CN117677639A - 抗体及其抗原结合片段 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段:(i)能够结合至N‑乙酰基‑S‑[2‑羧乙基]‑L‑半胱氨酸(CEMA)并且;(ii)能够结合至包含式[II]化合物的缀合物:其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
Description
技术领域
本发明整体涉及可以用于帮助确定或区分受试者的吸烟状况的免疫测定的新型抗体或其抗原结合片段。
背景技术
在所属领域中已提议烟草被加热而不燃烧的气溶胶生成制品。在加热式气溶胶生成制品中,通过加热基材(诸如烟草)来生成气溶胶。研究表明,将烟草加热至低于高温分解的温度和燃烧温度有可能减少或消除香烟烟雾中存在的一些有毒物质。通常在低于300℃的温度下加热不燃烧烟草足以释放尼古丁,但不足以引起显著的高温分解。在这些温度下,气溶胶组合物变为比香烟烟雾中所存在的更简单的物质。由于烟草的燃烧形成了香烟烟雾中的很多有害和潜在有害成分(HPHC)。因此,降低温度和加热不燃烧烟草可以减少或消除HPHC。
已知加热式气溶胶生成制品包括电加热式气溶胶生成制品,以及其中通过从可燃燃料元件或热源到物理上独立的气溶胶形成材料的热传递而生成气溶胶的气溶胶生成制品。这些所谓的“加热不燃烧”产品为吸烟者提供了常规香烟的替代品,并且可以在仍然提供尼古丁同时减少从烟草中释放的有害化学物质。一种此类烟草加热系统是IQOS(THS),它含有复杂的电子器件,用于加热专门设计的加热烟草单元。THS将烟草加热成足以释放含尼古丁的烟草蒸气,但不会燃烧烟草。香烟中的烟草在超过600℃的温度处燃烧,产生含有大量有害化学物质的烟雾。但是THS将烟草加热至低得多的温度,低达350℃,且不会燃烧、起火、产生灰分或烟雾。由于烟草被加热而不是燃烧,因此与香烟烟雾相比,有害化学物质的水平显著降低。
WO2018/211126中描述了确定或区分受试者的吸烟状况的诊断性测试。例如,该测试可以区分常规香烟的现时吸烟者(“吸烟者”)、已转换至“加热不燃烧”产品(也称为低风险产品或RRP)者(“转换者”)或已戒烟者(“非吸烟者”)。这种测试可具有很多应用。例如,所述测试可用于根据吸烟状况来鉴定和筛选受试者的临床试验。又如,所述测试可用于保障目的,作为监测向RRP的转换和对所述转换的适应的适应性测试。
WO2018/211126中描述了可以用作烟草烟雾暴露生物标志物的各种代谢物,包括可替宁和CEMA。
本领域需要可以以高特异性和灵敏度检测CEMA的试剂,尤其是用于免疫测定形式的试剂。此类试剂应易于制造,具有良好的溶解度和扩散性,并且能够特异性地和灵敏地检测复杂生物学样品(诸如尿液)中的CEMA。本发明旨在解决这种需要。
发明内容
本发明至少部分基于以下出乎意料的发现,即一种新型缀合物是引发强烈的免疫反应以获得抗CEMA抗体或其抗原结合片段的极好的缀合物,所述缀合物包含式[II]化合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基,所述化合物通过接头与免疫原性运载体偶联。CEMA通过接头与免疫原性运载体的缀合改善了免疫系统的识别和抗体的产生。通常,这种所谓的“抗半抗原抗体产生”可以产生靶标亲和力有限 的试剂。然而,有利地,本公开的抗体或抗原结合片段——尤其是scFv形式——即使在包括尿液的复杂生物学样品中也具有对CEMA的高灵敏度和特异性。在噬菌体展示筛选期间获得的96个反应性克隆中,鉴定出28个阳性克隆。从这28个阳性克隆中,收获了产生8个scFv的8个序列,这些scFv在免疫测定中进行测试。在这8个scFv中,基于它们对CEMA的极好灵敏度和特异性选择出3个,这三个在本文中称为“scFv G4”、“scFv B11”和“scFv E6”或者“G4”、“B11”和“E6”。
本发明的方面和实施方案
在一个方面,公开了一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段:(i)能够结合至N-乙酰基-S-[2-羧乙基]-L-半胱氨酸(CEMA)并且;(ii)能够结合至包含式[II]化合物的缀合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中所述式[II]化合物或所述式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联,适当地,其中所述接头通过胺基团与所述式[I]化合物偶联。
适当地,免疫原性运载体是蛋白质,优选地牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
合适地,接头是乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)或二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)。
适当地,抗体是单克隆抗体,优选地,其中其抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv、rIgG或双抗体,更优选地scFv。
适当地,抗体或其抗原结合片段不结合至可替宁或甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)或单羟基丁烯基-巯基尿酸(MHBMA)或3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)或二羟丁基巯基尿酸(DHBMA)。
适当地,尿液抑制百分比为20%或更少、10%或更少、5%或更少或者无抑制。
适当地,抗体或其抗原结合片段在免疫测定中对尿中CEMA的检测限为160ng/mLCEMA。
在另一个方面,公开了一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:分别由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者分别由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者分别由SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
适当地,所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2或11或20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列。
适当地,所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:6或15或24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
适当地,所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者
适当地,所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
适当地,其抗原结合片段选自由以下各项组成的组:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv、rIgG和双抗体,优选地scFv。
适当地,所述抗原结合片段是scFv,并且其中所述scFv包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在另一个方面,公开了一种编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸或者与其互补的多核苷酸。
适当地,多核苷酸包含一种或多种选自由以下各项组成的组的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸:SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34。
在另一个方面,提供了一种包含多核苷酸序列的载体。
适当地,所述载体还包含可操作地连接至编码可变重链结构域和/或可变轻链结构域的核酸的表达控制序列。
在另一个方面,提供了一种含有所述载体的宿主细胞。
适当地,所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
适当地,所述真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
适当地,所述原核细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞。
在另一个方面,提供了一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括温育宿主细胞,以使得编码的可变重链结构域和/或可变轻链结构域由细胞表达;以及回收表达的抗体或其抗原结合片段。
适当地,所述方法还包括分离和/或纯化回收的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,公开了一种用于产生本文所述的抗体的方法,所述方法包括用包含式[II]化合物的缀合物来免疫非人类动物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中所述式[II]化合物或式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联,适当地,其中所述接头通过胺基团与式[I]化合物偶联。
在另一个方面,公开了一种用于确定样品中CEMA的存在或不存在的装置,所述装置包括固定于装置的固相上的本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面,公开了一种用于确定样品中CEMA的存在或不存在的装置,所述装置包括固定于装置的固相上的本文所述的缀合物。
适当地,所述装置是便携式侧流免疫测定装置,优选地,浸棒。
适当地,所述装置包括:(i)样品垫,所述样品垫用于接收样品;(ii)缀合物垫,所述缀合物垫与所述样品垫流体连通;(iii)至少一个检测区,所述检测区与所述缀合物垫的远端流体连通;以及(iv)吸附垫,所述吸附垫与所述检测区的远端流体连通。
适当地,所述缀合物垫包含根据本发明和如上文所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段是经标记的;以及任选地能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段。
适当地,根据本发明和上文所述的抗体或其抗原结合片段是经标记的,并且单独包含在所述装置的中间垫中,所述中间垫定位于所述缀合物垫附近,并且任选地,其中,能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段单独包含在所述缀合物垫中。适当地,所述检测区包含固定于其上的CEMA和任选的可替宁,适当地,其中所述CEMA呈本发明和如上文所述的缀合物的形式。
在另一个方面,公开了一种用于检测样品中的CEMA的方法,所述方法包括使用本文所述的装置,或者一种用于检测样品中的CEMA和可替宁的方法,所述方法包括使用本文所述的装置。
适当地,所述方法包括:(i)将液体生物学样品(优选地尿液)的等分试样施加至所述样品垫,由此所述液体生物学样品通过毛细管作用沿着由所述样品垫、所述缀合物垫、所述检测区限定的流动路径转移;和吸附垫;以及(ii)确定所述检测区中是否存在CEMA以及任选地确定所述检测区中是否存在可替宁。
在另一个方面,公开了如本文所述的抗体或其抗原结合片段或者如本文所述的装置用于检测样品中的CEMA的用途。
附图说明
图1以图表的形式展示了ELISA测定结果,该图表显示了不同的scFv克隆对不同的免疫原和蛋白质(包括scFv G4、scFv B11和scFv E6)的反应性。y-轴表示在450nm处的光密度,x-轴表示CEMA的稀释度。如所附实施例中所述以BioteK EL808读数器测量光密度。
图2提供了使用BTG-EGS-CEMA免疫原和游离的CEMA的scFv竞争性ELISA结果的表格和图表。对于每个数据集,各列从左到右代表游离的CEMA为10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001μg/ml时的结果。y-轴表示在450nm处的光密度,x-轴表示scFv缀合物。如所附实施例中所述以BioteK EL808读数器测量光密度。
图3提供了使用BTG-DSS-CEMA免疫原和游离的CEMA的scFv竞争性ELISA结果的表格和图表。对于每个数据集,各列从左到右代表游离的CEMA为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml和0.0001μg/ml时的结果。y-轴表示在450nm处的光密度,x-轴表示scFv缀合物。如所附实施例中所述以BioteK EL808读数器测量光密度。
图4提供了显示侧流免疫测定反应性测试结果的图表,其中测试了选定的scFV针对BTG-EGS-CEMA免疫原和BTG-DSS-CEMA免疫原的反应性。对于每个数据集,各列从左到右代表BTG-EGS-CEMA免疫原或BTG-DSS-CEMA免疫原的结果。y-轴表示在侧流免疫测定中测量的信号强度,x-轴表示测试中的scFv缀合物。
图5提供了显示侧流免疫测定测试结果的图表,该测试研究游离的CEMA和BTG-EGS-CEMA免疫原对scFV的抑制。对于每个数据集,各列从左到右代表0μg/ml(PBS1x)、阴性尿液、CEMA 500ng/ml(尿液)、CEMA 100ng/ml(尿液)、CEMA 50ng/ml(尿液)、CEMA 20ng/ml(尿液)和CEMA 10ng/ml(尿液)的结果。y-轴表示在侧流免疫测定中测量的信号强度,x-轴表示测试中的scFv缀合物。
图6提供了显示侧流免疫测定测试结果的图表,该测试研究游离的CEMA和BTG-DSS-CEMA免疫原对scFV的抑制。对于每个数据集,各列从左到右代表0μg/ml(PBS1x)、阴性尿液、CEMA 500ng/ml(尿液)、CEMA 100ng/ml(尿液)、CEMA 50ng/ml(尿液)、CEMA 20ng/ml(尿液)和CEMA 10ng/ml(尿液)的结果。y-轴表示在侧流免疫测定中测量的信号强度,x-轴表示测试中的scFv缀合物。
图7提供了显示尿液样品中的选定的scFv的抑制谱的侧流免疫测定测试结果的图表。对于每个数据集,各列从左到右代表G4、B11或E6 scFv的结果。y-轴表示在侧流免疫测定中测量的信号强度,x-轴表示测试中的CEMA量。
图8提供了显示如在侧流免疫测定中所测量,scFV G4、scFV B11和scFV E6针对可替宁和结构接近CEMA的分子的特异性的图表,这些结构接近CEMA的分子是2-羟乙基巯基尿酸(HEMA)、单羟基丁烯基巯基尿酸(MHBMA)、3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)和二羟丁基巯基尿酸(DHBMA)。对于每个数据集,各列从左到右代表G4、B11或E6 scFv的结果。y-轴表示在侧流免疫测定中测量的信号强度,x-轴表示干扰测试中的分子。
图9是示根据本公开的一个方面的便携式侧流免疫测定装置形式的图。
图10是示可以在便携式侧流免疫测定装置上获得的多重测试方案以及它们的解释的图。C=对照;CEM=CEMA测试线;COT=可替宁测试线。
定义
本公开中所用的章节标题用于组织目的并且不旨在进行限制。除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下,将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料,但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所披露的所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。如本文所用,除非上下文另外明确指示,否则单数形式“一个/种”和“该/所述”既包括单数指代物也包括复数指代物。
术语“和/或”意指(a)或(b)或者(a)和(b)两者。
如本文所用,术语“包括”与“包含”或“含有”同义,并且是包括性的或开放式的,且不排除其他未引述的成员、要素或方法步骤。
术语“由……组成”意指排除其他组分,并且仅具有所引述的要素且不具有其他要素。
如本文所用,当提及诸如参数、量、时间持续期等等的可测量值时,术语“约”意味着涵盖指定值的和从指定值的变化,尤其是指定值的和从指定值的+/-10%或更少、优选地+/-5%或更少、更优选地+/-1%或更少、以及还更优选地+/-0.1%或更少的变化,只要这些变化适合于在本公开中实施即可。应当理解,修饰词“约”所指代的值本身也是明确地且优选地公开的。
如本文所用,术语“抗体”涵盖由至少两个完整抗体形成的完整单克隆抗体、多克隆抗体、多价(例如,2价、3价或更多价)和/或多特异性抗体(例如,双特异性抗体或更多特异性抗体),以及它们的抗原结合片段,只要它们表现出所期望的生物学活性(尤其是,特异性结合代谢物–诸如CEMA的能力)即可,以及这些片段的多价和/或多特异性复合物。该术语不仅包括通过包括免疫在内的方法产生的抗体,而且还包括被制备为涵盖能够特异性结合至表位的至少一个互补决定区(CDR)的任何多肽,例如重组表达的或合成的多肽。因此,该术语适用于这些分子,无论它们在体外产生还是在体内产生。
术语“分离的”是指将分子从其天然环境中除去。
尽管术语“一个或多个”,诸如一组成员中的一个或多个成员本身是明确的,但是通过进一步的例证,该术语尤其涵盖对所述成员中的任一者,或对所述成员中的任两者或多者,例如所述成员的任≥三者、≥四者、≥五者、≥六者或≥七者等,以及最多所有所述成员的提及。
术语“标记”是指可以用于提供可检测的以及优选地可定量的读数或性质,并且可以附接至所关注的实体(诸如代谢物或抗体或抗原结合片段)或构成其一部分的任何原子、分子、部分或生物分子。
术语“代谢物”在所属领域中是普遍的,并且可以泛指通过代谢或通过代谢过程所产生的任何物质。换言之,代谢物是代谢产生的终产物。该术语还涵盖代谢物的可检测部分,所述可检测部分在受试者中的定性和/或定量评估单独或与其他数据组合,提供了受试者关于转换适应的状态的信息。代谢物通常是来源于可燃烟草产品的小分子。随时间推移的代谢物监测可以允许待确定的受试者转换适应随时间推移而进展。
当在样品中检测到或确定分子或分子组的存在或不存在和/或数量,优选地基本上排除其他分子时,则在样品中“测量到”所述分子。例如,可以通过如本文所述的实验室测试来测量分子。
术语“非吸烟者”意指此前是吸烟者但在过去3个月内未吸食烟草产品(例如,香烟)的受试者。非吸烟者将被视为已戒烟。适当地,烟草产品或香烟是非薄荷醇烟草产品或非薄荷醇香烟。
术语“纯化的”不要求绝对纯度。相反,它表示离散环境,其中相对于其他分子而言,纯化的分子的丰度(方便地以质量或重量或浓度表示)大于在生物学样品中。离散环境表示单一介质,例如单一溶液、凝胶、沉淀物、冻干物等。纯化的分子可以通过已知的方法来获得,所述方法包括例如色谱法、制备性电泳、离心、沉淀、亲和纯化等。
术语“数量”、“量”和“水平”是同义的,并且通常是所属领域熟知的。关于代谢物,该术语可以特别指样品中的代谢物的绝对定量,或指样品中的代谢物,即,相对于另一个值(诸如,相对于本文教导的基线或参考值)的相对定量,或指表示代谢物的基线表达的值的范围。这些值或范围可以从单个受试者或从一组受试者获得。样品中的代谢物的绝对数量可以有利地表述为重量或摩尔量,或更常见地表述为浓度,例如每体积重量或每体积摩尔数。
如本文所用,术语“样品”或“生物学样品”包括从受试者获得的任何生物学样本。样品可以包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如,外周血单个核细胞)、唾液、尿液、排泄物(即,粪便)、泪液、汗液、皮脂、乳头抽吸液、导管冲洗液、肿瘤渗出物、滑液、脑脊液、淋巴、细针抽吸物、羊水、任何其他体液、指甲屑、细胞裂解物、细胞分泌产物、炎症液、阴道分泌物或活检样品(诸如优选地胎盘活检样品)。优选的样品可以包括包含可检测数量的本文教导的任何一种或多种代谢物的那些样品。在一个实施方案中,样品可以是全血或其部分组分,诸如血浆、血清或细胞沉淀物。优选地,通过微创方法可以容易地获得样品,从而允许检测、除去或分离来自受试者的所述样品。样品还可以包括组织样品和活检样品、组织匀浆物等等。术语“血浆”通常表示血液中基本上无色的含水流体,所述流体不含细胞,但是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)通常悬浮于其中,含有营养物、糖、蛋白质、矿物、酶等。在一个最合适的实施方案中,样品是尿液–诸如24小时尿液,因为它易于且以非侵入方式获得。24小时尿液收集通过将整个24小时时间段内受试者的尿液收集于容器中来进行。
术语“吸烟者”表示在过去一年中平均每天吸食10支或更多支烟草产品(例如,香烟)的受试者。吸烟者通常是现时吸烟者。适当地,烟草产品或香烟是非薄荷醇烟草产品或非薄荷醇香烟。
术语“转换者”表示在过去3个月期间从吸食可燃烟草产品(例如,香烟)转换为加热不燃烧(无烟雾)产品(诸如iQOS)的受试者。
如本文所用,术语“受试者”通常表示人,但是还可以涵盖对非人类动物,优选地温血动物,更优选地胎生动物,甚至更优选地哺乳动物(诸如非人类灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、羊、猪等)的提及。
在检测的语境中,术语“阈值”意指达到或超过某一或定义的量或数量或浓度的点。例如,当达到或超过阈值量或数量或浓度时,免疫测定装置上的测试线可以被构造为产生视觉变化。视觉变化可以是测试线的出现或消失。
具体实施方式
本文所述的抗体或其抗原结合片段能够结合至N-乙酰基-S-[2-羧乙基]-L-半胱氨酸(CEMA)。本文所述的抗体或其抗原结合片段能够结合至包含式[I]或[II]或[III]化合物的缀合物,其中所述化合物通过接头与免疫原性运载体偶联。
本文所述的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至N-乙酰基-S-[2-羧乙基]-L-半胱氨酸(CEMA)。本文所述的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合至包含式[I]或[II]或[III]化合物的缀合物,其中所述化合物通过接头与免疫原性运载体偶联。
因此,抗体或抗原结合片段可以以高亲和力,例如以小于1μM,优选地小于1nM的解离常数(Kd)结合。适当地,抗体特异性结合至CEMA和CEMA缀合物,并且不显著结合至可替宁或结构接近CEMA的分子–诸如2-羟乙基巯基尿酸(HEMA)、单羟基丁烯基巯基尿酸(MHBMA)、3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)或二羟丁基巯基尿酸(DHBMA)。
可以同时、分别或单独评估针对用作如本文所述的烟草烟雾暴露生物标志物的代谢物的相应数量或测量值。适当地,基本上同时或同时评估本文所述的代谢物。适当地,在相同的时间点同时评估本文所述的代谢物。一种或多种代谢物的量可以用于证实受试者是否为常规香烟的现时吸烟者。一种或多种代谢物的量可以用于证实受试者是否已戒烟。一种或多种代谢物的量可以用于证实受试者是否为从常规香烟的现时吸烟者至RRP的吸食者的转换者。可以为受试者建立转换谱,并且可以评估转换适应行为随时间推移的变化,以监测转换行为的进展。方便地,分析可以在单次测试中进行。
代谢物可以包含CEMA或者CEMA和可替宁,或者由CEMA或者CEMA和可替宁组成,或者基本上由CEMA或者CEMA和可替宁组成。在某些实施方案中,旨在涵盖这些代谢物的异构体形式(诸如立体异构体和/或几何异构体和/或光学异构体,以及它们的混合物)、化学衍生物、模拟物、变体、溶剂化物和盐。
在某些实施方案中,如果需要,一种或多种另外的代谢物——诸如一种或多种其他烟草烟雾暴露生物标志物——也可以同时、分开和/或单独测试。此外,样品的更一般的特征可以同时、分开和/或单独评估。例如,为了测试样品的掺杂性或稀释度,可以检测某些特征。就尿液样品而言,可以测量尿液样品中的许多特征-诸如pH、比重、氧化剂、亚硝酸盐、戊二醛和肌酐水平中的一者或多者。
CEMA是丙烯醛暴露的专有的尿液生物标志物。在吸烟者中,CEMA的尿液排出已显示出一致性地高于非吸烟者中。在非吸烟者中的范围通常小于2ng/mL,并且在吸烟者中增加至大于20ng/mL至205ng/mL的水平。在一个实例中,吸烟者排出187±181μg/L(平均值±SD)或184μg/L CEMA,而非吸烟者仅排出4.6±35μg/L或1.9μg/L。吸食20或更多支香烟/天(CPD)的吸烟者,如果被要求在5天的禁闭期期间恰好吸食20、15、5或0CPD,则显示出香烟的数量与尿液CEMA的水平之间的剂量关系(分别为218.0、168.0、93.2和38.3μg/24h)。5至8天的停烟研究显示出尿液中CEMA的水平显著降低约7至10倍。CEMA可以使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测–诸如通过免疫测定。各种类型的免疫测定技术是如本文所述的领域已知的。用于测量CEMA的各种方法是本领域已知的–诸如超高效液相色谱与电喷雾电离串联质谱联用。尿液中的CEMA的测定还描述于Anal.Bioanal.Chem.(2009)393:969-981和Anal Biochem.(2012)430(1):75-82中。
另一种代谢物是可替宁,在吸烟者的尿液中检测到的主要尼古丁代谢物。各种生物学流体中的可替宁水平被广泛用于估算烟草吸食者中的尼古丁摄入量。可替宁具有约20小时的体内半衰期,并且可以在烟草香烟的使用之后若干天检测到。血液、唾液和尿液中的可替宁水平与烟草烟雾的暴露量成比例。可替宁水平<10ng/mL表示未主动吸烟。值为10ng/mL至100ng/mL表示轻度吸烟或中度暴露。水平大于300ng/mL表示吸食超过20CPD的重度吸烟者状态。在尿液中,在11ng/mL和30ng/mL之间的值表示轻度或中度吸烟,并且主动吸烟者中的水平为约500ng/mL或更高。在唾液中,在1ng/mL和30ng/mL之间的值表示轻度或中度吸烟,并且主动吸烟者中的水平为约100ng/mL或更高。可替宁可以使用抗可替宁抗体或其抗原结合片段来检测–诸如通过免疫测定。用于测量可替宁的其他方法包括比色方法、气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)以及放射免疫测定(RIA)。用于测量可替宁的方法还在BMB Rep.(2014)3月;47(3):130–134;J Clin Diagn Res.(2016)3月;10(3):ZE04–ZE06和Ther Drug Monit.(2009)2月;31(1):14–30中有所描述。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子,它具有不同的结构,所有结构均基于免疫球蛋白折叠。例如,IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链,它们通过二硫键连接形成功能性抗体。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区确定抗体的抗原结合特异性,而C区在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体或其抗原结合片段特异性结合至特定抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征确定。可变性在可变结构域的110个氨基酸范围内不均匀地分布。相反,V区由15-30个氨基酸的相对不变的序列段(称为框架区(FR))组成,所述框架区由较短的极端可变区(称为“高变区”)分开,所述高变区的长度为9-12个氨基酸。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR,所述FR主要采取β-折叠构型,通过三个高变区连接,形成连接β-折叠结构的环,并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起,并且与另一条链中的高变区一起,有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出各种效应子功能,诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的抗体参与。
每个V区通常包含三个CDR(每个CDR含有“高变环”)和四个框架区。因此,抗体结合位点,即以显著亲和力结合至特定所期望的抗原所需的最小结构单元,将通常包括三个CDR,以及至少三个、优选地四个散布在其间的框架区,以保持和呈递CDR的适当构象。经典的四链抗体具有由VH结构域和VL结构域协作限定的抗原结合位点。某些抗体(诸如骆驼抗体和鲨鱼抗体)缺乏轻链,仅依赖于重链形成的结合位点。可以制备单结构域工程化的免疫球蛋白,其中结合位点仅由重链或轻链形成,而VH和VL之间不存在协作。
本文所述的抗体或其抗原结合片段可以被分离或纯化至任何程度。在一些实施方案中,抗体的天然环境的污染组分是会干扰抗体的(诊断)用途的材料,并且可以包括酶和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中,抗体或抗原结合片段将被纯化:(1)至大于95重量%的抗体,如通过Lowry方法所测定,并且最优选地大于99重量%;(2)足以通过使用旋转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度;或者(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝染色或优选地银染达到的同质性。通常,分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类中的任一者,优选地IgG类抗体。抗体可以是多克隆抗体,例如,抗血清或由其纯化(例如,亲和纯化)的免疫球蛋白。适当地,抗体是单克隆抗体或单克隆抗体的混合物。单克隆抗体可以以更大的选择性和再现性靶向特定抗原或抗原内的特定表位。例如但不限于,可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature 256:495描述的杂交瘤方法,或者使用三源杂交瘤技术,或者使用人B细胞杂交瘤技术(Kozbor(1983)Immunology Today 4:72)以及EBV-杂交瘤技术(产生人单克隆抗体)(Cole等人,(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.77-96)来制备单克隆抗体。
可以对编码抗体或抗原结合片段的DNA进行测序,提供以小规模或大规模重组产生抗体或其抗原结合片段的信息。还公开了一种用于产生抗体的方法,所述方法包括用如本文所述的CEMA缀合物来免疫非人动物。正如产生重组抗体或其抗原结合片段的方法那样,产生抗体及其抗原结合片段的方法是所属领域熟知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbour Laboratory,New York,1988;Harlow和Lane,“Using Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring HarbourLaboratory,New York,1999,ISBN 0879695447;“Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques”,Zola编,CRC Press 1987,ISBN 0849364760;“Monoclonal Antibodies:APractical Approach”,Dean和Shepherd编,Oxford University Press 2000,ISBN0199637229;Methods in Molecular Biology,第248卷:“Antibody Engineering:Methodsand Protocols”,Lo编,Humana Press 2004,ISBN 1588290921)。单克隆抗体也可以使用如通过例如Clackson等人(1991)Nature 352:624-628)和Marks等人.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库分离。
抗体可以是其抗原结合片段。此类片段包括完整抗体的一部分,所述部分包括抗体的抗原结合区或可变区。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;以及由抗原结合片段形成的多价和/或多特异性抗体,例如双抗体、三抗体和多抗体。
技术人员将理解,抗体可以包含一个或多个氨基酸缺失、添加和/或置换(例如,保守置换),只要这些改变保持抗体与CEMA或CEMA缀合物的结合即可。为了保持结合,可以对抗体的氨基酸序列中不负责结合CEMA或CEMA缀合物的那些部分进行此类改变。抗体还可以包含其组成氨基酸残基的一种或多种天然或人工修饰(例如,糖基化),只要此类改变保持抗体与CEMA或CEMA缀合物的结合即可。
抗体或其抗原结合片段可以与检测剂(诸如标记)缔合或附接,以便进行检测。此类检测剂的实例包括但不限于发光标记、比色标记(诸如染料)、荧光标记或化学标记(诸如电活性剂)、酶、放射性标记或射频标记。检测剂的实例包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。检测剂可以是颗粒——诸如胶体金颗粒、胶体硫颗粒、胶体硒颗粒、胶体硫酸钡颗粒、胶体硫酸铁颗粒、金属碘酸盐颗粒、卤化银颗粒、二氧化硅颗粒、胶体金属(水合)氧化物颗粒、胶体金属硫化物颗粒、胶体硒化铅颗粒、胶体硒化镉颗粒、胶体金属磷酸盐颗粒、胶体金属铁酸盐颗粒、涂覆有有机层或无机层的上述胶体颗粒中的任一者、蛋白质或肽分子、脂质体或有机物聚合物胶乳颗粒——诸如聚苯乙烯胶乳珠粒。更合适和优选的颗粒是胶体金颗粒,它是最常用的标记之一。胶体金可以通过任何常规手段——诸如使用G.Frens(1973)Nature Physical Science,241:20(1973)的方法来制备。替代性方法在US 5,578,577、US 5,141,850、US 5,079,172、US 5,202,267、US5,514,602、US 5,616,467和US 5,681,775中有所描述。
检测剂可以是允许用另一种试剂(诸如结合配偶体)进行检测的标签。此类标签可以是例如FLAG标签、生物素、链霉亲和素、组氨酸标签、myc标签、麦芽糖、麦芽糖结合蛋白或具有结合配偶体的所属领域已知的任何其他类型的标签。可以利用的缔合的实例可以包括生物素:链霉亲和素、组氨酸标签/金属离子或麦芽糖/麦芽糖结合蛋白。在某些实施方案中使用FLAG标签是优选的。
在一些实施方案中,直接或间接标记抗体以允许检测样品中的代谢物。例如,可以将经标记的抗体与样品组合,并且检测经标记的抗体-代谢物复合物。
根据本发明,CEMA可以使用如本文所述的抗体或其抗原结合片段来检测。具体而言,抗体或其抗原结合片段能够结合CEMA,并且能够结合至包含式[II]化合物的缀合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中式[II]或式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联。在一个实施方案中,接头通过胺基团与式[I]化合物偶联。
在一个实施方案中,式[I]化合物具有式[III]化合物的结构:
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其中R选自H和C1至C6烷基。
本发明的三种此类抗体已经被广泛表征并且在本文中表示为“B11scFv”、“E6scFv”和“G4 scFv”(并且在本文中也可以称为“B11”、“E6”和“G4”)。对于B11 scFv、E6 scFv和G4 scFv,VL链和VH链的可变结构域中的每个的三个CDR的多肽序列在本文中有所描述。
B11 scFv的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别对应于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。B11 scFv的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别对应于SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
E6 scFv的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别对应于SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列。E6 scFv的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别对应于SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
G4 scFv的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别对应于SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列。G4 scFv的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别对应于SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
抗体或其抗原结合片段可以包含由SEQ ID NO:2或11或20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列。
抗体或其抗原结合片段可以包含由SEQ ID NO:6或15或24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
抗体或其抗原结合片段可以包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。这些是B11 scFv的VH和VL氨基酸序列。
抗体或其抗原结合片段可以包含由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。这些是E6 scFv的VH和VL氨基酸序列。
抗体或其抗原结合片段可以包含由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。这些是G4 scFv的VH和VL氨基酸序列。
还公开了包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的scFv:SEQ ID NO:1(B11 scFv)或SEQ ID NO:10(E6 scFv)或SEQ ID NO:19(G4 scFv)。
根据Kabat编号对B11、E6和G4 scFv的氨基酸序列进行的详细分析提供于表1中。
对于B11 scFv、E6 scFv和G4 scFv中的每个,VL链和VH链的可变结构域中的每个的多核苷酸序列也在本文中有所描述。
B11 scFv的VH可以由包含SEQ ID NO:29或由其组成的多核苷酸序列编码。B11scFv的VL可以由包含SEQ ID NO:30或由其组成的多核苷酸序列编码。
E6 scFv的VH可以由包含SEQ ID NO:32或由其组成的多核苷酸序列编码。B11scFv的VL可以由包含SEQ ID NO:33或由其组成的多核苷酸序列编码。
G4 scFv的VH可以由包含SEQ ID NO:35或由其组成的多核苷酸序列编码。B11scFv的VL可以由包含SEQ ID NO:36或由其组成的多核苷酸序列编码。
抗体或其抗原结合片段可以包含由包含以下序列或由它们组成的多核苷酸序列编码的VH:SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:35。
抗体或其抗原结合片段可以包含由包含以下序列或由它们组成的多核苷酸序列编码的VL:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36。
还公开了可以由包含以下序列或由它们组成的多核苷酸序列编码的scFv:SEQ IDNO:28(B11 scFv)或SEQ ID NO:31(E6 scFv)或SEQ ID NO:34(G4 scFv)。
在某些实施方案中,B11和G4是优选的。在某些实施方案中,B11是优选的。
如技术人员将理解,存在用于分配/鉴定抗体VL/VH链中的CDR序列的多种模型。最通用/广泛接受的形式是Chothia和Kabat模型,但是也存在其他模型,诸如ABM和CONTACT模型。如本领域的惯例,本文提供的CDR序列使用Kabat模型(Kabat等人,(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.)来确定。
多种免疫原性运载体蛋白中的任一者可以用于本发明的缀合物,例如,蛋白质、肽、寡核苷酸或聚合物。免疫原性运载体蛋白与接头偶联。具体实例是白蛋白(诸如牛血清白蛋白(BSA))、球蛋白、甲状腺球蛋白、血红蛋白、血蓝蛋白、聚赖氨酸、聚谷氨酸、赖氨酸-谷氨酸共聚物以及含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物。合适的蛋白质的类别包括纤毛、外膜蛋白和病原细菌的分泌毒素、此类分泌毒素的无毒或“类毒素”形式、与细菌毒素抗原性相似的无毒蛋白以及其他蛋白质。还设想了使用病毒蛋白。在一个优选的实施方案中,免疫原性运载体是蛋白质,合适地,BSA或牛甲状腺球蛋白(BTG)。
在一个方面,公开了一种用于制备上文所述的缀合物的方法,所述方法包括:(a)活化免疫原性运载体;以及(b)使步骤(a)中获得的活化的免疫原性运载体通过接头与式(I)的化合物偶联。
在本发明中,式(I)的化合物连接至免疫原性运载体蛋白,该连接涉及使用式(I)的化合物的伯胺(-NH2)基团。存在很多与伯胺形成化学键的合成化学基团。这些包括异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤、酰亚氨酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯酯。大多数这些基团通过酰化或烷基化与胺缀合。
在一个实施方案中,使用接头辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS),它是不可切割的和膜可渗透的交联剂,在8碳间隔臂的每个末端处均含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。NHS酯在pH7-9处与伯胺反应形成稳定的酰胺键,并且释放N-羟基琥珀酰亚胺离去基团。首先将DSS溶解于有机溶剂(诸如DMF或DMSO)中,然后添加至水性交联反应中。
在另一个实施方案中,使用接头乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)。EGS是水不溶性的同双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)。间隔臂含有两个可切割的酯位点,该位点可以用羟胺切割,
产生两个具有末端酰胺键的片段并释放乙二醇。蛋白质和肽的N-末端上存在的可接近的α-胺基团以及赖氨酸的ε-胺在pH7-9处与NHS酯反应形成共价酰胺键。该反应导致N-羟基琥珀酰亚胺的释放。NHS酯交联反应最常在磷酸盐、碳酸盐/碳酸氢盐、HEPES和硼酸盐缓冲液中进行。
对于缀合物的制备,技术人员将能够容易地确定合适的缀合方法,例如,如Hermanson,G.T.(1996)Bioconjugate Techniques第1版;Academic Press:San Diego,California,第1卷中所提供。
在一个实施方案中,缀合物(免疫原)包含式[I]化合物:
其中式[I]化合物经由EGS接头与BTG偶联,该EGS接头与式[I]化合物的胺基团偶联。该化合物在本文中称为“BTG-EGS-CEMA”。
在另一个实施方案中,缀合物(免疫原)包含式[I]化合物:
其中式[I]化合物经由DSS接头与BTG偶联,该DSS接头与式[I]化合物的胺基团偶联。该缀合物在本文中称为“BTG-DSS-CEMA”。
式[I]化合物确保与蛋白质偶联后的完整CEMA结构。
在本发明的一个实施方案中,本发明的抗体是抗原结合片段是优选的。适当地,抗原结合片段是scFv。根据本公开,通过针对本文所述的CEMA缀合物筛选ELISA噬菌体来鉴定scFv,并且在挑选的96个菌落中,具有高信号的28个“命中”被鉴定为阳性。提取DNA并测序,鉴定出8个非冗余序列,然后将非冗余序列用于产生8个scFv,在ELISA和侧流免疫测定中测试scFv的CEMA结合。基于以下高度有利的性质选择3个scFv(在本文中表示为G4 scFv、B11scFv和E6 scFv):
1)CEMA运载体半抗原的反应性。从图1可以看出,在ELISA测定中,与单独的CEMA-BTG和BTG相比,G4、B11和E6与BTG-EGS-CEMA和BTG-DSS-CEMA具有良好的反应性。
2)使用BTG-EGS-CEMA和游离的CEMA进行的竞争性ELISA中的结合抑制。从图2可以看出,G4、B11和E6在10μg/ml游离的CEMA处具有可接受的抑制百分比,其中1μg/ml游离的CEMA区分灵敏度。
3)使用BTG-DSS-CEMA和游离的CEMA进行的竞争性ELISA中的结合抑制。从图3可以看出,G4、B11和E6在10μg/ml游离的CEMA和1μg/ml游离的CEMA处具有可接受的抑制百分比,其中0.1μg/ml游离的CEMA区分灵敏度。
4)通过侧流免疫测定进行的scFv的反应性测试。从图4可以看出,G4、B11和E6被免疫原BTG-EGS-CEMA和BTG-DSS-CEMA识别。scFv G12和G9不被任一免疫原识别,并且scFv G8具有低识别度。获得了针对scFv E6、F8、G6、B11和G4的可接受的反应性测试。
5)与尿液的交叉反应。从图5可以看出,直到100ng/mL尿液为止B11、E6和G4对免疫原BTG-EGS-CEMA的良好抑制(表示阳性信号)均得以实现。在存在尿液的情况下,信号略有减少,但未受到抑制。从图6可以看出,直到100ng/mL尿液为止B11、E6和G4对BTG-DSS-CEMA免疫原的良好抑制(表示阳性信号)也得以实现。在存在尿液的情况下,信号略有减少,但未受到抑制。可以看出,B11、E6和G4允许检测CEMA大于100ng/mL的所有阳性尿液。
6)从图7可以看出,B11、E6和G4允许检测CEMA大于100ng/mL的所有阳性尿液。
7)从图8可以看出,使用1μg/ml的测试浓度,未观察到与可替宁或结构接近CEMA的化合物(包括2-羟乙基巯基尿酸(HEMA)、单羟基丁烯基巯基尿酸(MHBMA)、3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)或二羟丁基巯基尿酸(DHBMA))的交叉反应性。G4、B11对CEMA具有高度特异性。
基于该实验数据,得出以下结论:G4、B11和E6是用于检测CEMA(尤其是在尿液中)的极好的scFv。因此,在一个优选的实施方案中,抗体是其抗原结合片段。在一个更优选的实施方案中,抗原结合片段是scFv片段。在一个更优选的实施方案中,抗原结合片段是如本文定义的scFv G4、scFv B11和scFv E6。
F(ab’)2(110,000道尔顿)片段含有两个通过二硫键在铰链处连接的抗原结合区。该片段缺乏大部分(但不是全部)Fc区。
Fab’(55,000道尔顿)片段可以通过F(ab’)2片段的还原来形成。Fab’片段含有游离的巯基基团,该巯基基团可以被烷基化或用于与酶、毒素或其他所关注的蛋白质缀合。Fab’来源于F(ab’)2;因此,它含有含有一小部分Fc。
Fab(50,000道尔顿)是可以由IgG和/或IgM产生的一价片段,由VH、CH1和VL、CL区组成,这些区通过分子内二硫键连接。
Fv(25,000道尔顿)是由IgG和/或IgM产生的最小片段,含有完整的抗原结合位点。Fv片段具有与Fab相同的结合性质和相似的三维结合特征。Fv片段的VH链和VL链通过非共价相互作用保持在一起。这些链在稀释时往往会解离,因此已经开发出通过戊二醛、分子间二硫化物或肽接头来使这些链交联的方法。
scFv是单链Fv,可以方便地通过重组进行制备。分子量为大约28,000Da。它由免疫球蛋白VH和VL的可变区组成,这些可变区通过10-25个氨基酸的短连接肽来连接。每个VH和VL结构域均含有三个CDR。为了制备scFv,首先从杂交瘤(或脾、淋巴细胞和骨髓)分离mRNA,然后将mRNA逆转录为cDNA,作为使用例如PCR进行抗体基因扩增的模板。通过这种方法,可以产生具有多种抗体VH和VL基因的大型文库。生物淘选,即从噬菌体展示文库中选择结合配偶体的程序,被用于获得具有最佳亲和力和特异性的scFv。一旦抗体基因被成功克隆和测序,scFv片段就可以容易地在合适的表达系统中表达。通常将合适的纯化标签添加至抗体scFv片段的C-末端——所述标签诸如多组氨酸标签、FLAG标签、HA标签和Myc标签。蛋白酶切割大小可以被设计为允许在纯化后移除标签。或者,标签可以被保留并用于免疫测定。关于scFv的更多细节可见于Ahmad等人(2012)Clinical and developmental immunology(2012),Biosensors and Bioelectronics(2016)85,32-45,MAbs(2010)2(1)77–83和US 4,946,778。
本文还提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞以及用于产生抗体或其抗原结合片段的重组技术。本文所述的抗体可以通过重组表达来产生。编码轻链可变区和重链可变区的核酸任选地连接至恒定区,并且插入表达载体中。轻链和重链可以克隆到相同的或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接至表达载体中的控制序列,以确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子、信号序列、增强子元件和转录终止序列。一旦表达载体掺入适当的宿主中,宿主就可以在适用于核苷酸序列的高水平表达以及交叉反应性抗体或其抗原结合片段的收集和纯化的条件下维持。通常,表达载体含有选择性标记,以允许检测用所期望的DNA序列转化的细胞。抗体或其抗原结合片段不仅可以直接重组产生,而且也可以作为与异源性多肽的融合多肽产生,该异源性多肽优选地是信号序列或者在成熟蛋白质或多肽的N-末端处具有特定切割位点的其他多肽。优选地选择的异源性信号序列是被宿主细胞识别和加工(即,被信号肽酶切割)的异源性信号序列。当重链和轻链被克隆到单独的表达载体上时,载体即可被共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和组装。一旦表达,就可以纯化完全抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或者其他免疫球蛋白形式。具有至少约90%至95%同质性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的,并且98%至99%或更高的同质性是最优选的。
当使用重组技术时,抗体或其抗原结合片段可以在细胞内、在周质空间中产生,或直接分泌至培养基中。如果抗体或其抗原结合片段在细胞内产生,则作为第一步,例如通过离心或超滤除去颗粒碎片、宿主细胞或裂解的片段。Carter等人,(1992)Bio/Technology10:163-167描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简而言之,使细胞浆在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下解冻约30分钟。细胞碎片可以通过离心除去。当抗体或其抗原结合片段分泌至培养基中时,通常首先使用商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)来浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解,并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。从细胞制备的抗体或其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化,其中亲和色谱是优选的纯化技术。用于蛋白质纯化的其他技术,诸如离子交换色谱柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸色谱柱)上的肝素SEPHAROSETM色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也可以根据要回收的抗体或其抗原结合片段来使用。
免疫测定可以用于使用本发明的抗体或其抗原结合片段来检测本文所述的代谢物中的一种或多种——包括CEMA。免疫测定技术是本领域已知的并且包括直接ELISA(酶联免疫吸附测定)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、多重ELISA、放射免疫测定(RIA)技术、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、DRI免疫测定、定量免疫测定、侧流免疫测定、微流体免疫测定和凝集免疫测定以及本领域已知的其他类似的技术。这些免疫测定方法的原理描述于例如John R.Crowther,"The ELISA Guidebook",第1版,Humana Press 2000,ISBN0896037282中。关于实用免疫色谱的其他信息可见于手册“Lateral flowimmunochromatography assays”P.J.Davies等人著,2008年3月15日在线发表,WileyOnline Library中。
直接ELISA采用经标记的一抗或其抗原结合片段来结合至固定在固体支持物(诸如微孔板)上的样品中的靶抗原,从而对靶抗原进行定量。
间接ELISA使用未标记的一抗或其抗原结合片段(结合至靶抗原)和经标记的二抗或其抗原结合片段(识别和允许定量抗原结合的一抗或其抗原结合片段)。
在夹心ELISA中,使用固定化‘捕获’抗体从样品捕获靶抗原,所述固定化‘捕获’抗体结合抗原内的一个抗原位点,在除去未结合的代谢物之后,使用‘检测’抗体来检测这样捕获的抗原,所述‘检测’抗体结合所述抗原内的另一个抗原位点,其中所述检测抗体如上文所述可以是直接标记的或可间接检测的。
竞争性ELISA是优选的免疫测定,它使用经标记的“竞争剂”,所述经标记的“竞争剂”可以是一抗或靶抗原。在一个实例中,将未标记的固定化一抗与样品一起温育,使该反应达到平衡,然后添加经标记的靶抗原。后者将结合至一抗未被来自样品的未标记的靶抗原占据的结合位点之处。因此,已结合的经标记的抗原的检测量与样品中未标记的抗原的量成反比。
多重ELISA允许同时检测通常处于多个阵列地址的单个隔室内的两种或更多种代谢物(参见例如Nielsen和Geierstanger 2004.J Immunol Methods290:107-20以及Ling等人,2007.Expert Rev Mol Diagn 7:87-98以获得进一步指导)。
应当理解,ELISA技术中的标记通常通过酶缀合来进行,并且终点通常是比色、化学发光或荧光、磁性、压电、热电等等。
用于免疫测定的装置通常用于单次和家庭用途,因为它们能够容易和迅速地使用,并且可以使用肉眼来查看结果。在一些情况下,对于确定一种或多种代谢物的存在和/或数量,可能需要更复杂的装置,例如当不能用肉眼来解读或产生不确定性时。这种装置在WO2016/075405中有所描述。
放射免疫测定(RIA)可以用于检测本文所述的一种或多种代谢物,包括CEMA。这是基于竞争的技术并且涉及将已知数量的放射性标记的(例如,125I-标记的或131I-标记的)靶抗原与所述抗原的抗体或其片段混合,然后添加来自样品的未标记的或‘冷’抗原并测量被替代的经标记的抗原的量(参见"An Introduction to Radioimmunoassay and RelatedTechniques",Chard T编,Elsevier Science 1995,ISBN 0444821198)。
凝集免疫测定可以用于检测本文所述的一种或多种代谢物,包括CEMA。这些测定利用抗体或其片段与抗原–DNA缀合物的结合和凝集(凝结),使DNA链连接,然后通过包括定量聚合酶链式反应(qPCR)方法进行定量。
适当地,免疫色谱用于检测本文所述的代谢物中的一种或多种——包括CEMA。它也称为侧流免疫色谱测定。免疫色谱可以整合到简单的装置中,所述装置旨在检测样品诸如尿液中代谢物的存在(或不存在),而无需专用和昂贵的装备。如下文所讨论,免疫色谱也可以整合到便携式侧流免疫测定装置中。
免疫色谱的一般原理是基于含有或疑似含有代谢物中的一种或多种的液体样品在无外力辅助的情况下通过毛细管作用通过侧流试纸条的各个区来进行检测。侧流测试条通常包括(i)样品垫;(ii)缀合物垫;(iii)检测区;和(iv)任选的吸收垫。样品垫和任选的吸收垫定位于侧流测试条的相对末端。通常,缀合物垫邻近样品垫,检测区邻近缀合物垫,并且任选的吸收垫邻近检测区。
侧流测试条的第一元件是用于样品的多孔元件,所述多孔元件在本文中称为样品垫。它作为海绵并容纳过量的样品流体。它通常由纤维素或玻璃纤维或它们的组合制成。它的功能是将样品运输至侧流测试条的其他组件。样品垫应能够以平稳、连续和均匀的方式运输样品。根据需要,样品垫可以浸渍有溶液–诸如缓冲盐和表面活性剂。一旦浸透,流体即可迁移至侧流测试条的第二元件。
侧流测试条的第二元件是用于缀合物的多孔元件,所述多孔元件在本文中称为缀合物垫。这是经标记的抗体或其抗原结合片段(包括能够单独地结合CEMA(或在某些测定形式中,CEMA类似物)和任选地其他代谢物的的那些)存在之处。玻璃纤维、纤维素和聚酯是用于制备缀合物垫的物质的实例。经标记的抗体或其抗原结合片段可以以干燥形式存在于缀合物垫中的基质(例如,盐-糖基质)中。在某些实施方案中,当期望检测除CEMA之外的代谢物时,可以使用两种、三种或四种或更多种不同的抗体或其抗原结合片段。可以根据需要调整所述特异性结合剂的量,以微调针对每种代谢物的测定灵敏度。通常,所使用的经标记的抗体或其抗原结合片段的量对于不同的代谢物是不同的。经标记的抗体或其抗原结合片段可以根据需要用相同的或不同的标记来进行标记。样品流体使经标记的抗体或其抗原结合片段溶解,并且在一次组合运输作用中,样品和经标记的抗体或其抗原结合片段在流过缀合物垫时混合,形成经标记的抗体或其抗原结合片段-代谢物缀合物。侧流测试条将具有一个或多个其中固定有一种或多种另外的分子的检测区–诸如测试线。通常,检测区将是硝酸纤维素膜。检测区的确切构型将取决于测定的形式。阳性或阴性结果的确定可以使用肉眼进行,或者如果需要数字或自动化结果,则使用读取器进行。例如,读取器可以是相机——诸如电荷耦合器件照相机或光学传感器——诸如共焦光学传感器。
根据本发明,竞争性形式通常是优选的形式,因为它通常用于具有较少的结合位点的较小的代谢物——诸如CEMA。样品首先遇到靶标代谢物的经标记或用标签标记的抗体。在使用标签标记的抗体的实施方案中,检测将被允许通过用标签标记抗体(将被标记)进行。测试线含有固定至表面的靶标代谢物。当样品中不存在靶标代谢物时,未结合的抗体将结合至这些固定的代谢物分子,这意味着将显示出视觉标记物。相反,当靶标代谢物存在于样品中时,它结合至抗体,以防止抗体与测试线中的固定代谢物结合,因此不会显示出视觉标记物。在被构造用于竞争性形式的装置的一个实施方案中:(a)缀合物垫包含沉积于其上的靶标代谢物的经标记的抗体或由它们组成:并且(b)检测区包含固定至表面的靶标代谢物或由它们组成,所述靶标代谢物可以包括如本文所述的CEMA或CEMA缀合物。在被构造用于利用标签的竞争性形式的装置的另一个实施方案中:(a)缀合物垫包含沉积于其上的经标记的抗标签抗体或由它们组成;(b)中间垫含有沉积于其上的靶标代谢物的用标签标记的抗体或其抗原结合片段,所述用标签标记的抗体包括如本文所述的用标签标记的CEMA抗体或抗原结合片段;并且(b)检测区包含固定至表面的靶标代谢物或由它们组成,所述靶标代谢物可以包括如本文所述的CEMA或CEMA缀合物。
适当地,中间垫仅含有CEMA的用标签标记的抗体或其抗原结合片段。当检测多于一种代谢物时,中间垫的单独位置允许微调与缀合物垫分离的CEMA标签标记的抗体或其抗原结合片段的量。
在通过缀合物垫和检测区之后,流体可以进入最终多孔元件,所述元件在本文中称为吸收垫。它作为废物容器,并且是任选的特征。侧流测试条的每个部分被固定或安装在背衬卡上,所述背衬卡作为支持物并使条带更易于操作。
当用装置检测多于一种代谢物时,也可以使用多重形式。多重检测形式可以以多种方式例如通过增加侧流测试条的长度或检测区的长度来构建。多重形式可使用竞争形式。在某些实施方案中,多重竞争形式是优选的。
为了获得一旦样品中一种或多种代谢物的水平大于某些预定阈值水平或参考值或基线值即形成信号的定性或半定量结果。根据测定形式,可以将颜色或信号的强度与参考颜色或信号图进行比较。或者,可以用电子装置(包括例如吸光度传感器或光发射计)来测量颜色或信号的量或强度,得到所形成的信号强度或颜色吸收的数值。对于监测受试者中一种或多种所述代谢物在一段时间内的水平,该实施方案是相关的。如果需要,还可以测量检测区的强度以确定样品中的代谢物的数量。几家公司使用称为侧流读取器的手持式诊断装置来提供完全定量的测定结果。一种此类手持式侧流装置平台由Detekt BiomedicalLLC制造。
侧流测试条可以被构造为包括阳性对照,以表示针对尿液中不具有任何代谢物的受试者进行测试(使用例如肌酸、白蛋白或尿液专有的蛋白质–诸如塔姆-霍斯福尔蛋白(THP)作为一种或多种标记物)。在一个实施方案中,侧流免疫测定的使用是优选的。在另一个实施方案中,竞争形式侧流免疫测定的使用是优选的。
在另一个实施方案中,本公开提供了一种便携式侧流免疫测定装置–诸如浸棒-以检测本文所述的代谢物中的一者或多者。装置使用如上文所讨论的免疫色谱的原理。
便携式侧流免疫测定装置通常将包括包含在外壳–诸如液密或不透液外壳–中的侧流测试条,以允许装置浸入样品中,并且仅允许侧流测试条的必要元件被润湿。装置通常将具有细长的形状,所述装置的尺寸可以根据装置的实际用途而变化;示例性尺寸为长度6cm至8cm,宽度3cm至6mm。
便携式侧流免疫测定装置的实例在WO2007/023372、EP1657550、US2015/168397中有所描述。
图10描绘了以竞争性测定形式构造的优选的便携式侧流免疫测定装置或浸棒100。在该实施方案中,装置或浸棒100被构造为检测CEMA和可替宁。在其他实施方案中,装置或浸棒100可被构造为检测CEMA和除可替宁之外的代谢物。在其他实施方案中,装置或浸棒100可以被构造为仅检测CEMA。装置100由赋予刚性的PVC支持物109制成,并且其上安装有硝酸纤维素膜110。从近端开始,存在用于沉积待测试的样品的样品垫102,并且朝向装置的远端移动,图中示出了邻近样品垫的缀合物垫103、邻近缀合物垫的中间垫104、可替宁测试线105、CEMA测试线106和对照测试线107。技术人员将理解,根据需要,缀合物垫和中间垫可以如图所示布置或交替围绕。技术人员还将理解,根据需要,测试线可以以任何顺序布置。侧流装置或浸棒100终止于吸收垫108以充当远端处的废物容器。缀合物垫103含有多孔材料,所述多孔材料含有:(i)与标记(胶体金)缀合的干燥的单克隆标签(例如,抗FLAG标签)标记的抗体;以及(ii)与相同的标记(胶体金)缀合的多克隆抗可替宁抗体。如果需要,可以使用不同的标记。中间垫104由含有干燥的具有标签(例如,FLAG标签)的抗CEMA scFv的多孔材料制成。FLAG标签是多肽标签,可以添加至具有氨基酸序列基序DYKDDDDK的蛋白质(Hopp等人(1988)Bio/Technology.6(10):1204–10)。CEMA测试线106含有如本文所述的CEMA缀合物。抗CEMA scFv在CEMA测试线106上的存在使用与最初存在于缀合物垫中的胶体金缀合的抗标签抗体来检测。可替宁测试线105含有可替宁-蛋白质缀合物。可替宁的存在使用与最初存在于缀合物垫中的相同的标记(胶体金)缀合的多克隆抗可替宁抗体来检测。虽然未示出,但是装置100可以容纳在液密或不透液的壳体中,从而允许装置100浸入液体样品中。外壳可以包括塑料或由其组成。样品可以是液体样品–诸如尿液。装置100可具有细长的形状,所述装置的尺寸可以根据装置的实际用途而变化;示例性尺寸为长度6cm至8cm,宽度3cm至6mm。
示例性竞争性免疫测定测试形式的结果显示于图10中,其中可替宁和CEMA测试呈阳性表示测试受试者是吸烟者。在本发明的一个实施方案中,测试的检测限对于可替宁测试线为200ng/mL并且对于CEMA测试线为160ng/mL。当测试样品中的可替宁的量大于200ng/mL时,将产生阳性信号;当测试样品中的可替宁的量小于200ng/mL时,将产生阴性信号。当测试样品中的CEMA的量大于160ng/mL时,将产生阳性信号;当测试样品中的CEMA的量小于160ng/mL时,将产生阴性信号。在竞争性形式中,可替宁或CEMA的结果呈阳性将意味着测试线不存在,并且可替宁或CEMA的结果呈阴性将意味着测试线存在。可替宁和CEMA测试呈阴性表示测试受试者是非吸烟者。可替宁测试呈阳性并且CEMA测试呈阴性表示测试受试者是从吸烟者至RRP的吸食者的转换者。无对照线表示测试无效。测试呈阳性表明已经超过检测阈值。由于图10中所示的测试构型是竞争性测定,因此当不存在CEMA或可替宁测试线时,结果为阳性,因此在测试线处不存在信号表示存在代谢物,而存在信号则表示不存在代谢物。在某些实施方案中,竞争形式对于在本公开中使用是优选的。
本公开还提供了用于检测代谢物中的一种或多种的套件,所述套件包括用于检测来自受试者的样品中的一种或多种代谢物的水平的装置。在一个优选的实施方案中,这样的一种或多种套件理论上被设计用于家庭或由医生在一般实践环境中的用途。
还公开了一种套件,特别是一种用于确定受试者中的如本文教导的受试者的吸烟状况的套件,所述套件包括(i)用于测量特别是在来自受试者的样品中的如本文教导的代谢物的构件,以及(ii)任选地针对一种或多种代谢物的参考值或用于确立所述参考值的构件,其中所述参考值表示代谢物的检测。
家庭测试套件可以为受试者提供读数,所述受试者可以就所述读数与执业医生进行交流,其后采取适当的行动。非限制性实例为:包含针对附接至固相的一种或多种必要代谢物的特异性结合分子的系统,例如便携式侧流免疫测定装置-诸如浸棒。一个非限制性实例是使用侧流测试条和经标记的抗体或其抗原结合片段,该组合不要求对膜进行任何洗涤。侧流测试条是例如妊娠测试套件领域熟知的,其中第一抗hCG抗体提供于支持物上,并且通过使尿液流到允许可视化的固定化第二抗hCG抗体上而与hCG进行复合。此类家用测试装置、系统或套件的其他非限制性实例可见于例如以下美国专利:6,107,045、6,974,706、5,108,889、6,027,944、6,482,156、6,511,814、5,824,268、5,726,010、6,001,658或美国专利申请:2008/0090305或2003/0109067。
还公开了一种用于确定受试者的吸烟状况的套件,所述套件包括以下各项或由以下各项组成:(i)第一装置,所述第一装置适用于检测CEMA在生物学样品中的存在;和(ii)第二装置,所述第二装置适用于检测可替宁在生物学样品中的存在;以及任选地,用于确定受试者的吸烟状况的一组指令。
本发明还提供了包含如本文所述的多核苷酸的核酸构建体。通常,构建体将是允许在合适的宿主中表达由多核苷酸编码的多肽的表达载体。构建体可以包含例如以下中的一者或多者:在宿主中有活性的启动子;一种或多种调控序列,诸如增强子;复制起点;以及标记物,优选地选择性标记。宿主可以是真核或原核宿主。构建体可以包含编码多肽的多核苷酸,所述多肽编码scFv。构建体可以包含编码包含三条轻链或三条重链的多肽的多核苷酸。或者,多核苷酸可以编码包含通过适当长度的适当柔性接头连接的三条重链和三条轻链的多肽。另一种可能性是单个构建体可以包含编码两个单独的多肽的多核苷酸——一个包含轻链,一个包含重链。单独的多肽可以独立地表达或可以形成单个共同操纵子的一部分。构建体可以包含一个或多个调节特征部,诸如增强子、复制起点以及一种或多种标记物(选择性标记物或其他标记物)。构建体可以以液体或固体形式提供,优选地作为冻干粉末提供,该冻干粉末通常在使用前用无菌水性液体来再水合。
载体包括表达载体和转化载体和穿梭载体。
表达载体是指能够在体内或体外表达的构建体。
转化载体是能够从一个实体转移到另一个实体的构建体——该实体可以属于同一物种或可以属于不同物种。如果构建体能够从一个物种转移到另一个物种——诸如从大肠杆菌质粒转移到诸如芽孢杆菌属(Bacillus)细菌,则转化载体有时称为穿梭载体。构建体甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到农杆菌再到植物的构建体。
载体可以转化至如下文所述的合适的宿主细胞,以提供本发明涵盖的多肽的表达。因此,在另一个方面,本发明提供了一种用于制备用于本发明的多肽的方法,所述方法包括在提供编码多肽的编码序列的载体的表达的条件下培养用如上文所述的表达载体转化或转染的宿主细胞,以及回收表达的多肽。载体可以是例如具有复制起点、任选地用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。载体可以含有一种或多种本领域熟知的选择性标记基因。很多已知的重链和轻链表达载体是可商购获得的。技术操作人员可以选择表达与原始抗体相同的恒定区亚型的载体。然后,可以容易地将重链可变区和轻链可变区的序列相应地放置于载体中。很多已知的商购获得的载体可用于scFv表达。
本发明还提供了一种包含本文所述的多核苷酸或构建体的宿主细胞——诸如体外宿主细胞。例如,宿主细胞可以是细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在某些实施方案中,宿主细胞是细菌。
大肠杆菌是一种可以使用并且在某些实施方案中是优选的原核宿主。其他微生物宿主包括芽孢杆菌(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)(诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种)。在这些原核宿主中,可以制备通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如,复制起点)的表达载体。此外,将存在任何数量的多种熟知的启动子,诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达,任选地具有操纵子序列,并且具有核糖体结合位点序列等等,以用于转录和翻译的起始和完成。
其他微生物(诸如酵母)也可以用于表达。酵母属(Saccharomyces)是优选的酵母宿主,其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如,启动子)、复制起点、终止序列等等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等等。
除了微生物之外,哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达和产生如本文所述的抗体或其片段(参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987))。本领域已经开发出很多能够分泌异源性蛋白质(例如,完整免疫球蛋白)的合适的宿主细胞系,这些宿主细胞系包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在某些实施方案中CHO细胞是优选的。
或者,可以将抗体编码的序列掺入转基因中,以引入转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达(参见,例如,US 5,741,957)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。
或者,本文所述的抗体或其抗原结合片段可以在转基因植物(诸如烟草、玉米、大豆和苜蓿)中产生。改进的“植物抗体(plantibody)”载体(参见Hendy等人(1999)J.Immunol.Methods 231:137-146)和纯化策略加上可转化作物物种的增加使得此类方法成为产生重组免疫球蛋白的实用和有效的手段。此外,已经显示植物产生的抗体是安全有效的。
全长抗体或抗原结合片段或抗体融合蛋白可以在细菌中产生。在大肠杆菌中产生更快且更经济。对于抗原结合片段和多肽在细菌中的表达,参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。
还在以下实例中描述了本发明,提供所述实例以更详细地描述本发明。这些实例阐述目前设想用于进行本发明的优选模式,意图说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1-CEMA连接的缀合物的合成
使用二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)或乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)接头将氰乙基巯基尿酸(CEMA)与作为运载体蛋白的β-甲状腺球蛋白(BTG)缀合。首首先,将CEMA和BTG在PBS(pH 7.4;137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4,溶于水)中稀释至20mg/ml。将EGS或DSS分别在干燥DMSO中在室温处溶解2小时达到15mM,然后以2000rpm离心2分钟,并收集所得的上清液。然后将上清液以10x摩尔过量添加至CEMA-BTG混合物中,并在室温处温育四小时,然后用1M Tris缓冲液(pH 7.4)以20mM的终浓度淬灭30分钟。然后将混合物以2000rpm离心2分钟,收集上清液,然后在Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液(10X缓冲液:1M Tris碱、1M硼酸、0.02M EDTA,溶于无RNA酶的水中,稀释至1X待用)中透析2小时,以除去其余的DMSO。
实施例2-免疫和抗CEMA文库构建
给3月龄新西兰兔皮下注射1mg BTG-DSS-CEMA或BTG-EGS-CEMA免疫原(根据实施例1制备)并在不完全弗氏佐剂中以1:1的比率稀释。兔每两周注射一次,总共注射最多五次。在第三次至第五次注射后一周,通过从耳血管获取5mL血样血清来测试抗体效价。然后使血液在室温处凝结一小时,然后以3200rpm离心15分钟,并将血清层吸移至新管中。然后使用针对BSA-DSS-CEMA、BSA-EGS-CEMA和BSA(作为阴性对照)的间接ELISA测定来测试收集的血清的抗体效价。为此,将96孔板用1μg/ml缀合的抗原(溶于PBS,pH 7.5)在4℃处涂覆过夜。然后用PBS将平板洗涤三次,然后用2.5%溶于PBS的乳(pH 7.4)封闭,并用PBS再洗涤三次。然后每孔添加50μL初级血清(1:100稀释并连续稀释1/10),并且将平板在37℃处温育一小时,然后用PBS洗涤三次。然后以1/5000稀释度添加50μL缀合至HRP的抗兔IgG抗体(Jackson 111-036-046),并在37℃处温育一小时,然后用PBS再次洗涤三次。最后,将孔与50μL TMB(KPL 52-00-01)一起温育10分钟,然后通过添加50μL酸终止溶液(H2SO4 0.1M)来终止。然后在BioteK EL808读取器中测量450nm处的信号。
响应的效价以ELISA中给出最高信号的50%的稀释度计算。选择具有最高抗体效价(1/170000)的兔,并用在不完全弗氏佐剂中以1:1比率稀释的1mg BTG-DSS-CEMA或BTG-EGS-CEMA再次注射,然后实施安乐死并取出脾。
收获脾并在Trizol试剂中切成小块,并使用分散仪器(IKA T18D Ultra-Turrax)粉碎,然后通过标准Trizol/BCP方案来提取mRNA。为此,将粉碎的兔脾放置于30ml TRI试剂中,在室温处温育5分钟,然后离心(4℃,2500g,10分钟),然后将3mL BCP添加至新管中的上清液中,并在室温处温育15分钟。将管离心(4℃,17500g,15分钟),然后将12mL异丙醇添加至上清液中,涡旋(15秒)并在室温处温育10分钟。然后,在离心(4℃,17500g,10分钟)后,使用1.5mL 75%乙醇来洗涤总RNA沉淀,离心(4℃,17500g,10分钟),然后在室温处干燥。对于定量,将RNA沉淀溶解于分子生物学级水中,并在光谱仪(Nanodrop)上定量。然后,在0.8%(w/v)琼脂糖凝胶上分析总RNA,从而确认18S和28S rRNA条带,并将剩余的RNA储存在-20℃的温度处。
对于免疫文库构建,根据制造商的说明,使用SuperScript III第一链合成(SuperMix(Invitrogen))对20μg总RNA进行逆转录。第一步,将20μg分离的mRNA与1μL退火缓冲液和1μL(50μM)寡核苷酸dT混合,在65℃处温育5分钟,放置于冰上1分钟。随后,仍在冰上时,按照制造商的说明添加10μl 2x第一链反应混合物和SuperScriptTMIII(ThermoFisher Scientific)/RNaseOUTTM酶混合物(Thermo Fisher Scientific)。在混合后,将反应在50℃处放置50分钟。通过在85℃处温育5分钟来终止反应。在终止后,将反应混合物放置于冰上或储存在-20℃处以备未来需要,因为对于储存cDNA比RNA更稳定。分别使用兔特异性引物VLκ、VLλ以及VH正向引物和反向引物进行PCR,以扩增编码可变结构域VLκ、VLλ和VH的cDNA(Ridder,R.,Schmitz,R.,Legay,F.等人Generation of Rabbit MonoclonalAntibody Fragments from a Combinatorial Phage Display Library and TheirProduction in the Yeast Pichia pastoris.Nat Biotechnol 13,255–260(1995))。对于50μL总体积PCR反应,将2μL cDNA产物,10x PCR缓冲液(100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和50mM KCl,pH 8.3)、0.2μM引物、0.2mM dNTP、1mM MgCl2和5单位的Taq DNA聚合酶引入反应容器中,并用无菌三蒸水调节反应混合物的最终体积。PCR反应由35个循环组成,每个循环包括:在94℃处加热使DNA变性5分钟(预变性)、94℃ 30秒(变性)、55℃ 30秒(退火)和72℃60秒(聚合)。在最后一个循环后,在72℃处再加热10分钟以终止PCR反应。在PCR后,在琼脂糖凝胶(0.8%)上分析5μL每种PCR产物,仅合并显示出扩增的VLκ、VLλ和VH反应。
将编码VL(VLκ和VLλ)和VH的cDNA片段分别在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,并使用凝胶提取套件(Illustra GFXR,GE)按照制造商说明进行提取/纯化,并克隆到pGemT载体(Promega)中作为备用材料,连接反应制备如下:
3个连接反应在4℃处温育过夜并储存于-20℃处。
如下所述将重链和轻链的PCR产物依次克隆到pTH1噬菌粒载体(Biotem,France)中。
第一步,制备用于文库克隆的pTH1和VL结构域载体。如下所述消化两个载体以用于VL克隆:
溶液或组分 | 体积 | 终浓度 |
dH2O | 83-xμL | - |
pHAL14或VL | xμL | 5μg或2μg |
NEB缓冲液3(10x) | 10μL | 1x |
BSA(100x) | 1μL | 1x |
NEB MluI(10U/μl) | 3μL | 30U |
NEB NotI(10U/μl) | 3μL |
将消化在37℃处温育2h,并在1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳上进行控制。使酶在65℃处失活10分钟,然后添加0.5μL CIP(1U/μL),并在37℃处温育30分钟。pTH1和VL结构域均使用PCR纯化套件根据制造商的说明进行纯化,并用50μL洗脱缓冲液或水进行洗脱。
如下所述将VL(约380bp)用于载体pTH1中的连接:
溶液或组分 | 体积 | 终浓度 |
dH2O | 89-x-yμL | - |
pHAL14 | xμL | 1000ng |
VL(κ或λ) | yμL | 270ng |
T4连接酶缓冲液(10x) | 10μL | 1x |
T4连接酶(3U/μL) | 1μL | 3U |
在16℃处温育过夜,用10μL 3M乙酸钠pH 5.2和250μL乙醇沉淀连接产物,在室温处温育2分钟,并以16000g在4℃处离心5分钟。用乙醇洗涤沉淀,并在4℃处以16000g离心2分钟,然后溶于35μL dH2O中。对于DNA扩增,在使用1.7kV脉冲电穿孔之前,将连接反应与电感受态XL1-Blue MRF’细胞一起温育。脉冲时间在4ms与5ms之间,以获得最佳电穿孔效率。立即添加1mL 37℃预热的SOC培养基,并储存于2mL盖中,并在600rpm和37℃处振荡1小时。为了确定转化子的量,将10μL(=10-2稀释度)的转换用于进行低至10-6的稀释系列,并在2xYT-GAT琼脂平板上以10-6稀释度铺板,在37℃处温育过夜。将其余的990μL铺板于2xYT-GAT琼脂平板上,并在37℃处温育过夜。然后,使用德里加尔斯基(drigalsky)刮刀用40mL2xYT培养基收获平板上的菌落,并根据制造商的说明将5mL细菌溶液用于小量质粒制备。
对于第二克隆步骤,如下所述消化pTH1-VL和pGemT-VH库:
溶液或组分 | 体积 | 终浓度 |
dH2O | 81-xμL | - |
pTH1-VL或VH | xμL | 5μg或2μg |
NEB缓冲液2(10x) | 10μL | 1x |
BSA(100x) | 1μL | 1x |
NEB NcoI(10U/μl) | 3μL | 30U |
NEB HindIII(20U/μl) | 5μL | 100U |
将消化在37℃处温育2h,并在1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳上进行控制。使酶在65℃处失活10分钟,然后添加0.5μL CIP(1U/μL),并在37℃处温育30分钟。pTH1-VL和VH结构域均使用PCR纯化套件根据制造商的说明进行纯化,并用50μL洗脱缓冲液或水进行洗脱。如下所述连接载体pTH1-VL(约4610bp)和VH(约380bp):
溶液或组分 | 体积 | 终浓度 |
dH2O | 89-x-yμL | - |
pTH1 | xμL | 1000ng |
VH | yμL | 250ng |
T4连接酶缓冲液(10x) | 10μL | 1x |
T4连接酶(3U/μL) | 1μL | 3U |
在16℃处温育过夜,用10μL 3M乙酸钠pH 5.2和250μL乙醇沉淀连接产物,在室温处温育2分钟,并以16000g在4℃处离心5分钟。用乙醇洗涤沉淀,并在4℃处以16000g离心2分钟,然后溶于35μL dH2O中。对于DNA扩增,在使用1.7kV脉冲电穿孔之前,将连接反应与电感受态XL1-Blue MRF’细胞一起温育。脉冲时间在4ms与5ms之间,以获得最佳电穿孔效率。立即添加1mL 37℃预热的SOC培养基,并储存于2mL盖中,并在600rpm和37℃处振荡1小时。为了确定转化子的量,将10μL(=10-2稀释度)的转换用于进行低至10-6的稀释系列,并在2xYT-GAT琼脂平板上以10-6稀释度铺板,并在37℃处温育过夜。将其余的990μL铺板于2xYT-GAT琼脂平板上,并在37℃处温育过夜。然后,使用德里加尔斯基(drigalsky)刮刀用40mL2xYT培养基收获平板上的菌落,并根据制造商的说明将5mL细菌溶液用于小量质粒制备,将800μL细菌溶液用于制备甘油储备液。每个子文库制备5-25瓶甘油储备液并储存于-80℃处。
为了包装文库,用1mL抗体基因文库储备液来接种1L锥形瓶中的400mL 2xTY-GA,并在37℃处以250rpm温育至O.D.600nm为约0.5。
将细菌培养物(~1.25*1010个细胞)以2.5*1011集落形成单位(cfu)的辅助噬菌体M13K07一起混合,在不振荡的情况下温育30分钟,然后在37℃处以250rpm温育30分钟。scFv噬菌体文库在250rpm、30℃处过夜产生。通过添加1/5体积的PEG溶液从上清液中收获噬菌体,在4℃处轻轻振荡温育1小时,然后在10000g处离心1小时。弃去上清液,将噬菌体沉淀悬浮于10mL噬菌体稀释缓冲液中,并添加1/5体积的PEG溶液,在冰上温育20分钟,并通过以10000g离心30分钟来沉淀。然后弃去上清液,将噬菌体沉淀悬浮于1mL噬菌体稀释TBS缓冲液中。
实施例3-淘选
对于噬菌体展示的抗体片段的选择,进行淘选。为此,将96孔Nunc Maxisorp圆底微量滴定板(Thermo Fisher Scientific)用4mL 10–100μg/mL抗原溶液(BTG-EGS-CEMA、BTG-DSS-CEMA,溶于0.1M NaHCO3缓冲液,pH 8.6)在4℃处涂覆过夜。将涂覆的孔用含有4%脱脂乳(4% PBSM)的300μL PBS洗涤和封闭,并用PBS/0.1% Tween 20(Sigma)洗涤两次,用PBS洗涤两次。然后,将100μL含有7×107个噬菌体的新鲜制备的噬菌体添加至每个孔中,并将平板在37℃处温育2小时,并轻轻摇动。每个孔用200μL含有0.5% Tween 20的PBS洗涤五次。使用0.05%胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)来洗脱每个孔中的结合的噬菌体。然后通过转化大肠杆菌(XL1蓝色MRF’)来重新扩增洗脱的噬菌体,并且与M13K07辅助噬菌体(如上文所述)一起温育并滴定。将新噬菌体用于进一步淘选,直到实现CEMA特异性噬菌体的显著富集。总共针对CEMA进行七轮生物淘选以富集结合性噬菌体。
实施例4-具有最强结合的scFv的鉴定
在淘选后,通过ELISA来测定特异性抗原结合,以鉴定具有最强结合的噬菌体/scFv。为此,通过用BTG-EGS-CEMA或BTG-DSS-CEMA涂覆96孔板来进行ELISA-噬菌体,并且在PBS(pH 7.5)中稀释,在4℃处放置过夜。然后用PBS洗涤平板三次,然后用在Tris缓冲(15mM)盐水(TBS,pH 7.4)中的1% BSA封闭,并用PBS再洗涤三次。然后每孔添加50μL选定的菌落,并将平板在37℃处温育一小时,然后用PBS洗涤三次。其次,然后添加稀释的50μL缀合至HRP的抗M13KO7抗体,并在37℃处温育一小时,然后用PBS再洗涤三次。最后,将孔与50μL TMB底物一起温育5分钟,然后通过添加50μL酸终止溶液来终止。然后在BioteK EL808读取器中测量450nm处的信号。
具有最高BTG-EGS-CEMA/BTG(信号/背景)比率的二十八种抗体被视为阳性。对这二十八个克隆进行DNA提取,并且通过序列比对来鉴定八个非冗余序列。然后这八个scFv以可溶性scFv产生,并在ELISA和LFIA中进行测试。
实施例5-所选的scFv的产生以及在ELISA中使用EGS或DSS进行的灵敏度比较
对于可溶性scFv产生,将克隆DNA用于大肠杆菌HB2151菌株转化,该大肠杆菌菌株是专门用于产生的。根据制造商的说明,使用NI-NTA色谱柱(Qiagen)上的HIS标签来纯化以可溶性scFv表达的scFv。
在竞争性ELISA中,将未标记的一抗scFv与靶抗原一起温育。为此,用1μg/ml BTG-EGS-CEMA或BTG-DSS-CEMA涂层来预涂覆96孔ELISA板,在4℃处放置过夜,并在第二天洗涤三次,并与封闭缓冲液(PBS,pH7.4,含2.5%乳)一起温育在37℃处温育1小时,以减少非特异性结合。然后,将未标记的一抗scFv R4C-B11、R5C-G4、R5C-F8、R5C-G6、R5C-G9和R5C-E6添加至预涂覆ELISA板的scFv-CEMA混合物孔中,并在37℃处温育1小时。然后用PBS洗涤孔三次,然后与在37℃处缀合至HRP的抗Flag二抗一起在37℃处再温育一小时,然后再次用PBS洗涤并与TMB底物一起温育5分钟。然后通过添加终止溶液来终止反应,并测量450nm处的吸光度(O.D.值)信号。使用相同的方法来生成标准曲线,但不是添加样品,而是将已知浓度的重组CEMA稀释系列添加至6-8个孔中。然后通过将每个样品孔与标准曲线进行比较,使用O.D.来计算每个孔中所关注的分子的量。
如图2所示,在存在10μg/mL游离的CEMA的情况下,R4C-B11、R5C-G4、R5C-F8、R5C-G6和R5C-E6具有77%-97%的高抑制百分比。然而,在1μg/mL游离的CEMA下,可以鉴定具有最佳灵敏度的scFv。对于BTG-EGS-CEMA,最灵敏的scFv如下:R4C-B11>R5C-F8>R5C-G6>R5C-E6=R5C-G4。
类似地,图3显示,在存在10μg/mL游离的CEMA的情况下,R4C-B11、R5C-G4、R5C-F8和R5C-E6有效抑制BTG-DSS-CEMA的结合。然而,在0.1μg/mL游离的CEMA下,抑制百分比表明,对于BTG-DSS-CEMA,具有最佳灵敏的scFv如下:R4C-B11>R5C-G6>R5C-F8>R5C-E6>R5C-G4。
实施例6-在侧流免疫测定中使用EGS或DSS制备的所选的scFv的灵敏度比较
在示例性侧流免疫测定中,侧流测试条包括(i)样品垫;(ii)缀合物垫;(iii)中间垫,(iv)检测区;和(v)任选的吸收垫(参见图9)。缀合物垫(纤维素纤维)的制备方法是将垫浸入含有Tween 20、0.5% BSA(重量/体积)的Hepes(pH 8),以及在530nm处的光密度(OD)为5的缀合至胶体金的单克隆抗FLAG标签抗体的稀释液,以及OD为0.5的缀合至胶体金的多克隆抗可替宁抗体的稀释液中。将垫在37℃处干燥过夜。通过将垫浸入含有Tween20、0.5%BSA(重量/体积)的Hepes(pH 8)和10μg/ml抗CEMA scFv稀释液中来制备中间垫。检测区包括两个测试线,这两个测试线的制备方法是将0.25mg/ml游离的BSA-DSS-CEMA或BSA-EGS-CEMA或0.25mg/ml游离的可替宁-BSA微喷到硝酸纤维素膜上,并使膜在37℃处干燥过夜。因此,当侧流测试条的样品垫浸入样品液体(例如,尿液)中或者使用移液器将样品添加至盒的样品孔中时,尿液通过毛细管作用通过每个垫吸入测试条中,将干燥的抗可替宁和抗FLAG标签抗体释放到中间垫,其中抗CEMA scFv结合至样品中的CEMA,并且抗FLAG标签抗体结合至抗CEMA scFv。类似地,抗可替宁抗体结合至尿液中的可替宁。然后这些免疫原-抗体复合物被进一步吸入侧流测试条到达测试线上,其中尿液中与可替宁或CEMA结合的抗体将无法与测试线可替宁或CEMA结合,因此不产生任何线。然而,如果尿液样品呈阴性,则抗CEMA和抗可替宁抗体自由结合至测试线上的可替宁和CEMA,产生颜色线。在添加尿液样品后5分钟读取检测结果,并且有一条由山羊抗小鼠抗体组成的对照线(参见图9和10)。
当进行LFIA时,使用实施例4中描述的八种抗CEMA scFv中的每种在中间垫上制备侧流测试条。
如图4所示,scFv与BTG-EGS-CEMA免疫原的结合略好于BTG-DSS-CEMA免疫原。类似地,图4表明,scFV R5C-G12和R5C-G9不识别这两种免疫原。scFV R5C-G8对CEMA的识别度似乎也较低。
实施例7-尿液中的抑制谱
由于scFV R5C-G12、R5C-G9和R5C-G8在实施例6中显示出较差的反应性,因此在本实施例的侧流免疫测定测试中仅使用R4C-B11、R5C-G4、R5C-F8、R5C-G6和R5C-E6来测定尿液的抑制谱。
使用含有10-500ng/mL CEMA的尿液来进行侧流免疫测定测试(如实施例6中所述),其中1x PBS和CEMA阴性尿液作为测试线上的BTG-EGS-CEMA涂层的阴性对照。如图5所示,scFv R5C-G6和R5C-F8在存在阴性尿液的情况下受到轻微抑制,因此可能不适合用于尿液侧流测试,因为可能会出现假阳性风险。抑制被认为是由于尿液中的高离子含量造成的。
然而,如图5所示,scFv R4C-B11、R5C-E6和R5C-G4在1x PBS和阴性尿液样品中均显示出阴性结果,但是在尿液样品中存在500ng/mL和100ng/mL CEMA的情况下显示出强抑制。R4C-B11在50ng/mL CEMA尿液样品中也显示出强抑制。如图5所示,当尿液样品中存在极少量CEMA(10-20ng/mL)时,scFv R4C-B11、R5C-E6和E5C-G4均显示出阴性反应。
因此,仅使用scFv R5C-G4、R4C-B11、R5C-E6对BTG-DSS-CEMA涂层进行侧流免疫测定(参见图6)。三种选定的scFv中的每种均在50-500ng/mL CEMA尿液样品中展示出良好的抑制。
因此,scFv R5C-G4、R4C-B11、R5C-E6在0.488-535ng/mL CEMA的稀释度中进行测定(图7)。scFv R5C-G4、R4C-B11、R5C-E6中的每种都可以检测到含量超过100ng/mL的阳性尿液样品。35ng/mL或以下的样品显示为阴性。
实施例8-所选的scFv的特异性
基于实施例5、6和7的结果,使用侧流免疫测定与测试线上具有类似于CEMA的结构的其他分子(诸如HEMA、MHBMA、3-HPMA、DHBMA,浓度为1μg/mL)来测试scFv R5C-G4、R4C-B11和R5C-E6的特异性。
如图8所示,scFv R5C-G4、R4C-B11和R5C-E6与类似的分子中的任一者无交叉反应性。因此,scFv R5C-G4、R4C-B11和R5C-E6对CEMA具有高特异性。
实施例9-用于人尿液中的CEMA和可替宁的定性检测的快速测试套件
设计了一种快速侧流免疫色谱测定测试套件,用于定性检测人尿液中的可替宁和CEMA。该测试套件旨在区分吸烟者、RRP(低风险产品)使用者和非吸烟者。
该套件是一种竞争性免疫色谱竞争性测定,用于检测人尿液中的可替宁和CEMA。当样品中不存在CEMA和/或可替宁时,出现测试线,但是当样品中存在CEMA或可替宁时,信号受到抑制,并且不出现测试线。在测试过程中,尿液样品与胶体金纳米颗粒反应,该纳米颗粒与针对可替宁的多克隆抗体或针对CEMA的单克隆抗体或其抗原结合片段缀合。然后,混合物通过毛细管作用迁移通过膜,并且与分别印刷在测试线1和2上的可替宁-BSA和CEMA-BSA缀合物分子相遇。如果样品中存在可替宁和/或CEMA,则它们抑制抗体的结合,防止出现颜色测试线。相反,如果样品不含可替宁和/或CEMA,则缀合抗体将识别测试线上的CEMA或可替宁缀合物分子,从而导致测试线的出现。对照线上应始终出现标记为“C”的颜色线,表明施加有足够的体积或尿液并且发生适当的测试迁移。
标本收集:将尿液收集到提供的收集杯中,并通过在侧面写上供体的姓名和尿液收集日期来标识样品。使用提供的移液器,收集100μL尿液,并通过按压储液器顶部将移液器管内含有的液体的总体积分配到装置的样品孔中。在5分钟至10分钟之间读取结果。请勿在10分钟后读取。
阴性结果:出现三条线,一条在对照区域(C),一条在可替宁(1)和CEMA(2)区域的每条测试线中。它应该被解释为非吸烟者的尿液。如果可替宁和CEMA的浓度低于检测限(每天吸食香烟的数量较少),也可以获得阴性结果。
阳性结果:对照区域(C)内出现一条线。它应被解释为吸烟者的尿液(尿液中含有CEMA和可替宁)。对照区域(C)和CEMA测试线(2)内出现两条线。它应被解释为转换者的尿液(尿液中只有可替宁)。
无效结果:如果未出现对照线(C),则测试结果无效。使用新测试来重复该程序。
在以下编号段落中阐述了本公开的其他方面。
1.一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段:(i)能够结合至N-乙酰基-S-[2-羧乙基]-L-半胱氨酸(CEMA)并且;(ii)能够结合至包含式[II]化合物的缀合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中所述式[II]化合物或所述式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联,适当地,其中所述接头通过胺基团与所述式[I]化合物偶联。
2.根据段落1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述免疫原性运载体是蛋白质,优选地,牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
3.根据段落1或段落2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述接头是乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)或二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)。
4.根据前述段落中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是单克隆抗体,优选地其中所述其抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv、rIgG或双抗体,更优选地scFv。
5.根据前述段落中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体不结合至可替宁或甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)或单羟基丁烯基-巯基尿酸(MHBMA)或3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)或二羟丁基巯基尿酸(DHBMA)。
6.根据前述段落中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中尿液抑制百分比为20%或更少、10%或更少、5%或更少或者无抑制。
7.根据前述段落中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段在免疫测定中对尿中CEMA的检测限为160ng/mL CEMA。
8.一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:分别由SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者分别由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者分别由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQID NO:23的氨基酸序列组成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:25、SEQID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
9.根据段落8所述的抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2或11或20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列。
10.根据段落8或段落9所述的抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:6或15或24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
11.根据段落8所述的抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ IDNO:24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
12.根据段落8至12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述其抗原结合片段选自由以下各项组成的组:Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv、rIgG和双抗体,优选地scFv。
13.根据段落12所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段是scFv,并且其中所述scFv包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
14.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码根据段落1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或与其互补的多核苷酸。
15.根据段落14所述的多核苷酸,包含一种或多种选自由以下各项组成的组的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸:SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34。
16.一种载体,所述载体包含根据段落14或段落15所述的多核苷酸序列。
17.根据段落16所述的载体,还包含可操作地连接至编码可变重链结构域和/或可变轻链结构域的核酸的表达控制序列。
18.一种宿主细胞,所述宿主细胞含有根据段落16或段落17所述的载体。
19.根据段落18所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
20.根据段落19所述的宿主细胞,其中所述真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
21.根据段落19所述的宿主细胞,其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
22.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括温育根据段落18至20中任一项所述的宿主细胞,以使得编码的可变重链结构域和/或可变轻链结构域由所述细胞表达;以及回收表达的抗体或其抗原结合片段。
23.根据段落22所述的方法,还包括分离和/或纯化回收的抗体或其抗原结合片段。
24.一种用于产生根据段落1至13中任一项所述的抗体的方法,所述方法包括用缀合物来免疫非人动物,所述缀合物包含式[II]化合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中所述式[II]化合物或式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联,适当地,其中所述接头通过胺基团与式[I]化合物偶联。
25.一种用于确定样品中CEMA的存在或不存在的装置,所述装置包括固定于所述装置的固相上的根据段落1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
26.根据段落25所述的装置,其中所述装置是便携式侧流免疫测定装置,优选地,浸棒。
27.根据段落25或段落26所述的装置,其中所述装置包括:(i)样品垫,所述样品垫用于接收样品;(ii)缀合物垫,所述缀合物垫与所述样品垫流体连通;(iii)至少一个检测区,所述检测区与所述缀合物垫的远端流体连通;以及(iv)吸附垫,所述吸附垫与所述检测区的远端流体连通。
28.根据段落27所述的装置,其中所述缀合物垫包含根据段落1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段是经标记的;以及任选地能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段。
29.根据段落28所述的装置,其中根据段落1至13中任一项所述的经标记的抗体或其抗原结合片段,以及能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段包含在彼此流体连通的单独的垫中。
30.根据段落28所述的装置,其中所述经标记的抗体或其抗原结合片段单独包含在所述装置的中间垫中,所述中间垫定位于所述缀合物垫附近,并且任选地,其中,能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段单独包含在所述缀合物垫中。
31.根据段落25至30中任一项所述的装置,其中所述检测区包含固定于其上的CEMA和任选的可替宁,适当地,其中所述CEMA呈根据段落1或段落2所述的缀合物的形式。
32.一种用于检测样品中的CEMA的方法,所述方法包括使用根据段落25至31中任一项所述的装置,或者一种用于检测样品中的CEMA和可替宁的方法,所述方法包括使用根据段落25至31中任一项所述的装置。
33.根据段落32所述的方法,包括:(i)将液体生物学样品(优选地尿液)的等分试样施加至所述样品垫,由此所述液体生物学样品通过毛细管作用沿着由所述样品垫、所述缀合物垫、所述检测区限定的流动路径转移;和吸附垫;以及(ii)确定所述检测区中是否存在CEMA以及任选地确定所述检测区中是否存在可替宁。
34.根据段落1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者根据段落25至31中任一项所述的装置用于检测样品中的CEMA的用途。
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多肽序列
SEQ ID NO:1-B11(VH加粗表示;VL未加粗表示;CDR以下划线表示)
SEQ ID NO:2-B11重链(VH)
SEQ ID NO:3-B11 VH CDR1
SEQ ID NO:4-B11 VH CDR2
SEQ ID NO:5-B11 VH CDR3
SEQ ID NO:6-B11轻链(VL)
ELVMTQTPASVSEPVGGTVTINCQASETIWSGLAWYQQKPGQPPKLLIYDASNLETGVPSRFRGSGSATQFTLTISDLECDDAATYYCQGPYYRSSGYFPFGGGTELEIL
SEQ ID NO:7-B11 VL CDR1
QASETIWSGLA
SEQ ID NO:8-B11 VL CDR2
DASNLET
SEQ ID NO:9-B11 VL CDR3
QGPYYRSSGYFP
全部根据Kabat命名法进行命名
SEQ ID NO:10-E6(VH加粗表示;VL未加粗表示;CDR以下划线表示)
SEQ ID NO:11-E6重链(VH)
SEQ ID NO:12-E6 VH CDR1
SEQ ID NO:13-E6 VH CDR2
SEQ ID NO:14-E6 VH CDR3
SEQ ID NO:15-E6轻链(VL)
ELDMTQTPPSLSASVGETVRITCLASEDIYSGISWYQQKPGKPPTLLISGASNLESGVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDAATYYCLGGVSFSTTGTTFGAGTNVEIK
SEQ ID NO:16-E6 VL CDR1
LASEDIYSGIS
SEQ ID NO:17-E6 VL CDR2
GASNLES
SEQ ID NO:18-E6 VL CDR3
LGGVSFSTTGTT
全部根据Kabat命名法进行命名
SEQ ID NO:19-G4(VH加粗表示;VL未加粗表示;CDR以下划线表示)
SEQ ID NO:20-G4重链(VH)
SEQ ID NO:21-G4 VH CDR1
SEQ ID NO:22-G4 VH CDR2
SEQ ID NO:23-G4 VH CDR3
SEQ ID NO:24-G4轻链(VL)
ELVMTQTPASVSEPVGGTVTINCQASETIWSGLAWYQQKPGQPPKLLIYDASNLETGVPSRFRGSGSATQFTLTISDLECDDAATYYCQGPYYRSSGYFPFGGGTELEIL
SEQ ID NO:25-G4 VL CDR1
QASETIWSGLA
SEQ ID NO:26-G4 VL CDR2
DASNLET
SEQ ID NO:27-G4 VL CDR3
QGPYYRSSGYFP
全部根据Kabat命名法进行命名
多核苷酸序列
SEQ ID NO:28-B11(VH加粗表示;VL未加粗表示)
SEQ ID NO:29-B11重链(VH)
SEQ ID NO:30-B11轻链(VL)
gagctggtcatgacacagacccctgctagcgtgtcagaaccagtgggtggtacagtcaccatcaattgccag
gcttccgagacaatatggtccggattggcctggtatcagcagaagcctggacagccacccaaactcctgatct
acgatgcctccaacctggaaacaggcgtacctagccgttttcgaggcagtggctctgcaactcagttcaccctt
acgatcagcgacttggaatgcgatgatgccgcaacctactactgtcaagggccctattatcggtctagtggata
ctttccctttggcggcggcactgagctggagattctc
SEQ ID NO:31-E6(VH加粗表示;VL未加粗表示)
SEQ ID NO:32-E6重链(VH)
SEQ ID NO:33-E6轻链(VL)
gagctcgatatgacccagactccaccctccctgtctgcatctgtgggagaaactgtcaggattacgtgcctggccagtgaggacatttacagtggtatatcctggtatcaacagaagccagggaaacctcctacactcctgatctctggtgcatccaatttagaatctggggtcccaccacggttcagtggcagtggatctgggacagattacaccctcaccattggcggcgtgcaggctgaagatgctgccacctactactgtctaggcggtgttagtttcagtactaccggtacgacttttggagctggcaccaatgtggaaatcaaac
SEQ ID NO:34-G4(VH加粗表示;VL未加粗表示)
SEQ ID NO:35-G4重链(VH)
SEQ ID NO:36-G4轻链(VL)
gagctcgtgatgacccagactccagcctccgtgtctgaacctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtgagactatttggagtggtttggcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaaactcctgatctatgatgcatccaatctggagactggggtcccatcgcggttcagaggcagtggatctgcgacacagttcactctcaccatcagcgacctggagtgtgacgatgctgccacttactattgtcaaggtccttattataggagtagtggctattttcctttcggcggagggaccgagctggagatccta
表1
B11、E6和G4 scFv的氨基酸序列分析根据Kabat编号进行
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Claims (15)
1.一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段:
(i)能够结合至N-乙酰基-S-[2-羧乙基]-L-半胱氨酸(CEMA)并且;
(ii)能够结合至包含式[II]化合物的缀合物:
其中n选自0至4(即,0、1、2、3或4),并且每个R独立地选自H或C1至C6烷基;优选地,式[I]化合物:
其中所述式[II]化合物或所述式[I]化合物通过接头与免疫原性运载体偶联,适当地,其中所述接头通过胺基团与所述式[I]化合物偶联。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述免疫原性运载体是蛋白质,优选地,牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白;并且/或者
其中所述接头是乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)或二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体是单克隆抗体,优选地其中所述其抗原结合片段是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、Fv、rIgG或双抗体,更优选地scFv。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体不结合至可替宁或甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)或单羟基丁烯基-巯基尿酸(MHBMA)或3-羟丙基巯基尿酸(3-HPMA)或二羟丁基巯基尿酸(DHBMA);并且/或者
其中尿液抑制百分比为20%或更少、10%或更少、5%或更少或者无抑制;并且/或者
其中所述抗体或其抗原结合片段在免疫测定中对尿中CEMA的检测限为160ng/mL。
5.一种抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含:
分别由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者
分别由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3;或者
分别由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3,以及分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
6.根据权利要求5所述的抗体,其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2或11或20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列;并且/或者
其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:6或15或24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的抗体,其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者
其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列;或者
其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的VH氨基酸序列和由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的VL氨基酸序列。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述其抗原结合片段选自由以下各项组成的组:Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、Fv、rIgG和双抗体,优选地scFv;更优选地,
其中所述抗原结合片段是scFv,并且其中所述scFv包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
9.一种用于确定样品中CEMA的存在或不存在的装置,所述装置包括固定于所述装置的固相上的根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的装置,其中所述装置是便携式侧流免疫测定装置,优选地,浸棒,更优选地,
其中所述装置包括:
(i)样品垫,所述样品垫用于接收样品;
(ii)缀合物垫,所述缀合物垫与所述样品垫流体连通;
(iii)至少一个检测区,所述检测区与所述缀合物垫的远端流体连通;以及
(iv)吸附垫,所述吸附垫与所述检测区的远端流体连通。
11.根据权利要求10所述的装置,其中所述缀合物垫包括含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段是经标记的;并且任选地还包含能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段;或者
其中根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段是经标记的,并且单独包含在所述装置的中间垫中,所述中间垫定位于所述缀合物垫附近,并且任选地,其中,能够结合可替宁的经标记的抗体或其抗原结合片段单独包含在所述缀合物垫中。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的装置,其中所述检测区包含固定于其上的CEMA和任选的可替宁。
13.根据权利要求12所述的装置,其中所述CEMA呈根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物的形式。
14.一种用于检测样品中的CEMA的方法,所述方法包括使用根据权利要求9至13中任一项所述的装置,或者一种用于检测样品中的CEMA和可替宁的方法,所述方法包括使用根据权利要求9至13中任一项所述的装置。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求9至13中任一项所述的装置用于检测样品中的CEMA的用途。
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