CN117321054A - 三环衍生物化合物的结晶形式、制备其的方法和包含其的药物组合物 - Google Patents

三环衍生物化合物的结晶形式、制备其的方法和包含其的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种由式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，一种制备该柠檬酸盐的结晶形式的方法和一种由式1表示的三环衍生物化合物的结晶形式，其中该三环衍生物化合物的结晶形式有效地用于制备柠檬酸盐的结晶形式。

Description

三环衍生物化合物的结晶形式、制备其的方法和包含其的药 物组合物
技术领域
本申请要求基于2021年5月18日提交的韩国专利申请No.10-2021-0064416的优先权，其全部内容作为本说明书的一部分并入本文。
本发明涉及一种具有优异的PARP和端锚聚合酶抑制活性的三环衍生物化合物的盐的新型结晶形式、制备其的方法、结晶形式的转化和包含其的药物组合物。
背景技术
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)由大约17种蛋白质组成，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4(vPARP)、PARP-5(端锚聚合酶-1、端锚聚合酶-2)、PARP-7、PARP-10等(Curr PharmDes.，13(9)，933-962，2007)。它们在其催化结构域中都表现出一定水平的同源性，但是在细胞中具有不同的功能(BioEssays.，26(8)，882-893，2004)。
PARP-1和PARP-2的主要作用是通过ADP-核糖基化促进DNA修复，并调节许多DNA修复蛋白质的数目。当癌细胞中的DNA受损时，PARP被激活以修复DNA中的单链断裂，这可能会在各种类型的癌症治疗中导致耐药性。因此，可以通过PARP抑制剂可以预期抗癌功效，并且特别地，已经报道它对于特异性杀死缺乏DNA双链损伤修复因子诸如BRCA-1和BRCA-2的肿瘤是有用的，因此，它正在被开发为用于具有异常DNA双链损伤修复因子的各种癌症类型诸如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的患者特异性抗癌药物(Nature，434，913-916，2005；CancerBiology&Therapy，4，934-936，2005)。
另外，PARP抑制剂可以用以于治疗各种神经和心血管疾病，包括缺血性脑损伤，并且也可以用于治疗炎症症状。最近，PARP抑制剂的治疗可能性也被提出用于治疗糖尿病神经病变(Diabetes.54(12)，3435-3441，2005)。
一方面，已知为PARP-5的端锚聚合酶-1和端锚聚合酶-2参与Wnt/β-连环蛋白信号通路、DNA修复过程和有丝分裂，这与细胞周期高度相关(Biochimica et BiophysicaActa，1846，201-205，2014)。另外，它们作为端粒长度的正调节因子。因此，抑制端锚聚合酶-1和端锚聚合酶-2可以抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路、DNA修复过程和端粒延伸，从而通过不同于PARP-1的机制表现出抗癌作用(Nature Reviews Drug Discovery，11，923-936，2012)。
国际公开号WO2016/200101公开了各种三环衍生物化合物，它们是PARP-1和端锚聚合酶的抑制剂，可以用于治疗由聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活性引起的疾病。这些化合物以游离碱或单盐酸盐至三盐酸盐的形式制备，并且它们中的大多数是盐酸盐的形式。本发明人已经证实，在国际公开号WO2016/200101中制备的化合物具有如此低的水溶性，以至于它们难以被用作药物，并且必须经过多个步骤来制备化合物，因此，它们不适合商业用途。因此，本发明是通过开发一种可应用于药物的具有水溶性并确保稳定性(诸如光稳定性)的盐的新结晶形式及其可用于商业用途的新方法而完成的。本发明的制备方法可以制备一种稳定结晶形式的高纯度化合物，而无需在反应完成后进行额外的纯化工艺，因此，该方法提供一种商业上非常有用的方法，同时实现了大规模生产。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种具有优异的PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2抑制活性的三环衍生物化合物的盐的新型结晶形式，，以及制备其的有效的方法。
综上所述，本发明的目的是解决现有技术的问题，特别是不适用于药物的低水溶性，改善必须经过多个步骤来提高纯度的低效率，并且同时减少生成后难以分离/去除的相关物质。
本发明的另一目的是提供一种用于预防或治疗由PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性引起的各种疾病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式。
技术方案
三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式
本发明提供一种由下面式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式：
[式1]
所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以是酸酐。
酸酐的结晶形式可以含有约1重量％以下，优选地0.5重量％以下的水。
酸酐的结晶形式的特征在于：在粉末XRD图案中包括10.01°、15.86°、19.62°和26.58°的2θ(±0.2°)值。
另外，所述酸酐的结晶形式在粉末XRD图案中可以进一步包括9.79°、20.10°和27.71°的2θ(±0.2°)值。
另外，所述酸酐的结晶形式基本上显示如图7中所示的XRD图案。
所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以是一水合物。
一水合物的结晶形式可以含有约2.0重量％至4.5重量％范围内的水，优选地约3重量％的水。
一水合物的结晶形式的特征在于：在粉末XRD图案中包括6.94°、9.99°、16.57°、18.17°、23.68°和26.39°的2θ(±0.2°)值。
另外，一水合物的结晶形式在粉末XRD图案中可以进一步包括11.89°、13.35°、15.07°和20.90°的2θ(±0.2°)值。
另外，所述柠檬酸盐一水合物的结晶形式基本上显示如图10中所示的XRD图案。
所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐可以是二水合物。
二水合物的结晶形式可以含有约5.0重量％至7.5重量％范围内的水，优选地约5.7重量％的水。二水化物的结晶形式的特征在于：在粉末XRD图案中包括8.15°、10.96°、16.09°、21.47°、25.45°和26.86°的2θ(±0.2°)值。
另外，二水合物的结晶形式在粉末XRD图案中可以进一步包括13.35°、18.73°和28.51°的2θ(±0.2°)值。
另外，所述柠檬酸盐二水合物的结晶形式基本上显示如图13中所示的XRD图案。
本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：
在光稳定性室中，在25℃和60％的湿度的条件下，用光强度为35W的紫外光照射至总照射量为200W后，纯度保持在95％以上，优选地96％以上。
另外，其特征可以在于：在25℃和60％的湿度的条件下，用光强度为35k勒克斯的可见光照射至总照射量为1200k勒克斯后，纯度保持在95％以上，优选地96％以上。
即，与常规的盐酸盐等相比，本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式提供非常优异的光稳定性。
三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：在HPLC分析中，在室温下43分钟至45分钟时，相关物质的峰面积(％)小于0.05％，更优选地，在室温下43分钟至45分钟时，没有观察到相关物质的峰(不存在)。
另外，三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：在HPLC分析中，在室温下48分钟至50分钟时，相关物质的峰面积(％)小于0.15％，优选地小于0.1％，更优选地小于0.05％，还更优选地小于0.015％，并且最优选地没有观察到相关物质的峰(不存在)。
另外，三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：在HPLC分析中，在室温下43分钟至45分钟和室温下48分钟至50分钟没有观察到相关物质的峰(不存在)。
在室温下48分钟至50分钟下观察到的相关物质具有下面化学结构：
由于相关物质在产生后难以分离和去除，并且对人体有害，如果产生的相关物质超过标准，则必须额外进行安全确认试验。因此，减少制备过程中的相关物质是非常重要的。
三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于具有99.6％以上的纯度。
另外，其特征可以在于：当在长期储存条件下(储存在25±2℃的温度和60±5％的湿度下)储存3个月时，纯度为99.6％以上。另外，其特征可以在于：当储存6个月时，其纯度为99.5％以上、优选地99.55％以上。另外，其特征可以在于：当储存12个月时，其纯度为99.7％以上。另外，其特征可以在于：当储存24个月时，其纯度为99.7％以上。另外，其特征可以在于：当储存36个月时，其纯度为99.7％以上。
另外，其特征可以在于：当在长期储存条件下(储存在25±2℃的温度和60±5％的湿度下)储存9个月以上时，纯度与初始纯度相比没有降低。
另外，其特征可以在于：在加速储存条件下(储存在40±2℃的温度和75±5％的湿度下)，当储存3个月时，纯度为99.6％以上，当储存6个月时，纯度为99.5％以上。
三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：在长期储存条件下(储存在25±2℃的温度和60±5％的湿度下)储存3个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.30％以下，更优选地0.29％以下。另外，其特征可以在于：在储存6个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.32％以下，更优选地0.30％以下。另外，其特征可以在于：在储存12个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.32％以下，优选地0.30％以下。另外，其特征可以在于：在储存24个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.35％以下。另外，其特征可以在于：在储存36个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.32％以下。
三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的特征可以在于：在加速储存条件下(储存在40±2℃的温度和75±5％的湿度下)储存3个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.35％以下，更优选地0.25％以下。另外，其特征可以在于：在储存6个月后，在HPLC分析中，相关物质的峰面积(％)为0.33％以下，更优选地0.30％以下。
三环衍生物化合物的结晶形式
另外，本发明提供
由下面式1表示的三环衍生物化合物的结晶形式：
[式1]
式1的三环衍生物化合物(游离碱)是一种活性成分，其在体内表现出PARP抑制剂和端锚聚合酶抑制剂的功效，并且也非常有用地用作制备柠檬酸盐结晶形式的中间体，该柠檬酸盐是其酸加成盐。
三环衍生物化合物的结晶形式可以是酸酐。
酸酐的结晶形式的特征在于：含有约1重量％以下，优选地0.5重量％以下的水。
三环衍生物化合物的结晶形式的特征在于：在粉末XRD图案中包括7.88°、10.23°、15.16°、19.27°、22.79°和23.94°的2θ(±0.2°)值。
另外，三环衍生物化合物的结晶形式在粉末XRD图案中可以进一步包括13.89°、15.78°、18.05°和19.51°的2θ(±0.2°)值。
另外，三环衍生物化合物的结晶形式基本上显示如图1中所示的XRD图案。
三环衍生物化合物的结晶形式可以是二水合物。
二水合物的结晶形式的特征可以在于：含有约7.0重量％至9.5重量％范围内的水，优选地约8.3重量％的水。
二水化物的结晶形式的特征在于：在粉末XRD图案中包括7.95°、10.25°、13.25°、13.78°、21.12°和25.22°的2θ(±0.2°)值。
另外，二水合物的结晶形式在粉末XRD图案中可以进一步包括11.93°、12.50°、15.98°、19.12°、22.80°和26.72°的2θ(±0.2°)值。
另外，二水合物的结晶形式基本上显示如图4中所示的XRD图案。
制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法
<第一种方法>
本发明提供了一种制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，如下面方案1-1中所示。本发明的制备方法具有的特征是：提供了优异的收率和纯度并且通过简化制备工艺显著地改善制备效率。
本发明的由式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以通过包括以下步骤来制备：
(a)通过使下面方案1-1中的式2化合物与式3化合物反应，然后进行结晶工艺，得到式1的结晶化合物；和
(b)使上面式1的结晶化合物与柠檬酸在50℃至80℃下在选自有机溶剂和水中的一种或多种溶剂中反应：
[方案1-1]
下文中，将逐步详细描述制备方法。
<步骤(a)>
上面步骤(a)中的反应可以在有机胺诸如吡啶、三乙胺和二乙基异丙胺，或碱诸如碳酸钾的存在下进行。
对于反应温度没有特别的限制，但是通常可以在低温至高温下、优选地在室温至高温下进行。
特别地，作为上面步骤(a)中的反应溶剂，可以使用选自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基哌啶酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)等中的至少一种，并且当使用这些溶剂时，与使用常规的有机溶剂的情况相比，反应时间显著缩短(反应时间从24小时减少至6小时)，不需要回流搅拌，并且由于相关物质的减少，不需要额外的工艺诸如重结晶和色谱法，因此，提供了大大简化工艺的效果。
在步骤(a)的结晶工艺中，可以使用选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃和水中的至少一种作为结晶溶剂。纯净水或蒸馏水可以用作水。
特别地，当水用作结晶溶剂时，可以制备高收率、高纯度的晶体，而无需额外的工艺诸如重结晶，并且该工艺可以大大简化，因此，它适用于大规模合成工艺。
另外，在上述步骤(a)中，当使用二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂并且使用水作为结晶溶剂时，提供了更好的效果。即，可以制备高收率、高纯度的晶体而无需额外的工艺诸如重结晶，并且该工艺可以大大简化，因此，它适用于大规模合成工艺。
上述步骤(a)中的反应可以在35℃至55℃下进行，并且可以在结晶工艺之后进一步进行过滤工艺。特别地，本发明的步骤(a)具有提供优异的纯度的特征，以至于不需要重结晶等。
<步骤(b)>
通过该制备方法制备的三环衍生物化合物的柠檬酸盐可以是酸酐或水合物，所述水合物可以是一水合物或二水合物。
在上面步骤(b)中的溶剂中，可以使用选自甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、丁醇、丙醇和四氢呋喃中的至少一种作为有机溶剂。
纯净水或蒸馏水可以在整个本发明中用作水。
通过该制备方法制备的三环衍生物化合物的柠檬酸盐可以制备为结晶形式，当其为柠檬酸酐的结晶形式时，可以使用上述溶剂中的有机溶剂作为上面步骤(b)中的溶剂，可以优选地使用甲醇和乙醇的混合溶剂。在这种情况下，混合溶剂中的甲醇和乙醇可以以1∶9至9∶1的体积比混合和使用，优选地以4∶9至2∶7的体积比使用。
另外，当三环衍生物化合物的柠檬酸盐是一水合物时，可以以1∶9至9∶1的体积比将上述有机溶剂和水混合并且用作上述步骤(b)中的溶剂，并且可以优选地使用甲醇和水的混合溶剂。在这种情况下，可以以3∶7至7∶3的体积比使用混合溶剂中的甲醇和水。
另外，当三环衍生物化合物的柠檬酸盐是二水合物时，可以以2∶8至0∶10的体积比将上述有机溶剂和水混合，并且用作上述步骤(b)中的溶剂，并且可以优选地使用水。
在上面步骤(b)中的反应完成后，可以对反应产物进一步进行过滤工艺。在这种情况下，即使没有额外的工艺诸如额外的重结晶和色谱法，也可以在反应完成之后通过过滤和干燥，得到具有优异的纯度和收率的结晶化合物。
<第二种方法>
本发明提供了一种制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，如以下面方案1-2中所示。本发明的制备方法具有的特征是：提供优异的收率和纯度并且通过简化制备工艺显著地改善制备效率。
本发明的由上式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以通过包括以下步骤来制备：
(1)通过使下面方案1-2中的式2′化合物与式3′化合物反应，然后进行结晶工艺，得到式1的结晶化合物；和
(2)使式1的结晶化合物与柠檬酸在50℃至80℃下在选自有机溶剂和水中的一种或多种溶剂中反应：
[方案1-2]
除了使用了改变的起始材料之外，上面步骤(1)和(2)可以以与上述第一种方法中的步骤(a)和(b)相同的方式进行。
另一方面，当在第一种或第二种方法中将三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式制备为酸酐时，可以通过在上述步骤(b)或步骤(2)中向式1表示的三环衍生物化合物中加入柠檬酸盐而将酸酐制备成酸酐的结晶形式，但是如下面方案2中所示，所述酸酐的结晶形式可以通过以下来制备：制备柠檬酸盐一水合物的结晶形式的式1的化合物，然后将水合物的结晶形式转化回酸酐的结晶形式。
[方案2]
在上面方案2中，将一水合物转化为酸酐的过程可以通过使一水合物在50℃至80℃的温度下在有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂中反应来进行。在这种情况下，可以进一步进行过滤工艺。
在这种情况下，可以使用选自乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、丙醇、丁醇、乙酸乙酯和四氢呋喃中的至少一种作为有机溶剂。
另外，当使用混合溶剂时，可以通过含有少量的水来提供降低残留溶剂水平的有益效果。
基于100重量份的一水合物，混合溶剂中包含的水可以以2重量份至15重量份、优选地4重量份至8重量份的量使用。当包含的水的量小于2重量份时，难以得到上面的效果，当包含的水的量超过15重量份时，可能不会发生向酸酐的转化，这不是优选的。
以这种方式，当从柠檬酸盐水合物制备柠檬酸盐酸酐时，可以实现在将结晶形式从水合物转化为酸酐的过程中额外去除相关物质的效果，从而可以得到更高纯度的化合物。
在根据本发明的制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法中，
可以在不进行回流工艺的情况下进行上面步骤(a)中的反应，可以在上面步骤(a)中的结晶工艺之后不进一步进行重结晶工艺，并且可以在上面步骤(a)中的结晶工艺之后不进行柱色谱纯化工艺。
根据本发明的制备方法，即使不进行所有的回流工艺、重结晶工艺和柱色谱纯化工艺，也提供优异的收率和纯度，并且可以大大减少制备工艺的数目。
在制备方法中，可以通过包括下面步骤来制备上述方案1-1中的式2化合物：
(a)向下面方案3-1中的式4化合物中加入有机溶剂后与盐酸反应；
(b)以1∶1至1∶3的体积比向反应产物中加入有机溶剂和水；和
(c)将步骤(b)中的反应产物的pH调节到8至10，然后过滤：
[方案3-1]
在上面化合物4中，“Pro”可以是选自芳基、苄基、苄基氧甲基、对甲氧基苄基(PMB)和甲氧基甲基(MOM)中的一种保护基团，优选地甲氧基甲基。
在上面步骤(a)和(b)中，可以使用选自乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、丙醇、丁醇、乙酸乙酯和四氢呋喃中的至少一种作为有机溶剂。
在上面步骤(c)中，可以使用碱进行pH调节，并且可以使用选自NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3等中的至少一种碱作为碱。
另外，在制备方法中，可以通过包括以下步骤来制备上面方案1-2中的式2′化合物：
(1)向下面方案3-2中的式4化合物中加入有机溶剂后与盐酸反应；和
(2)反应完成后向反应溶液中加入盐酸水溶液并过滤：
[方案3-2]
在上面步骤(1)中，反应可以在75℃至85℃下进行。另外，反应可以进行1至4小时，优选地2至3小时，在这种情况下，也可以进行搅拌。
在上面步骤(2)中，可以在冷却反应溶液之后加入盐酸水溶液，冷却温度可以为10℃至40℃。优选地，它可以为15℃到25℃。
盐酸水溶液可以以盐酸的5％至25％，优选地10％至20％的体积浓度使用。基于100重量份的起始材料，可以以0.1重量份至6.5重量份、优选地1.5重量份至4.5量份的量加入盐酸水溶液。
在上述面步骤(1)中，可以使用选自乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、丙醇、丁醇、乙酸乙酯和四氢呋喃中的至少一种作为有机溶剂。
在上面步骤(2)之后，可以优选地使用选自异丙醇、纯净水等中的至少一种用于洗涤。
包含三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的药物组合物、其用途和使用其的 治疗方法
本发明提供一种用于预防或治疗由PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性引起的疾病的药物组合物，包含由下面式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式作为活性成分：
[式1]
由PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性引起的疾病可以包括神经病理性疼痛、癫痫、脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病、精神分裂症、慢性或急性疼痛、缺血性脑损伤、缺氧后的神经元损失、创伤和神经损伤、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、高脂血症、心血管疾病诸如心血管组织损伤、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心绞痛和心源性休克、糖尿病神经病变、骨关节炎、骨质疏松症或癌症等。
本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以通过抑制聚(ADP-核糖)聚合酶的活性，有效地用于预防或治疗由PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性引起的疾病，特别是神经病理性疼痛、神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病神经病变、炎症性疾病、骨质疏松症或癌症。
癌症可以是晚期实体癌、复发性实体癌或转移性实体癌的形式。实体癌可以是但不限于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、晚期卵巢癌、高级别浆液性卵巢癌(包括输卵管癌和原发性腹膜癌)、从原发性卵巢癌转移的转移癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。
根据常规的方法，包含本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的各种组合物可以以口服制剂的形式配制和使用，诸如片剂、粉末、颗粒、药丸、胶囊、混悬剂、乳液、内服溶液、乳液和糖浆、外用制剂、栓剂或无菌注射液。
根据本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种赋形剂和/或稀释剂。
适合的药学上可接受的载体的非限制性实例包括固体和/或液体，例如乙醇、甘油、水等。基于治疗组合物或治疗组合的总重量，治疗组合物中的载体的量可以在约5重量％至约99重量％的范围内。适合的药学上可接受的赋形剂和稀释剂的非限制性实例包括无毒相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、延长剂、抗氧化剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、表面活性剂、乳化剂、悬浮剂等。这种赋形剂和稀释剂可以是但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，并且对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用所有其它药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。
在本发明的药物组合物中，以治疗有效量或预防有效量包含三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式。根据本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的优选剂量根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物的形式以及给药的途径和持续时间而变化，但是可以由本领域技术人员适当地选择。然而，为了所期望的效果，本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式可以以0.0001mg至1000mg、0.01mg至500mg、0.1mg至300mg、1mg至200mg或50mg至200mg的分剂量每天一次或几次给药。本发明的组合物中的上面式1的化合物可以基于总组合物的总重量以0.0001重量％至50重量％的量组合。
另外，本发明提供了三环衍生物化合物的结晶形式、三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式或药物组合物用于制备预防或治疗由PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性引起的各种疾病的药物的用途。
另外，本发明提供了一种治疗患有上述疾病的动物的方法，包括给动物施用有效量的三环衍生物化合物的结晶形式、三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式或药物组合物。
有益效果
根据本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式对PARP-1、端锚聚合酶-1或端锚聚合酶-2的活性具有优异的抑制作用，因此，它可以有效地用于预防或治疗神经病理性疼痛、神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病神经病变、炎症性疾病、骨质疏松症或癌症。
另外，根据本发明的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式具有改善的纯度、溶解性和稳定性，因此，其提供了促进药物制剂的制备和改善储存稳定性的效果。
本发明的制备方法提供了具有优异的收率和纯度的化合物，并且通过简化制备工艺显著地改善制备效率，因此，它提供了一种在商业上非常有用同时能够大规模生产的方法。
附图说明
图1是展示实施例1中制备的式1化合物(酸酐)的XRD分析中的峰的图，
图2是展示实施例1中制备的式1化合物(酸酐)的DSC分析中的吸热峰的图，
图3是展示实施例1中制备的式1化合物(酸酐)的TGA分析结果的图，
图4是展示实施例1-4中制备的式1化合物(二水合物)的XRD分析中的峰的图，
图5是展示实施例1-4中制备的式1化合物(二水合物)的DSC分析中的吸热峰的图，
图6是展示实施例1-4中制备的式1化合物(二水合物)的TGA分析结果的图；
图7是展示实施例2中制备的式1化合物(酸酐)的柠檬酸盐的XRD分析中的峰的图，
图8是展示实施例2中制备的式1化合物(酸酐)的柠檬酸盐的DSC分析中的吸热峰的图，
图9是展示实施例2中制备的式1化合物(酸酐)的柠檬酸盐的TGA分析结果的图，
图10是展示实施例3中制备的式1化合物的柠檬酸盐(一水合物)的XRD分析中的峰的图，
图11是展示实施例3中制备的式1化合物的柠檬酸盐(一水合物)的DSC分析中的吸热峰的图，
图12是展示实施例3中制备的式1化合物的柠檬酸盐(一水合物)的TGA分析结果的图，
图13是展示实施例4中制备的式1化合物的柠檬酸盐(二水合物)的XRD分析中的峰的图，
图14是展示实施例4中制备的式1化合物的柠檬酸盐(二水合物)的DSC分析中的吸热峰的图，
图15是展示实施例4中制备的式1化合物的柠檬酸盐(二水合物)的TGA分析结果的图，
图16是展示测量本发明的式1化合物的柠檬酸酐的结晶形式和常规药物的PARP-1酶抑制活性的结果的图，
图17是展示测量本发明的式1化合物的柠檬酸酐和常规药物的端锚聚合酶-1酶抑制活性的结果的图，并且
图18是展示测量本发明的式1化合物的柠檬酸酐和常规药物的端锚聚合酶-2酶抑制活性的结果的图。
具体实施方式
下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不应理解为限于这些实施例。
制备例1：制备化合物2
向化合物5(4.5kg，15.37mol)中加入46.7L的乙醇，然后向其中加入c-HCl(5.3L，61.48mol)。回流搅拌2小时并确认反应完成后，将其冷却并向其中加入16L的乙醇和29.4L的纯净水。用6N的NaOH水溶液调节pH到8至10，然后过滤得到化合物2(3.46kg，收率84.4％)。
制备例2：制备化合物2′
将异丙醇(6813mL)加入到化合物5(681.3g，2.33mol)中，然后向其中加入c-HCl(970g，9.32mol)。在75℃至85℃下搅拌2至3小时。在确认反应完成后，将其冷却并向其中加入6N的HCl水溶液。过滤所得固体，得到化合物2′(600g，收率85.1％)。
实施例1：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈(无固定形式)
(1)实施例1-1
将DMF(65L)加入化合物2(6.5kg，24.37mol)和化合物3(5.73kg，30.46mol)中。向其中加入三乙胺(2.71kg，26.8mol)，并在45℃至50℃下搅拌5小时。在确认反应完成后，将其冷却并通过加入甲醇(130L)结晶。过滤所得固体。向湿固体中加入65L的甲醇并在回流下搅拌1.5小时。冷却后过滤得到化合物1(7.34kg，收率75.2％)。
(2)实施例1-2
将DMF(100mL)加入化合物2(10g，37.49mmol)和化合物3(8.47g，44.99mmol)中。向其中加入三乙胺(5.75g，41.24mmol)，并在38℃至42℃搅拌6小时。在确认反应完成后，通过加入纯净水(100mL)将其冷却并结晶。过滤所得固体，得到化合物1(13.99g，收率93％)
(3)实施例1-3
向化合物3′(750.34g，2.87mol)中加DMF(9.96L)，然后向其中加入三乙胺(1097g，10.84mol)并搅拌2小时。向其中加入化合物2′(664.3g，2.19mol)，并在45℃至50℃下搅拌5.5小时。在确认反应完成后，通过加入纯净水(19.93L)将其冷却并结晶。过滤所得固体，得到化合物1的无水晶体(788.41g，收率89.9％)。
(4)实施例1-4
将实施例1-1至实施例1-3中制备的化合物1(100g，249.7mmol)加入DMAC(1.6L)和THF(1.6L)的混合溶剂中，然后在45℃至55℃下搅拌溶解。过滤后，加入纯净水(3.2L)并冷却到0℃至10℃。通过在相同温度下的搅拌和过滤工艺，得到化合物1的二水合物晶体。
如图1至图3中所示，已证实实施例1-1至实施例1-3中制备的化合物1在X射线衍射(XRD)分析中在7.88°、10.23°、13.89°、15.16°、15.78°、18.05°、19.27°、19.51°、22.79°和23.94°的2θ值处显示峰(图1)，并且在差示扫描量热法(DSC)分析中在272℃下观察到吸热峰(图2)。另外，作为热重分析(TGA)的结果，化合物1确认为无水结晶形式，因为最初没有观察到质量损失(图3)。
已证实在上面实施例1-4中进一步制备的化合物1的二水合物晶体在X射线衍射(XRD)分析中在7.95°、10.25°、13.25°、13.78°、21.12°和25.22°的2θ值处显示峰(图4)，并且在差示扫描量热法(DSC)分析中在117℃和272℃下观察到吸热峰(图5)。另外，作为热重分析(TGA)的结果，化合物1的二水合物晶体确认为二水合物，因为在约94℃下观察到约7.7％的质量损失(图6)。
实施例2：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈的柠檬酸酐
(1)实施例2-1
向柠檬酸(690.8g，3.59mol)中加入乙醇(7.2L)和甲醇(2.4L)。向其中加入上面实施例1中制备的化合物1(960g，2.39mol)，并在65℃至70℃下搅拌2小时。冷却至室温后，进行过滤。将甲醇(7.2L)加入湿固体中，并在回流下搅拌2小时。冷却后，过滤得到目标化合物(1.31kg，92％)。
(2)实施例2-2
将乙醇(15.5L)、丙酮(15.5L)和异丙醇(15.5L)加入到下面实施例3中制备的6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈(一水合物)的柠檬酸盐(4.7kg，7.7mol)中。将温度升高至55℃后，在55℃至70℃下搅拌4小时。冷却至25℃以下后，搅拌30分钟。过滤所得固体以得到目标化合物的结晶形式(4.39kg，收率96.3％)。
(3)实施例2-3
将乙醇(2.5L)、丙酮(2.5L)和异丙醇(2.5L)加入到下面实施例3中制备的6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈的柠檬酸盐(一水合物)(500g，0.82mol)中，并向其中加入纯净水(20mL)。将温度升高至55℃后，在55℃至75℃下搅拌4小时。冷却至25℃以下后，搅拌30分钟。过滤所得固体以得到目标化合物的结晶形式(470g，收率96.7％)。
如图7至图9中所示，式1的柠檬酸酐的结晶化合物在XRD分析中在9.79°、10.01°、15.86°、19.62°、20.10°、21.71°和26.58°的2θ值处显示峰(图7)，并且在DSC分析中在230℃和270℃处观察到吸热峰(图8)。另外，作为TGA的结果，式1的柠檬酸酐的结晶化合物确认为酸酐，因为最初没有观察到质量损失(图9)。
实施例2-2和实施例2-3的方法示出在水合物转化为酸酐的工艺中额外去除相关物质的效果，从而可以得到更高纯度的无水结晶化合物。
实施例3：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈的柠檬酸盐一水合物
向上面实施例1中制备的化合物1(7.34kg，18.32mol)中加入甲醇(25.7L)和纯净水(25.7L)。向其中加入溶解在甲醇和纯净水的1∶1的混合溶液(22L)中的柠檬酸(5.28kg，27.49mol)。在15℃至25℃下搅拌30分钟后，将温度升高至60℃，并在60℃至70℃下搅拌2小时。冷却至室温后，过滤得到目标化合物(10.7kg，95.8％)。
如图10至图12中所示，式1的柠檬酸盐一水合物的结晶化合物在XRD分析中显示在6.94°、9.99°、11.89°、13.35°、15.07°、16.57°、18.17°、20.90°、23.68°和26.39°的2θ值处的峰(图10)，并且在DSC分析中在120℃和193℃下观察到吸热峰(图11)。另外，作为TGA的结果，式1的柠檬酸盐一水合物的结晶化合物确认为一水合物，因为在80℃至120℃下质量损失约为2.4％(图12)。
在制备方法中，当反应完成时，得到结晶形式的目标化合物。因此，不需要重结晶以提高纯度或额外的工艺以减少残留溶剂。
实施例4：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈的柠檬酸盐二水合物
向上面实施例1中制备的化合物1(6g，15mmol)中加入纯净水(42mL)。向其中加入溶解在纯净水(18mL)中的柠檬酸(3.6g，22.5mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将温度升高至60℃，并在60℃至65℃下搅拌1.5小时。冷却至室温后，过滤得到目标化合物(8.45g，收率97.8％)。
如图13至图15中所示，式1的柠檬酸盐二水合物的结晶化合物在XRD分析中在8.15°、10.96°、13.35°、16.09°、18.73°、21.47°、25.45°、26.86°和28.51°的2θ值处显示峰(图13)，并且在DSC分析中在140℃、176℃和266℃下观察到吸热峰(图14)。另外，作为TGA的结果，式1的柠檬酸盐二水合物的结晶化合物确认为二水合物，因为在100℃至150℃下质量损失约为5.6％(图15)。
比较例1：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈(无固定形式)
(1)比较合成例1-1
向化合物2(2.56kg，9.6mol)和化合物3(1.98kg，10.56mol)中加入35.8L的甲醇。向其中加入三乙胺(2.67L，19.2mol)并在回流下搅拌24小时。在确认反应完成后，向其中加入DMAC(38.4L)和THF(38.4L)，并通过升高温度溶解。向溶液中加入活性炭并搅拌。过滤后，将其滴加到纯净水中结晶并过滤。
将DMAC和THF加入到湿固体中并溶解，然后重结晶以得到化合物1(2.93kg，71.1％)。(步骤1)
此后，进行额外的纯化工艺以去除相关物质，得到纯净的化合物1(1.59kg，收率39％)。(步骤2)
(2)比较合成例1-2
(步骤a)
向上述化合物5中加入甲醇，然后向其中加入6-(哌嗪-1-基)烟腈和三乙胺。在80℃下搅拌24小时并确认反应完成后，浓缩反应溶液。此后，用二氯甲烷提取，用无水硫酸镁干燥有机溶剂层，减压浓缩溶剂得到残留物，通过柱色谱(己烷∶乙酸乙酯＝1∶9)纯化得到类似于上面方案的化合物(收率75％)。
(步骤b)
将步骤a中制备的化合物溶解在二氯甲烷中，然后向其中加入三氟乙酸，并使用回流冷凝器加热24小时。在确认反应完成后，用二氯甲烷萃取，并在饱和碳酸氢钠水溶液中再次用二氯甲烷萃取。用无水硫酸镁干燥，减压浓缩溶剂得到残留物，通过柱色谱(二氯甲烷：甲醇＝1：9)纯化得到式1化合物(收率65％)。
比较例2：合成6-{4-[(5-氧代-1，2，3，4，5，6-六氢苯并[h][1，6]萘啶-8-基)甲基]哌嗪-1-基}烟腈的二盐酸盐
将上面比较合成例1-2中得到的化合物1溶解在甲醇中，然后向其中加入1.25M的盐酸甲醇溶液并搅拌12小时。反应完成后，减压浓缩溶剂，然后用乙酸乙酯过滤固体，得到化合物1的二盐酸盐(收率95％)。
分析方法：水分含量分析、DSC分析、TGA分析和XRD分析
本发明中所述的水分含量分析、DSC分析、TGA分析和XRD分析按下面方式进行：
(1)水分含量测量
使用870KF Titrino Plus(Metrohm)卡尔-费休水分滴定仪测量水分含量。
(2)DSC分析
DSC分析在DSC 8000(PerkinElmer)分析仪上在30℃至250℃至350℃下进行。称取0.5mg至2mg的样品放入铝DSC盘中，并用穿孔铝盖进行非气密性密封，然后以10℃/分钟的扫描速率将样品从30℃加热至250℃至350℃，并监测所产生的热流反应。
(3)TGA分析
TGA分析在TGA 8000(PerkinElmer)分析仪上在30℃至900℃下进行。称取0.5mg至2mg的样品放入陶瓷坩埚中，以5℃/分钟的扫描速率将样品从30℃加热至900℃，并监测所产生的质量损失。
(4)XRD分析
XRD分析在D8 Focus(BrukerASX)分析仪上从2°的2θ到40°的2θ下进行。将约100mg的样品轻轻地压在塑料样品架上，使样品表面光滑，刚好高于样品架的水平面，然后在以下条件下测量。
<分析条件>
阳极材料(Ka)：Cu Ka扫描范围：2°到40°；发生器设置：40mA，40kV；扫描速率：10°/分钟；发散狭缝尺寸：0.6mm；温度：25℃；步长：0.02°的2θ；旋转：使用
实验例1：分析相关物质
使用HPLC(产品名称：Agilent 1100；制造商：Agilent)测量在上面实施例和比较例中制备的化合物中包含的相关物质的量，并且将结果示出在下表2中。
<HPLC操作条件>
检测器：紫外检测器(检测波长：220nm)
色谱柱：Watchers 100 ODS-P、4.6×250mm、5μm或同等色谱柱
温度：恒温25℃左右
流动相A：通过将11.503g的磷酸二氢铵溶于1000mL的水中，过滤后脱气制得；流动相B：乙腈
流动相梯度：
[表1]
分析时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 85 15
5 80 20
15 80 20
20 75 25
25 75 25
75 30 70
76 85 15
90 85 15
稀释剂：使用以5∶5的比例混合的流动相A和乙腈。
流速：1.0mL/分钟；注射量：10.0μL；分析时间：90分钟
*试验溶液的制备：使用溶解在50mL的稀释剂中的10mg的样品。
[表2]
作为上面实验的结果，在根据本发明的实施例制备的化合物1的柠檬酸盐的结晶形式的情况下，已证实尽管在整个制备工艺中没有进行重结晶工艺，但是主要的相关物质显著减少或者没有检测到。
在HPLC分析的情况下，预测在49分钟的保留时间左右出现的相关物质是由于上式2与式3或者上式5与式3的偶联工艺中的过度反应而产生的物质，并且在产生后难以分离和去除，因此，在制备工艺中减少相关物质是非常重要的。
RT 49左右的相关物质：
实验例2：测量水中溶解度
测量化合物1的加成盐在水中的溶解度，并将结果示于下表4中。
具体地，将过量的化合物和溶剂(10mM，在1mL的水中)放入摇瓶中并摇动24小时，然后使用UPLC进行定量分析。
<使用的设备和条件>
设备名称：Acquity UPLC(Waters)
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm×2.1mm×50mm
波长：226nm、276nm、310nm(PDA检测器)
柱温：40℃；样品温度：25℃；注射量：5μl
流动相和浓度梯度
[表3]
时间(分钟) 水(0.2％磷酸) 乙腈
0 90 10
0.3 90 10
1.5 1 99
1.6 0 100
1.8 90 10
3.0 90 10
将化合物溶解在DMSO中，用UPLC测量，然后绘制校准曲线。
将通过摇瓶法饱和的化合物过滤，然后通过UPLC测量，并将其代入校准曲线以计算浓度。
[表4]
作为上面实验的结果，已证实与其它盐相比，本发明的化合物1的柠檬酸盐的结晶酸酐在水中具有显著优异的溶解性。
实验例3：证实化合物1的加成盐的稳定性
已证实在上面实施例和比较例中制备的化合物1的加成盐的晶体的稳定性，并且将结果示出于下表5中。
在每种条件下储存于稳定室后，通过HPLC确认纯度的方法进行根据温度、湿度和光照条件的实验。
<200W的紫外线照射>
将每个样品薄薄地铺在培养皿中，然后在25℃和60％湿度的条件下，使用光稳定性试验箱(CARON 6542-2)，用光强度为35W的紫外光照射至总照射量为200W后，评价稳定性。
<1200k勒克斯的可见光照射>
将每个样品薄薄地铺在培养皿中，然后在25℃和60％湿度的条件下，使用光稳定性试验箱(CARON 6542-2)，用光强度为35k勒克斯的可见光照射至总照射量为1200k勒克斯后，评价稳定性。
[表5]
作为上面实验的结果，发现化合物1的二盐酸盐的结晶酸酐和化合物1的柠檬盐的结晶酸酐在温度和湿度下都是稳定的。然而，二盐酸盐在200W的紫外线和1200K勒克斯的可见光下表现出非常差的光稳定性。如果光稳定性低，储存稳定性可能会因室内照明和阳光而降低，从而降低纯度，因此，在管理上中要注意，诸如需要在阴凉处储存原材料。当以这种方式确认稳定性时，发现化合物1的柠檬酸盐是最合适的。
实验例4：确定盐的熔点
使用B-454(BUCHI)熔点检测器测量上面实施例中制备的柠檬酸盐的化合物的熔点，并且将结果示于下表6中。
[表6]
作为上面实验的结果，已证实本发明的柠檬酸盐的所有结晶形式作为药物原料具有足够高的熔点。
实验例5：测量在各种溶剂中的溶解度
测量上面实施例中制备的结晶化合物在各种溶剂中的溶解度，并且将结果示于下表7中。
具体地，精确地称取0.1g的样品，放入每种溶剂中，并且在15℃至25℃下每5分钟剧烈摇动并混合30秒，并且测量30分钟内溶解的量。
[表7]
实验例6：评价化合物1的柠檬酸盐的酸酐和化合物1的柠檬酸盐的一水合物的纯度和稳定性
评价了根据本发明的实施例2中制备的柠檬酸盐的结晶酸酐和实施例3中制备的柠檬酸盐的结晶一水合物的纯度和稳定性，并且将结果示于下表8和表9中。
在下表中，稳定性试验在40±2℃的温度和75±5％的湿度的加速储存条件下进行，纯度和稳定性试验在25±2℃的温度和60±5％的湿度的长期储存条件下进行。在与实验例1中相同的条件下，使用HPLC(产品名称：agilent 1290，制造商：Agilent)测量实验结果。
[表8]
[表9]
实验例7：聚(ADP-核糖)聚合酶[PARP-1]酶的抑制试验
如下使用购自BPS Bioscience的试剂盒(cat.80551)测定根据本发明的式1化合物的柠檬酸盐的结晶酸酐(实施例2)和式1化合物的盐酸盐的结晶酸酐(比较例2)的PARP-1酶抑制活性。
将组蛋白涂覆在BPS Bioscience试剂盒提供的96孔板上，并在4℃下放置16小时。此后，用PBST(7.5mM Na2HPO4，2.5mM NaH2PO4，145mM NaCl，0.05％的吐温20，pH7.4)洗涤板4次，然后向其中加入阻断缓冲液(由BPS Bioscience的试剂盒提供)以防止非特异性反应，并在25℃下放置1小时。静置1小时后，用PBST洗涤板4次，将不同浓度的实施例2和比较例2的化合物加入到含有PARP-1酶(50ng/孔)、测定混合物和活化DNA的反应溶液中，并在25℃下反应1小时。1小时后，每个孔用PBST洗涤4次，并向其中加入链霉亲和素连接的过氧化物酶(Strep-HRP，1∶50稀释度)以测量PARP酶的核糖基化量，并在25℃下反应30分钟。用PBST洗涤板4次，然后最终向其中加入HRP化学发光底物并反应。使用SynergyTM H4杂交多模式微孔板读数器(BioTek Instruments，Inc.，美国)定量由每种酶形成的组蛋白核糖基化的量。对于本发明的化合物的每个浓度得到的结果是在两个孔中得到的平均值，并且使用SigmaPlot 10(Systat Software Inc.，美国)计算化合物的IC50值以分析结果。具有代表性的PARP抑制剂AZD-2281(奥拉帕尼)用作对照化合物。
将实验结果示于下表10中，并且在图16中以图的方式示出。
[表10]
实验例8：端锚聚合酶-1酶和端锚聚合酶-2酶的抑制试验
使用购自BPS Bioscience的试剂盒(cat.80573，80578)如下测定根据本发明的式1化合物的柠檬酸盐的结晶酸酐(实施例2)和式1化合物的盐酸盐的结晶酸酐(比较例2)的端锚聚合酶-1酶或端锚聚合酶-2酶抑制活性。
将组蛋白涂覆在BPS Bioscience试剂盒提供的96孔板上，并在4℃下放置16小时。此后，用PBST(7.5mM Na2HPO4，2.5mM NaH2PO4，145mM NaCl，0.05％的吐温20，pH 7.4)洗涤板4次，然后向其中加入阻断缓冲液(由BPS Bioscience的试剂盒提供)以防止非特异性反应，并在25℃下放置1小时。静置1小时后，用PBST洗涤板4次，将不同浓度的实施例的化合物加入到含有端锚聚合酶-1酶(40ng/孔)或端锚聚合酶-2酶(15ng/孔)和分析混合物的反应溶液中，并在25℃下反应1小时。1小时后，每个孔用PBST洗涤4次，并向其中加入链霉亲和素连接的过氧化物酶(Strep-HRP，1∶50稀释度)以测量PARP酶的核糖基化量，并在25℃下反应30分钟。用PBST洗涤板4次，然后最终向其中加入HRP化学发光底物并反应。使用SynergyTMH4杂交多模式微孔板读数器(BioTek Instruments，Inc.，美国)定量由每种酶形成的组蛋白核糖基化的量。对于本发明的化合物的每个浓度得到的结果是在两个孔中得到的平均值，并且使用SigmaPlot 10(Systat Software Inc.，美国)计算化合物的IC50值以分析结果。
使用XAV-939(一种代表性的端锚聚合酶抑制剂)和BMN-673(他拉唑帕利)(作为PARP抑制剂开发的，但已知可有效抑制端锚聚合酶)作为对照化合物。
将实验结果示于下表11和表12中，并且在图17和图18中以图的方式示出。
[表11]
[表12]
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Claims (23)

1.一种由下式表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式：
2.根据权利要求1所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐是酸酐。
3.根据权利要求2所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中包括10.01°、15.86°、19.62°和26.58°的2θ(±0.2°)值。
4.根据权利要求3所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中进一步包括9.79°、20.10°和27.71°的2θ(±0.2°)值。
5.根据权利要求1所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐是一水合物。
6.根据权利要求5所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中包括6.94°、9.99°、16.57°、18.17°、23.68°和26.39°的2θ(±0.2°)值。
7.根据权利要求6所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中进一步包括11.89°、13.35°、15.07°和20.90°的2θ(±0.2°)值。
8.根据权利要求1所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述三环衍生物化合物的柠檬酸盐是二水合物。
9.根据权利要求8所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中包括8.15°、10.96°、16.09°、21.47°、25.45°和26.86°的2θ(±0.2°)值。
10.根据权利要求9所述的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中进一步包括13.35°、18.73°和28.51°的2θ(±0.2°)值。
11.一种由下式1表示的三环衍生物化合物的结晶形式：
[式1]
12.根据权利要求11所述的三环衍生物化合物的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中包括7.88°、10.23°、15.16°、19.27°、22.79°和23.94°的2θ(±0.2°)值。
13.根据权利要求11所述的三环衍生物化合物的结晶形式，其特征在于，所述结晶形式在粉末XRD图案中包括7.95°、10.25°、13.25°、13.78°、21.12°和25.22°的2θ(±0.2°)值。
14.一种制备由下式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，包括：
(a)通过使下面方案1-1中的式2的化合物与式3的化合物反应，然后进行结晶工艺，得到式1的结晶化合物；和
(b)使上面式1的结晶化合物与柠檬酸在50℃至80℃下在选自有机溶剂和水的一种或多种溶剂中反应：
[方案1-1]
15.一种制备由下式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，包括：
(1)通过使下面方案1-2中的式2′的化合物与式3′的化合物反应，然后进行结晶工艺，得到式1的结晶化合物；和
(2)使式1的结晶化合物与柠檬酸在50℃至80℃下在选自有机溶剂和水的一种或多种溶剂中反应：
[方案1-2]
16.根据权利要求14或权利要求15所述的制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，在权利要求14所述的步骤(a)或权利要求15所述的步骤(1)的反应中，使用选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基哌啶酮(NMP)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种作为反应溶剂。
17.根据权利要求16所述的制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，在权利要求14所述的步骤(a)或权利要求15所述的步骤(1)的结晶工艺中，使用甲醇或水作为结晶溶剂。
18.根据权利要求14或权利要求15所述的制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，所述结晶形式是酸酐或水合物。
19.根据权利要求18所述的制备三环衍生物化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，所述结晶形式是酸酐，并且所述酸酐是通过在权利要求14所述的步骤(b)或权利要求15所述的步骤(2)中制备一水合物结晶形式的由式1表示的三环衍生物化合物的柠檬酸盐，然后将所述一水合物结晶形式转化回酸酐结晶形式而制备的。
20.根据权利要求14或权利要求15所述的制备式1化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，在权利要求14所述的步骤(b)或权利要求15所述的步骤(2)中，使用甲醇和乙醇的混合溶剂作为溶剂，并且通过使用该溶剂制备酸酐结晶形式。
21.根据权利要求14或权利要求15所述的制备式1化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，在权利要求14所述的步骤(b)或权利要求15所述的步骤(2)中，使用甲醇和水的混合溶剂作为溶剂，并且通过使用该溶剂制备一水合物结晶形式。
22.根据权利要求14或权利要求15所述的制备式1化合物的柠檬酸盐的结晶形式的方法，其特征在于，在权利要求14所述的步骤(b)或权利要求15所述的步骤(2)中，使用水作为溶剂，并且通过使用该溶剂制备二水合物结晶形式。
23.一种药物组合物，包含根据权利要求1至13中任一项所述的结晶形式和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
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