CN114854737B - 基于三代测序平台的i类hla基因扩增引物、试剂盒及分型方法 - Google Patents

基于三代测序平台的i类hla基因扩增引物、试剂盒及分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、试剂盒及分型方法；扩增引物包括：HLA‑A基因正向扩增引物HLA‑A_F1、HLA‑A_F2，以及HLA‑A基因反向扩增引物HLA‑A_R1、HLA‑A_R2、HLA‑A_R3；HLA‑B基因正向扩增引物HLA‑B_F1、HLA‑B_F2、HLA‑B_F3，以及HLA‑B基因反向扩增引物HLA‑B_R1、HLA‑B_R2；HLA‑C基因正向扩增引物HLA‑C_F1、HLA‑C_F2、HLA‑C_F3，以及HLA‑C基因反向扩增引物HLA‑C_R1、HLA‑C_R2；基于中国人群数据库设计，包含HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C基因的外显子及内含子，能够对中国人群I类HLA基因进行更好的扩增，通过三代测序平台进行全长测序，得到超高分辨率的基因分型。

Description

基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、试剂盒及分型 方法
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，具体涉及基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物、试剂盒及分型方法。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，是编码人类的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的基因。HLA 的编码基因位于人6号染色体上，包括一系列紧密连锁的基因座，由360万个碱基对组成，是目前已知的人类染色体中多态性最为丰富的区域。
编码HLA的I类基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C基因，根据国际免疫遗传项目(IMGT：International ImMunoGeneTics project)的统计结果，I类 HLA基因共包括23002个等位基因(截止2021.09，IPD-IMGT/HLA数据库3.46 版本)，其中HLA-A基因包括7114个等位基因型，B基因包括8464个等位基因型，C基因包括6855个等位基因型。I类HLA基因与临床密切相关，如在进行器官移植需要考虑供体和受体I类HLA基因的基因分型，相似程度越高，排异反应越小。
I类HLA基因与药物的毒副作用密切相关，例如，HLA-B*57:01基因型携带者在接受阿巴卡韦治疗时发生超敏反应的风险显著升高，CPIC指南不建议 HLA-B*57:01基因型携带者使用阿巴卡韦。与HLA-B*58:01基因型未携带者相比，具有一个或两个HLA-B*58:01等位基因的患者在使用别嘌呤醇治疗时，发生严重皮肤不良反应如史蒂文斯-约翰逊综合征和中毒性表皮坏死松解 (SJS/TEN)的风险显著增加。HLA-A*31:01基因型携带者在接受卡马西平治疗时发生SJS/TEN的风险增加，不建议使用卡马西平。HLA-B*15:02基因型携带者在接受卡马西平治疗时发生SJS/TEN的风险增加，不建议使用卡马西平。与HLA-C*03:02基因型未携带者相比，具有一个或两个HLA-C*03:02 等位基因的患者使用别嘌呤醇治疗时发生严重皮肤不良反应(SCAR)的风险显著升高。HLA-C*04:01基因型携带者在接受奈韦拉平治疗时发生药物不良反应(如皮肤不良反应)风险升高。
传统的I类HLA基因分型方法包括PCR-RFLP、PCR-SSO、PCR-SSP等，虽然其具有快速、成本较低等特点，但是他们都存在分辨率低，无法识别新位点，已经逐渐无法满足临床上对药物相关位点的高分辨率分型的需要； PCR-SBT分型方法虽然是目前HLA分型的金标准，但是对其结果判断要求较高，对两种alleles不易区分导致容易出现模棱两可的结果。二代测序具有通量高，测序结果准确度高等特点，在临床上有着广泛应用，但因为其短序列的特征，数据分析可能需要依赖拼接和组装，多条不同reads进行连锁分析对二代数据分型的算法也提出了更高的要求。三代测序平台目前主要包括牛津大学纳米孔测序技术平台和美国太平洋生物科学公司的PacBio测序平台，与二代测序平台相比，三代测序平台具有超长读长等特点可以将I类HLA基因进行基因组全长测序，得到两条明确的alleles，进而通过对外显子和内含子上不同SNP进行分析可以得到超高分辨率的HLA分型结果。
目前基于三代测序技术的HLA扩增引物和分型方法都比较少，CN 108460246A公布了一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，但其算法较为复杂。有关HLA-A，HLA-B，HLA-C基因的扩增引物基本都没有参考我国的人群基因组频率信息，如CN113817725A公布一系列I类和II类HLA的扩增引物组合，但是引物设计没有参考我国的人群基因组频率信息，而HLA系列基因的上下游区域同样也是多态性较高的区域，在实际应用过程中可能发生部分多态性低的人群样本扩增不理想等问题；CN108441547B提供了一种 HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1的扩增方案，但是其设计是基于不同exon而非基因的全长进行设计的，而内含子区域的多态性区域要高于基因间区的多态性区域的，在高多态性区域进行引物设计同样可能出现部分频率低的人群样本出现无法扩增的问题；CN110494562A中提及的扩增引物在设计时虽然参考了人群基因组频率信息，但其所参考的是日本人的人群基因组频率信息，可能并不完全适用于我国的人群样本扩增。
发明内容
有鉴于此，一方面，一些实施例公开了基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物，该扩增引物包括：
(1)HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1、HLA-A_F2，以及HLA-A 基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3；
(2)HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3，以及HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2；
(3)HLA-C基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3，以及HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2；
其中，所述HLA-A_F1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述HLA-A_F2 的序列如SEQ IDNO:2所示；所述HLA-A_R1的序列如SEQ ID NO:3所示；所述HLA-A_R2的序列如SEQ ID NO:4所示；所述HLA-A_R3的序列如SEQ ID NO:5所示；
所述HLA-B_F1的序列如SEQ ID NO:6所示；所述HLA-B_F2的序列如 SEQ ID NO:7所示；所述HLA-B_F3的序列如SEQ ID NO:8所示；所述 HLA-B_R1的序列如SEQ ID NO:9所示；所述HLA-B_R2的序列如SEQ ID NO:10所示；
所述HLA-C_F1的序列如SEQ ID NO:11所示；所述HLA-C_F2的序列如SEQ ID NO:12所示；所述HLA-C_F3的序列如SEQ ID NO:13所示；所述HLA-C_R1的序列如SEQ ID NO:14所示；所述HLA-C_R2的序列如SEQ ID NO:15所示。
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物，HLA-A 基因正向扩增引物HLA-A_F1与HLA-A_F2摩尔比为1:1，HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3的摩尔比为1:1:1；HLA-B 基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3的摩尔比为1:1:1， HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2的摩尔比为1:1；HLA-C 基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3的摩尔比为1:1:1， HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2的摩尔比为1:1。
另一方面，一些实施例公开了基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂盒，包括本申请实施例公开的I类HLA基因扩增引物。
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂盒，还包括PCR扩增试剂、测序文库构建试剂以及基因纯化试剂。
再一方面，一些实施例公开了基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，包括：
(1)利用I类HLA基因扩增及测序试剂盒构建三代测序文库；
(2)在三代测序平台进行上机测序；
(3)测序完成后对测序数据进行分析，确定分型结果。
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，构建三代测序文库具体包括：
(1-1)利用基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物对目标样品进行扩增，得到扩增物；
(1-2)得到的扩增物进行纯化、末端修饰、接头连接和文库扩增，构建得到三代测序文库。
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，对目标样品进行扩增的程序设定为：
95℃，5min；
95℃，30s；65℃，30s；72℃，3min 30s进行35个循环；
72℃，10min。
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，扩增反应的反应体系为：
Figure SMS_1
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，构建三代测序文库的试剂配置为：
Figure SMS_2
Figure SMS_3
一些实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，在测序完成后对测序数据进行分析，具体包括：
(3-1)利用NanoFilt将三代测序平台测序所得的fastq序列进行数据质控，得到clean data的fastq文件；
(3-2)通过minimap2软件与人参考基因组进行比对分析，得到长片段比对结果的bam文件；
(3-3)利用samtools软件根据bam文件中HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因的位置对bam文件进行拆分，分别得到HLA-A基因、HLA-B基因、 HLA-C基因的fastq文件；
(3-4)利用Canu软件分别对HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因的fastq序列进行序列校正和截取；
(3-5)将校正和截取过后序列按照序列长度进行排序选取最长的30条序列进行alignment对齐，根据对齐结果选择2条代表性的alleles与人HLA 基因数据库进行blast比对，得到打分最高的2条序列即为该基因的分型结果。
本申请实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物基于中国人群基因组数据库设计，包括针对HLA-A、HLA-B、HLA-C基因分别进行扩增的正向扩增引物和反向扩增引物，包含HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因的外显子及内含子，能够对中国人群I类HLA基因进行更好的扩增，通过三代测序平台进行全长测序，可以得到I类HLA基因不同alleles的全长序列，从而达到超高分辨率的基因分型结果。
附图说明
图1：HLA-A、HLA-B、HLA-C三个基因临床样本扩增产物凝胶电泳结果。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本申请实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本申请中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本申请公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本申请中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～ 3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。本文中，正向引物用“F”表示，又称为上游引物，反向引物用“R”表示，又称为下游引物。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本申请内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本申请同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本申请的主旨。
在不冲突的前提下，本申请实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本申请实施例公开的内容。
在一些实施方式中，基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物，该扩增引物包括：(1)HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1、HLA-A_F2，以及HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3；(2) HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3，以及HLA-B 基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2；(3)HLA-C基因正向扩增引物 HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3，以及HLA-C基因反向扩增引物 HLA-C_R1、HLA-C_R2；
其中，所述HLA-A_F1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述HLA-A_F2 的序列如SEQ IDNO:2所示；所述HLA-A_R1的序列如SEQ ID NO:3所示；所述HLA-A_R2的序列如SEQ ID NO:4所示；所述HLA-A_R3的序列如SEQ ID NO:5所示；所述HLA-B_F1的序列如SEQ ID NO:6所示；所述HLA-B_F2 的序列如SEQ ID NO:7所示；所述HLA-B_F3的序列如SEQ ID NO:8所示；所述HLA-B_R1的序列如SEQ ID NO:9所示；所述HLA-B_R2的序列如SEQ ID NO:10所示；所述HLA-C_F1的序列如SEQ ID NO:11所示；所述 HLA-C_F2的序列如SEQ ID NO:12所示；所述HLA-C_F3的序列如SEQ ID NO:13所示；所述HLA-C_R1的序列如SEQ ID NO:14所示；所述HLA-C_R2的序列如SEQ ID NO:15所示。
引物设计、优化
本实施例1中，基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物设计优化中，发明人通过对1463个中国人群进行全基因组测序，得到中国人群HLA-A、 HLA-B、HLA-C基因及上下游区域的SNP多态性结果，同时参考人hg19 版本基因组序列和中国人群全基因测序数据的SNP多态性结果，进行引物设计和优化；
引物设计采用primer3.0工具进行，引物设计和优化过程中，发明人分别在HLA-A，HLA-B，HLA-C基因的上下游设计引物，使其可以分别扩增 HLA-A，HLA-B，HLA-C基因的全长序列，引物设计区间尽量避开包含人群多态性位点的区域；若不能避开多态性区域，尽量选择包含多态性位点较少的区域，同时在该区域增加包含多态性位点的引物；引物设计退火温度在 65℃左右，引物长度在20～30nt之间。得到的基于三代测序平台的I类HLA 基因扩增引物包括：HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1、HLA-A_F2，以及HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3；HLA-B 基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3，以及HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2；HLA-C基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3，以及HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、 HLA-C_R2；上述引物、序列和序列号列于表1。
表1基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、序列及序列号列表
引物 序列 序列号
HLA-A_F1 5’-CCGAAGGAGGATTCAAAATGAAAAC-3’ SEQ ID NO:1
HLA-A_F2 5’-CTGAAGGAGGATTCAAAATGAAAAC-3’ SEQ ID NO:2
HLA-A_R1 5’-GAGGCACAATATTGCTTCTGGTTTG-3’ SEQ ID NO:3
HLA-A_R2 5’-GAGGCACAATATTGCTTCTGGTTCA-3’ SEQ ID NO:4
HLA-A_R3 5’-GGGGCACAATATTGCTTCTGGTTTG-3’ SEQ ID NO:5
HLA-B_F1 5’-CTATGTCTGGCCAATGACAAAGGTC-3’ SEQ ID NO:6
HLA-B_F2 5’-CTATGTCTGGCCAATGACAAACGTC-3’ SEQ ID NO:7
HLA-B_F3 5’-CTATGTCTGGCCAATGAGAAAGGTC-3’ SEQ ID NO:8
HLA-B_R1 5’-AAACTCAGGGTGGGGAATGAAGATAA-3’ SEQ ID NO:9
HLA-B_R2 5’-AAACTCGGGGTGGGGAATGAAGATAA-3’ SEQ ID NO:10
HLA-C_F1 5’-GTCTGCCTCTTACCACTGGAGCATA-3’ SEQ ID NO:11
HLA-C_F2 5’-GTCTGCCTCTTACCACTGAAGCATA-3’ SEQ ID NO:12
HLA-C_F3 5’-GTCTGCCTCTTACCACTGGAGCACA-3’ SEQ ID NO:13
HLA-C_R1 5’-TGTGACAAAGATGCTTGGTGTAGGA-3’ SEQ ID NO:14
HLA-C_R2 5’-TGTGACAAAGATGCATGGTGTAGGA-3’ SEQ ID No:15
扩增测试和优选
本实施例2中，引物设计完成后选取DNA进行扩增测试和优选，经过设计和测试优化得到的HLA-A，HLA-B，HLA-C三个基因的引物组成及扩增长度如表2所示，对于HLA-A基因的扩增引物，包括两条正向扩增引物 HLA-A_F1、HLA-A_F2和三条反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、 HLA-A_R3，其中，正向引物中HLA-A_F2为依据人群多态性结果的补充引物，反向引物中HLA-A_R2、HLA-A_R3为依据人群多态性结果的补充引物；
对于HLA-B基因的扩增引物，包括三条正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3和两条反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2，其中，正向引物中HLA-B_F2、HLA-B_F3为依据人群多态性结果的补充引物，反向引物中HLA-B_R2为依据人群多态性结果的补充引物；
对于HLA-C基因的扩增引物，包括三条正向扩增引物HLA-C_F1、 HLA-C_F2、HLA-C_F3和两条反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2，其中，正向引物中HLA-C_F2、HLA-C_F3为依据人群多态性结果的补充引物，反向引物中HLA-C_R2为依据人群多态性结果的补充引物；
表2基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、序列及扩增长度
Figure SMS_4
PCR扩增、纯化
本实施例3中，依照下述方法进行PCR扩增、纯化：
(1)提取待测样本的DNA，例如，采用临床上血液/组织DNA提取试剂盒对待测样本进行DNA提取；
(2)配置PCR反应体系；
对于HLA-A，HLA-B，HLA-C基因的正向引物和反向引物，分别按照等比例配置相应的引物混合物mix，如HLA-A基因的正向引物混合mix，按照等比例原则加入HLA-A_F1和HLA-A_F2，反向引物混合mix则按照等比例原则分别加入HLA-A_R1，HLA-A_R2和HLA-A_R3，配置好正向引物和反向引物后，按照表3的PCR扩增反应体系配置列表配置PCR扩增反应体系，其中目标基因正向引物与目标基因反向引物按照等比原则配置。
作为可选实施例，HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1与HLA-A_F2 摩尔比为1:1，HLA-A基因反向扩增引物的HLA-A_R1、HLA-A_R2、 HLA-A_R3的摩尔比为1:1:1；HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、 HLA-B_F2、HLA-B_F3的摩尔比为1:1:1，HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2的摩尔比为1:1；HLA-C基因正向扩增引物 HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3的摩尔比为1:1:1，HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2的摩尔比为1:1。
表3 PCR扩增反应体系配置列表
Figure SMS_5
(3)PCR上机扩增
按照配置好的PCR反应体系，分别对HLA-A，HLA-B，HLA-C进行PCR 扩增；
(4)PCR扩增产物纯化
PCR扩增产物纯化过程包括柱平衡步骤：
向吸附柱CB2中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中；
估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液 PB，充分混匀，将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，室温放置2min， 12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中，重复此步骤；
将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；
将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 30～50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min；12000rpm离心2min收集DNA 溶液；
PCR产物纯化完成后，使用Nanodrop2000对纯化后产物进行浓度测定， OD260/280比值应在1.7～1.9区间。
三代测序DNA准备
本实施例4中，依照下述方法进行三代测序DNA准备：
(1)将1000ng DNA片段转入1.5ml的EP管中轻轻混匀，避免剧烈震荡，之后用离心力快速离心；
(2)室温下解冻DNA CS，快速离心，混匀并至于冰上；
(3)按照说明书准备NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra II Endrepair/dA-tailing Module试剂，并至于冰上待用；
(4)在0.2ml的PCR管中按照如下表4配置mix：
表4试剂列表
Figure SMS_6
(5)用手指轻弹管壁混匀，并快速离心；
(6)20℃孵育5分钟，随后65℃孵育5分钟；
(7)用漩涡震荡仪器将AMPure XP磁珠重悬；
(8)将DNA样本转移到一个干净的1.5ml的EP管中；
(9)向end-prep反应体系中加入60μl重悬混匀后的AMPure XP磁珠, 轻弹管壁混匀；
(10)室温孵育5分钟；
(11)用无核酸水配置500μl 70％的乙醇；
(12)快速离心样本，并放置于磁力架上，用移液枪去掉上清；
(13)将管子放置在磁力架上不动，用200μl的新鲜配置的70％的乙醇清洗磁珠，并弃乙醇；
(14)重复步骤13操作；
(15)快速离心并将离心管放置在磁力架上，吸取干净多余的乙醇，风干大约30秒，注意不要烘干太干；
(16)将管子从磁力架上移开，用61μl的无核酸水重悬磁珠，室温孵育 2分钟；
(17)继续将磁珠放置在磁力架上，直到洗脱液呈无色为止；
(18)将管子从磁力架上移除，加入61μl的洗脱液到新的1.5ml的EP DNA LoBind管中。
三代测序文库构建
本实施例5以Nanopore测序平台为例说明三代测序文库构建方法，具体包括：
(1)快速离心Adapter mix和T4连接酶，并置于冰上待用；
(2)室温溶解LNB，快速离心并用枪头混匀，由于比较粘稠，震荡难度较大，解冻和混匀后快速放在冰上待用；
(3)室温解冻EB，漩涡震荡混匀，快速离心后放在冰上待用；
(4)解冻LFB，混匀后快速离心并置于冰上富集长度大于3kb的片段；
(5)室温下融化一管SFB，漩涡震荡混匀，快速离心后放在冰上待用，以获得不同片段长度的DNA；
(6)在1.5ml的LoBind管中配置试剂，试剂配置如表5所列；
(7)温和混匀并快速离心；
(8)室温下孵育10分钟；
(9)漩涡震荡重悬AMPure XP beads；
(10)向反应液中加入40μl重悬后的AMPure XP beads，轻弹管壁混匀；
(11)室温下在旋转混合器中抚育5分钟；
(12)快速离心样本，并放在磁力架上，弃上清；
(13)加入250μl的LFB用于清洗磁珠，重悬磁珠，重新把管子放置在磁力架上，吸除上清液；
(14)重复上一步(13)一次；
(15)快速离心并将管子放回磁力架上，吸除多余的上清，风干大约30 秒；
(16)从磁力架上取下管子，加入15μl的EB buffer重悬磁珠，室温孵育10分钟；
(17)将磁珠微球放在磁力架上，直到洗脱液澄清并无色为止；
(18)弃掉洗脱液，留大概15μl的洗脱液转移到一个1.5ml的EP DNA LoBind管中。
表5三代测序文库构建试剂配置列表
Figure SMS_7
三代测序平台测序及数据分析
本实施例6以Oxford Nanopore测序平台为例，说明上机测序及数据分析方法，具体包括：
(1)文库构建完成后，使用Nanopore MinION测序仪进行上机测序；
(2)利用NanoFilt将三代测序平台测序所得的fastq序列进行数据质控，得到clean data的fastq文件；
(3)通过minimap2软件与人参考基因组进行比对分析，得到长片段比对结果的bam文件；
(4)利用samtools软件根据bam文件中HLA-A，HLA-B，HLA-C基因的位置对bam文件进行拆分，分别得到HLA-A基因，HLA-B基因，HLA-C 基因的fastq文件；
(5)利用Canu软件分别对HLA-A基因，HLA-B基因，HLA-C基因的fastq序列进行序列校正和截取；
(6)将校正和截取过后序列按照序列长度进行排序选取最长的30条序列进行alignment对齐，根据对齐结果选择2条代表性的alleles与人HLA基因数据库进行blast比对，得到打分最高的2条序列即为该基因的分型结果。
基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法
本实施例7基于具体测试样本说明基于三代测序平台的I类HLA基因分型方法，具体包括：
(1)样本准备
随机选取六个临床肾移植样本，进行DNA提取，提取后的DNA利用 Qubit进行浓度和质量测定，要求DNA浓度大于20ng/μl，OD260/OD280在 1.8～2.0之间，即判定为质量合格样本；
(2)PCR扩增
参照实施例3公开的扩增和纯化方法，配置扩增体系，进行PCR扩增； PCR扩增程序设定为：95℃，5min，(95℃，30s；65℃，30s；72℃，3min 30s) 35个循环，72℃，10min；
分别得到HLA-A，HLA-B，HLA-C的扩增产物，将扩增后产物进行电泳测试，结果如图1所示，图1中最左边是10K长度的长度标记marker，后面依次为HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因的样本；HLA-A基因、 HLA-B基因、HLA-C基因分别包含有六个样本；HLA-A基因六个样本的顺序分别为S0094、S0119、S0122、S0138、S0179、S0233，HLA-B基因、HLA-C 基因的六个样本顺序与HLA-A基因六个样本顺序相同；从图1中可以看出各个样本各个基因的扩增产物单一，HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因的扩增产物与设计长度一致；
将三个基因的扩增产物进行等比例混合，得到混合后的mix产物；
(3)PCR产物纯化
将混合后的mix产物进行纯化，然后使用Nanodrop2000对纯化后产物进行浓度及纯度测定，OD260/280比值为1.7～1.9；
(4)三代测序文库构建
对片段化后的PCR产物进行末端修饰、接头连接和文库扩增反应，参照实施例4公开的方法准备三代测序DNA，然后进行三代测序文库构建，参照实施例5公开的方法构建三代测序文库；
(5)三代测序平台测序、分型
参照实施例6公开的三代测序平台测序方法进行测序，并对测序数据进行分型；
对三代测序原始fastq数据进行分型，将得到分型结果与全外显子组测序(WES)分型结果进行比较，结果如表6、7、8所示，可以看到在6位 HLA基因分型的分辨率上，两种方法的一致率达到了100％。
表6三代测序分型结果与外显子测序(WES)分型结果比较列表一
Sample HLA-A(WES) HLA-A(Nanopore)
S0094 A*24:02:01/A*24:02:01 A*24:02:01:96/A*24:02:01
S0119 A*26:01:01/A*02:01:01 A*26:01:01:01/A*02:01:02:02
S0122 A*11:01:01/A*24:02:01 A*11:01:01:01/A*24:02:01:03
S0138 A*02:01:01/A*02:03:01 A*02:01:01:01/A*02:03:01:01
S0179 A*11:01:01/A*24:02:01 A*24:02:01:108/A*11:01:01:07
S0233 A*01:01:01/A*01:01:01 A＊01:01:01/A*01:01:01
表7三代测序分型结果与外显子测序(WES)分型结果比较列表二
Sample HLA-B(WES) HLA-B(Nanopore)
S0094 B*07:02:01/B*40:02:01 B*07:02:01:01/B*40:02:01:30
S0119 B*15:01:01/B*27:04:01 B*15:01:01:05/B*27:04:01
S0122 B*15:02:01/B*40:06:01 B＊15:02:01:05/B*40:06:01:12/
S0138 B*15:01:01/B＊38:02:01 B*15:01:01:01/B*38:02:01:01
S0179 B＊40:02:01/B*40:06:01 B*40:06:01:12/B*40:02:01:18
S0233 B*08:01:01/B*52:01:01 B*52:01:01:02/B*08:01:01
表8三代测序分型结果与外显子测序(WES)分型结果比较列表三
Sample HLA-C(WES) HLA-C(Nanopore)
S0094 C*07:02:01/C*03:03:01 C*03:03:01:01/C*07:02:01:03
S0119 C*03:03:01/C*15:09:01 C*15:09:01:01/C*03:03:01:01
S0122 C*08:01:01/C*08:01:01 C*08:01:01:01/C*08:01:01:01
S0138 C*07:02:01/C＊01:02:03 C*07:02:01:107/C*01:02:03
S0179 C＊03:04:01/C＊08:01:01 C＊03:04:01:49/C*08:01:01:01
S0233 C*07:02:01/C*12:02:02 C*07:02:01:01/C*12:02:02:01
一些实施方式公开的用于I类HLA基因扩增及测序的试剂盒，包括I 类HLA基因扩增引物。I类HLA基因扩增引物包括：(1)HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1、HLA-A_F2，以及HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、 HLA-A_R2、HLA-A_R3；(2)HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、 HLA-B_F2、HLA-B_F3，以及HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、 HLA-B_R2；(3)HLA-C基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、 HLA-C_F3，以及HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2。
作为可选实施例，用于I类HLA基因扩增及测序的试剂盒还包括PCR 扩增试剂、测序文库构建试剂以及基因纯化试剂。例如，包括表3所列的 PCR扩增反应试剂，表4所列的三代测序文库构建试剂。
本申请实施例公开的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物基于中国人群数据库设计，包括针对HLA-A、HLA-B、HLA-C基因分别进行扩增的正向扩增引物和反向扩增引物，包含HLA-A、HLA-B、HLA-C基因的外显子及内含子，能够对中国人群I类HLA基因进行更好的扩增，通过三代测序平台进行全长测序，可以得到I类HLA基因不同alleles的全长序列，从而达到超高分辨率的基因分型。
本申请公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本申请的发明构思，并不构成对本申请技术方案的限定，凡是对本申请公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本申请具有相同的发明构思，都在本申请权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学、河南申友医学检验所有限公司
<120> 基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物、试剂盒及分型方法
<130> 2022-02-22
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 1
ccgaaggagg attcaaaatg aaaac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 2
ctgaaggagg attcaaaatg aaaac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 3
gaggcacaat attgcttctg gtttg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 4
gaggcacaat attgcttctg gttca 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 5
ggggcacaat attgcttctg gtttg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 6
ctatgtctgg ccaatgacaa aggtc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 7
ctatgtctgg ccaatgacaa acgtc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 8
ctatgtctgg ccaatgagaa aggtc 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 9
aaactcaggg tggggaatga agataa 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 10
aaactcgggg tggggaatga agataa 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 11
gtctgcctct taccactgga gcata 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 12
gtctgcctct taccactgaa gcata 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 13
gtctgcctct taccactgga gcaca 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 14
tgtgacaaag atgcttggtg tagga 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工合成
<400> 15
tgtgacaaag atgcatggtg tagga 25

Claims (4)

1.基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物，其特征在于，包括：
（1）HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1、HLA-A_F2，以及HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3；
（2）HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3，以及HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2；
（3）HLA-C基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3，以及HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2；
其中，所述HLA-A_F1的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述HLA-A_F2的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述HLA-A_R1的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述HLA-A_R2的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述HLA-A_R3的序列如SEQ ID NO:5所示；
所述HLA-B_F1的序列如SEQ ID NO:6所示；
所述HLA-B_F2的序列如SEQ ID NO:7所示；
所述HLA-B_F3的序列如SEQ ID NO:8所示；
所述HLA-B_R1的序列如SEQ ID NO:9所示；
所述HLA-B_R2的序列如SEQ ID NO:10所示；
所述HLA-C_F1的序列如SEQ ID NO:11所示；
所述HLA-C_F2的序列如SEQ ID NO:12所示；
所述HLA-C_F3的序列如SEQ ID NO:13所示；
所述HLA-C_R1的序列如SEQ ID NO:14所示；
所述HLA-C_R2的序列如SEQ ID NO:15所示。
2.根据权利要求1所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物，其特征在于：
所述HLA-A基因正向扩增引物HLA-A_F1与HLA-A_F2摩尔比为1:1，所述HLA-A基因反向扩增引物HLA-A_R1、HLA-A_R2、HLA-A_R3的摩尔比为1:1:1；
所述HLA-B基因正向扩增引物HLA-B_F1、HLA-B_F2、HLA-B_F3的摩尔比为1:1:1，所述HLA-B基因反向扩增引物HLA-B_R1、HLA-B_R2的摩尔比为1:1；
所述HLA-C基因正向扩增引物HLA-C_F1、HLA-C_F2、HLA-C_F3的摩尔比为1:1:1，所述HLA-C基因反向扩增引物HLA-C_R1、HLA-C_R2的摩尔比为1:1。
3.基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增引物。
4.根据权利要求3所述的基于三代测序平台的I类HLA基因扩增及测序试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂、测序文库构建试剂以及基因纯化试剂。
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