CN117229160B

CN117229160B - 三酯类阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途

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Publication number: CN117229160B
Application number: CN202311498270.5A
Authority: CN
Inventors: 于飞; 张宏雷; 宋更申; 刘洋健; 张超; 黄华捷; 修东辉; 李雨晴; 张万年; 李静
Original assignee: Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-11-13
Filing date: 2023-11-13
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2043-11-13
Also published as: CN117229160A

Abstract

本发明提供一种式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，还提供了包含前述化合物的组合物以及它们用于递送治疗剂或预防剂的用途。

Description

三酯类阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途。

背景技术

生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸尤其是核酸的有效靶向递送是一个持久的医学难题。核酸治疗剂因低细胞渗透性和对某些核酸分子(包括RNA)降解的高敏感性而面临很大挑战。

证实，含阳离子脂质的组合物、脂质体和脂质体复合物(lipoplex)作为运输媒介物，可有效地将生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸运送至细胞和/或细胞内隔室中。这些组合物一般包含一种或多种“阳离子性”和/或氨基(可离子化)脂质，还包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质。阳离子性和/或可离子化脂质包括例如可容易地质子化的含胺脂质。尽管已经展示多种此类含脂质的纳米粒子组合物，但安全性、功效和特异性仍有待改良。值得注意的是，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)复杂性的增加使其生产复杂化，并可能增加其毒性，这是一个可能限制其临床应用的主要担忧。例如，LNPsiRNA颗粒(如patisiran)需要预先使用类固醇和抗组胺药来消除不必要的免疫反应(T.Coelho, D. Adams, A. Silva, et al., Safety and efficacy of RNAi therapy fortransthyretin amyloidosis, N Engl J Med, 369 (2013) 819-829.)。因此，仍需要开发有助于将治疗剂和/或预防剂如核酸递送至细胞的改进的阳离子脂质化合物。

发明内容

本发明提供了一种基于三酯的阳离子脂质化合物，包括其药物可接受的盐和其立体异构体或互变异构体。当与其它脂质成分形成脂质纳米颗粒后，能够有效地递送mRNA或药物分子到细胞内发挥生物功能。

本发明的第一方面提供一种阳离子脂质化合物，其为式(I)化合物

，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：

G₁为C_1~10亚烷基；

G₂为C_2~12亚烷基；

G₃为

、/>、/>、/>或/>；

G₄为C_1~3亚烷基；

R₁为未取代的C_6~15直链烷基或未取代的C_8~25支链烷基；

R₂为未取代的C_2~15直链烷基。

例如，G₁为未取代的C_2~8亚烷基。优选地，G₁为未取代的C₇亚烷基、C₃亚烷基或C₅亚烷基。

例如，G₂为未取代的C_3~10亚烷基。优选地，G₂为未取代的C₅亚烷基、C₆亚烷基或C₉亚烷基。

例如，G₄为C₂亚烷基。

在一种实施方案中，R₁为未取代C_10~22支链烷基，例如，R₁为未取代C₁₇、C₁₈、C₁₅或C₁₆支链烷基；优选地，R₁为、/>、/>或/>。在另一种实施方案中，R₁为未取代C_8~12直链烷基，例如，R₁为未取代C₁₀直链烷基。

例如，R₂为未取代的C_3~12直链烷基。优选地，R₂为未取代的C₄、C₃或C₁₀直链烷基。

例如，式(I)化合物具有以下结构中的一种：

，

。

本发明的第二方面提供一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括本发明第一方面的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。

本发明的第三方面提供本发明第一方面的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者本发明第二方面的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的用途。

本发明的第四方面提供本发明第一方面的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者本发明第二方面的组合物在制备用于治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1显示基于YK-602、YK-603、YK-610、MC3、化合物79和11-A-M制备的Fluc-mRNA的LNP制剂的细胞转染实验结果，其中a为YK-602，b为YK-603，c为YK-610，d为MC3，e为化合物79，f为11-A-M。

图2显示由不同阳离子脂质（YK-602、YK-603、YK-610、YK-601、YK-604、YK-605、YK-606、YK-607、YK-608、YK-609、YK-611、YK-612、YK-613、YK-614、MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）制备的Fluc-mRNA的LNP制剂的荧光吸收强度。

图3显示由不同阳离子脂质（YK-602、YK-603、YK-610、YK-601、YK-604、YK-605、YK-606、YK-607、YK-608、YK-609、YK-611、YK-612、YK-613、YK-614、MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）制备的Fluc-mRNA的LNP制剂加入细胞培养液中培养24 h后的细胞存活率。

图4显示由不同阳离子脂质（YK-602、YK-603、YK-610、YK-608、MC3、1-O12B、化合物79、11-A-M）制备的Fluc-mRNA的LNP制剂在小鼠尾部静脉注射6 h、24 h、48 h和7 d的平均辐射强度。

图5显示由不同阳离子脂质（YK-602、YK-603、YK-610、YK-608、MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）制备的Fluc-mRNA的LNP制剂在小鼠尾部静脉注射6 h、24 h、48 h和7 d的活体成像荧光图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方案都可与任一其它实施方案或多个其它实施方案中的技术特征进行组合以得到另外的实施方案。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方案。

本发明中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本发明。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本发明中使用的用途或术语冲突，那么以本发明的用途和术语为准。

本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。

除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。

除了在工作实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质量如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本申请列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。

本发明中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本文所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…组成”、或“由…组成”。

术语“药学上可接受的”在本申请中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。

术语“受试者”或“患者”在本申请中包括人类和哺乳动物。

本文所用的术语“治疗”是指给患有疾病或者具有所述疾病的症状的患者或受试者施用一种或多种药物物质，用以治愈、缓解、减轻、改善或影响所述疾病或者所述疾病的症状。在本申请的上下文中，除非作出相反的具体说明，术语“治疗”也可包括预防。

术语“溶剂合物”在本申请中指的是通过组合式(I)化合物或其药学上可接受的盐和溶剂(例如乙醇或水)而形成的复合物。应理解的是，在治疗疾病或病症中使用的式I化合物的任何溶剂合物尽管可能提供不同的性质(包括药代动力学性质)，但是一旦吸收至受试者中，会得到式I化合物，使得式I化合物的使用分别涵盖式I化合物的任何溶剂合物的使用。

术语“水合物”指的是上述术语“溶剂合物”中溶剂为水的情形。

应进一步理解，式I化合物或其药学上可接受的盐可以溶剂合物形式分离，并且因此任何所述溶剂合物皆包括于本发明的范围内。例如，式I化合物或其药学上可接受的盐可以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S. M. Berge等人“Pharmaceutical Salts”，J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。例如，可使用HCl(或盐酸)、HBr(或氢溴酸溶液)、甲磺酸、硫酸、酒石酸或富马酸与式I所示的化合物形成药学上可接受的盐。

本发明的式(I)的含氮化合物可通过用氧化剂(例如间氯过氧苯甲酸、过氧化氢、臭氧)处理而转化成N-氧化物。因此，在价态和结构允许的条件下，本申请要求保护的化合物不但包括结构式所示的含氮化合物，而且还包括其N-氧化物衍生物。

本发明的某些化合物可以以一种或多种立体异构体的形式存在。立体异构体包括几何异构体、非对映异构体和对映异构体。因此，本发明要求保护的化合物还包括外消旋混合物、单一的立体异构体和具有光学活性的混合物。本领域技术人员应该理解的是，一种立体异构体可能比其它立体异构体具有更好的功效和/或更低的副作用。单一的立体异构体和具有光学活性的混合物可手性源合成法、手性催化、手性拆分等方法得到。消旋体可通过色谱拆分法或者化学拆分法进行手性拆分。例如，可通过加入手性酒石酸、手性苹果酸等手性酸类拆分试剂与本发明的化合物成盐，利用产物的物理化学性质例如溶解度不同进行分离。

本发明还包括本发明化合物所有适合的同位素变体。同位素变体定义为这样的化合物，其中至少一个原子被具有相同原子序数但其原子质量不同于自然界中常见的或主要存在的原子质量的原子替代。可以引入到本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和氧的同位素，分别例如²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O和¹⁸O。

术语“烷基”在本发明中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族一价烃基。术语“亚烷基”在本发明中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族二价烃基。C_n~m是指包括具有n至m个碳原子数的基团。例如C_2~5亚烷基包括C₂亚烷基、C₃亚烷基、C₄亚烷基、C₅亚烷基。

烷基(或亚烷基)可未经取代，或烷基(或亚烷基)可经取代，其中至少一个氢被另一种化学基团代替。

“治疗有效量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量。“预防有效量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本发明常规地确定治疗有效量和预防有效量。

在本申请中，当化合物的名称与结构式不一致时，以结构式为准。

应理解，本申请所用的术语“本发明化合物”根据语境可包括：式(I)化合物，其N-氧化物、其溶剂合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体，以及它们的混合物。

本文所用术语阳离子脂质是指在选定的pH值带正电荷的脂质。

阳离子脂质体易于与带负电荷的核酸结合，即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用，形成脂质纳米颗粒(LNP)。LNP是目前主流的递送载体之一。

发明人在筛选大量化合物时发现，筛选出满足以下条件的合适的阳离子脂质化合物是非常困难的：与现有技术代表性阳离子脂质结构差异巨大，同时具有极高的转染效率和极低的细胞低毒性，并且在小鼠体内具有高表达及持续表达。本发明通过独特的设计，发现了一些化合物例如YK-602、YK-603和YK-610，相对于已知的阳离子脂质化合物表现出较高的转染效率和较小的细胞毒性，以及在动物体内显著提高的表达量和持续时间来递送核酸，从而实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。

本申请将本发明的阳离子脂质与现有技术代表性阳离子脂质进行了比较。

DLin-MC3-DMA（MC3）是阿里拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals，Inc.)在CN102625696B(说明书第6页)中公开的阳离子脂质化合物。

1-O12B是美国塔夫茨大学许巧兵等报道的阳离子脂质(Ming Wang, QiaobingXu, et al., Enhanced Intracellular siRNA Delivery using Bioreducible Lipid-Like Nanoparticles, Adv. Healthcare Mater. 2014, 3, 1399正文第2页)。

化合物79是美国摩登纳特斯有限公司(Modernatx Inc.)在CN110520409A(说明书第69页)中公开的阳离子脂质化合物。

11-A-M是美国佐治亚理工学院James Everett等在WO2021021634Al(说明书第50页)中公开的阳离子脂质。

现有技术代表性阳离子脂质的化学结构如下：

(CN102625696B，说明书第6页)；

(Adv. Healthcare Mater.2014, 3, 1399 正文第2页)；

(CN110520409A，说明书第69页)；

(WO2021021634Al，说明书第50页)。

本申请发明人发现：

1．在本发明设计的此系列化合物中，由YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，与现有技术中代表性的阳离子脂质（无论是结构差异巨大，例如MC3，还是结构类似，例如1-O12B、化合物79和11-A-M）相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低、mRNA在小鼠体内表达量和持续时间显著提高。例如，细胞转染效率YK-603可达MC3的11.41倍、1-O12B的4.87倍、化合物79的20.72倍和11-A-M的17.10倍；细胞存活率YK-602可比 MC3高8%、比1-O12B高12%、比化合物79高33%、比11-A-M高26%；尾部静脉注射，mRNA在小鼠体内表达量，6 h后YK-603可达到MC3的11.80倍、1-O12B的17.40倍、化合物79的112.95倍和11-A-M的19.41倍，48 h后YK-603可达到MC3的21.73倍、1-O12B的31.38倍、化合物79的229.08倍和11-A-M的50.20倍。

2．在本发明设计的化学结构差异很小的一系列化合物中，由YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，同其它化合物相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低、mRNA在小鼠体内的表达量和持续时间显著提高。例如，YK-603细胞转染效率可达YK-611的286.08倍和YK-614的309.38倍；细胞毒性可比YK-606降低33%；mRNA在小鼠体内的表达量，6h可达YK-608的48.95倍，48 h可达239.71倍。

3．阳离子脂质化合物的结构与细胞内转染效率、对细胞产生的毒性以及由其制备的LNP制剂中mRNA在动物体内的高表达与持续表达之间无明显的对应关系。结构差异较小的化合物，在转染效率和/或细胞毒性、以及细胞内的表达方面极有可能差异巨大。因此，筛选合适的阳离子脂质化合物，能同时具有高的细胞转染效率、低的细胞毒性和mRNA在动物体内的高表达与持续表达是非常困难的事情，需要付出大量创造性的劳动。

本发明一方面提供一种新的用于递送治疗剂或预防剂的阳离子脂质化合物。本发明的阳离子脂质化合物可用于递送核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质。相对于已知的阳离子脂质化合物，本发明的阳离子脂质化合物表现出较高的转染效率、较低的细胞毒性，提高了递送效率和安全性。

阳离子脂质

本发明提供一种阳离子脂质，其为式(I)化合物

，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，

G₁为C_1~10亚烷基；

G₂为C_2~12亚烷基；

G₃为

、/>、/>、/>或/>；

G₄为C_1~3亚烷基；

R₁为未取代的C_6~15直链烷基或未取代的C_8~25支链烷基；

R₂为未取代的C_2~15直链烷基。

例如，G₄为C₂亚烷基。

例如，式(I)化合物具有以下结构中的一种：

，

，/>

，

，/>

，

。

在本发明的组合物/载体的一种实施方式中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物。例如，阳离子脂质为化合物YK-601、YK-602、YK-603、YK-604、YK-605、YK-606、YK-607、YK-608、YK-609、YK-610、YK-611、YK-612、YK-613或YK-614。在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-602。在另一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-603。在另一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK-610。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25%~75%，例如35%、45%、49%、50%、51%、55%、60%、65%。

该载体可用于递送活性成分例如治疗剂或预防剂。活性成分可包封在载体内或者与载体结合。

例如，所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。所述核酸包括但不限于单链DNA、双链DNA和RNA。适宜的RNA包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。

中性脂质

载体可包含中性脂质。中性脂质在本发明中是指在选定的pH值不带电荷或者以两性离子形式存在的起辅助作用的脂质。中性脂质可能通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性成脂质双层结构并提高效率，同时还可能影响靶器官的特异性。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1~15:1，例如14:1、13:1、12:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5.1:1、5:1、4.9:1、4:1、3:1、2:1。在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为4.9:1，在另一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为4.5:1。

例如，中性脂质可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

包含阳离子脂质的组合物的载体组分可以包括一种或多种中性脂质-磷脂，如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

中性脂质部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖包括带有修饰和取代的天然物种的非天然物种，所述修饰和取代包括分支、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可能经历铜催化的环加成反应。这些反应可用于使组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或将组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)偶联。

可用于这些组合物中的中性脂质可以选自由以下组成的非限制性组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC。在某些实施方案中，中性脂质包括DOPE。在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC和DOPE两种。

结构性脂质

包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种结构性脂质。结构性脂质在本发明中是指通过填充脂质之间的间隙来增强纳米颗粒的稳定性的脂质。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为约0.6:1~3:1，例如，约1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1。在一些优选实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为45:43.5。在一些优选实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为49:39.5。

结构性脂质可以选自但不限于由以下组成的组：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇以及其混合物。在一些实施方案中，结构性脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构性脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。

聚合物共轭脂质

包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种聚合物共轭脂质。聚合物共轭脂质主要是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来增加纳米颗粒的半衰期。

在一些实施方案中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。PEG修饰的PEG分子量通常为350~5000Da。

例如，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，所述聚合物共轭脂质是DMG-PEG2000。

在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25~75):(5~25):(15~65):(0.5~10)，例如(35~49):(4.5~15):(35~55):(1~5)。

在本发明的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为45:10:43.5:1.5。

在本发明的组合物/载体的另一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为49:10:39.5:1.5。

治疗剂和/或预防剂

组合物可以包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为10:1~30:1，例如12.5:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1。

在一些实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为12.5:1~25:1，优选为15:1。

所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。

例如，所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。

本发明的载体可将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物细胞或器官，因此本发明还提供治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的方法，这些方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的组合物和/或使哺乳动物细胞与该组合物接触。

治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质并且替代地称为“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞或器官中或者其它身体组织或系统中引起所希望的变化的物质。此类物种可用于治疗一种或多种疾病、病症或病况。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病况的小分子药物。可用于组合物的药物的实例包括但不限于抗赘生剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracycline)、烷化剂、铂类化合物、抗代谢物以及核苷类似物，如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉剂(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素能阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、第莫洛(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼酞嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、奈替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂。

在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫响应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)，以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够提供针对与感染性疾病如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、瘟疫、肝炎和肺结核相关的一种或多种病况的免疫性的化合物和制剂并且可以包括编码感染性疾病源性抗原和/或表位的mRNA。疫苗还可以包括引导针对癌细胞的免疫响应的化合物和制剂并且可以包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA。引起免疫响应的化合物可以包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)和其它物种。在一些实施方案中，通过包括根据式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(III)的化合物(例如化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108-112或122)的组合物肌肉内施用能够引起免疫响应的疫苗和/或化合物。其它治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC-1065)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、罗莫司丁(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素)。

在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质。可用于本发明中的纳米粒子中的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。

在一些实施方案中，治疗剂是多核苷酸或核酸(例如核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”的最广泛含义包括呈寡核苷酸链或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本发明使用的示例性多核苷酸包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体；RNAi诱导因子；RNAi因子；siRNA；shRNA；miRNA；反义RNA；核糖酶；催化性DNA；诱导三股螺旋形成的RNA；适体等。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是RNA。可用于本文所描述的组合物和方法中的RNA可以选自由但不限于以下组成的组：shortmer、antagomir、反义RNA、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。在某些实施方案中，RNA是mRNA。

在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是mRNA。mRNA可以编码任何所关注多肽，包括任何天然或非天然存在或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任何大小并且可以具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA编码的多肽当在细胞中表达时可以具有治疗作用。

在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是siRNA。siRNA能够选择性降低所关注基因的表达或下调该基因的表达。例如，siRNA的选择可以使得在将包括该siRNA的组合物施用给有需要受试者后使与特定疾病、病症或病况有关的基因沉默。siRNA可以包含与编码所关注基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA可以是免疫调节性siRNA。

在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是sgRNA和/或cas9 mRNA。sgRNA和/或cas9 mRNA可以用作基因编辑工具。例如，sgRNA-cas9复合物可以影响细胞基因的mRNA翻译。

在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是shRNA或者其编码载体或质粒。shRNA可以在将适当构建体递送至核中后在目标细胞内部产生。与shRNA相关的构建体和机制是相关领域中众所周知的。

疾病或病症

本发明的组合物/载体可以向受试者或患者递送治疗剂或预防剂。所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。因此，本发明的组合物可用于制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物。由于上述治疗剂或预防剂的种类广泛，本发明的组合物可用于治疗或预防多种疾病或病症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症以功能失常或异常的蛋白质或多肽活性为特征。

例如，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

在一些实施方案中，所述感染性疾病选自由冠状病毒，流感病毒，或HIV病毒引起的疾病、小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，多种疱疹。

其它组分

组合物可以包括一种或多种除前述部分中所描述的那些外的组分。例如，组合物可以包括一个或多个疏水性小分子，如维生素(例如维生素A或维生素E)或固醇。

组合物还可以包括一个或多个渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其它组分。渗透性增强分子可以是例如美国专利申请公布第2005/0222064号所描述的分子。碳水化合物可以包括简单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原以及其衍生物和类似物)。

表面改变剂可以包括但不限于阴离子性蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子性表面活性剂，如二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽(thymosin)β4、链球菌DNA酶α(dornasealfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNA酶(例如rhDNA酶)。表面改变剂可以被安置在组合物的纳米粒子内和/或表面上(例如通过涂布、吸附、共价连接或其它方法)。

组合物还可以包含一种或多种官能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可能经历环加成反应。确切地说，脂质双层可以通过这一方式，用一个或多个可有效地促进膜渗透、细胞识别或成像的基团官能化。组合物的表面还可以与一种或多种有用抗体偶联。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和偶联物是本领域中众所周知的。

除这些组分外，组合物可以包括可用于药物组合物中的任何物质。例如，组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，赋形剂但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂、调味剂、着色剂等。赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington’sThe Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins, Baltimore, MD, 2006)。

稀释剂的实例可以包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末状糖和/或其组合。

在一些实施方案中，包括一种或多种本文所述的脂质的组合物还可以包括一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(例如A类或B类)、多聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。

本发明的组合物可以制成固体、半固体、液体或气体的形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、软膏剂、酏剂、糖浆、溶液、乳液、悬浮液、注射剂、气溶胶。本发明的组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，无菌注射溶液可通过将所需量的治疗剂或预防剂与所需的上述各种其它成分掺入适当的溶剂例如无菌蒸馏水中，然后过滤灭菌来制备。还可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。

例如，本发明的组合物的施用方式为经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入。在一些实施方案中，所述组合物的施用方式为皮下。

本发明的组合物以治疗有效量给药，所述量不仅可以随所选择的特定试剂而变化，还可以随给药途径，所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终可以由主治医师或临床医生自行决定。例如，可将0.001~10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用给哺乳动物(例如人)。

实施例

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。除非另有说明，上下文中百分比为重量百分比，所有的温度以摄氏度给出。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以下缩写字母分别代表如下试剂：

DCM：二氯甲烷；ACN：乙腈；Tol：甲苯；IPA：异丙醇；EDCI：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐； DMAP：4-二甲基氨基吡啶； DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺；DIEA：N,N-二异丙基乙胺。

实施例1：阳离子脂质化合物的合成

1. YK-601的合成

合成路线如下：

步骤一：1,3-金刚烷二羧酸二丙酯(YK-601-PM1)的合成

将1,3-金刚烷二羧酸(5.00 g, 22.3 mmol)溶于50.0 mL正丙醇中，20 °C在氮气保护下搅拌中加入浓硫酸(219 mg, 2.23 mmol)，110 °C搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，50 °C真空减压浓缩除去溶剂，将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得目标化合物(5.00 g, 16.2 mmol, 72.7%)。

步骤二：3-(丙氧羰基)-金刚烷-1-羧酸(YK-601-PM2)的合成

将YK-601-PM1 (5.00 g, 16.2 mmol)溶于20.0 mL四氢呋喃和20.0 mL乙醇中，20°C搅拌中加入NaOH (648 mg, 16.2 mmol)的乙醇溶液(20.0 mL)，20 °C搅拌反应12 h，TLC显示反应完全，室温真空减压浓缩除去溶剂，将残余物溶于50 mL水，2 N HCl调pH至2.0，50.0 mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水MgSO₄干燥，过滤，真空减压浓缩除去溶剂，将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得白色固体目标化合物(2.00 g, 7.51mmol, 46.3%)。

步骤三：金刚烷-1-甲酸5-溴戊酯-3-甲酸丙酯(YK-601-PM3)的合成

将YK-601-PM2 (300 mg, 1.13 mmol)和5-溴戊醇(376 mg, 2.25 mmol)溶于二氯甲烷(3.0 mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(432 mg,2.25 mmol)及DMAP (138 mg, 1.13 mmol)，于30°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到黄色液体目标产物(200 mg, 0.48 mmol, 42.7%)。

步骤四：金刚烷-1-甲酸5-((8-(十七烷-9-氧基)-8-氧代辛基)(2-羟乙基)氨基)戊酯-3-甲酸丙酯(YK-601)的合成

将YK-601-PM3 (200 mg, 0.48 mmol)、8-((2-羟基乙基)氨基)辛酸十七烷-9-酯(213 mg, 0.48 mmol)溶于异丙醇(5 mL)中，20 °C下向上述体系加入碳酸钠(153 mg,1.44 mmol)，加热至90°C搅拌反应40 h。TLC显示反应完全，降温至室温，反应液加入20 mL水，再加入二氯甲烷(20 mL × 2)萃取，合并有机相后再用饱和碳酸氢钠水溶液(20 mL ×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得无色液体目标产物(57.1 mg, 73.6 μmol, 15.3%)。C₄₇H₈₅NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺)776.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.87 (quin, J = 6.0 Hz, 1H), 4.18 - 4.00 (m,4H), 3.54 (br t, J = 4.9 Hz, 2H), 2.59 (br t, J = 4.9 Hz, 2H), 2.51 - 2.42(m, 4H), 2.28 (br t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.16 (br s, 2H), 2.02 (s, 2H), 1.92 -1.81 (m, 8H), 1.73 - 1.57 (m, 8H), 1.54 - 1.41 (m, 9H), 1.38 - 1.19 (m, 35H),0.93 - 0.84 (m, 6H)。

2. YK-602的合成

合成路线如下：

步骤一：4-(丁氧羰基)-环己烷-1-羧酸(YK-602-PM1)的合成

将环己烷-1,4-二羧酸(10.0 g, 58.1 mmol)溶于200.0 mL甲苯中，20 °C在氮气保护下搅拌中加入正丁醇(12.9 g, 174 mmol)和浓硫酸(570 mg, 5.81 mmol)，110 °C搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，50°C真空减压浓缩除去溶剂，将残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得黄色油状目标化合物(3.00 g, 13.1 mmol, 22.6%)。

步骤二：环己烷-1-甲酸5-溴戊酯-4-甲酸丁酯(YK-602-PM2)的合成

以YK-602-PM1 (500 mg, 2.19 mmol)和5-溴戊醇(732 mg, 4.38 mmol) 为原料，按照合成YK-601-PM3的方法，得到黄色液体目标产物(500 mg, 1.33 mmol, 60.5%)。

步骤三：环己烷-1-甲酸5-((8-(十七烷-9-氧基)-8-氧代辛基)(2-羟乙基)氨基)戊酯-4-甲酸丁酯(YK-602)的合成

以YK-602-PM2 (200 mg, 530 μmol)和8-((2-羟基乙基)氨基)辛酸十七烷-9-酯(234 mg, 530 μmol)为原料，按照合成YK-601的方法，得到无色液体目标产物(60.0 mg,81.3 μmol, 15.3%)。C₄₄H₈₃NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺)738.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.78 (quin, J = 6.1 Hz, 1H), 4.23 (br s,1H), 4.07 - 3.94 (m, 4H), 3.39 (br d, J = 4.8 Hz, 2H), 2.42 (br t, J = 6.6Hz, 2H), 2.35 (br s, 4H), 2.24 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.75 - 1.67 (m, 3H), 1.65- 1.42 (m, 14H), 1.22 (br s, 41H), 0.92 - 0.80 (m, 9H)。

3. YK-603的合成

合成路线如下：

步骤一：3,3'-二硫二丙酸酐(YK-603-PM1)的合成

将3,3'-二硫二丙酸(5.0 g, 23.78 mmol)加入乙酰氯(23 mL)中，升温至回流，搅拌反应2 h。反应结束后降温至室温，减压浓缩除去乙酰氯，得到黄色液体目标产物(3.1 g,16.12 mmol，67.8%)。

步骤二：3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酸(YK-603-PM2)的合成

将YK-603-PM1(3.1 g, 16.12 mmol) 和正丙醇(3.1 mL, 41.47 mmol)溶于THF(15 mL)中，升温至回流并搅拌反应过夜。反应结束后降温至室温，减压浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯)得到黄色液体目标产物(1.6 g, 6.34 mmol,39.3%)。

步骤三：3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酸-5-溴戊酯(YK-603-PM3)的合成

将YK-603-PM2 (842 mg, 3.34 mmol)和5-溴戊醇(508 mg, 3.04 mmol) 溶于二氯甲烷(10 mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(640 mg,3.34 mmol)及DMAP (589 mg, 4.82 mmol)，于30-35°C下搅拌反应4 h。反应完毕后将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到亮黄色液体目标产物(867 mg , 2.16 mmol, 71.0%)。

步骤四： 8-((2-羟乙基)(5-((3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酰基)氧基)戊基)氨基)辛酸十七烷-9-酯(YK-603)的合成

将YK-603-PM3(230 mg, 0.57 mmol)、8-((2-羟基乙基)氨基)辛酸十七烷-9-酯(253 mg, 0.57 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，向上述体系加入碳酸钾(238 mg, 1.72 mmol)，加热至90 °C搅拌反应12 h。反应完毕后反应液加入50 mL水，再加入乙酸乙酯(50 mL ×2)萃取，合并有机相后再用饱和食盐水(20 mL × 3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得所述油状目标化合物(20 mg, 26.24 μmol, 4.5％)。C₄₁H₇₉NO₇S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)762.5。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.86 (s, 1H), 4.11 (s, 4H), 3.80 (s, 2H),3.10 – 2.65 (m, 12H), 2.28 (s, 2H), 1.82 – 1.12 (m, 50H), 0.91 (d, J = 20.3Hz, 9H)。

4. YK-604的合成

合成路线如下：

步骤一：金刚烷-1-甲酸9-溴壬酯-3-甲酸丙酯(YK-604-PM1)的合成

将YK-601-PM2 (837 mg, 3.14 mmol)和9-溴壬醇(1402 mg, 6.28 mmol)溶于二氯甲烷(8.0 mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(904mg, 4.71 mmol)及DMAP (192 mg, 1.57 mmol)，于30°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液依次用饱和碳酸钠水溶液洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到黄色液体目标产物YK-604-PM1 (1230 mg , 2.61 mmol, 83.0%)。

步骤二：金刚烷-1-甲酸9-((2-羟乙基)氨基)壬酯-3-甲酸丙酯(YK-604-PM2)的合成

将YK-604-PM1 (1230 mg，2.61 mmol)、乙醇胺(800 mg，13.10 mmol)溶于乙腈(12mL)中，向上述体系加入碳酸钾(1080 mg，7.81 mmol)，加热至75 °C搅拌反应2 h。反应完毕后反应液加入20 mL水，乙酸乙酯(20 mL × 2)萃取，合并有机相后再用饱和食盐水(20 mL× 2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得所述目标化合物YK-604-PM2 (440 mg, 0.97 mmol, 37.3％)。C₂₆H₄₅NO₅, MS(ES): m/z(M+H⁺)452.3。

步骤三：金刚烷-1-甲酸9-((4-癸氧基-4-氧代丁基)(2-羟基乙基)氨基)壬酯-3-甲酸丙酯(YK-604)的合成

将YK-604-PM2 (440 mg, 0.97 mmol)和4-溴丁酸癸酯(838 mg，2.73 mmol) 溶于乙腈(10mL)中，向上述体系加入碳酸钾(404 mg, 2.92 mmol)、碳酸铯(95 mg, 0.29 mmol)和碘化钾(32 mg, 0.19 mmol)加热至70°C搅拌反应5 h。反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得YK-604 (208mg, 0.31 mmol, 31.6％)。C₄₀H₇₁NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺)678.5。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.10 – 3.97 (m, 6H), 3.54 (t, J = 5.1 Hz,2H), 2.60 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.48 (dt, J = 20.5, 7.3 Hz, 4H), 2.31 (t, J =7.2 Hz, 2H), 2.14 (s, 2H), 2.01 (s, 2H), 1.90 – 1.79 (m, 8H), 1.71 – 1.56 (m,8H), 1.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 7.0 Hz, 26H), 0.93 (t, J = 7.4Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H)。

5. YK-605的合成

合成路线如下：

步骤一：环己烷-1-甲酸丁酯-4-甲酸5-((2-羟乙基)氨基)戊酯(YK-605-PM1)的合成

以YK-602-PM2 (177 mg, 0.47 mmol)和乙醇胺(144 mg，2.36 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得YK-605-PM1 (132 mg, 0.37 mmol, 78.7％)。C₁₉H₃₅N₂O₅, MS(ES): m/z(M+H⁺)358.3。

步骤二：环己烷-1-甲酸丁酯-4-甲酸5-((4-(癸氧基)-4-氧代丁基)(2-羟乙基)氨基)戊酯(YK-605)的合成

以YK-605-PM1 (132 mg, 0.37 mmol)和4-溴丁酸癸酯(204 mg，0.66 mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-605 (115 mg, 0.20 mmol, 53.3%)。C₃₃H₆₁NO₇, MS(ES):m/z(M+H⁺)584.4。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.10 – 4.01 (m, 6H), 3.56 (t, J = 4.9 Hz,2H), 2.63 (s, 2H), 2.52 (dt, J = 14.9, 7.3 Hz, 4H), 2.45 (s, 2H), 2.32 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 1.95 – 1.74 (m, 6H), 1.71 – 1.56 (m, 10H), 1.38 – 1.24 (m,20H), 0.94 – 0.85 (m, 6H)。

6. YK-606的合成

合成路线如下：

步骤一：3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酸-6-溴己酯(YK-606-PM1)的合成

以YK-603-PM2 (1060 mg, 4.20 mmol)和6-溴己醇(723 mg, 3.99 mmol)为原料，按照合成YK-603-PM3的方法，得YK-606-PM1 (1020 mg, 2.46 mmol, 61.5％)。

步骤二： 3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫)丙酸-6-((2-羟乙基)氨基)己酯(YK-606-PM2)的合成

以YK-606-PM1 (1000 mg, 2.41 mmol)和乙醇胺(441 mg，7.22 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得YK-606-PM2 (690 mg, 1.74 mmol, 72.5％)。C₁₇H₃₃NO₅S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)396.2。

步骤三：6-((2-羟乙基)(6-((3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酰基)氧基)己基)氨基)己酸癸酯(YK-606)的合成

以YK-606-PM2 (270 mg, 0.68 mmol)和6-溴己酸癸酯(410 mg, 1.22 mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-606 (70 mg, 0.11 mmol, 15.8%)。C₃₃H₆₃NO₇S₂, MS(ES):m/z(M+H⁺)650.4。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.07 (ddd, J = 10.4, 10.0, 5.1 Hz, 7H), 2.93(t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.74 (dd, J = 9.0, 5.2 Hz, 6H), 2.31 (t, J = 7.4 Hz,2H), 1.64 (dt, J = 15.7, 7.1 Hz, 12H), 1.29 (dd, J = 27.8, 10.8 Hz, 25H),0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.1 Hz, 3H)。

7. YK-607的合成

合成路线如下：

步骤一：6-((2-羟乙基)(6-((3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酰基)氧基)己基)氨基)己酸-2-辛基癸酯(YK-607)的合成

以YK-606-PM2 (300 mg, 0.76 mmol)和6-溴己酸-2-辛基癸酯(373 mg，0.83mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-607 (80 mg, 0.10 mmol, 13.8%)。C₄₁H₇₉NO₇S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)762.5。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.08 (dt, J = 13.7, 6.7 Hz, 5H), 3.97 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 2.74 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 2.32 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 1.65 (dt, J = 14.0, 7.0 Hz, 13H), 1.38 (s, 8H), 1.26 (s, 32H),0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H)。

8. YK-608的合成

合成路线如下：

6-((2-羟乙基)(6-((3-((3-氧代-3-丙氧基丙基)二硫基)丙酰基)氧基)己基)氨基)己酸-3-己基壬酯(YK-608)的合成

以YK-606-PM2 (200 mg, 0.51 mmol)和6-溴己酸-3-己基壬酯(243 mg，0.56mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-608 (40 mg, 0.05 mmol, 10.6%)。C₄₀H₇₇NO₇S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)748.5。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.08 (dt, J = 11.9, 6.6 Hz, 4H), 2.93 (t, J= 7.1 Hz, 4H), 2.74 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.83 (s,2H), 1.70 – 1.51 (m, 12H), 1.46 – 1.18 (m, 39H), 0.95 (t, J = 7.4 Hz, 3H),0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H)。

9. YK-609的合成

合成路线如下：

步骤一：3-(丁氧羰基)-金刚烷-1-羧酸(YK-609-PM1)的合成

将1,3-金刚烷二羧酸(1000 mg, 4.46 mmol)和正丁醇(2644 mg, 35.68 mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1112mg, 5.80 mmol)及DMAP (708 mg, 5.80 mmol)，于30°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到黄色液体目标产物(404 mg, 1.44 mmol, 32.3%)。

步骤二：金刚烷-1-甲酸-9-溴壬酯-3-甲酸丁酯(YK-609-PM2)的合成

以YK-609-PM1 (404 mg, 1.44 mmol)和9-溴壬醇(304 mg, 1.36 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM1的方法，得到目标产物YK-609-PM2 (445 mg, 0.92 mmol, 63.6%)。

步骤三：金刚烷-1-甲酸-9-((2-羟乙基)氨基)壬酯-3-甲酸丁酯(YK-609-PM 3)的合成

以YK-609-PM2 (445 mg , 0.92 mmol)和乙醇胺(281 mg，4.60 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得到目标产物YK-609-PM3 (106 mg , 0.23 mmol, 收率:24.8%)。C₂₇H₄₇NO₅, MS(ES): m/z(M+H⁺)466.3。

步骤四：金刚烷-1-甲酸9-((4-(癸氧基)-4-氧代丁基)(2-羟基乙基)氨基)壬酯-3-甲酸丁酯(YK-609)的合成

以YK-609-PM3 (106 mg , 0.23 mmol)和4-溴丁酸癸酯(126 mg，0.41 mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得到目标产物YK-609 (42 mg, 0.06 mmol, 26.7％)。C₄₁H₇₃NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺)692.5。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.11 – 4.01 (m, 6H), 3.19 (s, 4H), 3.08 (s,2H), 2.45 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 2.15 (s, 4H), 1.61 (d, J = 6.9 Hz, 7H), 1.41 –1.22 (m, 41H), 0.99 – 0.89 (m, 6H)。

10. YK-610的合成

合成路线如下：

/>

步骤一：3-(癸氧羰基)-金刚烷-1-羧酸(YK-610-PM1)的合成

以1,3-金刚烷二羧酸(1000 mg, 4.46 mmol)和正癸醇(2823 mg, 17.83 mmol)为原料，按照合成YK-609-PM1的方法，得到目标产物YK-610-PM1 (786 mg , 2.16 mmol,48.4%)。

步骤二：金刚烷-1-甲酸-5-溴戊酯-3-甲酸癸酯(YK-610-PM2)的合成

以YK-610-PM1 (786 mg , 2.16 mmol)和5-溴戊醇(342 mg, 2.05 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM1的方法，得到目标产物YK-610-PM2 (653 mg, 1.27 mmol, 59.0%)。

步骤三：金刚烷-1-甲酸(5-((2-羟乙基)氨基)戊基酯-3-甲酸癸酯(YK-610-PM3)的合成

以YK-610-PM2 (653 mg, 1.27 mmol)和乙醇胺(388 mg，6.35 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得到目标产物YK-610-PM3 (176 mg , 0.36 mmol, 28.0%)。C₂₉H₅₁NO₅, MS(ES): m/z(M+H⁺)494.4。

步骤四：金刚烷-1-甲酸-5-((4-(癸氧基)-4-氧代丁基)(2-羟基乙基)氨基)戊酯-3-甲酸癸酯(YK-610)的合成

以YK-610-PM3 (176 mg, 0.36 mmol)和4-溴丁酸癸酯(197 mg，0.64 mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得到目标产物YK-610 (49 mg, 0.07 mmol, 19.1％)。C₄₃H₇₇NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺)720.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.05 (d, J = 5.4 Hz, 6H), 3.61 (s, 2H), 2.68(s, 2H), 2.58 (s, 4H), 2.34 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15 (s, 2H), 1.68 (s, 3H),1.66 – 1.57 (m, 8H), 1.54 (s, 3H), 1.28 (d, J = 15.6 Hz, 38H), 0.88 (d, J =5.5 Hz, 6H)。

11. YK-611的合成

合成路线如下：

环己烷-1-甲酸丁酯-4-甲酸-5-((8-((3-己基壬基)氧基)-8-氧代辛基)(2-羟乙基)氨基)戊酯(YK-611)的合成

以YK-605-PM1 (50 mg, 0.14 mmol)和8-溴辛酸-3-己基壬酯(109 mg，0.25mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-611 (58 mg, 0.08 mmol, 58.4%)。C₄₂H₇₉NO₇,MS(ES): m/z(M+H⁺)710.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.07 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 3.62 (s, 2H), 2.70(s, 2H), 2.57 (s, 2H), 2.45 (s, 2H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.95 – 1.82(m, 4H), 1.71 – 1.53 (m, 14H), 1.42 – 1.21 (m, 35H), 0.90 (dt, J = 13.2, 7.1Hz, 9H)。

12. YK-612的合成

合成路线如下：

步骤一：环己烷-1-甲酸-9-溴壬酯-4-甲酸丁酯(YK-612-PM1)的合成

以YK-602-PM1 (300 mg, 1.31 mmol)和9-溴壬醇(279 mg, 1.25 mmol)为原料，按照合成YK-601-PM3的方法，得到黄色液体目标产物(409 mg, 0.94 mmol, 75.5%)。

步骤二：环己烷-1-甲酸丁酯-4-甲酸9-((2-羟乙基)氨基)壬酯(YK-612-PM2)的合成

以YK-612-PM1 (409 mg, 0.94 mmol)和乙醇胺(288 mg, 4.72 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得YK-612-PM2 (87 mg, 0.21 mmol, 22.3％)。C₂₃H₄₃NO₅, MS(ES): m/z(M+H⁺)414.3。

步骤三：环己烷-1-甲酸丁酯-4-甲酸-9-((8-(十七烷-9-氧基)-8-氧代辛基)(2-羟乙基)氨基)壬酯(YK-612)的合成

以YK-612-PM2 (87 mg, 0.21 mmol)和8-溴辛酸十七烷-9-酯(175 mg，0.38mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-612 (79 mg, 0.10 mmol, 47.3%)。C₄₈H₉₁NO₇,MS(ES): m/z(M+H⁺)794.7。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.86 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.06 (q, J = 6.3Hz, 4H), 3.56 (s, 2H), 2.62 (s, 2H), 2.51 – 2.44 (m, 4H), 2.27 (t, J = 7.4Hz, 2H), 1.97 – 1.80 (m, 4H), 1.63 (tt, J = 14.6, 7.3 Hz, 10H), 1.54 – 1.41(m, 8H), 1.40 – 1.17 (m, 44H), 0.94 – 0.84 (m, 9H)。

13. YK-613的合成

合成路线如下：

步骤一：3-((2-((3-(癸氧基)-3-氧代丙基)硫)丙烷-2-基)硫)丙酸(YK-613-PM1)的合成

以3,3'-(丙烷-2,2-二硫)二丙酸 (800 mg, 3.17 mmol)和正癸醇(1004 mg,6.34 mmol)溶于二氯甲烷(8.0 mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(729 mg, 3.80 mmol)及DMAP (194 mg, 1.59 mmol)，于30°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到无色液体目标产物(803 mg, 2.05 mmol, 64.5％)。

步骤二：3-((2-((3-(癸氧基)-3-氧代丙基)硫)丙烷-2-基)硫)丙酸-5-溴戊酯(YK-613-PM2)的合成

以YK-613-PM1 (803 mg, 2.05 mmol)和5-溴戊醇(342 mg, 2.05 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM1的方法，得YK-613-PM2 (453 mg, 0.84 mmol, 40.9％)。

步骤三：3-((2-((3-((5-((2-羟乙基)氨基)戊基)氧基)-3-氧代丙基)硫)丙烷-2-基)硫)丙酸癸酯(YK-613-PM3)的合成

以YK-613-PM2 (453 mg, 0.84 mmol)和乙醇胺(256 mg, 4.19 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得YK-613-PM3 (248 mg, 0.48 mmol, 56.8％)。C₂₆H₅₁NO₅S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)522.3。

步骤四：6-((11,11-二甲基-7,15-二氧代-6,16-二氧杂-10,12-二硫杂二十六烷基)(2-羟乙基)氨基)己酸-2-己基癸酯(YK-613)的合成

以YK-613-PM3 (248 mg, 0.48 mmol)和6-溴己酸-2-己基癸酯(399 mg，0.95mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-613 (187 mg, 0.22 mmol, 45.7%)。C₄₈H₉₃NO₇S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)860.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.16 – 4.04 (m, 4H), 3.97 (d, J = 5.8 Hz,3H), 2.95 (d, J = 22.8 Hz, 4H), 2.86 (td, J = 7.3, 1.9 Hz, 4H), 2.61 (td, J =7.3, 4.7 Hz, 4H), 2.33 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 24.7 Hz, 3H), 1.74 –1.53 (m, 15H), 1.41 (d, J = 10.9 Hz, 5H), 1.36 – 1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J =6.7 Hz, 9H)。

14. YK-614的合成

合成路线如下：

步骤一：2-((2-((2-丁氧基-2-氧代乙基)硫)丙烷-2-基)硫)乙酸(YK-614-PM1)的合成

以2,2'-(丙烷-2,2-二硫)二乙酸(2568 mg, 11.45 mmol)和正丁醇(1274 mg,17.19 mmol)为原料，按照合成YK-613-PM1的方法，得YK-614-PM1 (1521 mg, 5.42 mmol,47.4％)。

步骤二：2-((2-((2-丁氧基-2-氧代乙基)硫)丙烷-2-基)硫)乙酸-6-溴己酯(YK-614-PM2)的合成

以YK-614-PM1 (1521 mg, 5.42 mmol)和6-溴己醇(1179 mg, 6.51 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM1的方法，得YK-614-PM2 (1845 mg, 4.16 mmol, 76.7％)。

步骤三：2-((2-((2-((6-((2-羟乙基)氨基)己基)氧基)-2-氧代乙基)硫)丙烷-2-基)硫)乙酸丁酯(YK-614-PM3)的合成

以YK-614-PM2 (1845 mg, 4.16 mmol)和乙醇胺(1270 mg，20.79 mmol)为原料，按照合成YK-604-PM2的方法，得YK-614-PM3 (702 mg, 1.66 mmol, 39.8％)。C₁₉H₃₇NO₅S₂,MS(ES): m/z(M+H⁺)424.2。

步骤四：6-((9,9-二甲基-6,12-二氧代-5,13-二氧杂-8,10-二硫杂十九烷-19-基)(2-羟乙基)氨基)己酸癸酯(YK-614)的合成

以YK-614-PM3 (234 mg, 0.55 mmol)和6-溴己酸癸酯(222 mg，0.66 mmol)为原料，按照合成YK-604的方法，得YK-614 (165 mg, 0.24 mmol, 44.1%)。C₃₅H₆₇NO₇S₂, MS(ES): m/z(M+H⁺)678.4。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.09 (ddd, J = 21.1, 12.4, 6.7 Hz, 6H), 3.57(d, J = 13.2 Hz, 2H), 3.41 (s, 4H), 2.63 (s, 2H), 2.53 (s, 4H), 2.30 (t, J =7.4 Hz, 2H), 1.70 – 1.57 (m, 14H), 1.48 (d, J = 21.5 Hz, 3H), 1.43 – 1.19 (m,23H), 0.91 (dt, J = 13.5, 7.2 Hz, 6H)。

15. 1-O12B的合成

合成路线如下：

步骤一：2-(十二烷基二硫基)吡啶(1-O16B-PM1)的合成

将十二硫醇(3000 mg, 14.82 mmol)、二硫二吡啶(9796 mg, 44.46 mmol)溶于30mL二氯甲烷，在氮气保护下缓慢滴入醋酸(890 mg, 14.82 mmol)，后置于25 °C反应48 h。反应结束后，减压浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯)得黄色油状液体1-O16B-PM1 (3861 mg, 12.39 mmol, 83.6％)。

步骤二：2-(十二烷基二硫基)乙烷-1-醇(1-O16B-PM2)的合成

将1-O16B-PM1(3000 mg, 9.63 mmol)、2-巯基乙醇(2257 mg, 28.89 mmol)溶于30 mL二氯甲烷，在氮气保护下缓慢滴入醋酸(578 mg, 9.63 mmol)，后置于25 °C反应48h。反应结束后，减压浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯)得黄色油状液体1-O16B-PM2 (2183 mg, 7.84 mmol, 81.4％)。

步骤三：丙烯酸2-(十二烷基二硫基)乙酯(1-O16B-PM3)的合成

将1-O16B-PM2(1500 mg, 5.39 mmol)、三乙胺(1635 mg, 16.16 mmol)溶于15 mL的DCM，降温至0 °C，缓慢加入丙烯酰氯(585 mg, 6.46 mmol)，后置于25 °C反应1 h。反应结束后，减压浓缩除去溶剂，残留物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇)得黄色固体1-O16B-PM3 (1089 mg, 3.27 mmol, 60.8％)。

步骤四： 3,3'-((3-(二甲基氨基)丙基)氮杂二基)二丙酸二(2-(十二烷基二硫基)乙酯) (1-O16B)的合成

将1-O16B-PM3(600 mg, 1.80 mmol)和N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷(442 mg,4.33 mmol)直接混合后80 °C反应48 h。反应结束后，将残留物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇)得淡黄色粘稠液体1-O16B(338 mg, 0.44 mmol, 48.8％)。C₃₉H₇₈N₂O₄S₄, MS(ES): m/z(M+H⁺)767.7。

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ; 4.35 (t, J = 8.1 Hz, 4H); 2.92(t, J = 6.5Hz, 4H); 2.81 (t, J = 9.4 Hz, 4H); 2.72 (t, J = 9.2 Hz, 4H); 2.49 (dd, J =6.9 Hz, 6H); 2.21 (s, 6H); 2.26(m, 2H); 1.37 (m, 2H); 1.55 – 1.75 (m, 40H);0.91 (t, J = 7.2 Hz, 6H)。

16. 化合物79的合成

合成路线如下：

步骤一：8-溴辛酸-4-戊基环己酯(化合物79-PM1)的合成

将8-溴辛酸(1540 mg, 6.90 mmol)和4-戊基环己烷-1-醇 (1068 mg, 6.27mmol) 在氮气保护下溶于二氯甲烷(20.0 mL)中，向上述溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.0 g, 15.65 mmol)和DMAP (153 mg, 1.25 mmol)，于25°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液依次用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到油状目标产物化合物79-PM1 (1680 mg g , 4.48 mmol, 71.4%)。

步骤二：8-((2-羟乙基)氨基)辛酸4-戊基环己酯(化合物79-PM2)的合成

将化合物79-PM1 (1680 mg g , 4.48 mmol)、乙醇胺(410 mg，6.71 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，向上述体系加入碳酸钾(1857 mg，13.44 mmol)，加热至75 °C搅拌反应2 h。反应完毕后反应液加入10 mL水，乙酸乙酯(10 mL × 2)萃取，合并有机相后再用饱和食盐水 (10 mL × 2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得所述目标产物化合物79-PM2 (1130 mg, 3.18mmol, 71.0％)。C₂₁H₄₁NO₃, MS(ES): m/z(M+H⁺)356.3。

步骤三：8-((2-羟乙基)(8-氧代-8-((4-戊基环己基)氧基)辛基)氨基)辛酸壬酯(化合物79)的合成

将8-溴辛酸壬酯(1111 mg, 3.18 mmol)和化合物79-PM2 (1130 mg, 3.18 mmol)溶于乙腈(10 mL)中，向上述体系加入碳酸钾(1318 mg，9.54 mmol)和碘化钾(53 mg，0.32mmol)，加热至75 °C搅拌反应5 h。反应完毕后反应液加入10 mL水，乙酸乙酯(10 mL × 2)萃取，合并有机相后再用饱和食盐水(10 mL × 2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得到液体目标产物化合物79 (730 mg, 1.17 mmol, 36.8%)。C₃₈H₇₃NO₅, MS(ES): m/z(M+H⁺) 624.6。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.00 (br. m, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.08 (t,2H), 3.56 (m, 2H), 2.72 - 2.38(m, 6H), 2.31(m, 4H), 1.97(m, 1H), 1.82(m, 2H),1.73 - 0.95 (m, 48H), 0.90 (m, 6H)。

17. 11-A-M的合成

合成路线如下：

步骤一：(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸-3-羟基-2-(羟基甲基)丙酯(11-A-M -PM1)的合成

将(Z,Z)-9,12-十八烷二烯酸(4.0 g, 14.3 mmol)和2-羟甲基-1,3-丙二醇(1.5g, 14.1 mmol)在氮气保护下溶于二氯甲烷(40.0 mL)中，向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.1 g, 21.4 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.7 mL, 20.5mmol)及DMAP (192 mg, 1.57 mmol)，于25°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液依次用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到液体目标产物11-A-M-PM1 (2.3g , 6.24 mmol, 43.8%)。

步骤二：(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸-3-(2-((3R,5R,7R)-金刚烷-1-基)乙酰氧基)-2-(羟甲基)丙酯(11-A-M-PM2)的合成

将11-A-M-PM1 (150 mg, 0.41 mmol)和1-金刚烷乙酸(79.7 mg，0.41 mmol)溶于二氯甲烷(2.0 mL)中，向上述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(101.2.0 mg, 0.6 mmol)和N,N-二异丙基乙胺 (0.1 mL, 0.6 mmol)及DMAP (12.2 mg,0.1 mmol)，于25°C下搅拌反应12 h。TLC显示反应完全，将反应液用饱和碳酸钠洗涤、饱和食盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。将混合物过滤，滤液经真空减压浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到液体目标产物11-A-M-PM2 (103.0 mg , 0.19 mmol,46.5%)。

步骤三：(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸-3-(2-((3R,5R,7R)-金刚烷-1-基)乙酰氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基氧基)甲基)丙酯(11-A-M)的合成

将11-A-M-PM2 (76.0 mg, 0.14 mmol)和DMAP (45.2 mg, 0.37 mmol)溶于二氯甲烷(2 mL)中，向上述体系中加入氯甲酸4-硝基苯酯(64.5 mg, 0.32 mmol)，室温搅拌反应1 h后加入3-二乙氨基-1-丙醇(0.44 mL, 0.96 mmol)，室温搅拌反应1 h，反应液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，得11-A-M (32.0 mg,0.05 mmol, 32.7％)。C₄₂H₇₁NO₇, MS(ES): m/z(M+H⁺) 702.53。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.10 – 3.99 (m, 6H), 3.54 (t, J = 5.1 Hz,2H), 2.60 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.48 (dt, J = 20.5, 7.3 Hz, 4H), 2.31 (t, J =7.2 Hz, 2H), 2.14 (s, 2H), 2.01 (s, 2H), 1.90 – 1.79 (m, 8H), 1.71 – 1.56 (m,8H), 1.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 1.26 (d, J = 7.0 Hz, 26H), 0.93 (t, J = 7.4Hz, 3H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 3H)。

实施例2：纳米脂质颗粒(LNP制剂)制备条件优化

1. 载体(脂质体)与mRNA比例优化

将实施例1中合成的阳离子脂质化合物YK-602、YK-603和YK-610分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液。通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液(pH=4~5)，涡旋30 s备用。将eGFP-mRNA(购自上海起发实验试剂有限公司)在柠檬酸盐缓冲液(pH=4~5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与mRNA水溶液，分别以总脂质与mRNA的重量比为5:1、10:1、15:1、20:1、30:1和35:1制备脂质体。25°C超声15 min(超声频率40 kHz，超声功率800 W)。所得脂质体用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000 (摩尔比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP-mRNA的LNP制剂。

细胞转染实验结果显示，载体与mRNA重量比在10:1~30:1范围内，均有较好转染效果，其中转染效果最好为载体与mRNA重量比15:1，载体与mRNA重量比为5:1和30:1转染效果较差，不能用此比例来运载mRNA。

2. 阳离子脂质与中性脂质比例优化

按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK-603(或YK-602、YK-610)与中性脂质DSPC摩尔比分别为1:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、4.9:1、10:1、15:1和20:1。

通过细胞转染实验可以看出，阳离子脂质与中性脂质摩尔比为1:1~15:1均有转染效果，其中转染效率最高的是4.5:1。

3. 聚合物共轭脂质占载体(脂质体)比例优化

按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，载体中阳离子脂质为YK-603(或YK-602、YK-610)，其中聚合物共轭脂质DMG-PEG2000占载体摩尔比即聚合物共轭脂质：(阳离子脂质+中性脂质+结构脂质+聚合物共轭脂质)摩尔比分别为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、5%、10%和15%。

细胞转染实验结果显示，聚合物共轭脂质占载体摩尔比在0.5%~10%范围内，均有转染效果，1.5%时转染效率最高，10%时最低。

4. 载体(脂质体)中各成分比例优化

按照1中方法制备包封eGFP-mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK-603(或YK-602、YK-610)、中性脂质DSPC、结构性脂质胆固醇和聚合物共轭脂质DMG-PEG2000摩尔比分别为75:5:15:5、65:8:25:2、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5。

通过细胞转染实验可知，阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质摩尔比为75:5:15:5、65:8:25:2、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5比例下均能转染，在比例为(35~49):(7.5~15):(35~55):(1~5)的范围内具有良好的转染效果，其中摩尔比为45:10:43.5:1.5时，转染效果最好。

实施例3：eGFP-mRNA的LNP制剂细胞转染实验

细胞复苏与传代：将293T细胞复苏，于培养皿中培养传代至所需的细胞数量。

种板：将培养皿中的细胞消化并计数，以每孔1万个细胞铺在96孔板中，以每孔15万个细胞铺在12孔板中，过夜培养至细胞贴壁。

细胞转染实验：分别将含有1.5μg实施例2中制备的eGFP-mRNA的LNP制剂(载体中阳离子脂质为YK-602、YK-603或YK-610)加入12孔板的细胞培养液中，继续培养24h后，经荧光显微镜观察，根据荧光强度考察样品的转染效率。

根据实验结果，最后确定了纳米脂质颗粒(LNP制剂)的制备条件：载体与mRNA重量比例为15: 1；阳离子脂质与中性脂质摩尔比为4.9: 1；聚合物共轭脂质占脂质体1.5%；阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质摩尔比为49:10:39.5:1.5，载体采用此比例为本领域公认的具有较好转染效果的比例，后面的实验按此条件制备纳米脂质颗粒(LNP制剂)。

实施例4：纳米脂质颗粒(LNP制剂)的制备

表1 阳离子脂质结构

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将表1中所列阳离子脂质分别与DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液，通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液(pH=4~5)，涡旋30s备用。将eGFP-mRNA(购自上海起发实验试剂有限公司)或Fluc-mRNA(购自上海起发实验试剂有限公司)在柠檬酸盐缓冲液(pH=4~5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与mRNA水溶液，以总脂质与mRNA的重量比为15: 1制备脂质体。25°C超声15min(超声频率40kHz，超声功率800W)。所得脂质体经用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000 (摩尔百分比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP-mRNA或Fluc-mRNA的LNP制剂。

实施例5：纳米脂质颗粒粒径及多分散系数(PDI)的测定

利用动态光散射，采用马尔文激光粒度仪测定粒径及多分散系数(PDI)。

取脂质体溶液10μL，用无RNA酶去离子水稀释至1mL，加入样品池，每个样品重复测定3次。测定条件为：90 °散射角，25°C。检测结果如表2：

表2 纳米脂质颗粒的粒径及多分散系数(PDI)

由表2可以看出，实施例4中制备的纳米脂质颗粒粒径在120~210nm之间，均可用于递送mRNA：

其中，由YK-607制备的颗粒粒径最小，为128nm；由YK-604制备的颗粒粒径最大，为202nm。

所有纳米脂质颗粒的多分散系数在6%~24%之间，其中最小的是YK-611，为6.7%；最大的是YK-604，为23.2%。

由YK-602、YK-603和YK-610制备的颗粒形态也在较好水平。

实施例6：体外验证LNP递送载体的性能

细胞复苏与传代：方法同实施例3。

种板：方法同实施例3。

1. Fluc-mRNA的荧光检测(转染效率)

将含有0.3μg Fluc-mRNA的LNP制剂(LNP制剂载体组分为阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质)加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24 h后，按照Gaussia Luciferase Assay Kit说明书加入相应试剂，经IVIS荧光检测系统检测每孔荧光表达强度。

表3列出了由不同阳离子脂质制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂荧光检测结果。阳离子脂质包括本申请设计的一系列阳离子脂质化合物，和现有技术阳离子脂质MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M。

表3 Fluc-mRNA的荧光检测结果

实验结果分析：

(1) 本申请设计的一系列阳离子脂质化合物，其中包括YK-602、YK-603和YK-610，与现有技术代表性阳离子脂质，有的化学结构差异巨大，例如MC3；有的化学结构类似，例如1-O12B、化合物79和11-A-M。

与现有技术代表性阳离子脂质MC3相比，本申请设计的化合物化学结构完全不同，差异巨大。MC3无本申请设计的化合物结构所包含的官能团G₃，即、/>、、/>或/>。MC3叔胺的头部氮原子与两个甲基相连，本申请设计的化合物叔胺的头部氮原子通过亚烷基与羟基连接；MC3只有1个支链结构疏水尾，而本申请设计的化合物有2个疏水尾；MC3的尾部结构中含有C=C双键，而本申请设计的化合物尾部结构无C=C双键；其它基团也均有较大差异。

与现有技术包含而二硫基(-S-S-)、环己基、金刚烷基的阳离子脂质，例如1-O12B、化合物79和11-A-M相比，本申请设计的化合物化学结构相近。例如，1-O12B与本申请化合物YK-603、YK-606、YK-607和YK-608的疏水尾部均含有二硫基(-S-S-)，化合物79和本申请化合物YK-602、YK-605、YK-611和YK-612的疏水尾部均含有环己基，11-A-M和本申请化合物YK-601、YK-604、YK-609、YK-610均含有金刚烷基。本申请设计的化合物与1-O12B、化合物79和 11-A-M相比，其它结构稍有差异。

(2) 设计的一系列化合物中，由YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂细胞转染效率最高，相比于现有技术中代表性阳离子脂质，无论是结构相差巨大(例如MC3)，还是结构差异很小(例如1-O12B、化合物79和11-A-M)，细胞转染效率均显著提高。例如，YK-603细胞转染效率，可达MC3的11.41倍、化合物79的20.72倍和11-A-M的17.10倍。

由表3和图2可知，由YK-602、YK-603和YK-610制备的含有Fluc-mRNA的LNP制剂，RLU值分别为1032246、1789452和589452，荧光吸收强度显著高于其它LNP制剂。

YK-602可达MC3的6.58倍、1-O12B的2.81倍、化合物79的11.95倍和11-A-M的9.87倍。

YK-603可达MC3的11.41倍、1-O12B的4.87倍、化合物79的20.72倍和11-A-M的17.10倍。

YK-610可达MC3的3.76倍、1-O12B的1.60倍、化合物79的6.83倍和11-A-M的5.63倍。

用GraphPad Prism软件对数据进行分析，YK-602、YK-603和YK-610的任一个，与MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M比较均有明显差异，转染效率明显提高。

(3) 在结构类似、G₃基团均为的一系列化合物中，YK-603的细胞转染效率最高。YK-603的细胞转染效率可达YK-606的7.65倍、YK-607的20.94倍、YK-608的49.76倍。

将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，包括YK-603、YK-606、YK-607和YK-608，进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。细胞转染结果表明，此系列化合物活性差别非常大，其中YK-603的细胞转染效率最高。YK-603的细胞转染效率可达YK-606的7.65倍、YK-607的20.94倍、YK-608的49.76倍。

(4) 在结构类似、G₃基团均为的一系列化合物中，YK-610的细胞转染效率最高。YK-610的细胞转染效率可达YK-604的66.63倍和YK-609的5.65倍。

将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，包括YK-601、YK-604、YK-609和YK-610，进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。细胞转染结果表明，此系列化合物活性差别非常大，其中YK-610的细胞转染效率最高。YK-610的细胞转染效率可达YK-604的66.63倍和YK-609的5.65倍。

(5) 在结构类似、G₃基团均为的一系列化合物中，YK-602的细胞转染效率最高。YK-602的细胞转染效率可达YK-605的41.82倍、YK-611的165.03倍和YK-612的11.47倍。

将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，包括YK-602、YK-605、YK-611和YK-612，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。细胞转染结果表明，此系列化合物活性差别非常大，其中YK-602的细胞转染效率最高。YK-602的细胞转染效率可达YK-605的41.82倍、YK-611的165.03倍和YK-612的11.47倍。

可见，无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞转染效率，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，细胞转染效率均极有可能具有非常大的差异。

小结：

(1) 由本申请设计的化合物，例如YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，体外细胞转染效率比现有技术中代表性阳离子脂质（例如MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）和本申请中其它结构类似的化合物（例如YK-604、YK-608和YK-611）显著提高。例如，YK-603的细胞转染效率可达MC3的11.41倍、1-O12B的4.87倍、化合物79的20.72倍、11-A-M的17.10倍和YK-608的49.76倍。

(2) 阳离子脂质化合物的结构与由其制备的LNP制剂的细胞转染效率之间无明显的对应关系，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，制备的LNP制剂的细胞转染效率均极有可能具有非常大的差异，无法根据阳离子脂质化合物的结构推测其活性。

2. 细胞存活率测定

将含有1.5μg Fluc-mRNA的LNP制剂(LNP制剂载体组分为阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质)加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24 h后，向每孔中加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱中孵育1 h后，经酶标仪测定在450nm处的吸光度，细胞存活率结果见表4。

表4 细胞存活率

实验结果分析：

(1)由YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂细胞毒性最低，与现有技术中代表性阳离子脂质相比，细胞存活率显著提高。例如，细胞存活率YK-602可比MC3高8%、比1-O12B高12%、比化合物79高33%、比11-A-M高26%。（图3）

(2) 将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，例如YK-606、YK-607和YK-608，与YK-603进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。其中YK-603细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK-603的细胞存活率可比YK-606高33%、比YK-607高15%。/>

(3) 将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，例如YK-601、YK-604和YK-609，与YK-610进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。其中YK-610细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK-610的细胞存活率分别比YK-601高11%、比YK-604高17%、比YK-609高7%。

(4) 将结构类似、G₃基团均为的一系列化合物，例如YK-605、YK-611和YK-612，与YK-602进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同。其中YK-602细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK-602的细胞存活率分别比YK-605高31%、比YK-611高23%、比YK-612高18%。

可见，无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞毒性，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，细胞毒性均极有可能具有非常大的差异。

小结：

(1) 由本申请设计的化合物，例如YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，细胞毒性比现有技术中代表性阳离子脂质（例如MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）和本申请中其它结构类似的化合物（例如YK-604、YK-608和YK-611）显著降低。例如，YK-602的细胞存活率可比MC3高8%、比1-O12B高12%、比化合物79高33%、比11-A-M高26%、比YK-605高31%。

(2) 阳离子脂质化合物的结构与由其制备的LNP制剂的细胞毒性之间无明显的对应关系，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，制备的LNP制剂的细胞毒性均极有可能具有非常大的差异，无法根据阳离子脂质化合物的结构推测其细胞毒性。

实施例7：体内验证阳离子脂质(LNP)递送载体的性能

另外，我们也验证了设计的阳离子脂质递送的mRNA在小鼠体内蛋白表达和持续时间。体内实验进一步证明了我们的LNP递送载体能将mRNA有效地递送至动物体内，并高效持续地表达。

将含有10μg Fluc-mRNA的LNP制剂经尾静脉注射至4~6周龄、重量为17~19g的雌性BALB/C小鼠体内，并在给药后特定的时间点(6 h、24 h、48 h和7 d)对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物，小鼠自由活动5 min，然后经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测LNP所携带的mRNA在小鼠体内表达的蛋白质的平均辐射强度(对应于荧光表达强度)。经IVISSpectrum小动物活体成像仪检测LNP所携带的mRNA在小鼠体内表达的蛋白质的平均辐射强度(对应于荧光表达强度)，小鼠活体成像检测结果见图4和表5。

表5 小鼠活体成像实验数据

实验结果分析：

(1) YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，相比于现有技术中代表性阳离子脂质，mRNA在小鼠体内表达强度和持续时间均显著提高。例如，6 h后YK-603可达到MC3的11.80倍、1-O12B的17.40倍、化合物79的112.95倍和11-A-M的19.41倍，48 h后YK-603可达到MC3的21.73倍、1-O12B的31.38倍、化合物79的229.08倍和11-A-M的50.20倍。（图5）

(2) 与结构类似、个别基团稍有区别的化合物相比，由YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，mRNA在小鼠体内表达强度和持续时间均显著提高。例如，6 h后YK-603可达YK-608的48.95倍，48 h可达239.71倍。

可见，无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂中的mRNA在小鼠体内表达量和持续时间，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，均极有可能具有非常大的差异。

总之，本申请设计了一系列阳离子脂质化合物，例如，YK-602、YK-603和YK-610，细胞转染效率显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠体内表达量和持续时间显著提高。

1．设计的一系列化合物，包括YK-602、YK-603和YK-610，与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的化学结构差异巨大，例如MC3；有的化学结构类似，例如1-O12B、化合物79和11-A-M。

2．YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，体外细胞转染效率比现有技术中代表性阳离子脂质（例如MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）和本申请中其它结构类似的化合物（例如YK-604、YK-608和YK-611）显著提高。

例如，与现有技术代表性阳离子脂质相比，YK-603的细胞转染效率可达MC3的11.41倍、1-O12B的4.87倍、化合物79的20.72倍和11-A-M的17.10倍。与本申请中其它化合物相比，YK-603的细胞转染效率可达YK-607 YK-608的49.76倍，YK-610的细胞转染效率可达YK-604的66.63倍，YK-602的细胞转染效率可达YK-611的165.03倍。

无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞转染效率，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，细胞转染效率均极有可能具有非常大的差异。

3．YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，细胞毒性比现有技术中代表性阳离子脂质（例如MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）和本申请中结构类似的化合物（YK-604、YK-605和YK-611）显著降低。

例如，与现有技术代表性阳离子脂质相比，YK-602的细胞存活率可比MC3高8%、比1-O12B高12%、比化合物79高33%、比11-A-M高26%。与本申请中其它化合物相比，YK-610的细胞存活率可比YK-604高17%，YK-602的细胞存活率可比YK-605高31%、比YK-611高23%。

无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞毒性，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，细胞毒性均极有可能具有非常大的差异。

4．YK-602、YK-603和YK-610制备的LNP制剂，mRNA在动物体内表达量和持续时间比现有技术中代表性阳离子脂质（例如MC3、1-O12B、化合物79和11-A-M）和本申请中结构类似的化合物（例如YK-608）显著提高。

例如，与现有技术代表性阳离子脂质相比，mRNA在小鼠体内表达量，6 h后YK-603可达到MC3的11.80倍、1-O12B的17.40倍、化合物79的112.95倍和11-A-M的19.41倍，48 h后YK-603可达到MC3的21.73倍、1-O12B的31.38倍、化合物79的229.08倍和11-A-M的50.20倍。与本申请中其它化合物相比，YK-603表达量6 h后可达YK-608的48.95倍，48 h可达239.71倍。

阳离子脂质化合物的结构和mRNA在动物体内表达量和持续时间之间无对应关系，结构相差很小的化合物，由其制备的LNP制剂中的mRNA在动物体内表达方面极有可能存在巨大的差异。因此，无法根据化学结构预测mRNA在动物体内表达量和持续时间，筛选出mRNA在动物体内高表达和持续表达的阳离子脂质是非常困难的事情，需要付出大量创造性的劳动。

5. 本发明通过独特的设计和筛选，发现了一些化合物，例如YK-602、YK-603和YK-610，相对于现有技术代表性阳离子脂质（无论是结构差异巨大，例如MC3，还是结构类似，例如1-O12B、化合物79和11-A-M），以及结构类似的其它化合物，能够显著提高细胞转染效率、显著降低细胞毒性、显著提高在动物体内表达量和持续时间，提高了递送效率，取得了预料不到的技术效果。能够实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明所保护的范围内。

Claims

1.化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述化合物具有以下结构中的一种：

2.化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中，所述化合物是具有以下结构的化合物YK-602：

3.化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中，所述化合物是具有以下结构的化合物YK-603：

4.化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中，所述化合物是具有以下结构的化合物YK-610：

5.一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括根据前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25％～75％。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述载体还包含中性脂质。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1～15:1。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为4.5:1。

10.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述中性脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和/或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。

13.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述载体还包含结构性脂质。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为0.6:1～3:1。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述结构性脂质为胆固醇。

17.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述载体还包含聚合物共轭脂质。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为0.5％～10％。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为1.5％。

20.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。

21.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

22.根据权利要求5所述的组合物，其中所述载体包括阳离子脂质、中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质：中性脂质：结构脂质：聚合物共轭脂质的摩尔用量比为(25～75):(5～25):(15～65):(0.5～10)。

23.根据权利要求22中所述的组合物，其中所述阳离子脂质：中性脂质：结构脂质：聚合物共轭脂质的摩尔用量比为(35～49):(7.5～15):(35～55):(1～5)。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述阳离子脂质：中性脂质：结构脂质：聚合物共轭脂质的摩尔用量比为45:10:43.5:1.5。

25.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物为纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均粒径为10nm～210nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数(PDI)≤50％。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述纳米颗粒制剂的平均粒径为100nm～205nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数(PDI)≤30％。

27.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述阳离子脂质还包括一种或多种其它可电离的脂质化合物。

28.根据权利要求5所述的组合物，其中，还包含治疗剂或预防剂。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为10:1～30:1。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为12.5:1～25:1。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为15:1。

32.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。

33.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。

34.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是核酸。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是核糖核酸(RNA)。

36.根据权利要求34所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是脱氧核糖核酸(DNA)。

37.根据权利要求35所述的组合物，其中，所述RNA选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中，所述RNA是mRNA。

39.根据权利要求5-38中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括一种或多种可药用的赋形剂或稀释剂。

40.一种如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体或者如权利要求5-39中任一项所述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、或蛋白质药物中的用途。

41.一种如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体或者如权利要求5-39中任一项所述的组合物在制备用于治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途，其中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

42.根据权利要求41所述的用途，其中，所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病，小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，或多种疱疹。

43.根据权利要求41-42中任一项所述的用途，其中，所述哺乳动物是人。

44.根据权利要求41-42中任一项所述的用途，其中，所述药物的施用途径为经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或吸入。

45.根据权利要求44所述的用途，其中，所述药物的施用途径为皮下。

46.根据权利要求41-42中任一项所述的用途，其中，所述药物的施用剂量为0.001～10mg/kg。