CN116199646B - 一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用，所述脂质含有包含含氮杂环环的头部基团，以三羟甲基氨基甲烷(Tris)为核心的连接部和碳链尾；所制备的脂质纳米颗粒配方包含可电离脂质、胆固醇、PEG脂质、辅助脂质以及核酸药物，可将核酸安全高效地转染入细胞中，在纳米核酸疫苗、核酸药物制剂等基因治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用，属于核酸药物递送技术领域。
背景技术
基因治疗成为近年医药研究领域的一大热点，核酸药物如siRNA、mRNA等已陆续上市药物投入临床使用。裸露的核酸是一种不稳定的分子，容易被体内核酸酶降解，进而失去治疗作用，因此开发一种安全高效的核酸药物递送系统是突破基因治疗限制的关键。
目前核酸递送系统包括病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体存在成本高、安全性差的问题；目前递送核酸的系统多采用不同种类的脂质化合物递送方式，脂质作为细胞膜的主要成分，具有安全性好、生物相容性高、体内可降解的优点，是目前递送核酸的系统多采用的理想载体材料。
过去的研究主要以阳离子脂质为主，其正电性可增强载体与细胞的亲和力。可电离脂质在生理pH下呈现中性，相对于阳离子脂质有更好的安全性，基于此制备的纳米颗粒在进入细胞后可在内体酸性环境作用下电离进而提供良好的内体逃逸效果。脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)通常包括可电离脂质、胆固醇、磷脂和PEG脂质，可以保护RNA不受细胞外RNA酶的影响，并协助RNA的胞内递送，已作为新冠病毒mRNA疫苗的递送载体已在海外市场获得了巨大成功。
但目前可电离脂质存在细胞毒性大、核酸压缩性能低、内体逃逸差、肝清除率高、物化稳定性低等缺点，限制了核酸药物制剂及基因治疗的发展，因此设计一种生物安全性高、递送效能佳、物化性能稳定的新型可电离脂质迫在眉睫。
发明内容
为了实现核酸药物的有效包裹并有效递送，本发明提供一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用。
本发明的基于Tris的可电离脂质可以高效递送核酸药物，具有较高的转染效率与生物安全性。
制备所需原料廉价，反应条件温和，反应步骤简单，纯化方便，易于扩大生产。
术语说明：
三羟甲基氨基甲烷，简称Tris。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基于Tris的可电离脂质，所述可电离脂质结构以Tris为核心并连接一个含氮杂环头部基团以及疏水的脂肪链尾，结构如式Ⅰ所示：
其中m1、m2相同或不相同，选自C1-C3烷基；
n1-n4相同或不相同，各自为氢原子或任选自取代的或未被取代的C1-C3烷基；所述取代的取代基团为-OH或卤素；
L1、L2相同或不相同，各自为氢原子或任选自取代的或未被取代的C1-C4烷基；所述取代的取代基团为-OH、卤素或氨基；
X1选自C1-C5的烷基直链或支链、C2-C5的烯基直链或支链、炔基的烯基直链或支链；
Y1、Y2、Y3存在或不存在，存在的话，Y1、Y2、Y3为-CO-，不存在的话，直接连在R1、R2、R3；
R1、R2、R3相同或不相同直链或支链，选自取代或未被取代的C8-C17烷基直链或支链，或取代或未被取代的C8-C17烯基直链或支链，或取代或未被取代的C8-C17炔基直链或支链，所述取代的取代基团为-OH、卤素或氨基。
根据本发明优选的：
m1和m2相同且均为C2烷基。
n1-n4相同且均为氢键。
L1和L2不同，L1为甲基，L2为氢键；
X1为C1-C5的烷基直链。
Y1、Y2、Y3相同且均为-CO-。
R1、R2、R3相同且均为未被取代的不饱和C17烯基或未被取代的多不饱和C17烯基。
本发明的第二个目的是提供上述基于Tris的可电离脂质的制备方法。
基于Tris的可电离脂质的制备方法，包括步骤如下：
1)在催化剂a存在下，使叔丁基二甲基氯硅烷、三羟甲基氨基甲烷在无水溶剂中反应得到Tris-TBS，即6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2,3,3,9,9,10,10-八甲基-4,8-二氧杂-3,9-二硅杂十一烷-6-胺；
2)在催化剂b存在下，使Tris-TBS与含氮杂环的羧酸反应得到中间产物；使用四丁基氟化铵三水合物(TBAF·3H2O)脱去叔丁基二甲基硅烷基(TBS)；
3)在催化剂c存在下，使结构通式中Y1-R1、Y2-R2、Y3-R3表示的羧酸对应的酰氯与脱去TBS反应后处理混合物发生酯化反应；或在酸性加热条件下通过使R1、R2、R3对应的醇与脱去TBS产物反应得到对应的醚；反应均使用硅胶柱色谱法纯化。
根据本发明优选的：
所述溶剂选自甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、乙醚、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种以上。
优选的，所述溶剂可为甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲醇、乙酸乙酯、异丙醇等。
所述催化剂a选自咪唑；催化剂b选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)中的一种或两种以上；催化剂c选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)中的一种或两种以上。
优选的，所述催化剂b为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBT)；催化剂c为二环己基碳二亚胺(DCC)。
本发明的第三个目的是提供基于上述可电离脂质的可电离脂质纳米颗粒组合物。
可电离脂质纳米颗粒组合物包括上述可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质、核酸药物。
优选的，可电离脂质纳米颗粒组合物中，可电离脂质的摩尔百分比含量为20-75％。
所述辅助脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺-马来酰亚胺(DOPE-MAL)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二嘧磺酰磷脂酰胆碱(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)或1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)。
优选的，所述辅助脂质为DOPE。
优选的，可电离脂质纳米颗粒组合物中，辅助脂质摩尔百分比含量为10-40％。
所述胆固醇选自胆固醇或20α-羟基胆固醇。
优选的，所述胆固醇为胆固醇。
优选的，可电离脂质纳米颗粒组合物中，胆固醇的摩尔百分比含量为10-50％。
所述PEG脂质选自聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或聚乙二醇-二甲基丙烯酸(PEG-DMA)。
优选的，所述PEG脂质为DMG-PEG2000。
优选的，可电离脂质纳米颗粒组合物中，PEG脂质的摩尔百分比含量为1％-20％。
所述核酸药物为信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、环状RNA(circRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、质粒DNA(plasmid DNA)、小环DNA(mini circleDNA)中的一种或两种以上。
优选的，所述核酸药物为mRNA。
优选的，所述核酸药物与可电离脂质的质量比为1/1-1/30。
可电离脂质化合物制备的脂质纳米颗粒平均粒径范围为1-1000nm。
优选的，所述纳米颗粒粒径平均粒径范围为50-200nm
上述可电离脂质纳米颗粒组合物采用薄膜水化法、挤出法、纳米沉淀法或微流控法制备，但不限于上述方法，只要能按本领域制得即可。
优选的，可电离脂质纳米颗粒组合物的制备方法选自如下方法之一：
1)乙醇注入法：按照处方将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质使用有机溶剂配制脂质有机相混合液，使用柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4)将核酸药物配置水相溶液，按水相和有机相之间的体积比为3：1的比例，使用移液枪吸取水相，注入有机相中立即吹打70-80次，静置15分钟后稀释获得均匀的脂质纳米颗粒；
2)微流控法：在按照处方将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质使用有机溶剂配制脂质有机相混合液，使用柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4)将核酸药物配置水相溶液，按水相和有机相之间的体积比为3：1的比例，随后将有机相吸入1mL注射器，水相吸入3mL注射器中并与样品导入管连接，固定到注射泵上，控制流速，运行程序收集流出液，稀释获得均匀的脂质纳米颗粒。
优选的，所述可电离脂质纳米颗粒通过微流控法制备。
优选的，所述有机溶剂为乙醇或异丙醇。
为要解决的核酸递送的关键难点，核酸分子不稳定，易被降解，进而失去治疗作用。因此，本发明提供一种可压缩核酸的脂质纳米颗粒作为递送系统可保护核酸药物在进入细胞后在内体酸性环境作用下电离继而发生内体逃逸，实现核酸药物在胞浆内的释放。本发明的核酸药物递送系统可使用靶向分子在其表面修饰，赋予脂质纳米颗粒靶向功能从而实现特定细胞、组织或器官的靶向。包括但不限于在可电离脂质纳米粒表面修饰甘露糖增强其靶向巨噬细胞的能力，在可电离脂质纳米粒表面修饰叶酸增强其靶向肿瘤细胞的能力。
一种核酸药物递送系统，按上述方法制备得到。
本发明的核酸药物递送系统可应用于细胞水平、动物体内以及人体实验。
本发明提供一种可电离脂质纳米颗粒的应用，应用于核酸药物、基因疫苗的递送。
给药方式包括但不限于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、肺部吸入。所述脂质纳米颗粒适用于多种给药形式，可根据脂质纳米颗粒在目的治疗部位不同的积聚效果选取不同的给药形式。例如，目标治疗部位在肺部时，可采取肺部吸入给药。
本发明的技术特点及优点：
1、本发明的可电离脂质的制备方法步骤简单、过程低毒、产率高，易于放大生产，结构中Tris组分在药物合成、缓冲溶液等方面应用广泛，且为已上市核酸药物Givlaari结构组成部分之一；哌嗪环包含两个叔胺，相较单叔胺结构具有更好的核酸压缩性能，同时根据文献(Adv.Mater.2020,32,1906128,Nat Commun,2022,13:4766)报道，基于哌嗪环头部的脂质纳米颗粒具有一定的非肝靶向能力，该脂质化合物可广泛应用于核酸药物的递送。
2、本发明脂质纳米颗粒作为递送系统可保护核酸药物在进入细胞后在内体酸性环境作用下电离继而发生内体逃逸，实现核酸药物在胞浆内的释放。可使用靶向分子在其表面修饰，赋予脂质纳米颗粒靶向功能从而实现特定细胞、组织或器官的靶向。包括但不限于在可电离脂质纳米粒表面修饰甘露糖增强其靶向巨噬细胞的能力，在可电离脂质纳米粒表面修饰叶酸增强其靶向肿瘤细胞的能力。
3、本发明的脂质纳米颗粒具有制备工艺简单，生物相容性良好，稳定性较好的优点，并且适用于多种给药形式，能够在肿瘤治疗、罕见病治疗等领域发挥重要的作用，具有良好的应用前景。
4.本发明所提供的脂质纳米粒配方中，可电离脂质的结构以及各组成成分的比例，不同辅助脂质的选择也会影响核酸的转染效果，本发明经大量处方筛选后所得优选的处方比例可实现高效核酸转染。
附图说明：
图1为实施例3、实施例4的纳米颗粒粒径考察结果。
图2为实施例3、实施例4的纳米颗粒电位考察结果。
图3为实施例3的P2TL纳米颗粒形态考察结果。
图4为实施例3、实施例4的纳米颗粒包封率考察结果。
图5为实施例3、实施例4的Hep3B细胞转染实验中使用市售转染试剂LipoSmartmRNA Transfection Reagent作为对照组检测转染效果。
具体实施方式
在本文中所披露范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间，各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1
可电离脂质的制备
化合物名称：(10Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸-3-{[(10Z,12Z)-1-氧亚基十八-9,12-二烯基]氧基}-2-({[(10Z,12Z)-1-氧亚基十八-9,12-二烯基]氧基}甲基)-2-{[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基]氨基}丙基酯
合成步骤
6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2,3,3,9,9,10,10-八甲基-4,8-二氧杂-3,9-二硅杂十一烷-6-胺的合成
向叔丁基二甲基氯硅烷(6.715g，44.6mmol)、咪唑(6.304g，92.9mmol)、三羟甲基氨基甲烷(1.54g，12.4mmol)的混合物中加入5mL无水N,N-二甲基甲酰胺，室温下反应12h，水洗，二氯甲烷萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，200-300目硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得透明油状物A5.37g(94.21％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.44(s,6H),0.88(s,27H),0.03(s,18H).
2-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-[2,2,3,3,9,9,10,10-八甲基-6-(3,3,4,4-四甲基-2-氧杂-3-硅杂戊-1-基)-4,8-二氧杂-3,9-二硅杂十一烷-6-基]乙酰胺的合成
冰浴搅拌下向4-甲基-1-哌嗪乙酸(1.500g，6.32mmol)与二氯甲烷(10mL)的混合物中滴加7.200mL三乙胺，反应10min；继续向该体系下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.800g，9.39mmol)和1-羟基苯并三唑(1.26g，9.32mmol)，反应30min；将A(3.000g，6.47mmol)溶于适量二氯甲烷中滴入上述体系，反应24h，饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、二氯甲烷萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，200-300目硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得黄色油状物B 3.474g(74.11％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.81(s,6H),2.86(s,2H),2.53(m,8H),2.25(s,3H),0.84(s,28H),0.00(s,18H)。
(10Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸-3-{[(10Z,12Z)-1-氧亚基十八-9,12-二烯基]氧基}-2-({[(10Z,12Z)-1-氧亚基十八-9,12-二烯基]氧基}甲基)-2-{[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基]氨基}丙基酯的合成
称取865mg(2.73mmol)TBAF·3H2O溶于四氢呋喃中，将该液冰浴下滴入500mg(0.828mmol)B与10mL四氢呋喃的混合物中，反应3h后减压蒸发除去溶剂，得淡黄色油状物；反应无需纯化，加入N,N’-二环己基碳二亚胺(563mg,2.73mmol)、4-二甲氨基吡啶(334mg,2.73mmol)、二氯甲烷，冰浴搅拌下加入亚油酸(765mg，2.73mmol)，反应24h；饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、二氯甲烷萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，200-300目硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得橙色油状物210mg(24.22％)，记作：P2TL。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.52(s,1H),5.35(m,12H),4.47(s,6H),2.93(s,2H),2.76(t,J＝4Hz,6H),2.52(m,8H),2.30(t,J＝8Hz,9H),2.06(q,J＝4Hz,12H),1.60(m,6H),1.30(m,42H),0.88(t,J＝4Hz,9H)
实施例2
可电离脂质的制备
化合物名称：(10Z)-十八-9-烯酸-3-{[(10Z)-1-氧亚基十八-9-烯基]氧基}-2-({[(10Z)-1-氧亚基十八-9-烯基]氧基}甲基)-2-{[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基]氨基}丙基酯
合成步骤
(10Z)-十八-9-烯酸-3-{[(10Z)-1-氧亚基十八-9-烯基]氧基}-2-({[(10Z)-1-氧亚基十八-9-烯基]氧基}甲基)-2-{[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基]氨基}丙基酯的合成
称取862mg(2.73mmol)TBAF·3H2O溶于四氢呋喃中，将该液冰浴下滴入500mg(0.828mmol)B与10mL四氢呋喃的混合物中，反应3h后减压蒸发除去溶剂，得淡黄色油状物；反应无需纯化，加入N,N’-二环己基碳二亚胺(563mg,2.73mmol)、4-二甲氨基吡啶(334mg,2.73mmol)、二氯甲烷，冰浴搅拌下加入油酸(771mg，2.73mmol)，反应24h；饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、二氯甲烷萃取，收集有机相无水硫酸钠干燥后过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，200-300目硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得黄色油状物190mg(21.76％)，记作：P2TO。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(s,1H),5.32(m,6H),4.40(s,6H),2.92(s,2H),2.56(m,8H),2.29(t,J＝8Hz,9H),1.99(s,12H),1.59(m,6H),1.28(m,60H),0.85(t,J＝4Hz,9H)。
实施例3
可电离脂质纳米颗粒组合物，包括实施例1制得的P2TL可电离脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG、核酸药物。
基于P2TL可电离脂质的脂质纳米颗粒的制备
将P2TL可电离脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG加入到异丙醇中，制得有机相，P2TL:胆固醇:DMG-PEG:DOPE的摩尔比＝35:25:1:20；将mRNA加入到柠檬酸盐缓冲液中，制得水相，有机相、水相通过0.22微米滤膜过滤，有机相吸入1mL注射器中(吸入体积约0.7mL)，水相吸入3mL注射器中(吸入体积约2.1mL)，分别将两相与样品导入管连接，并安装在注射泵上，运行程序，观察流出管流速稳定后用收集管收集流出的液体(丢弃前200微升、最后1-2秒的液体)，得到可电离脂质与mRNA质量比为10/1的脂质纳米颗粒分散液，得到的产物记为：P2TL脂质纳米颗粒。
实施例4
可电离脂质纳米颗粒组合物，包括实施例2制得的P2TO可电离脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG、核酸药物。
基于P2TO可电离脂质的脂质纳米颗粒的制备，通过NanoAssemblr微流控设备(Precision Nanosystem公司)进行制备。
将P2TL可电离脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG加入到异丙醇中，制得有机相，P2TL:胆固醇:DMG-PEG:DOPE的摩尔比＝35:25:1:20；将mRNA加入到柠檬酸盐缓冲液中，制得水相，有机相、水相通过0.22微米滤膜过滤，
有机相吸入1mL注射器中(吸入体积约0.7mL)，水相吸入3mL注射器中(吸入体积约2.1mL)，分别将两相与样品导入管连接，并安装在注射泵上，运行程序，观察流出管流速稳定后用收集管收集流出的液体(丢弃前200微升、最后1-2秒的液体)，得到可电离脂质与mRNA质量比为10/1的脂质纳米颗粒分散液，得到的产物记为：P2TO脂质纳米颗粒。
实验例1
可电离脂质纳米颗粒的表征：
1、粒径和电位的考察：
使用动态光散射激光粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)检测实施例3、实施例4的可电离脂质纳米粒的粒径、Zeta电位、PDI；检测时将样品用PBS稀释30倍，检测模式为90°反向散射检测，每个样品均在设备中平衡120s，达到25℃后再开始检测。
实施例3、实施例4的可电离脂质纳米粒的粒径结果如图1。
实施例3、实施例4的可电离脂质纳米粒的Zeta电位结果如图2。
2、纳米粒形态的考察：
将电镜用铜网在实施例3的脂质纳米颗粒溶液中捞取数次，置于室温干燥后，在透射电子显微镜下拍照观察测试纳米粒的形态。检测结果如图3所示，可见所制得脂质纳米颗粒形态清晰，粒径均匀，分散性较好。
3、Ribogreen荧光法检测包封率：
使用Quant-iT RiboGreen RNAAssay Kit RNA定量检测试剂盒分别测试实施例3、实施例4的包封率。取PCR管A和管B，A管加入无变形剂的TAE缓冲液和脂质纳米颗粒，B观加入含1％ Triton-X100的TAE和脂质纳米颗粒。将管A和管B室温下孵育10min后将两管内溶液分别加入到96孔板中，加入含Ribogreen染料的TAE溶液。将96孔板放入多功能酶标仪中，选择荧光值激发波长为480nm，发射光为520nm。结果如图4所示。
实验例2
可电离脂质纳米颗粒的体外转染性能考察
取对数生长期的Hep3B细胞接种于装有DMEM培养基的24孔板，铺板密度为每孔1*104个细胞，细胞贴壁后准备转染(37℃，约12小时)。将包载有mRNA的LNP置于冰(盒)上维持低温，每孔加入30ul GFP-mRNA(10ng/ul)，设置3个复孔。转染24小时后，使用荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞的荧光比例。各组处方流式细胞仪检测结果如图5(仅展示制造例中一组处方)所示，其中阳性对照为市售转染试剂LipoSmart mRNATransfection Reagent。
结果显示，对于采用可电离脂质P2TL、P2TO制备的不同处方的LNP其粒径均位于100nm左右，且具有良好的包封核酸能力。在Hep3B细胞转染实验中可观察到不同处方下制备的纳米颗粒转染能力存在较大差异，可电离脂质P2TL转染能力优于市售脂质LipoSmartmRNATransfection Reagent，可实现高效低频的给药，进而降低潜在的毒性风险。

Claims (8)

1.一种基于Tris的可电离脂质，结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：
式Ⅰ，
式Ⅱ。
2.权利要求1所述的基于Tris的可电离脂质的制备方法，包括步骤如下：
1）在催化剂a存在下，使叔丁基二甲基氯硅烷、三羟甲基氨基甲烷在无水溶剂中反应得到Tris-TBS，即6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2,3,3,9,9,10,10-八甲基-4,8-二氧杂-3,9-二硅杂十一烷-6-胺；
2）在催化剂b存在下，使Tris-TBS与含氮杂环的羧酸反应得到中间产物；使用四丁基氟化铵三水合物脱去叔丁基二甲基硅烷基；
3）在催化剂c存在下，使结构通式中Y1-R1、Y2-R2、Y3-R3表示的羧酸对应的酰氯与脱去TBS反应后处理混合物发生酯化反应；或在酸性加热条件下通过使R1、R2、R3对应的醇与脱去TBS产物反应得到对应的醚；反应均使用硅胶柱色谱法纯化；
所述催化剂a选自咪唑；催化剂b选自N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸中的一种或两种以上；催化剂c选自N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸中的一种或两种以上。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、乙醚、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种以上。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂b为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑；催化剂c为二环己基碳二亚胺。
5.可电离脂质纳米颗粒组合物，包括权利要求1或2所述的基于Tris的可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质、核酸药物。
6.根权利要求5所述的可电离脂质纳米颗粒组合物，其特征在于，可电离脂质纳米颗粒组合物中，可电离脂质的摩尔百分比含量为20-75%；
所述辅助脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺-马来酰亚胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二嘧磺酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺或1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺；
可电离脂质纳米颗粒组合物中，辅助脂质摩尔百分比含量为10-40%；
所述胆固醇选自胆固醇或20α-羟基胆固醇；
可电离脂质纳米颗粒组合物中，胆固醇的摩尔百分比含量为10-50%；
所述PEG脂质选自聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇-二甲基丙烯酸；
可电离脂质纳米颗粒组合物中，PEG脂质的摩尔百分比含量为1%-20%；
所述核酸药物为信使RNA、小干扰RNA、微小RNA、环状RNA、长非编码RNA、质粒DNA、小环DNA中的一种或两种以上；
所述核酸药物与可电离脂质的质量比为1/1-1/30；
可电离脂质化合物制备的脂质纳米颗粒平均粒径范围为1-1000 nm。
7.权利要求5或6所述的可电离脂质纳米颗粒组合物的制备方法，选自如下方法之一：
1）乙醇注入法：按照处方将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质使用有机溶剂配制脂质有机相混合液，使用浓度10 mM，pH= 4的柠檬酸盐缓冲液将核酸药物配置水相溶液，按水相和有机相之间的体积比为3：1的比例，使用移液枪吸取水相，注入有机相中立即吹打70-80次，静置15分钟后稀释获得均匀的脂质纳米颗粒；
2）微流控法：在按照处方将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质使用有机溶剂配制脂质有机相混合液，使用浓度10 mM，pH= 4的柠檬酸盐缓冲液将核酸药物配置水相溶液，按水相和有机相之间的体积比为3：1的比例，随后将有机相吸入1 mL注射器中，水相吸入3 mL注射器中并与样品导入管连接，固定到注射泵上，控制流速，运行程序收集流出液，稀释获得均匀的脂质纳米颗粒。
8.权利要求1或2所述的可电离脂质纳米颗粒在制备核酸药物、基因疫苗中的应用。
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