CN114921401B - 一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，属于粘液处理技术领域。在本发明中，羧甲基纤维素经多价金属离子交联改性后，具有多孔状立体分子交联结构，其多孔状结构特性实现了类似筛取细胞的功能，简称为“液相分子筛”，此结构不仅可以吸附粘液中的蛋白分子，将粘液蛋白长分子链之间进行分离，使细胞成分从粘液包裹状态解离出来，更因为自身带有大量孔洞，能使细胞在机械力的作用下通过孔洞分离出来，实现细胞的分离提取。本发明以使用纯物理方式从粘液液样本中提取细胞成分，多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素不与细胞发生化学反应，因此不会破坏细胞结构。

Description

一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法

技术领域

本发明涉及粘液处理技术领域，特别涉及一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法。

背景技术

粘液(或称黏液)是一种从人体的黏膜层或黏膜下层分泌出来的湿滑液体，如痰液、宫颈细胞液等。粘液一般都是比较浓稠的胶状体，其内含有丰富的细胞成分。粘液是病理细胞学或细胞培养等领域经常遇到的样本类型，从粘液中将细胞样本完整地提取出来，是进行诊断或科研的前提和基础。

目前从粘液中提取细胞的技术，主要有“碱溶液处理法”和“化学裂解液法”两种方法。“碱溶液处理法”通常是将痰液等样本放入到热的氢氧化钠水溶液中进行粘液裂解。“化学裂解液法”是使用如乙酰半胱氨酸、盐酸溴己新等化学成分，对粘液蛋白中的二硫键进行化学裂解。很明显，无论是强碱条件，还是化学裂解条件，细胞成分根本承受不了这样的理化环境。实际处理效果已经证明，上述两种方法，细胞成分的形态均会受到极大破坏，处理粘液的同时，难以获得有诊断价值的细胞成分。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，本发明提供的方法不破坏细胞结构，能够顺利将细胞从粘液中分离提取出来。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，包括以下步骤：

提供多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液；

将粘液与所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液混合，机械力分离，得到细胞。

优选的，所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的质量浓度为0.2～0.5％；

所述粘液与多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的体积比≤65:100。

优选的，所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的制备方法，包括以下步骤：

将羧甲基纤维素、水与无机强碱混合，得到碱改性羧甲基纤维素溶液；

将所述碱改性羧甲基纤维素溶液与冰醋酸混合，得到酸改性羧甲基纤维素溶液；

将所述酸改性羧甲基纤维素溶液与可溶性多价金属盐混合，进行交联反应，得到多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。

优选的，所述可溶性多价金属盐为可溶性镁盐、可溶性钙盐、可溶性锌盐和可溶性铁盐中的一种或几种。

优选的，所述羧甲基纤维素与水的质量比为0.2～0.5:100；所述羧甲基纤维素与无机强碱的质量比为0.5～1:0.5～1。

优选的，所述羧甲基纤维素的质量与冰醋酸的体积比为0.8～1.3g:0.8～1.5mL；

所述羧甲基纤维素与可溶性多价金属盐的质量比为0.5～1:0.5～1。

优选的，所述混合的方式为振荡混合或涡旋混合，所述混合的时间为5～10min。

优选的，所述机械力分离为离心分离；所述离心分离的离心力为600～800g，所述离心分离的时间为5～10min。

优选的，所述粘液为痰液、宫颈细胞液、肺泡灌洗液、支气管涮洗液、甲状腺穿刺样本、肾穿刺样本中的一种或几种。

本发明提供了一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，包括以下步骤：提供多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液；将粘液与所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液混合，机械力分离，得到细胞。在本发明中，羧甲基纤维素有吸附粘液的功能，其机理是，羧甲基纤维素分子与粘液中的蛋白分子极性相反，能够与粘液中的蛋白分子形成物理性相异相吸。羧甲基纤维素经多价金属离子交联改性后，具有多孔状立体分子交联结构，该交联结构不仅可以吸附粘液中的蛋白分子，将粘液蛋白长分子链之间进行分离，使细胞成分从粘液包裹状态解离出来，更因为自身带有大量孔洞，能够使细胞在机械力的作用下通过孔洞分离出来，实现细胞的分离提取。因为本发明的多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液具有多孔状立体分子结构，只能存在于液相中，而且其多孔状结构特性实现了类似筛取细胞的功能，为便于区别于传统技术，也为简化技术名称，发明人将“改性羧甲基纤维素水溶性交联多孔状立体结构溶液”这样的复杂名称，简称为“液相分子筛”。

本发明以使用纯物理方式从粘液液样本中提取细胞成分，多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素不与细胞发生化学反应，因此不会破坏细胞结构。实施例结果表明，采用本发明方法进行提取，制得的细胞样本载玻片中，几乎无粘液存在，大量细胞清晰可见。

附图说明

图1为痰液样本显微镜观察结果；

图2为实施例1细胞样本显微镜观察结果；

图3为实施例2细胞样本显微镜观察结果；

图4为实施例3细胞样本显微镜观察结果；

图5为实施例4细胞样本显微镜观察结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，包括以下步骤：

提供多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液；

将粘液与所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液混合，机械力分离，得到细胞。

本发明提供多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。在本发明中，所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的制备方法，优选包括以下步骤：

将羧甲基纤维素、水与无机强碱混合，得到碱改性羧甲基纤维素溶液；

将所述碱改性羧甲基纤维素溶液与冰醋酸混合，得到酸改性羧甲基纤维素溶液；

将所述酸改性羧甲基纤维素溶液与可溶性多价金属盐混合，进行交联反应，得到多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。

本发明优选将羧甲基纤维素、水与无机强碱混合，得到碱改性羧甲基纤维素溶液。在本发明中，所述羧甲基纤维素的来源优选为市售。在本发明中，所述羧甲基纤维素的粘度优选为400～1200mPa.s，更优选为600～1000mPa.s。

在本发明中，所述无机强碱优选为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

在本发明中，所述羧甲基纤维素与水的质量比优选为0.05～0.25:100，更优选为0.1～0.2:100；所述羧甲基纤维素与无机强碱的质量比优选为0.5～1:0.5～1，更优选为1:1。

在本发明中，所述混合的方式优选为先将羧甲基纤维素与水混合，得到羧甲基纤维素溶液，再将羧甲基纤维素溶液与无机强碱混合。在本发明中，所述羧甲基纤维素与水混合的温度优选为40～50℃，更优选为45～50℃。

得到所述碱改性羧甲基纤维素溶液后，本发明优选将所述碱改性羧甲基纤维素溶液与冰醋酸混合，得到酸改性羧甲基纤维素溶液。

在所述混合前，本发明优选对所述碱改性羧甲基纤维素溶液进行加热。在本发明中，所述加热的温度优选为40～50℃，更优选为45～50℃；所述加热的时间优选为0.8～1.4h，更优选为1h。

在本发明中，所述羧甲基纤维素的质量与冰醋酸的体积比优选为0.8～1.3g:0.8～1.5mL，更优选为1g:1mL。

在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合；本发明对所述搅拌混合的具体操作方式没有特殊的要求。

得到所述酸改性羧甲基纤维素溶液后，本发明优选将所述酸改性羧甲基纤维素溶液与可溶性多价金属盐混合，进行交联反应，得到多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。在本发明中，所述可溶性多价金属盐优选为可溶性镁盐、可溶性钙盐、可溶性锌盐和可溶性铁盐中的一种或几种。

在本发明中，所述可溶性镁盐优选为氯化镁；所述可溶性钙盐优选为氯化钙；所述可溶性锌盐优选为氯化锌；所述可溶性铁盐优选为氯化铁。本发明使用以上可溶性多价金属盐，其在酸改性羧甲基纤维素溶液中具有良好的溶解度。

在本发明中，所述羧甲基纤维素与可溶性多价盐的质量比优选为0.5～1:0.5～1，更优选为1:1。

在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合；本发明对所述搅拌混合的具体操作方式没有特殊的要求。

在本发明中，所述交联反应优选在静置的条件下进行，所述交联反应的温度优选为室温，时间优选为24～72h，更优选为36～48h。

本发明依次使用碱、酸、可溶性多价盐对羧甲基纤维素进行改性，羧甲基纤维素分子结构中的甲基，一步分被替换成了多价离子，一部分会完全去掉，变成空位。多价离子含有多价键，而原甲基的位置为一价键，因此，多价离子会再链接其他的羧甲基纤维素的去掉甲基的空位键，从而获得多孔状立体分子交联结构。

在本发明中，所述多孔状立体分子交联结构中的孔洞分为两种，一种是本发明将粘液蛋白长分子链集束之间拉开的空隙，为长条状或不规则缝隙，宽度约30μm或更大。另一种是本发明将粘液蛋白长分子链之间拉开形成的较规则孔洞，平均孔径约50～300μm。

本发明将粘液与所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液混合，机械力分离，得到细胞。在本发明中，所述粘液优选为痰液、宫颈细胞液、肺泡灌洗液、支气管涮洗液、甲状腺穿刺样本、肾穿刺样本中的一种或几种。

在本发明中，所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的质量浓度优选为0.2～0.5％，更优选为0.3～0.4％；所述粘液与多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的体积比优选≤65:100，更优选为1～65:100，进一步优选为2～50:100，更进一步优选为10～35:100。

在本发明中，所述混合的方式优选为振荡混合或涡旋混合，所述混合的时间优选为5～10min，更优选为3～8min；在本发明中，所述振荡混合的频率优选为0.1～2Hz，更优选为0.5～1Hz。

在本发明中，所述机械力分离的方式优选为离心分离；所述离心的离心力优选为600～800g，更优选为700g；所述离心的时间优选为5～10min，更优选为6～8min。

本发明优选在离心管内进行所述离心分离，所述离心后，在离心管底部得到细胞。

下面结合实施例对本发明提供的从粘液中提取细胞的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

取新鲜痰液1mL，用竹签搅拌均匀，平均分为5份。其中1份为对照组，其余4份分别用实施例1～4进行处理。这样，同一样本的平行对比即可充分客观地表现出本发明的实施效果。

对照组

将对照组痰液样本加入50mL 2％的氢氧化钠溶液中，边搅拌边水浴加热，恒温40℃下持续搅拌30分钟，对粘液进行裂解。然后将混合液倒入50mL离心管中，在600g离心力下离心5min，去掉离心管上清液，用吸管吸取离心管底部物质，涂抹于载玻片上，晾干，放入95％乙醇浸泡10分钟，固定细胞形态。然后进行HE染色和封片。20倍镜下效果如图1所示。

由图1可以看出，传统碱溶液处理后，粘液未完全裂解，而且，裂解后的粘液片段与细胞混合在一起，很多细胞被粘液遮挡，无法看清，而且上皮细胞形态结构已经被破坏，成为裸核，无法进行形态学诊断。

实施例1

取1g中粘度型、粘度为600mPa.s的羧甲基纤维素，在50℃下用水溶解，得到质量浓度为0.3％的羧甲基纤维素溶液；

向所述羧甲基纤维素溶液中加入1g氢氧化钠，迅速搅拌，得到碱改性羧甲基纤维素溶液；

将所述碱改性羧甲基纤维素溶液加热至45℃，加入1mL冰醋酸，混合均匀后得到酸改性羧甲基纤维素溶液；

向所述酸改性羧甲基纤维素中加入1g氯化镁，搅拌均匀后静置24h，得到镁离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。取10mL镁离子交联改性的羧甲基纤维素溶液和1份新鲜痰液置于离心管中，振荡混合10min，在600g离心力下离心5min，去掉离心管上清液，在离心管底部获得分离提取的细胞用吸管吸取离心管底部物质，涂抹于载玻片上，晾干，得到细胞样本涂片。放入95％乙醇浸泡10分钟，固定细胞形态。然后进行HE染色和封片。20倍镜下效果结果如图2所示。

由图2可以看出，经本实施例处理后的痰液，上皮细胞及中性粒细胞分散均匀，并可观察到口腔内的杂菌，细胞结构清晰，无粘液痕迹。说明本发明方法在不破坏细胞结构的前提下，能够顺利将细胞从粘液中分离提取出来。

实施例2

与实施例1相比，将氯化镁替换为氯化钙，其余操作均相同，获得分离提取的细胞。

按照实施例1的方式制备细胞样本载玻片，进行显微镜观察，20倍镜下效果如图3所示。由图3可以看出，上皮细胞及中性粒细胞分散均匀，并可观察到口腔内的杂菌，细胞结构清晰，无粘液痕迹。说明本发明方法在不破坏细胞结构的前提下，能够顺利将细胞从粘液中分离提取出来。

实施例3

与实施例1相比，将氯化镁替换为氯化铁，其余操作均相同，获得分离提取的细胞。

按照实施例1的方式制备细胞样本涂片，进行显微镜观察，结果如图4所示。结果显示，上皮细胞及中性粒细胞分散均匀，并可观察到口腔内的杂菌，细胞结构清晰，无粘液痕迹。说明本发明方法在不破坏细胞结构的前提下，能够顺利将细胞从粘液中分离提取出来。

实施例4

与实施例1相比，将氯化镁替换为氯化锌，其余操作均相同，获得分离提取的细胞。

按照实施例1的方式制备细胞样本涂片，进行显微镜观察，结果如图5所示。结果显示，上皮细胞及中性粒细胞分散均匀，并可观察到口腔内的杂菌，细胞结构清晰，无粘液痕迹。说明本发明方法在不破坏细胞结构的前提下，能够顺利将细胞从粘液中分离提取出来。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于液相分子筛从粘液中提取细胞的方法，包括以下步骤：

提供多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液；

将粘液与所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液混合，机械力分离，得到细胞；

所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的制备方法，包括以下步骤：

将羧甲基纤维素、水与无机强碱混合，得到碱改性羧甲基纤维素溶液；

将所述碱改性羧甲基纤维素溶液与冰醋酸混合，得到酸改性羧甲基纤维素溶液；

将所述酸改性羧甲基纤维素溶液与可溶性多价金属盐混合，进行交联反应，得到多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的质量浓度为0.2～0.5％；

所述粘液与多价金属离子交联改性的羧甲基纤维素溶液的体积比≤65:100。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可溶性多价金属盐为可溶性镁盐、可溶性钙盐、可溶性锌盐和可溶性铁盐中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素与水的质量比为0.2～0.5:100；所述羧甲基纤维素与无机强碱的质量比为0.5～1:0.5～1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羧甲基纤维素的质量与冰醋酸的体积比为0.8～1.3g:0.8～1.5mL；

所述羧甲基纤维素与可溶性多价金属盐的质量比为0.5～1:0.5～1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合的方式为振荡混合或涡旋混合，所述混合的时间为5～10min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述机械力分离为离心分离；所述离心分离的离心力为600～800g，所述离心分离的时间为5～10min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粘液为痰液、宫颈细胞液、肺泡灌洗液、支气管涮洗液、甲状腺穿刺样本、肾穿刺样本中的一种或几种。