CN117777259A

CN117777259A - 检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN117777259A
Application number: CN202410200509.4A
Authority: CN
Inventors: 孙祥明; 俞亚波
Original assignee: Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Kexin Biotech Co Ltd
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2044-02-23

Abstract

本发明涉及检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用。具体地，本发明提供的所述抗原肽混合物包括：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EST‑6抗原表位肽JHP01；和(b)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CFP‑10抗原表位肽JHP04。本发明的抗原肽混合物可进一步制备检测结核感染的试剂盒，具有操作简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点。

Description

检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，具体地涉及检测结核感染的抗原组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。

结核感染人体后，在大多数情况下，人体处于一个潜伏感染状态，在任何时候都有可能转化为活动性结核病。结核病的易传播性和社会危害性，在健康人群中筛查结核潜伏患者就显得尤为重要。目前我国在诊断结核感染方面有了很大的改变，其中包括用于检测结核病和耐药性的分子测试、用于检测结核感染的干扰素γ释放试验(IGRAs)、用于检测结核病的基于生物标志物的试验、用于使用数字胸片检查进行结核病筛查的人工智能计算机辅助检测(CAD)、以及用于检测结核病的新型气溶胶捕获技术。

世界卫生组织于2022年评估推荐了基于重组蛋白抗原的结核感染皮肤试验，其表现优于结核菌素皮肤试验。基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其具有简便性、快速性，是重要的潜伏性肺结核感染临床辅助性诊断手段。然而，目前基于抗原抗体反应的血清学诊断的性能也存在一些缺陷，如敏感度不高，特异性不强等。

因此，本领域迫切需要开发具有更高敏感度和特异性的检测结核感染的标志物和检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种更高敏感度和特异性的检测结核感染的标志物和检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种抗原肽混合物，所述抗原肽混合物包括：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EST-6抗原表位肽JHP01；和

(b) 氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CFP-10抗原表位肽JHP04。

在另一优选例中，所述抗原肽混合物还包括选自下组的一种或多种抗原表位肽：

(c) 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的EST-6抗原表位肽JHP02；

(d) 氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CFP-10抗原表位肽JHP03；

(e) 氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CFP-10抗原表位肽JHP05。

在另一优选例中，所述抗原肽混合物选自下组：氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的4种抗原表位肽；或氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的4种抗原表位肽。

在另一优选例中，所述抗原肽混合物包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的5种抗原表位肽。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物由结核杆菌的抗原肽构成。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物由抗原肽JHP01、抗原肽JHP02、抗原肽JHP03、抗原肽JHP04和抗原肽JHP05构成。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP04的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP04的摩尔比为(1±0.1)：(1±0.1)，更佳地为约1：1。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，(i)JHP01与(ii)选自JHP02、JHP03和JHP05中任一种抗原肽的摩尔比，各自独立地为(1±0.2)：(1±0.2)。

在另一优选例中，JHP01：JHP02的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)。

在另一优选例中，JHP01：JHP03的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2) ；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)。

在另一优选例中，JHP01：JHP05的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2) ；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP02：JHP03：JHP04的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP02：JHP04：JHP05的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP02：JHP03：JHP04:JHP05的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)；较佳地(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1)：(1±0.1) ：(1±0.1)。

在本发明第二方面，提供了本发明第一方面所述的抗原肽混合物的用途,其被用于制备检测结核感染的检测试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的结核包括肺结核感染。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：酶标板。

在另一优选例中，所述酶标板包被有所述的抗原肽混合物。

在另一优选例中，所述的检测结核感染是针对选自下组的样本：血清样本、血液样本、血浆、脑脊液、或胸腔积液。

在本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(Z1)如本发明第一方面所述的抗原肽混合物，或用于形成所述抗原肽混合物的抗原表位肽；

(Z2) 使用说明书。

在另一优选例中，所述试剂盒中，所述的抗原肽混合物以包被形式存在。

在另一优选例中，所述的抗原肽混合物中的抗原表位肽被包被在酶标板上。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种试剂：

(Y1)用于固定所述抗原表位肽的固相载体；

(Y2)酶标二抗；

(Y3)包被缓冲液；

(Y4)样品稀释液；

(Y5)浓缩洗涤液；

(Y6)封闭液；

(Y7)阳性对照；

(Y8)阴性对照；

(Y9)显色液；

(Y10)酶抗底物；

(Y11)终止液。

在另一优选例中，所述的试剂盒为用于检测结核感染的试剂盒。

在另一优选例中，所述的说明书记载了检测结核感染的步骤和说明。

在另一优选例中，所述的检测结核感染是针对选自下组的样本：血清样本、血液样本、血浆、脑脊液、胸腔积液。

在本发明的第四方面，提供了一种非诊断和非治疗的体外检测样品中是否存在抗结核杆菌的抗体的方法，包括步骤：

(a) 提供待检测的样品和本发明第一方面所述的抗原肽混合物，其中，所述的待检测的样品选自下组：血清样本、血液样本、血浆、脑脊液、胸腔积液；

(b) 检测所述样品中与所述抗原肽混合物中的抗原表位肽是否发生特异性的抗原-抗体结合反应；其中，如果发生特异性的抗原-抗体结合反应，则表示所述样品存在抗结核杆菌的抗体；如果未发生特异性的抗原-抗体结合反应，则表示所述样品不存在抗结核杆菌的抗体。

在另一优选例中，所述的抗结核杆菌的抗体是抗EST-6抗体和/或抗CFP-10的抗体。

在本发明第五方面，提供了一种体外检测结核感染的方法，包括步骤：

(a) 提供待检测的样品和本发明第一方面所述的抗原肽混合物，其中，所述的待检测的样品选自下组：血清样本、血液样本、血浆、脑脊液、胸腔积液等；

(b) 检测所述样品中与所述抗原肽混合物中的抗原表位肽发生特异性的抗原-抗体结合反应；其中，如果发生特异性的抗原-抗体结合反应，则表示所述样品存在结核感染；如果未发生特异性的抗原-抗体结合反应，则表示所述样品不存在结核感染。

在另一优选例中，在步骤(a)中，提供包被有所述的抗原肽混合物的酶标板。

在另一优选例中，所述的方法为定量检测。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了试剂盒检测结核分枝杆菌的标准曲线图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种抗原肽混合物、试剂盒及其应用。本发明的抗原肽混合物，在检测结核感染上具有特异性强、灵敏度高的优势。本发明的抗原肽混合物可进一步制备检测结核感染的试剂盒，所述试剂盒操作简便、耗时短、特异性强、灵敏度高。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4 等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40^oC，较佳地，25±5^oC。

如本文所用，术语“结核病”被理解为由来自结核复合体的有毒力的分枝杆菌引起的感染，结核复合体的有毒力的分枝杆菌(如人结核分枝杆菌)能够在动物或人类中引起结核病感染和疾病。应理解，结核感染可以为潜伏期或发作期的结核感染；换言之，包括潜伏期结核感染的全病程结核感染。

如本文所用，术语“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的物质,也就是能被T淋巴细胞或B淋巴细胞表面的抗原受体特异性识别与结合,活化这两种细胞使之增殖分化,产生免疫应答产物,并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

如本文所用，术语“抗原表位”是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。可分为T细胞表位和B细胞表位。

如本文所用，术语“细胞因子”被理解为可以被用作免疫应答的指示的任何免疫调节剂诸如白细胞介素和干扰素。这包括(但并不限于)：干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素2(IL-2)等。

英文缩写

PBST 浓缩洗涤液

BSA Bovine Serum Albumin牛血清白蛋白

AP碱性磷酸酶

HRP辣根过氧化物酶

HPLC 高效液相色谱法

DMSO 二甲基亚砜

TMB 四甲基联苯胺

用于检测结核感染的特异性抗原表位肽

如本文所用，术语“本发明的抗原表位肽”、“本发明的检测结核感染的特异性抗原表位肽”、“本发明的抗原肽”、“本发明的抗原”可互换使用，指本发明中SEQ ID No: 1和/或4所示的结核感染特异性的抗原表位肽。

如本文所用，“本发明的抗原肽混合物”是指包括上述一或多条抗原表位肽的混合物。

应理解，所述术语还包括含有额外的抗原表位肽(如SEQ ID No: 2、3和5中任一种或多种抗原表位肽)。优选地，该术语包括多种抗原表位肽构成的组合或混合物，尤其是含有SEQ ID No: 1～5这五种抗原表位肽或由SEQ ID No: 1～5这五种抗原表位肽构成的组合或混合物。

基于本发明提供的序列，本发明的抗原表位肽可用常规方法制备，包括人工合成。

抗结核分支杆菌抗体诊断试剂盒及其制备方法

本发明还提供了基于本发明的抗原表位肽的抗结核分支杆菌抗体诊断试剂盒及其制备方法。

典型地，本发明抗结核分支杆菌抗体诊断试剂或试剂盒是采取以下方法进行制备。

在一个实施例中，本发明还提供了优选的制备方法，以基于酶标板的检测试剂盒为例，其主要包括三个部分：

1、酶标板的制备(包被抗原)：

采用相对单位(RU/mL)为浓度单位，使用标准品绘制标准曲线；为绘制标准曲线，需设多个测量点，根据测量点的数量，制备相应数量的标准品，一般设4～12个测量点，优选5～8个测量点，进一步优选5个测量点。

浓度单位的设定方法是：按照OD₄₅₀的上限和下限分别确定浓度单位的上限和下限，中间部分将OD₄₅₀的数值按照等比、等差、差比或其他比例等方法常规方法设定相应的浓度单位；浓度单位的上限一般设定为100RU/mL或1000RU/mL，浓度单位的下限一般设定为0RU/mL，浓度单位的中间部分一般有3～10个浓度设定点，优选5-8个浓度设定点，进一步优选5个浓度设定点。

取结核分支杆菌抗体阳性的结核病病人血清，用抗体稀释液进行稀释、混匀，得混合液H：取其部分分装，注明为标准品H，低温贮存：

取上述余下的混合液H，加入抗体稀释液、混匀，得混合液H-1：再取其部分分装，注明为标准品H-1号，低温贮存：

取上述余下的混合液H-1，加入抗体稀释液、混匀，得混合液H-2；再取其部分分装，注明为标准品H-2号，低温贮存：

重复以上操作，从而逐步得到需要的多份标准品，待用。

②弱阳性对照品的制备：取多份抗结核分支杆菌抗体弱阳性的结核病病人血清，混合后离心取上清，过滤除菌，将上清加入到抗体稀释液中，混合，分装，低温保存待用。

③阴性对照品的制备：取多份正常人血清，等比例混合后离心取上清，过滤除菌，将上清加入到抗体稀释液中，混合，分装，低温保存待用。

3、配制液体试剂：

①浓缩洗涤液的配制：取需要量的NaCl、Na₂HPO₄•12H₂O和NaH₂PO₄•2H₂O，溶解于水中。用NaOH调节pH值，再加入吐温20，再加水混合至定量，灭菌，低温保存。

②样本稀释缓冲液的配制：将浓缩洗涤液稀释，称取需要量的BSA溶解其中，加入硫柳汞钠盐、庆大霉素，再加水混合至定量，过滤，低温保存。

③酶标记的抗人IgG抗体的制备：取酶标记的抗人IgG抗体酶标结合物贮存液，加抗体稀释液稀释至需要浓度，混匀，低温贮存。

④HRP标记的抗人IgG抗体底物A液的配制：取需要量的柠檬酸和Na₂HPO₄•12H₂O，溶解水中，加入需要量的过氧化氢，混合，加水稀释，低温保存。

⑤HRP标记的抗人IgG抗体底物B液的配制：取需要量的TMB溶解水中，加入需要量的DMSO，在搅拌的同时，缓慢加入需要量的HCl，至完全溶解，最后加水稀释，低温保存。

⑥HRP标记的抗人IgG抗体底物的反应终止液的配制：取需要量的浓硫酸，缓慢加入到水中，混匀，低温保存。

本发明的主要优点包括：

(1)假阴性结果低，而且重复性好(CV值很低)；

(2)特异性强、灵敏度高；

(3)可检测潜伏结核感染；

(4)操作简便、耗时短；

(5)可避免卡介苗或陈旧感染等的干扰导致假阳性的结果，减少模板使用；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1抗原组合物的制备

(1)抗原表位肽的制备

合成序列如SEQ ID NO:1、2所示的CFP10抗原表位肽、序列如SEQ ID NO:3、4、5所示的ESAT6抗原表位肽；所得抗原表位肽的存在状态为干粉。

5种不同的抗原表位肽还可以通过常规的手段进行重组表达，具体来说：将表位肽的基因片段插入市售的pET-28a载体制备重组质粒，进而以BL-21DE宿主细菌可控表达、使用Ni NTA镍柱纯化获得。

所述5种抗原表位肽的氨基酸序列如下:

EAST-6 抗原表位肽JHP01:

GKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWD (SEQ ID No: 1)

EAST-6抗原表位肽JHP02:

QAMASTEGNVTGMFA(SEQ ID No: 2)

CFP-10抗原表位肽JHP03:

MAEMKTDAATL(SEQ ID No: 3)

CFP-10抗原表位肽JHP04:

TAGSLQGQWRGAAGTAAQ (SEQ ID No: 4)

CFP-10抗原表位肽JHP05:

DEEQQQALSSQMGF (SEQ ID No: 5)。

(2)抗原组合物的制备

将上述制备的5种不同的抗原表位肽干粉按照摩尔比1:1:1:1:1进行混合，获得抗原表位肽混合物。

实施例2

试剂盒的组成成分

试剂盒包括盒体，设在盒体内的酶标板、对照物和液体试剂。

(1)酶标板

酶标板包括96孔酶标板或48孔酶标板等。所述酶标板的每个孔内有包被液包被、且被无关蛋白或血清封闭的特异性抗原肽段。

所述人工合成的抗原肽段纯度要求HPLC方法大于99%。所述的无关蛋白或血清包括牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、饱和赖氨酸和小牛血清等。

(2)对照物

对照物包括结核分支杆菌抗体的标准品(简称标准品)、弱阳性对照品和阴性对照品。

所述的标准品是结核分支杆菌抗体阳性、并确诊为结核病的病人血清，盒体内设多个标准品，优选5个标准品。根据其波长450nm的吸光度(简称OD₄₅₀)的数值确定相应的浓度数值，绘制标准品的剂量反应曲线。根据该曲线，能够确定待检样本中抗结核分支杆菌抗体的浓度，实现定量检测。这种定量检测方法，能够动态观察病人血清中结核分支杆菌抗体浓度的变化，有利于监测病人的病情变化。

所述的弱阳性对照品是结核分支杆菌抗体阳性、并确诊为结核病的病人血清，但其结核分支杆菌抗体是弱阳性，确定的方法是血清的结核分支杆菌抗体的浓度必须在临界值(简称Cutoff)附近。通过比较待检样本和弱阳性对照品的吸光度值，就能够定性确定待检样本的阴阳性，即实现了定性检测。

所述的阴性对照品是为多份正常人血清的混合品，一般选择5份正常人血清的混合品，优选5-10份正常人血清的混合品，进一步优选10份正常人血清的等比例混合品。

(3)液体制剂

所述的液体试剂包括浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标记的抗人IgG抗体、酶的底物和反应终止液等。

所述的浓缩洗涤液是经浓缩的洗涤液，浓缩的倍数一般是5～20倍，优选10倍浓缩的洗涤液为例(简称10×PBST)，其配比如下：①氯化物：1-2mol/L，优选1.5mol/L；氯化物为一价氯化物，优选氯化钠，氯化钾；②磷酸盐：0.01-0.08mol/L，磷酸盐优选磷酸钾盐或磷酸钠盐，优选磷酸氢二钠0.01-0.04mol/L和磷酸二氢钠0.008-0.03mol/L，优选磷酸氢二钠0.032mol/L和磷酸二氢钠0.013mol/L；③去污剂：质量分数0.1-1%；去污剂优选吐温-20或TritonX-100等。优选质量分数0.5-0.6%的吐温-20。

所述的样本稀释缓冲液，其配比如下：①无关蛋白或血清：4g/L-15g/L，优选10g/L；②防腐剂：W/W,0.0001-0.01%,优选硫柳汞钠盐W/W,0.005%；③抗生素：W/W,0.0001-0.05%,优选庆大霉素W/W,0.01%，溶于1×PBST。其中无关蛋白或血清指牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉、饱和赖氨酸和小牛血清等。

所述的酶标记的抗人IgG抗体包括碱性磷酸酶(简称AP)或辣根过氧化物酶(简称HRP)标记的抗人IgG抗体优选羊、兔抗人IgG抗体，优选HRP标记的羊抗人IgG抗体，按照1：30000-1：40000的比例用抗体稀释液进行稀释。

所述的酶的底物以HRP标记的抗人IgG抗体的底物为例：①底物A，配比如下：柠檬酸-磷酸盐：0.1-0.8mol/L,优选柠檬酸-磷酸氢二钠，0.2mol/L；收氢体：0.005-0.1mol/L，优选过氧化氢或过氧化氢尿素，优选0.01mol/L过氧化氢；②底物B，配比如下：供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS等，0.0001-0.01mol/L,优选四甲基联苯胺(TMB)0.001mol/L；②有机溶剂：二甲基亚砜(DMSO)或无水乙醇，0.01-1mol/L,优选二甲基亚砜(DMSO)0.08mol/L。

所述的反应终止液以HRP标记的抗人IgG抗体的底物的终止液为例，配比如下：浓硫酸1-4mol/L,优选2mol/L。

实施例3

抗结核分支杆菌抗体诊断试剂盒的制备

采用以下方法，制备抗结核分支杆菌抗体诊断试剂盒：

1、包被抗原

包被稀释液的配制：称取适量碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸氢钠(NaHCO₃)溶解水中，配置成碳酸钠(Na₂CO₃)1.5g/L和碳酸氢钠(NaHCO₃)3g/L的溶液，高压蒸汽灭菌30分钟。

封闭液的配制：称取适量BSA，完全溶解于1000mL的1×PBST中，配置成10g/L的溶液，0.22µm滤膜过滤。

酶标板：购自上海晶科安生物

取实施例1制备的抗原表位肽混合物(含结核杆菌抗原肽段)，与储存液混合，获得贮存母液。取所述贮存母液适量，用包被稀释液稀释，至包被抗原的浓度为3µg/mL。然后将加有抗原肽段的包被液加入酶标板的各孔中，每孔100 μL；置于8℃下17h，之后取出酶标板，甩去包被液，洗板三次，拍干，加入封闭液，每孔200 μL；置于37℃下2h，之后取出酶标板，弃去封闭液，洗板三次，拍干：将酶标板板条放置在真空干燥箱内进行真空抽干并于真空箱内保存1h：最后将酶标板条装入铝销袋，真空封口机封口，贴标签和加盖批号。

2、对照物的制备

标准品的制备

5号标准品的制备：取结核杆菌病抗体阳性且OD₄₅₀=1.8-2.0的结核杆菌病人血清1mL，用100mL样品稀释液进行稀释，充分混匀：取其中的50mL，即为标准品5号。

4号标准品的制备：取上述余下的50 mL，加入样品稀释液至50 mL，充分混匀：即为标准品4号。

3号标准品的制备：取上述余下的50 mL时，加入样品稀释液至50 mL，充分混匀：即为标准品3号。

2号标准品的制备：取上述余下的50 mL时，加入样品稀释液至50 mL，充分混匀：即为标准品2号。

1号标准品的制备：取样品稀释液50 mL，分装标准小瓶，每瓶1 mL，注明为标准品1号，2-8℃下贮存。

弱阳性对照品的制备：取一份结核杆菌抗体阳性的结核杆菌病人血清500μL，离心取上清，用0.22μm生物滤膜过滤除菌。最后将上清加入到50mL样品稀释液中，充分混合，分装，即为弱阳性对照品。

③阴性对照品的制备：取10份正常人血清，每份血清取50μL，等比例充分混合后离心，上清用0.22μm生物滤膜过滤除菌，最后将上清加入到50mL样品稀释液中，充分混合，分装，即为阴性对照品。

3、液体试剂的配制

①浓缩洗涤液的配制：以10倍浓缩的洗涤液为例，其配比如下：

氯化钠(NaCl):1.5mol/L

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄•12H₂O):0.032mol/L

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄•2H₂O):0.013mol/L

吐温20(TWEEN-20):0.5%(W/W)

溶于纯水，用NaOH调节pH值为7.2，高压蒸汽灭菌30分钟，保存于2℃备用。

②样本稀释缓冲液的配制，其配比如下：

牛血清白蛋白(简称BSA):10g/L

1%硫柳汞钠盐：0.05g/L

庆大霉素(40mg/mL):0.1g/L

溶于1×PBST，混匀后0.22µm滤膜抽滤，保存于2℃备用。

③HRP标记的羊抗人IgG抗体配制：采购诺维赞公司的HRP标记的羊抗人IgG抗体，用市售抗体稀释液作40000倍稀释，混匀，2～8℃贮存。

④HRP标记的抗人IgG抗体底物A的配制，配比如下：

柠檬酸(C₆H₈O₇•H₂O):0.2mol/L

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄•12H₂O):0.02mol/L

30%过氧化氢(H₂O₂):0.01mol/L

溶于纯化水，保存于2℃

⑤HRP标记的抗人IgG抗体底物B的配制，配比如下：

3,3,5,5'四甲基联苯胺(TMB):8mmol/L

二甲基亚砜(DMSO):0.07mol/L

当量(N)盐酸(HCl):0.03mol/L

溶于纯化水，棕色瓶保存于2℃。

⑥HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制，配比如下：

98%浓硫酸(H₂SO₄):2mol/L,溶于纯化水，充分混匀，保存于2℃。

实施例4

结核分支杆菌样本的检测

1、准备工作：

配制工作洗涤液：将试剂盒中的浓缩洗涤液(10×)按1:10倍的比例稀释。

稀释待检血清：将待检血清用样本稀释液按1:100的比例稀释(即5 μL→500 μL)，充分混匀。

2、操作步骤

①将所需结核杆菌抗原肽包被的酶标板放置在酶标板架上。

②加样品：分别向酶标板孔中加标准品、对照品和稀释后的待检血清，每孔100μL，用封板纸把板条封好，室温(20℃～25℃)温育半小时，从加完最后一个样本后开始计时。

③洗板：把反应孔内的溶液倾出，每孔加入300 μL 工作洗涤液，甩干。如此重复3次，最后把板条倒扣拍干。

④加酶标二抗，每孔加入HRP标记的羊抗人IgG抗体100μL，室温温育半小时。

⑤洗板：把反应孔内的溶液倾出，每孔加入300µL工作洗涤液，静置1分钟，甩干，吸水纸上拍干。重复洗板5次。

⑥显色：每孔加入显色A、B液各50 μL，混匀，室温避光反应30分钟。

⑦终止反应：每孔加入50 μL终止液，轻轻震荡混匀，终止反应。

⑧酶标仪测定波为450nm，半小时内测定各孔OD₄₅₀值。

(3)结果计算与判定

①定性的形式

结果计算：比值=样本OD₄₅₀/弱阳性对照品OD₄₅₀

结果判定：当比值＜0.90，表明样本为阴，当0.90＜比值≤1.1，表明样本在临界；当比值＞1.1 ，表明样本为阳性

②定量的形式

标准曲线绘制：以五个标准品的OD₄₅₀值为纵坐标，各自对应的浓度为横坐标，绘制出标准曲线，如图1所示。

结果计算：计算样本平行测定的OD₄₅₀平均值，然后在标准曲线上读出相应的浓度。

结果判定：当样本浓度≥30RU/mL，表明样本为阳性；当样本浓度＜30RU/mL，表明样本为阴性。

实施例5

对结核病诊断的敏感度和特异度的评价

应用实施例3制备的抗结核分支杆菌抗体诊断试剂盒，对收集的临床样本进行结核感染的检测，并对结核病诊断的敏感度和特异度进行评价。

样本：在贵州安康医检中心测试结核杆菌阳性病人血清200份，作为敏感度测定样本。正常人血清200份，作为特异性测定样本。

检测结果如表1所示：

表1检测结果

注：真阳性样本指200份患者血清样本用本试剂盒测试是阳性的样本，假阴性样本指200份患者血清样本用本试剂盒测试是阴性的样本。真阴性样本指200份正常人血清样本用本产品测试是阴性的样本，假阳性样本指200份正常人血清样本用本产品测试是阳性的样本。

灵敏度＝真阳性／(真阳性＋假阴性)=192/200=96%。

特异度＝真阴性／(真阴性＋假阳性)=194/200=97%。

结论：本发明的试剂盒具有非常高的灵敏度和特异度。

实施例6

本发明检出限的测定

结核杆菌阳性病人血清10份，每份血清用样本稀释液稀释成1：100，1：1000，1：10000，1：100000，参照实施例4中定性判定，判定结果如表2所示：

表2 检出限测定

结论：本发明提供的产品，在血清稀释10000倍的情况下，仍然能准确检出，检出限低，灵敏度高。

实施例7

本产品批间和批内精密度的测定

(1)批内精密度

选择5份阳性病人血清作为测定样本。每个测定样本在同一批试剂盒重复测定20次。测定完成后，分别计算测定结果均值、标准差(SD)。按(1)式求出每个测定样本的变异系数(CV%)。

CV=SD/100% ……………………(1)

式中：SD为测定样本的标准差；为测定样本的均值：CV%为测定样本的变异系数。结果如表3所示：

表3 批内精密度

/>

(2)批间精密度

批间精密度用批间相对极差表示。选择5份临床患者血清样品作为测定样本。取3个批号的试剂盒，每个批号重复测试3次，测定完成后，分别计算每一份血清9个试剂盒测定结果的总均值T和每个批号3盒试剂盒测定结果的均值/>1、/>2、/>3。

批间相对极差＝……………………(2)

式中：

为三批试剂检测的均值：

为三批试剂中的最大值；

为三批试剂中的最小值。

结果如表4所示：

表4 批间精密度

由此可见，本发明提供的产品具有优良的批间精密度和批内精密度。

实施例7

本发明试剂盒存储稳定性

2～8℃保存24个月，测定结核杆菌阳性病人血清样本，敏感度、特异度、批间和批内精密度均无显著变化。

实施例8

抗原表位肽的组合

本发明人还筛选了近百种抗原表位肽，其中筛选出优选的抗原表位肽的氨基酸序列见下表5。

表5 部分优选的抗原表位肽的氨基酸序列

对于表5中优选的抗原表位肽，进行2种或多种抗原表位肽的组合，并选用经过确诊的100例阳性样本和100例阴性样本，测定这些不同的抗原表位肽的组合对于结核感染的灵敏度和特异性。

结果如表6所示。

表6 不同抗原表位肽的组合的检测结果

结果表明：

首先，从组A结果看，SEQ ID NO:1和2所示的EST-6抗原表位肽可以提供有用的具有一定灵敏度和特异性的诊断信息。

从组B结果看，SEQ ID NO:3、4、5所示的CFP-10抗原表位肽可以提供有用的具有一定灵敏度和特异性的诊断信息。

其次，从组E和组F结果看，当组合中具有SEQ ID No: 1(EST-6抗原表位肽JHP01)和SEQ ID No: 4(CFP-10抗原表位肽JHP04)时，灵敏度和特异性均非常优异。这表明，SEQID NO:1和4对于抗原表位肽的组合的灵敏度和特异度的提高具有显著意义。

此外，基于组G和组I(同实施例1)的结果,可看出将SEQ ID NO:1替换为SEQ IDNO:6，灵敏度和特异度下降(灵敏度从96%降低至85%，特异度从97%降低至88%)，因此，SEQID NO:1对于抗原表位肽的组合灵敏度和特异度的提高具有显著意义。

从上表中组D和组I(同实施例1)的结果，可以看出：抗原表位肽组合缺乏SEQ IDNO:4时，灵敏度和特异度均有大幅下降(灵敏度从96%降低至69%，特异度从97%降低至78%)。因此，SEQ ID NO:4对于抗原表位肽的组合灵敏度和特异度的提高具有显著意义。

上述结果还得到了组H和组I(同实施例1)的结果验证。将SEQ ID NO:4替换为比较接近的对比序列SEQ ID NO:7，灵敏度和特异度也有下降(灵敏度从96%降低至81%，特异度从97%降低至86%)，因此SEQ ID NO:4的存在对于抗原表位肽的组合灵敏度和特异度的提高具有显著意义。

最后，在SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 4的组合的基础上，三种综合性能最优的组合分别为组E、组F和组I，具有高的临床应用价值。

此外，抗原表位肽组合为五种抗原表位肽组合时(SEQ ID NO:1-5)，灵敏度和特异度最高。这表示由SEQ ID NO:1-5抗原表位肽混合物制备的抗原表位肽的组合(组I)检测结核感染的效果最佳。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗原肽混合物，其特征在于，所述抗原肽混合物包括：

(a) 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的EST-6抗原表位肽JHP01；和

(b) 氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CFP-10抗原表位肽JHP04；

其中，抗原表位肽JHP01：抗原表位肽JHP04的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)。

2.如权利要求1所述的抗原肽混合物，其特征在于，所述抗原肽混合物还包括选自下组的一种或多种抗原表位肽：

(c) 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的EST-6抗原表位肽JHP02；

(d) 氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CFP-10抗原表位肽JHP03；

(e) 氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CFP-10抗原表位肽JHP05。

3.如权利要求1所述的抗原肽混合物，其特征在于，所述抗原肽混合物选自下组：

氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的4种抗原表位肽；

或氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的4种抗原表位肽。

4. 如权利要求1所述的抗原肽混合物，其特征在于，所述抗原肽混合物包括：氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的5种抗原表位肽。

5.如权利要求2所述的抗原肽混合物，其特征在于，所述的抗原肽混合物中，JHP01：JHP02：JHP03：JHP04：JHP05的摩尔比为(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)：(1±0.2)。

6.如权利要求1所述的抗原肽混合物的用途，其特征在于，用于制备检测结核感染的检测试剂或试剂盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测结核感染是针对选自下组的样本：血清样本、血液样本、血浆、脑脊液、或胸腔积液。

8. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(Z1)如权利要求1-5任一项所述的抗原肽混合物，或用于形成所述抗原肽混合物的抗原表位肽；和