFP, rozpustné receptory IL-1, rozpustné receptory IL-2, antagonisté receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.
Geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami jsou například geny pro TFGP, IFNa, IFNP, IFNy, IL-12, rozpustné receptory IL-4, rozpustné receptory IL-6, imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující VH a Vl.
Geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami jsou například geny pro IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa nebo TNFP, IL-13, imunosupresivní protilátku nebo její fragmenty obsahující VH a VL.
Geny inhibitorů buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických přípravků již byly detailně popsány výše.
Geny pro léčbu artritidy jsou například strukturní geny, jejichž exprimovaný protein inhibuje zánět, například v kloubu, přímo nebo nepřímo, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky, vazivové tkáně) v kloubu.
Příklady těchto proteinů jsou antagonista receptoru IL-1 (IL-l-RA), protože IL-l-RA inhibuje tvorbu IL-la, IL-Ιβ; rozpustný receptor IL-1, protože rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1; IL-6, protože IL-6 zvyšuje sekreci TIMP
synoviálními TNF, protože IL-4, protože • · · « · · • « · · · • · 9 · *
- 26 a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa buňkami a chondrocyty; rozpustný receptor rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF;
IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP; IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP; růstový faktor podobný inzulínu (IGF-1), protože IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty; TGFp, zejména TGFpi a TGFP2, protože TGFP stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty; superoxiddismutáza nebo TIMP, zejména TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3.
Léčba hematopoetického systému
Cílové buňky pro léčbu nedostatečné tvorby krvinek jsou například, proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo buňky stromatu sousedící s hematopoetickými buňkami; použité promotory jsou například specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:
Geny pro léčbu anémie jsou například gen pro erytropoetín.
Geny pro léčbu leukopenie jsou například G-CSF, GM-CSF nebo M-CSF.
Geny pro léčbu trombocytopenie jsou například IL-3, leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-11 nebo trombopoetin.
Léčba nervového systému
Cílové buňky pro léčbu poškození nervového systému jsou například gliové buňky nebo proliferující endotelové buňky, použité promotory jsou například specifické pro gliové buňky • · · · · * • «
- 27 a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo nespecifické a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:
Geny pro neuronové růstové faktory jsou například geny pro FGF, nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF), neurotrofin 3 (NT-3), neurotrofin 4 (NT-4) nebo ciliární neurotrofický faktor (CNTF).
Geny pro enzymy jsou například geny pro tyrosinhydroxylázu nebo dopadekarboxylázu.
Geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický účinek TNFa jsou například geny pro TGF3; rozpustné receptory TNF, protože receptory TNF neutralizují TNFa; IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4; rozpustné .receptory IL-1, jako je IL-1 receptor I nebo IL-1 - receptor II, protože rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1; antagonista receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.
Léčba poruch krevní koagulace a oběhového systému
Cílové buňky pro léčbu poruch krevní koagulace a oběhového systému jsou například endotelové buňky, proliferující endotelové buňky, somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buňky hladkého svalstva nebo makrofágy, použité promotory jsou například buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo promotory specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:
Geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy jsou například geny pro tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), • · • · β ·
- 28 aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA), hybridy tPA a uPA, protein C, hirudin, - inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako je například inhibitor C-1S, al-antitrypsin nebo antitrombin III nebo inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI) .
Geny pro podporu koagulace jsou například F VIII, F IX, von Willebrandův faktor, F XIII, PAI-1, PAI-2 nebo tkáňový faktor a jeho fragmenty.
Geny pro faktory angiogeneze jsou například VEGF nebo
FGF.
Geny pro snížení krevního tlaku jsou například geny pro kalikrein nebo syntázu oxidu dusičného endotelových buněk.
Geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva po poranění vrstvy endotelu jsou například geny pro antiproliferační, cytostatický nebo cytotoxický protein nebo enzym pro štěpení prekurzorů cytostatických' přípravků na cytostatické přípravky, jak již bylo uvedeno výše, nebo fúzní protein jednoho z těchto léčiv s ligandem, například s protilátkou nebo protilátkovými fragmenty, které jsou specifické pro svalové buňky.
Geny pro další proteiny krevní plazmy jsou například geny pro albumin, inaktivátor Cl, sérovou cholinesterázu, transferin nebo al-antitrypsin.
Profylaxe a/nebo léčba infekčních nemocí
Cílové buňky pro očkování jsou například svalové buňky nebo makrofágy a/nebo lymfocyty, použité promotory jsou například nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro cílovou buňku a promotory specifické pro buněčný cyklus, a použité efektory jsou například geny pro profylaxi infekčních nemocí.
«· · · · · • · · · · · • · · · · · · • · ······ · · · ·« • · · · a · · · * · 1
Vybraná aktivní látka je obecně DNA pro protein, který je tvořen patogenem a který vede vyvoláním imunitní reakce, tj . pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, k neutralizaci a/nebo destrukci patogenu. Tyto -takzvané neutralizační antigeny jsou již používány jako vakcinační antigeny (viz přehled v Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263, 1992).
Pro účel vynálezu je výhodná nukleová kyselina, která kóduje neutralizační antigeny pro následující patogeny: virus chřipky A, HIV, virus rabies, virus HSV (virus herpes simplex), RSV (respirační syncyciální virus), virus parainfluenzy, rotavirus, VZV (cytomegalovirus), virus papilomavirus) , HBV (virus HDV (virus virus varicella zoster), CMV spalniček, HPV (lidský
B), HCV hepatitidy hepatitidy
D)
HEV virus virus hepatitidy C), hepatitidy E) , HAV (virus hepatitidy A) , antigen Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi nebo Helicobacter pylori nebo antigen malárie.
Aktivní látky tohoto typu pro účel předkládaného vynálezu také zahrnují DNA pro antiidiotypovou protilátku nebo její fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (oblasti určující komplementaritu) tvoří kopie proteinové struktury nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu patogenu (viz výše).
Ántiidiotypové protilátky tohoto typu a jejich štěpné produkty mohou nahradit zejména sacharidové antigeny pro bakteriální patogeny a jsou uvedeny například v přehledech , (J. Immunother., 14, 273, 1993)
ISpringer Seminars in Immunopathol., autoru: Hawkins et al a Westerink a Apicella 15, 227, 1993) .
Příklady dalších efektorů jsou geny pro ,nádorové vakcíny. Ty zahrnují antigeny na nádorových buňkách, jak • to to ·
- 30 bylo uvedeno například v přehledu Sedlaček et al., Contrib. to Oncol., 32, Karger Verlag, Munich, 1988, a Contrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, Munich, 1992.
Další příklady jsou geny pro následující antigeny nebo následující antiidiotypové protilátky: sialyl Lewis; peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány T buňkami; proteiny, které jsou exprimované onkogeny; antigeny krevních skupin a jejich prekurzory; antigeny na polymorfním epitelovém mucinu nebo antigeny na proteinech tepelného šoku.
Cílové buňky pro léčbu chronických infekčních nemocí jsou například jaterní buňky, lymfocyty a/nebo makrofágy, epitelové buňky nebo endotelové buňky, použité promotory jsou například virově specifické nebo buněčně specifické a promotory specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:
Geny kódující protein, který má cytostatické, apoptotické nebo cytotoxické účinky nebo kódující enzym, který štěpí prekurzor' antivirové nebo cytotoxické látky na aktivní látku.
Geny kódující antivirové proteiny, jako antivirově aktivní cytokiny a růstové faktory, jako jsou například geny pro IFNa, IFNp, IFNy, TNFP, TNFa, IL-1 nebo TGFP nebo protilátky se specifitou, která inaktivuje příslušný virus nebo její fragmenty obsahující VH a VL, nebo její fragmenty VH a VL, spojené prostřednictvím spojky, jak již bylo popsáno. Příklady protilátek proti virovým antigenům jsou: anti-HBV, anti-HCV, anti-HSV, anti-HPV, anti-HIV, anti-EBV, anti-HTLV, anti-coxsackievirus nebo anti-hantavirus.
Další příklad antivirově aktivního proteinu je protein vázající rev. Tyto proteiny se váží k rev RNA a inhibují kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi
• ·
- 31 retrovirových genů. Příklady proteinů vázajících rev jsou RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D nebo pseudogeny RBPl-8.
Geny kódující antibakteriální proteiny, jako jsou například protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo které opsonizují bakterie. Příklady těchto protilátek jsou protilátky proti meningokokům C nebo Β, E. coli, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylorí, nebo Staphylococcus aureus.
Vynález je dále podrobněji vysvětlen a ilustrován pomocí následujících obrázků a příkladů, aniž by však byl jimi vynález jakkoliv omezován.
Popis obrázků
Obr. 1 schematicky popisuje strukturu jednořetězcové molekuly vázající dva antigeny.
Obr. 2 schematicky popisuje jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny s efektorem.
Obr. 3 a obr. 5 schematicky popisují konstrukty nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny.
Obr. 4 schematicky popisuje konstrukt nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny s efektorem.
Obr. 6 ukazuje vychytání β-galaktosidázy na CEA navázaný na plastické hmotě prostřednictvím jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny podle vynálezu (scDb-CEAGal), ve srovnání s „diabodies proti CEA a β-galaktosidázou E. coli (CEAGal). Jako negativní kontrola byla mikrotitrační destička povlečená BSA.
Obr
Obr
Obr ukazuje vychytání β-galaktosidázy prostřednictvím scDb-CEAGal, secernovaným savčími buňkami, s různými množstvími scDb-CEAGal a β-galaktosidázy použitými na mikrotitrační destičky povlečené CEA. Použitý substrát byl o-nitrofenyl-fi-D-galaktopyranosid. Jako negativní kontrola byla mikrotitrační destička povlečená BSA.
8A ukazuje smrt buněk LoVo v přítomnosti jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny podle vynálezu (scDb), β-galaktosidázy (β-Gal), daunomycin β-D-galaktopyranosidu (předlék) a/nebo daunomycinu (lék).
8B ukazuje kontrolní pokusy s CEA-negativní buněčnou linií (A549) .
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 uříprava a bakteriální exprese vázajícího dva antigeny j ednořetězcového proteinu
Příprava jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny je popsána na příkladu proteinu, který rozpoznává dva antigeny - karcinomembryonální antigen (CEA) a β-galaktosidázu E. coli.
Následující sekvence DNA byly spolu spojeny ve směru od 5'-konce ke 3'-konci:
- promotor LacZ
- bakteriální struktura vázající ribozom (AAGGAG)
- bakteriální signální sekvence pelB (Power et al., Gene, 113, 95-99, 1992)
- 33 - VH anti-CEA (Kontermann et al., Immunotechnol., 3, 137,
1997)
- spojka GGGS (Kontermann et al., 1997)
- VL anti-p-galaktosidázy (Kontermann et al., 1997)
- spojující peptid GGGGSGGTASGGGGS
- VH anti-3-galaktosidázy (Kontermann et al., 1997)
- spojka GGGGS
- VL anti-CEA (Kontermann et al., 1997)
- epitop Myc pro protilátku 9E10 EQKLISEEDLN (Munro a Pelham, Cell, 46, 291-300, 1986)
- polyhistidin HHHHHH purifikace IMAC (Kontermann et al., 1997)
Navázaní jednotlivých složek konstruktu bylo umožněno vhodnými restrikčními místy, která byla vložena prostřednictvím amplifikace PCR na konce různých sekvencí DNA (Kontermann et al., Immunotechnol., 3, 137, 1997).
Navázání se uskutečnilo použitím enzymů specifických pro restrikční místa a DNA ligáz, které jsou odborníkovi známy. Enzymy mohou být zakoupeny komerčně. Konstrukt byl klonován do bakteriálního expresního vektoru pABl (Kontermann et al., 1997) .
Klonování se provádělo pomocí oligonukleotidových primerů LBM2 a LBM3 (Kontermann, R.E., 1997) a
VK-NotFor: 5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3', scDb-AscBack: 5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TGT GG-3', scDb-AscForK: GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3' a pelB-Metminus: 5'- TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG
GT-3 ' .
- 34 ·«··
Pro tento účel byly amplifikovány fragmenty VHB-VLA (fragment 1) a VHA-VLB (fragment 2) z „diabodies CEAGal (Kontermann, R.E., 1997) za použití primerů LMB2 a LMB3 a byly purifikovány v gelu. Fragment 1 byl poté amplifikován za použití primerů VK-NotFor a scDb-AscBack, aby se vložilo místo AscI a 7 aminokyselin spojky. Fragment 2 byl amplifikován za použití primerů LMB3 a scDb-AscForX, aby se vložilo místo AscI a 8 aminokyselin spojky. Fragmenty se hydrolyzovaly s AscI a Notl (fragment 1) a Sfil a AscI (fragment 2) a klonovaly do bakteriálního expresního vektoru pABl (Kontermann, R.E., 1997). Výsledný inzert kóduje jednořetězcový polypeptid, ve kterém je VHA-VLB spojen prostřednictvím spojky o délce 15 aminokyselin se sekvencí GGGGSGGRASGGGGS k VHB-VLA.
Plazmid byl poté vložen do bakterií TG1, které se pěstovaly metodami odborníkovi známými (Kontermann et al., 1997) .
Bakterie se rozrušily a jednořetězcový protein vázající dva antigeny se purifikoval z peripiazmatického preparátu afinitní chromatografií s imobilizovaným kovem (IMAC) (Hochuli et al., Bio/Techn., 6, 1321-1325, 1988. Detaily této metody jsou popsány Kontermannem et al. (1997).
Purifikovaný protein měl molekulovou hmotnost 60kD, jak bylo prokázáno elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu a gelovou filtrací. Bylo možné purifikovat přibližně 200 až 300 μg této molekuly na litr bakteriální kultury. Bakteriálně exprimovaný jednořetězcoý protein vázající dva antigeny reaguje v testu ELISA s CEA a β-galaktosidázou a byl schopný nachytat enzym na CEA navázaný na plastické hmotě, jak bylo ukázáno konverzí o-nitrofenyl β-D-galaktopyranosidu (obr. 6). Kromě toho byl tento jednořetězcoý protein vázající dva antigeny- schopný označit živé a fixované buňky LoVo
- 35 ·· ···· • t · • to to • · · · to » · ······ ·· • to · ·· · ·· exprimující CEA tím, že vychytal β-galaktosidázu a konvertoval substrát 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid (X-Gal). Kvůli tomu se buňky LoVo inkubovaly s 10 μg/ml příslušného proteinu vázajícího antigen a s 10 μς/ηΐ β-galaktosidázy a X-Gal (0,8 mg/ml v PBS, 3mM kyanid draselnoželezitý, 3mM kyanid draselnoželeznatý) . Žádné značení nebylo pozorováno u různých kontrolních buněk (A549, HEK293) nebo u „diabodies proti lysozymu slepičího vejce a β-galaktosidáze (HELGal, Kontermann et al., 1997).
Příklad 2
Eukaryotická exprese jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny
Pro expresi v eukaryotických buňkách byla kódující oblast jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny klonována do eukaryotického expresního vektoru (pSecTagA, Invitrogen), bakteriální signální sekvence byla nahrazena signální sekvencí Ig-κ ve vektoru již přítomnou.
Kvůli tomu se jednořetězcový konstrukt amplifikoval pomocí primerů LMB2 a pelB-Metminus, čímž byl methionin ve vedoucí sekvenci pelB (pozice 21) nahrazen threoninem. To bylo následováno hydrolýzou se Sfil a EcoRI a klonováním do vektoru pSecTagA. Zralý jednořetězcový protein vázající dva antigeny obsahuje 7 dalších aminokyselin (AAQPATA) na N-koncové části domény VHA.
Plazmid byl přechodně transfekován s Lipofectaminem (Gíbco) do eukaryotických buněk HEK 293. Stabilní buňky se vybíraly v přítomnosti zeocinu. V imunofluorescenčních pokusech s těmito buňkami bylo možné detekovat značení endoplazmatického retikula a Golgih-o aparátu. Dále bylo možné
- 36 • fl flflflfl • · • · fl • ···· fl fl • flfl • · • flfl • · detekovat sekreci jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny imunoprecipitací proteinu o velikosti 60kD ze supernatantu buněk značených 35 S-Met a purifikací afinitní chromatografii s imobilizovaným kovem (IMAC). Purifikovaný protein je funkčně aktivní ve vazbě β-galaktosidázy a CEA povlečeného na mikrotitračních destičkách a ve vychytávání β-galaktosidázy na CEA navázaný na plastické hmotě (obr. 7) .
Příklad 3
Vychytávání enzymu in vitro společnou kultivací s buňkami secernujícími jednořetězcový protein vázající dva antigeny
Vychytávání in vitro se vyšetřovalo společnou kultivací buněk HEK 293 produkujících jednořetězcový protein vázající dva antigeny a CEA-pozitivních buněk LoVo. Za tímto účelem byly nejdříve buňky tvořící protein podle vynálezu kultivovány s buňkami LoVo v nádobách na tkáňové kultury buněčné linie byla přidána se detekovalo
Transwell (Costar), ve kterých jsou dvě odděleny membránou. Po dvou dnech β-galaktosidáza (10 pg/ml) a vychytávání přidáním substrátu X-Gal. Při společné kultivaci s buňkami produkujícími jednořetězcový protein vázající dva antigeny bylo nalezeno specifické značení, zatímco kontrolní pokusy s netransfekovanými buňkami HEK 293 neprokazovaly žádné značení.
Pokusy, ve kterých byly buňky LoVo nahrazeny buňkami A549 (CEA-negativní), a pokusy, ve kterých byly buňky tvořící jednořetězcový protein vázající dva antigeny inkubovány s enzymem a substrátem, byly podobně negativní. Posledně uvedené dokládá, že buňky produkující jednořetězcový protein vázající dva antigeny nejsou samy o sobě schopny vázat enzym.
• 44 *··
- 37 ·· 4444 ·· * ·· » » 4 9 » · · · » 4 4444 » 4 4
4
V dalším pokuse byly buňky HEK 293 secernující jednořetězcový protein vázající dva antigeny a buňky LoVo kultivovány společně přímo s inokulačním poměrem od 1:4 až 1:24. Aby se odlišily buňky HEK 293 od buněk LoVo, byly buňky HEK 293 před přidáním k buňkám LoVo označeny CM-Dil (Molecular Probes) (červená fluorescence). Po dvou dnech byla přidána β-galaktosidáza, a vazba na buňky se detekovala přidáním X-Gal (10 μg/ml) a přímou imunofluorescencí s protilátkou anti^-galaktosidáza (Biotrend). Tyto pokusy také ukázaly specifické vychytávání enzymu buňkami LoVo, zatímco buňky HEK . 293 nebyly označeny. Kontrolní enzymy s netransfekovanými buňkami HEK 293 byly negativní. Tyto pokusy prokázaly, že jednořetězcový protein vázající dva antigeny specificky a selektivně rozpoznává nádorové buňky.
V dalších pokusech se vyšetřovala konverze netoxického β-D-galaktopyranosidu na cytotoxický daunomycin. Inkubací buněk LoVo s purifikovaným jednořetězcovým proteinem vázajícím dva antigeny (10 μg/ml) jednu hodinu a následnou inkubací s β-galaktosidázou (1 μg/ml) a daunomycin-p-D-galaktopyranosidem (2 μΜ) při 37 °C jednu hodinu bylo možné detekovat specifickou lokalizaci výsledného v jádru autofluorescencí látky, srovnatelnou daunomycinu s označením způsobeným přímou inkubací s daunomycinem. Při nepřítomnosti jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny nebo β-galaktosidázy a u kontrolních buněk (HEK 293, HEK tvořících jednořetězcový protein vázající dva antigeny) nebylo detekovatelné žádné jaderné značení. Tyto pokusy prokázaly, že jednořetězcový protein vázající dva antigeny je schopný zachytit a navázat enzym k nádorové buňce a že tento enzym může být použit pro konverzi netoxického prekurzoru na toxickou látku.
·· · ··· ···· • · · ···· · · · · • · ? · · · ···· · ··· ··* ··· · · · * · • · · · » · ·· · ·
- 38 Tento účinek může být využit v dalších pokusech pro specifickou destrukci nádorových buněk.
Za tímto účelem byly buňky LoVo inkubovány na 96-jamkových destičkách s jednořetězcovým proteinem vázajícím dva antigeny (10 pg/ml), a poté s daunomycin-p-D-galaktopyranosidem (5 μΜ) při 37 °C jednu hodinu. Smrt buněk se analyzovala po 2 dnech za použití testu WST (Boehringer Mannheim) (obr. 8) . V tomto případě bylo smrti buněk při konverzi předléku na lék dosahováno přibližně stejně jako v přítomnosti léku (obr. 8A). Při chybění jedné složky nebo u CEA-negativních buněk A549 nebyl nalezen v podstatě žádný účinek (obr. 8B).
I
Příklad 4
Příprava konstruktů pro intracelulární expresi jednořetězcových proteinů vázajících dva antigeny
Pro intracelulární expresi jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny je DNA genu pro jednořetězcový protein vázající dva antigeny amplifikována s různými primery:
- Transmembránový jednořetězcový protein vázající dva antigeny (TM-scDAP). Je použit primer, který vkládá transmembránovou doménu PDGFR na 3'-konec genu.
(LPFKWVISAIIALWLTI ISLI ILIMLWQKKPRYES )
- Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v endoplazmatickém retikulu (ER-scDAP). Je použit primer, který vkládá ER retenční signál (SEKDEL) na 3'-konec genu.
- Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v cytoplazmě (cyto-scDAP). Je použit primer, který
- 39 ·· · · · · · · · · · • · · · · · ···· · ··· ··· ··· ··· · · ·· · ·· * ·.· ·· nahrazuje signální sekvenci na 5'-konci genu methioninem a Kozákovou sekvenci pro optimální iniciaci translace. Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v jádře (nuc-scDb). Jsou použity primery, které nahrazují signální sekvenci na 5'-konci genu
methioninem a Kozákovou sekvenci pro optimální iniciaci
translace, a vkládáj i j adernou lokalizační signální
sekvenci na 3'-konec genu (PKKKRKVGGGT, j aderná
lokalizační sekvence je podtržena).
Tyto fragmenty jsou klonovány do vhodných eukaryotických expresních vektorů (pSecTagA a pcDNA3, Invitrogen). Výsledné konstrukty (TM-scDAP, ER-scDAP, cyto-scDAP, nuc-scDAP a sec-sc-DAP (= secernovaný protein, viz příklad 2) jsou poté přechodně transfekovány do eukaryotických buněk (3T3) a'lokalizace exprimovaného proteinu se vyšetřuje imunofluorescencí za použití anti-Myc protilátky proti epitopu Myc. Značení typické pro sekreční dráhu může být detekováno u konstruktů sec-sc-DAP, ER-scDAP a TM-scDAP, zatímco cyto-scDAP vykazuje difúzní lokalizaci v cytoplazmě a nuc-scDAP vykazuje lokalizaci v jádru.
• * · · · ·
• · · · · · · • ··· · · · · • ······ ··· ··· • · · · · • · · ·« · ·
- 40 SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D) DÉLKA: 14 aminokyselin TYP: aminokyselina TYP VLÁKNA: jednoduché
TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1
GGGGSGGRAS GGGS 14 (2) INFORMACE. PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2
GGGGSGGRAS GGGGS 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26
(B) TYP: nukleotid
(C) TYP VLÁKNA: dvojité
(D) TOPOLOGIE: lineární
* » ···· ·· ♦ · · · · • · · · · · · · · · • · · ···· · · · · « · » · · · ···· · ·♦· ··· ··· · · · · · • · « ·« * ·· ·*
- 41 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: Myc E-box (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: E-Box (Myo D) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
AGCAGGTGTT GGGAGGC 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 41 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: GATA-4 vazebná (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G • flflfl • fl · · · · ♦··· • fl · ···· · · · · • · · flflfl flflflfl · ··· flflfl • flfl flflfl · · flflfl flfl * flflflfl
- 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: Myc E-Box (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6
GGAAGCAGAC CAGCTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7
GGGSGGRASG GGS 13 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment
- 43 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8
Β Β · <*·· Β · · · ·
Β Β · · · Β · ····
Β Β Β ΒΒΒ ···· Β ΒΒΒ ΒΒΒ
ΒΒΒ · · · · ·
ΒΒΒ ΒΒ · ΟΒ ΒΒ
GGGS (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11
(B) TYP: aminokyselina
(C) TYP VLÁKNA : jednoduché
(D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: peptid
(v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9
EQKLISEEDL N 11 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10:
HHHHHH 6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
-(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 • · • · • · · ·
- 44 • · · ··· · · · · • · · ···· · · · · • · · * · ····»» · · · ·· · ··· · · · · · »· « ·· » ·· · · (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11
TTGTTCTGCG GCCGCCCGTT TCAGCTCCAG CTTGGTGCCA GCACC 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 59 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP'MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12
TGCATGCTAG GGCGCGCCTC GGGCGGAGGT GGCTCACAGG 40
TGCAGCTGGT GCAATCTGG 59 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 60 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 13
GCTCGGTAAG GCGCGCCCAC CGCTGCCACC GCCTCCACCT AGGACGGTCA GCTTGGTCCC
- 45 • · · · · · • · · · · · · • · · «« ···· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer . (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14
TTACTCGCGG CCCAGCCGGC CACGGCCCAG GT 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 7 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: N-koncová část (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15
AAQPATA 7 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: C-koncová část • · · · • ·
- 46 • · · ·· · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO
LPFKWVISA IIALWLTII SLIILIMLWQ KKPRYES (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
ČÍSLA 16 s
:
(A) DÉLKA: 11
(B) TYP: aminokyselina
(C) TYP VLÁKNA: jednoduché
(D) TOPOLOGIE: lineární
ii) TYP MOLEKULY: peptid
V) TYP FRAGMENTU: C-koncová část
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO
ČÍSLA 17
PKKKRKVGGG T ·· · · · · • to to • to

Claims (36)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, která obsahuje následující složky:
    a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) s první specifitou (A) a její funkční části,
    b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) s druhou specifitou (B) a její funkční části,
    c) variabilní doménu těžkého 'řetězce imunoglobulinu (VH) se specifitou (B) a její funkční části, a
    d) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) se specifitou (A) a její funkční části, přičemž VH a VL domény jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL nebo konstruktu VL-VH a dva konstrukty VH-VL jsou spojeny prostřednictvím peptidu (P).
  2. 2. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 1, která obsahuje více než konstrukty VH-VL.
  3. 3. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 1 nebo 2, ve které jsou konstrukty VH-VL spojeny prostřednictvím domén se stejnou specifitou.
  4. 4. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, kde specifity (A) a (B) jsou v podstatě shodné.
  5. 5. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, kde VH a VL domény jsou spojeny prostřednictvím peptidové spojky (L) ve formě konstruktu VH-L-VL nebo konstruktu VL-L-VH.
    • · · · • ·
    - 48 • toto·· · to · · • to · · toto·· · ··· ···
  6. 6. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 5, kde spojka (L) je tvořena 1 až 20 aminokyselinami, výhodně 1 až 5 aminokyselinami.
    Jednořetězcová nároku 5, kde
    GGGGS.
    molekula vázající několik antigenů podle spojka (L) obsahuje sekvenci aminokyselin
  7. 8. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, kde peptid (P) je tvořen 12 až 40 aminokyselinami, výhodně 12 až 20 aminokyselinami a zvláště výhodně 14 aminokyselinami.
  8. 9. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 8, kde peptid (P) obsahuje sekvenci aminokyselin GGGGSGGRASGGGS nebo GGGGSGGRASGGGGS.
  9. 10. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, kde uvedená molekula obsahuje jako další složku jeden nebo několik efektorů (E).
  10. 11. ' Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 10, kde efektor (E) je spojen s uvedenou molekulou prostřednictvím konektoru (B).
  11. 12. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 11, kde konektor (B) obsahuje proteázovou štěpnou sekvenci, výhodně štěpnou sekvenci PSA, katepsinu, plazminogenu a/nebo aktivátoru plazminogenu.
    • · · ·
  12. 13. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti molekule, která má být analyzována, a druhá specifita (B) proti molekule analytu.
  13. 14. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 13, kde analytem je radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym.
  14. 15. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti molekule, která má být analyzována, druhá specifita (B) je namířena proti jiné molekule, která má být analyzována, a efektor (E) je analyt.
  15. 16,. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 15, kde analytem je radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym.
  16. 17. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12, kde peptid (P) a/nebo efektor (E) obsahuje fúzogenní peptid.
  17. 18. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 17, kde první specifita (A) je namířena proti cílové buňce a druhá specifita (B) je namířena proti vektoru.
  18. 19. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 18, kde vektor je nukleová kyselina, kationtový peptid nebo protein, kationtový lipid, kationtový polymer, kationtový porfyrin nebo je to virový vektor • · · · · · ···· · ··· ··· ··· · · · · · ·· · · · · · · · ·
    - 50 vybraný ze skupiny obsahující vektory AdV, AAV, vakcinie,
    RSV, HSV, chřipky nebo lentiviru.
  19. 20. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti buněčné membráně, zvláště proti lymfocytům, makrofágům, monocytům, granulocytům, hematopoetickým buňkám, endotelovým buňkám, buňkám hladkého svalstva, buňkám příčně pruhovaného svalstva, epitelovým buňkám, jaterním buňkám, buňkám ledvin, gliovým buňkám, buňkám podpůrných tkání, nádorovým buňkám nebo leukemickým buňkám, nebo proti proteinům mezibuněčné hmoty, komplementového systému, koagulačního systému, kininového systému, krevní plazmy, podpůrné tkáně, nebo proti cytokinům či chemokinům, nebo proti endogenním či exogenním toxinům, ‘ nebo proti léčivům, zejména digitalisu, a/nebo proti patogenům, jako jsou například bakteriální, virové a/nebo parazitární patogeny.
  20. 21. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a 20, kde druhá specifita (B) je namířena proti buněčné membráně, zvláště proti lymfocytům, makrofágům, monocytům nebo granulocytům, proti cytokinům, chemokinům nebo růstovým faktorům, proti proteinům komplementového systému, proti proteinům koagulačního systému, proti fibrinolytickým proteinům, proti enzymům, které jsou schopné konvertovat inaktivní prekurzor léčiva na aktivní zejména cytotoxický lék na cílové struktuře, proti peptidovým hormonům nebo steroidním hormonům, proti konstantní části imunoglobulinu, proti mediátoru, jako je zejména histamin, serotonin, leukotrien, prost^cyklin nebo kinin,
    -519 9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9
    999 99 · proti patogenům, proti nádorovým buňkám, proti endogenním nebo exogenním toxinům, proti léčivům, zejména digitalisu.
  21. 22. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12, 20 a 21, kde efektor (E) je vybrán z transmembránové domény, glykofosfolipidové kotvy, části receptoru vázající ligand, ligandů pro receptor nebo části ligandů vázajícího se na receptor, peptidového hormonu, cytokinů, růstového faktoru, inhibitoru růstového faktoru, chemokinu, interferonu, mediátoru, peptidu ovlivňujícího cirkulaci, enzymu, který konvertuje inaktivní prekurzor léku na aktivní lék, proteinu, který aktivuje nebo koagulaci, proteinu, který aktivuje nebo fibrinolýzu, proteinu, který aktivuje- nebo komplementový systém, jedné nebo více_ konstantních domén imunoglobulinu, cytotoxického peptidu, jiné jednořetězcové, jeden nebo několik, konkrétně dva antigeny vázající molekuly, nádorového antigenu nebo antigenu patogenu, jako je například bakteriální antigen nebo virový antigen, peptidu obsahujícího cystein a/nebo dimerizujícího nebo multimerizujícího peptidu.
    inhibuj e inhibuj e inhibuj e
  22. 23. Nukleová kyselina, která kóduje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22 .
  23. 24. Nukleová kyselina podle nároku 23, která obsahuje na svém 5'-konci nukleotidovou sekvenci kódující signální nebo transmembránovou sekvenci.
    •fl ···· • · • fl « flflfl ···· • fl · ···· ···· •flfl flflfl ···· fl flflfl flflfl • flfl flflfl · · • flfl flfl · flfl flfl
    - 52
  24. 25. Nukleová kyselina podle nároku 23 nebo 24, která obsahuje na svém 5'-konci promotor a/nebo aktivátor.
  25. 26. Nukleová kyselina podle nároku 25, kde aktivátor může být aktivován nebo utlumen buněčně specificky, specificky pro buněčný cyklus, metabolicky specificky a/nebo prostřednictvím léčiva.
  26. 27. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26, která obsahuje na 5'-konci startovacího kodonu sekvenci GCCACC nebo GCCGCC.
  27. 28. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27.
  28. 29. Vektor podle nároku 28, který je virový nebo nevirový vektor.
  29. 30. Vektor podle nároku 29, kde nevirový vektor je vybrán ze skupiny obsahující kationtový lipid, kationtový polymer, kationtový peptid nebo kationtový porfyrin.
  30. 31. Buňka, která obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27 nebo vektor podle nároku 28 nebo 29.
  31. 32. Buňka podle nároku 31, která je bakteriální, kvasinková, hmyzí nebo savčí buňka.
  32. 33. Buňka podle nároku 32, kde savčí buňka je lymfocyt, makrcfág, gliová buňka, epitelová buňka, jaterní buňka, • fl flflflfl • fl · ·· ·· • fl · flflfl ···· • fl · flflflfl flflflfl • flfl flflfl flflflfl · flflfl flflfl flflfl · · · 9 · flflfl ·· · flflflfl
    - 53 buňky ledvin, buňky kostní dřeně, endotelové buňka, buňka hladkého nebo příčně pruhovaného svalstva nebo fibroblast.
  33. 34. Způsob přípravy jednořetězcové molekuly vázající několik antigenů vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se kultivuje buňka podle nároku 31 nebo 32 a kdy se izoluje expresní produkt, pokud je to žádoucí.
  34. 35. Léčivo vyznačující se tím, že obsahuje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a 17 až 22, nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vektor podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30 nebo buňku podle kteréhokoliv z nároků 31 až 33.
  35. 36. Diagnostický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 13 až 16.
  36. 37. Použití jednořetězcové molekuly vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vektoru podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30 nebo buňky podle kteréhokoliv z nároků 31 až 33, pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu onkologických onemocnění, autoimunitních nemocí, zánětlivých nemocí, krevních poruch, zejména krevní koagulace a/nebo oběhového systému, poruch nervového systému a/nebo infekčních nemocí.
    >· ··
CZ991215A 1998-04-09 1999-04-07 Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu CZ121599A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19816141A DE19816141A1 (de) 1998-04-09 1998-04-09 Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül, dessen Herstellung und Verwendung
DE19827239A DE19827239A1 (de) 1998-06-18 1998-06-18 Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül, dessen Herstellung und Verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ121599A3 true CZ121599A3 (cs) 1999-10-13

Family

ID=26045416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ991215A CZ121599A3 (cs) 1998-04-09 1999-04-07 Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu

Country Status (17)

Country Link
US (3) US6759518B1 (cs)
EP (2) EP0952218B1 (cs)
JP (1) JP5306564B2 (cs)
KR (1) KR19990083043A (cs)
CN (1) CN1234406A (cs)
AT (1) ATE414150T1 (cs)
AU (2) AU767580C (cs)
BR (1) BR9902039A (cs)
CA (1) CA2268258C (cs)
CY (1) CY1108728T1 (cs)
CZ (1) CZ121599A3 (cs)
DE (1) DE59914902D1 (cs)
DK (2) DK2036926T3 (cs)
ES (1) ES2317680T3 (cs)
HK (1) HK1130498A1 (cs)
HU (1) HUP9900956A2 (cs)
PT (1) PT952218E (cs)

Families Citing this family (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
HUP9900956A2 (hu) * 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
DE19910419A1 (de) * 1999-03-10 2000-09-21 Aventis Pharma Gmbh Zielzellspezifische, multivalente Proteine (MVP)
US20040058393A1 (en) * 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
EP1294904A1 (en) * 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
KR100388942B1 (ko) * 2000-07-08 2003-06-25 한화석유화학 주식회사 인체의 피질 흉선 세포 및 백혈병 종양 세포 표면단백질을 인식하는 분절 항체
DE10043481A1 (de) * 2000-09-04 2002-04-11 Vectron Therapeutics Ag Imt Humaner Antikörper gegen Endoglin (CD105) und seine Verwendung
DE10156482A1 (de) * 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
ES2283368T3 (es) * 2001-11-14 2007-11-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos biespecificos anti-cd19 y anti-cd16 y usos de los mismos.
AU2002360073A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-09 Micromet Ag Mono-and dual chemokine/cytokine constructs
AU2003251238A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Umc Utrecht Holding B.V. Modulation of platelet adhesion based on the surface exposed beta-switch loop of platelet glycoprotein ib-alpha
EP1400534B1 (en) * 2002-09-10 2015-10-28 Affimed GmbH Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US20060034845A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
EP2390268B1 (en) * 2002-11-08 2017-11-01 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
AU2003286002B2 (en) * 2002-11-08 2011-06-16 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
US20060034833A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Els Beirnaert Single domain antibodies directed against interferron-gamma and uses therefor
ES2655912T3 (es) * 2002-11-08 2018-02-22 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
US20100003253A1 (en) * 2002-11-08 2010-01-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
EP1591527B1 (en) * 2003-01-23 2015-08-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human pd-1
EP1641826A2 (en) * 2003-06-27 2006-04-05 Biogen Idec MA Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
CA2543257C (en) 2003-10-24 2013-12-31 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
WO2006074399A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
DE602006015281D1 (de) 2005-01-14 2010-08-19 Ablynx Nv Verfahren und testvorrichtungen zur unterscheidung verschiedener formen von krankheiten und leiden, die durch thrombocytopenia und/oder durch spontane interaktionen zwischen dem von-willebrand-faktor und plättchen gekennzeichnet sind
MX2007014564A (es) 2005-05-20 2008-02-07 Ablynx Nv Anticuerpos de vhh de dominio unico contra el factor de von willebrand.
GB0601513D0 (en) * 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
ES2363891T3 (es) 2006-03-20 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer.
WO2009032949A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
CN101977654A (zh) * 2008-03-21 2011-02-16 埃博灵克斯股份有限公司 冯威勒布兰特因子特异性结合物及其应用方法
US8444976B2 (en) * 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
KR20110079693A (ko) 2008-10-29 2011-07-07 와이어쓰 엘엘씨 단일 도메인 항원 결합 분자의 정제 방법
MX345226B (es) 2008-10-29 2017-01-20 Ablynx Nv Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo.
EP2398504B1 (en) 2009-02-17 2018-11-28 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
JP2011026294A (ja) * 2009-06-26 2011-02-10 Canon Inc 化合物
EA023179B1 (ru) 2009-08-13 2016-05-31 Круселл Холланд Б.В. Антитела против респираторного синцитиального вируса (pcb) и способы их применения
GB2473295A (en) * 2009-09-07 2011-03-09 Univ Basel Self assembling protein fibres
WO2011069019A2 (en) 2009-12-02 2011-06-09 David Ho J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
US20110206672A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
MX343298B (es) 2010-07-09 2016-11-01 Crucell Holland Bv Anticuerpos contra el virus sincitial respiratorio (rsv) humano y metodos de uso.
ES2687245T3 (es) 2011-10-20 2018-10-24 Esbatech - A Novartis Company Llc Anticuerpo estable de unión a antígenos múltiples
US11339208B1 (en) 2012-05-31 2022-05-24 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Camelidae single-domain antibodies against Yersinia pestis and methods of use
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CU24481B1 (es) 2014-03-14 2020-03-04 Immutep Sas Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
PT3142750T (pt) * 2014-05-13 2020-09-22 Univ Pennsylvania Composições que compreendem aav expressando construções de anticorpos duplos e suas utilizações
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
AU2015292755B2 (en) 2014-07-21 2020-11-12 Novartis Ag Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
EP3174546B1 (en) 2014-07-31 2019-10-30 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
US10851149B2 (en) 2014-08-14 2020-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using GFR α-4 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI716362B (zh) 2014-10-14 2021-01-21 瑞士商諾華公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體分子及其用途
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
SG11201708191XA (en) 2015-04-08 2017-11-29 Novartis Ag Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car) - expressing cell
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
US20180207273A1 (en) 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
JP2019503349A (ja) 2015-12-17 2019-02-07 ノバルティス アーゲー Ｐｄ−１に対する抗体分子およびその使用
CA3007421A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
US20200281973A1 (en) 2016-03-04 2020-09-10 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
SI3443096T1 (sl) 2016-04-15 2023-07-31 Novartis Ag Sestavki in postopki za selektivno izražanje himerni antigenskih receptorjev
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
KR102365977B1 (ko) 2016-05-20 2022-02-22 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 쇄 가변 단편 cd3 결합 단백질
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
KR20230100748A (ko) 2016-07-28 2023-07-05 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
CN110225927B (zh) 2016-10-07 2024-01-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
EP3323473A1 (de) 2016-11-21 2018-05-23 Tyromotion GmbH Vorrichtung zum trainieren der unteren und/oder oberen extremitäten einer person
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
MX2019006045A (es) 2016-11-23 2019-11-11 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso.
WO2018136725A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Innate immune cell inducible binding proteins and methods of use
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
EA202090104A1 (ru) 2017-06-22 2020-04-09 Новартис Аг Молекулы антител к cd73 и пути их применения
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
NZ760841A (en) 2017-07-11 2024-02-23 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human cd137 and uses thereof
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
AU2018347582A1 (en) 2017-10-13 2020-05-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
US10927180B2 (en) 2017-10-13 2021-02-23 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2019099838A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
TWI804572B (zh) 2018-02-09 2023-06-11 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
JP2021525243A (ja) 2018-05-21 2021-09-24 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｎｋ細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
PE20210418A1 (es) 2018-06-19 2021-03-08 Atarga Llc Moleculas de anticuerpo de componente de complemento 5 y sus usos
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
KR20210086623A (ko) 2018-09-25 2021-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. Ddl3 결합 단백질 및 사용 방법
AU2019379576A1 (en) 2018-11-13 2021-06-03 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
CN113194952A (zh) 2018-12-20 2021-07-30 诺华股份有限公司 Hdm2-p53相互作用抑制剂和bcl2抑制剂的组合及其治疗癌症的用途
CA3123511A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
EP3946593A1 (en) 2019-03-29 2022-02-09 Atarga, LLC Anti fgf23 antibody
EP3967329A4 (en) 2019-05-07 2023-06-14 Gracell Biotechnologies (Shanghai) Co., Ltd. AGAINST BCMA GM IMMUNE CELLS AND THEIR USE
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
EP4048285A1 (en) 2019-10-21 2022-08-31 Novartis AG Tim-3 inhibitors and uses thereof
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
IL293752A (en) 2020-01-17 2022-08-01 Novartis Ag A combination containing a tim-3 inhibitor and a substance that causes hypomethylation for use in the treatment of myeloplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
WO2021168303A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
US11524998B2 (en) 2020-07-16 2022-12-13 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
CN116635062A (zh) 2020-11-13 2023-08-22 诺华股份有限公司 使用表达嵌合抗原受体（car）的细胞的组合疗法
US20240141060A1 (en) 2021-01-29 2024-05-02 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US20230383010A1 (en) 2022-02-07 2023-11-30 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851527A (en) * 1988-04-18 1998-12-22 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of therapeutic agents
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
WO1993011161A1 (en) * 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE19524720A1 (de) 1995-07-12 1997-01-16 Hoechst Ag Zellspezifische Gentherapie mit Hilfe eines neuen Promotors für den "Tissue Inhibitor of Metalloproteinasn-3"
GB9506466D0 (en) 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
DE19605274A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte für die zellzyklusregulierte Expression von Genen, derartige Konstrukte enthaltende Zellen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Heilmitteln
DE19605279A1 (de) 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung
DE19617851A1 (de) 1996-05-03 1997-11-13 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für Transportsignale
DE19639103A1 (de) 1996-09-24 1998-03-26 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Hybridpromotoren für gentherapeutische Maßnahmen
DE19649645A1 (de) 1996-11-29 1998-06-04 Hoechst Ag Mehrfach funktionelles Ligandensystem zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen
DE19651443A1 (de) 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme
DE19704301C1 (de) 1997-02-06 1998-03-26 Hoechst Ag Der Promotor des humanen Endoglingens und seine Verwendung für die Gentherapie
EP0860445A1 (en) 1997-02-18 1998-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft New nucleotide sequences for the cell cycle regulated expression of structural genes
DE19710643A1 (de) 1997-03-14 1998-09-17 Hoechst Ag Der Promotor des cdc25B Genes und seine Verwendung in der Gentherapie
HUP9900956A2 (hu) * 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
DE19819846B4 (de) * 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte

Also Published As

Publication number Publication date
AU2365699A (en) 1999-10-28
DE59914902D1 (de) 2008-12-24
KR19990083043A (ko) 1999-11-25
HK1130498A1 (en) 2009-12-31
PT952218E (pt) 2009-01-22
AU767580C (en) 2004-11-04
DK2036926T3 (da) 2013-11-04
EP0952218A3 (de) 2000-10-18
US7838637B2 (en) 2010-11-23
CA2268258C (en) 2012-05-29
ES2317680T3 (es) 2009-04-16
EP0952218A2 (de) 1999-10-27
DK0952218T3 (da) 2009-02-09
EP2036926B1 (de) 2013-08-14
US6759518B1 (en) 2004-07-06
AU2004200632A1 (en) 2004-03-11
HU9900956D0 (en) 1999-06-28
EP0952218B1 (de) 2008-11-12
EP2036926A2 (de) 2009-03-18
JP2000201678A (ja) 2000-07-25
BR9902039A (pt) 2000-05-02
ATE414150T1 (de) 2008-11-15
CN1234406A (zh) 1999-11-10
EP2036926A3 (de) 2010-12-01
JP5306564B2 (ja) 2013-10-02
US20050004352A1 (en) 2005-01-06
CA2268258A1 (en) 1999-10-09
HUP9900956A2 (hu) 2002-04-29
US20090326206A1 (en) 2009-12-31
AU767580B2 (en) 2003-11-20
CY1108728T1 (el) 2014-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6759518B1 (en) Single-chain multiple antigen-binding molecule, its preparation and use
Alt et al. Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin γ1 Fc or CH3 region
JP4386741B2 (ja) ｓｃＤｂライブラリーの作成方法
US20040220388A1 (en) Novel heterodimeric fusion proteins
US6482618B2 (en) Self-enhancing, pharmacologically controllable expression systems
US6265562B1 (en) Nucleic acid constructs whose activity is affected by inhibitors of cyclin-dependent kinases and uses thereof
AU2018289383B2 (en) Methods and compositions for reducing the immunogenicity of chimeric notch receptors
US6465246B1 (en) Oncogene- or virus-controlled expression systems
De Jonge et al. In vivo retargeting of T cell effector function by recombinant bispecific single chain Fv (anti-CD3× anti-idiotype) induces long-term survival in the murine BCL1 lymphoma model
DE19816141A1 (de) Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül, dessen Herstellung und Verwendung
JP2002537847A (ja) 標的細胞特異的な多価タンパク質（ｍｖｐ）
Zhou et al. Cloning and expression in Escherichia coli of a human gelatinase B-inhibitory single-chain immunoglobulin variable fragment (scFv)
HRP20010149A2 (en) High-affinity antibodies
EP0528469B1 (en) Recombinant DNA-molecule for the expression of the FV-fragment of an antibody
DE19827239A1 (de) Einzelkettiges, mehrfach-antigenbindendes Molekül, dessen Herstellung und Verwendung
Power et al. Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy
WO1991005856A1 (en) Chimeric monoclonal antibodies generated by trans-splicing
Schoonjans et al. Efficient heterodimerization of recombinant bi-and trispecific antibodies
MXPA97010007A (es) Sistema de expresion auto-internsificadores farmacologicamente controlables

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic