CN115097143B - 外周血血浆总外泌体中维生素d结合蛋白在诊断抑郁症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白在诊断抑郁症中的应用，属于生物科学领域。本发明发现在抑郁症及健康受试者外周血血浆总外泌体中的差异表达，作为抑郁症诊断的外周生物分子标志物。本发明表明维生素D结合蛋白在抑郁症和健康对照者血浆总外泌体中的差异性表达，在抑郁症患者血浆总外泌体中水平降低；通过单独使用该蛋白作为外周血液生物标记物检测其含量用于诊断抑郁症，可显著提高抑郁症与健康人群的鉴别诊断准确性。因此，外周血血浆中总外泌体中维生素D结合蛋白水平检测在抑郁症的诊断中具有很高的临床应用价值，为抑郁症的快速有效诊断提供了一种全新的途径。

Description

外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白在诊断抑郁症中的 应用
技术领域
本发明涉及生物科学领域，具体涉及外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白在诊断抑郁症中的应用。
背景技术
抑郁症是最常见的高级脑功能紊乱的重性精神障碍，WHO报道其人类疾病总负担高居第二(Lancet.2021；397(10270):220-32)。遗憾的是，抑郁症存在高度异质性，诊断依然依赖临床表象，缺乏客观诊断生物标记物，无法实现早期预警、正确诊断和精准个体化治疗(Brain Behav Immun.2019；81:24-40.)。在过去半个多世纪，国内外研究者从多维度多层面寻找客观诊断标记，遗憾的是至今尚无确定任何用于临床诊断的标记物。
外泌体是细胞释放的天然纳米颗粒，其携带大量来自亲代细胞的生物分子，如脂质、蛋白质、各种类型的核酸和可溶性小分子。在哺乳动物中，外泌体存在于所有生物样本中，如血液、唾液、母乳、尿液、脑脊液、羊水、精液和腹水(EscudéMartinez de Castilla P,Adv Drug Deliv Rev,2021)。本课题组前期研究提示与对照组相比，MDD患者外周血血浆中VDBP表达水平存在差异性表达(Journal of affective disorders.2020；277:620-30.)。而有关外泌体VDBP水平在MDD疾病中研究目前未见报道。因此，健康对照和MDD患者血浆总外泌体VDBP表达水平是否也存在差异表达，是当下亟待解决的关键问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白在诊断抑郁症中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于诊断抑郁症的设备，包括：用于分离外周血血浆中总外泌体的装置与用于检测所述的外周血血浆中总外泌体的维生素D结合蛋白浓度/含量的试剂盒。
可选地，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
可选地，所述的用于分离外周血血浆中总外泌体的装置为外泌体提取试剂盒
另一方面，本发明还提出了外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白的作为标志物在制备抑郁症诊断试剂中的应用。
可选地，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
可选地，所述的ELISA试剂盒中提供的微孔板预先包被抗体。
可选地，采用生物素偶联抗体作为检测抗体。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：首次发现血浆总外泌体中VDBP作为特异性诊断抑郁症的生物标志物的用途，为鉴别诊断抑郁症提供了一条全新的途径；单独采用VDBP作为指标，从非精神疾病健康人群中诊断抑郁症，ROC曲线下的面积值AUC为0.723。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为MDD和非精神疾病对照者的血浆中总外泌体VDBP蛋白浓度结果；
图2为血浆总外泌体VDBP蛋白在诊断抑郁症与健康人群鉴别效能示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的一些示例中，公开了外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白的测定实验。其中，试验对象为收集从未服用过抗精神病药物、心境稳定剂、苯二氮卓类等药物的105名抑郁症患者及48名非精神疾病对照者的外周血血浆样品。抑郁症的诊断由有丰富临床经验的三级精神专科医师(主任/副主任医师、主治医师和高年资住院医师)分别根据《精神疾病诊断与统计手册(第四版)》(DSM-V)中的诊断标准进行诊断和确认，上述精神疾病患者招募自东南大学附属中大医院和新乡医学院第二附属医院，健康对照者的样品来自东南大学附属中大医院及新乡医学院第二附属医院体检中心。
所做的检验和评估包括：外周血血浆总外泌体中VDBP蛋白浓度测定；评估各组患者病情严重程度的量表，包括汉密尔顿抑郁量表(24-item Hamilton Depression RatingScale,HAMD-24)、抑郁自评量表(Self-Rating Depression Scale,SDS)、贝克绝望量表(Beck Hopelessness Scale,BHS)、简明精神病量表(Brief Psychiatric Rating Scale,BRPS)、杨氏躁狂评定量表(Young Mania Rating Scale,YMRS)。
外周血血浆总外泌体的提取采用ExoQuick kit(System Biosciences Inc.,Mountain view,CA)试剂盒提取，具体提取方法如下：
0.3mL血浆与0.15mL凝血酶原-D(ThermoFisher Scientific,Waltham,USA)在室温下孵育1小时，加入0.2mL含有蛋白酶抑制(Roche,Indianapolis,IN)和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific；DBS++)的无钙和镁的Dulbecco平衡盐溶液(DBS)。4℃，10000rpm离心5分钟，上清移入干净的试管中进行总外泌体的分离。随后每管加入155μLExoQuick，4℃，1500×g，离心30分钟。收集血浆总外泌体，用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬。
外泌体通过直接加入RIPA裂解液进行溶解。随后对裂解液采用ELISA方法进行VDBP定量，所用试剂盒详细信息如下：Human DBP/Vitamin D Binding Protein(Vitamin DBinding Protein)ELISA Kit，EH2937，Fine Biotech Co.,Ltd，Wuhan，China。
该试剂盒的检测范围为3.906-250ng/ml。
试剂盒组件外所需器材和试剂：酶标仪(波长：450nm)，37℃恒温箱，自动洗板机，精密的单道和多道移液器以及干净的一次性枪头，干净的EP管，去离子水或蒸馏水。
更具体地说，所述的试剂盒基于双抗体夹心ELISA检测法。试剂盒中提供的微孔板已预先包被抗体。采用生物素偶联抗体作为检测抗体。依次将标准品、待测样品和生物素偶联检测抗体加入孔中，用洗涤液洗去未结合的成分。加入HRP-链霉亲和素(SABC)，用洗涤液洗去未结合的偶联物。再将TMB底物溶液添加到每个孔中。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度法在450nm的波长处测量OD值。将样品的OD450值与标准曲线进行比对，确定样品中待测蛋白的浓度。
具体实验步骤：
稀释样品和试剂时，必须将它们完全均匀地混合。在将TMB加入孔中之前，请将TMB底物在37℃下平衡30分钟。每次测试都绘制标准曲线。
设定标准品孔、待测样品孔(用样品稀释液至少稀释一倍)、空白孔，并记录其位置。为减小实验误差，每个标准品和样品一式两份进行测量。加样前，可先用洗涤缓冲液洗板2次。
加样：向相应孔中加入100ul标准品或待测样品，覆膜，并在37℃下孵育90分钟。(将溶液添加到微孔板的底部，并尽可能避免接触管壁和吸打起泡沫。)
洗板:取下覆膜或盖板，并用洗涤缓冲液洗板2次。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
加生物素标记抗体工作液:每孔加100ul生物素标记抗体工作液。盖上新的覆膜，37℃孵育60分钟。
洗板:取下覆膜或盖板，并用洗涤缓冲液洗板3次，每次浸泡1分钟。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
加HRP-链霉亲和素结合物(SABC):每孔加100ul SABC工作液。盖上新的覆膜，37℃孵育30分钟。
洗板:取下覆膜或盖板，用洗涤缓冲液洗涤板5次，每次浸泡1-2分钟。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去所有的洗涤缓冲液。
加TMB底物溶液:每孔加入90ul TMB底物溶液，覆膜，在37℃下于暗箱中孵育10-20分钟(根据颜色的实际变化，反应时间可以缩短或延长，但不能超过30分钟。当标准孔中出现明显的蓝色梯度时，可以终止反应)。
加终止液:向每孔中添加50ul终止液。颜色将由蓝色立即变为黄色。添加终止液的操作与添加TMB底物溶液的操作相同。
OD值的测量:加入终止溶液后，立即在酶标仪的450nm吸光处进行吸光度测定，读取OD450数值。
至于计算，可以将标准曲线绘制为标准品溶液的每个梯度的OD450值(Y轴)与标准品溶液各自对应的浓度(X轴)的关系。通过计算机软件进行标准曲线的绘制，例如CurveExpert 1.3or 1.4。将样本的OD值代入标准曲线，即可计算得到样品的目标浓度。
注:如果待测样品被稀释过，则标准曲线中计算得到的浓度需乘以稀释倍数，得到稀释前的浓度。
受试者的人口学和临床特征见表1，MDD和非精神疾病对照者的血浆中总外泌体VDBP蛋白浓度结果见图1，血浆总外泌体中VDBP的诊断与诊断效能分析见图2。
图1可见，与对照组相比，抑郁症患者中血浆总外泌体中VDBP显著下降。图2表明血浆总外泌体VDBP蛋白在诊断抑郁症与健康人群有较高的鉴别效能。ROC曲线下面积(AUC)为0.723。
注：数据使用平均值(标准差)或例数(百分比％)表示；
MDD:抑郁症；HC:非精神疾病健康人；
标记“a”表示两独立样本t检验；
标记“b”表示卡方检验。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (1)

1.外周血血浆总外泌体中维生素D结合蛋白作为标志物在制备抑郁症诊断试剂盒中的应用；所述的试剂盒为ELISA试剂盒；所述的ELISA试剂盒中提供的微孔板预先包被抗体；所述的ELISA试剂盒采用生物素偶联抗体作为检测抗体。
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