CN114656422B - 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用 - Google Patents

一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114656422B
CN114656422B CN202210430570.9A CN202210430570A CN114656422B CN 114656422 B CN114656422 B CN 114656422B CN 202210430570 A CN202210430570 A CN 202210430570A CN 114656422 B CN114656422 B CN 114656422B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cationic liposome
lipid
crown ether
ether compound
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210430570.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114656422A (zh
Inventor
李硕
侯梦琪
程倩
万山可
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing University of Technology
Original Assignee
Chongqing University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing University of Technology filed Critical Chongqing University of Technology
Priority to CN202210430570.9A priority Critical patent/CN114656422B/zh
Publication of CN114656422A publication Critical patent/CN114656422A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114656422B publication Critical patent/CN114656422B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D273/00—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D261/00 - C07D271/00
    • C07D273/08—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D261/00 - C07D271/00 having two nitrogen atoms and more than one oxygen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome

Abstract

本发明公开了一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用，所述阳离子脂质体是以二氮杂18‑冠醚‑6为原料，通过亲核取代反应、水解反应、与不同碳链的烷基胺进行HBTU缩合反应得到新型氮杂冠醚化合物，新型氮杂冠醚化合物再与二烯酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组装得到稳定的阳离子脂质体lipid 1‑M，进而阳离子脂质体与pDNA通过静电相互作用得到阳离子脂质体/pDNA复合物。可作为病毒载体。并且随着碳链的增长，细胞毒性逐渐减小，细胞转染效率逐渐升高。为基因载体的研究提供了新的思路，拓宽了氮杂冠醚结构衍生物的应用范围。

Description

一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用。
背景技术
癌症一直是最大的健康问题，癌症的一般治疗策略包括化疗、放疗、切除肿瘤和杀死癌细胞等，致使人体免疫力降低，伤害极大。然而像黑色瘤素这样的细胞却不能通过手术切除，需要寻找新的治疗方法。近年来，基因治疗仍是治疗遗传性疾病和获得性疾病很有前途的一种治疗策略，因此，开发高转染效率和低细胞毒性的基因载体是基因治疗中最关键的一环。
理想的基因载体是能够靶向细胞，将核酸药物成功释放并表达。普遍地，病毒载体的转染效率更高，但也有一定的问题存在，比如细胞毒性更高，临床困难等；而非病毒转染载体的安全性高，但细胞转染效率却不理想。
阳离子脂质体是一种潜在的纳米载体，可以与核酸的磷酸根通过静电作用将高分子DNA完全包裹形成脂复合物，从而压缩DNA的体积，再靶向递送至细胞中进行DNA释放及表达。脂质类基因载体都具有一定的细胞毒性，并且其毒性是由小分子化合物的决定的，因此对于脂质类基因载体的研究，安全性是及其关键的。
氮杂冠醚是具有空腔的大环多胺配体，因其独特的结构性质，在催化、化学与生物探针、分离以及细胞成像等领域被研究。氮杂冠醚衍生物在其生物性能的研究中，证实其具有低细胞毒性，减少多药耐药性等优势。
发明内容
针对上述的不足，本发明的第一目的在于，提供一种新型氮杂冠醚化合物；
本发明的第二目的在于，提供一种新型氮杂冠醚化合物的制备方法；
本发明的第三目的在于，以新型氮杂冠醚化合物作为原料制备一种阳离子脂质体并与pDNA结合形成脂质/DOPE/DNA复合物(阳离子脂质体复合物)在作为基因载体材料中的应用。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种新型氮杂冠醚化合物，所述新型氮杂冠醚化合物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003610200850000021
其中，n选自7、11、15。
进一步地，具体步骤如下：
1)将1份1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷和0.77份TEA溶于30份二氯甲烷Ⅰ，得到溶液Ⅰ，然后将0.83份二叔丁基二碳酸酯溶于30份二氯甲烷Ⅱ，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ缓慢滴加到溶液Ⅰ中，使其在室温下搅拌24h后，浓缩溶剂，残余物在硅胶柱上用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯；
2)将1份1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯、0.48份溴乙酸乙酯、0.75份碳酸钾、50份乙腈混合并加热到82℃反应24h，反应后得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到16-(2-乙氧基-2-氧乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯；
3)将1份16-(2-乙氧基-2-氧乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯、0.61份氢氧化钠于15份乙醇中，在室温下搅拌24h，得到溶液Ⅳ，将溶液ⅣpH调至4，过滤掉固体，挥发溶剂得到2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸；
4)将1份2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸与胺类化合物混合，然后再与1.27份的O-(1h-苯并三唑-1-基)-N-四甲基六氟磷酸铵、0.60份的TEA、20份的乙腈在室温下搅拌过夜，得到溶液Ⅴ，将溶液Ⅴ过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用乙酸乙酯/甲醇＝60/1洗脱后得到新型氮杂冠醚化合物。
进一步地，所述胺类化合物选自0.31份的辛烷-1-胺、0.44份的十二烷-1-胺、0.57份的十六烷-1-胺中的一种或多种。
进一步地，一种阳离子脂质体，所述阳离子脂质体由权利要求1-3任一项所述的新型氮杂冠醚化合物和二油酰磷脂酰乙醇胺制备得到。
进一步地，具体步骤如下：
将中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺与新型氮杂冠醚化合物按照1:1摩尔比混合后在氯仿中结合，在减压条件下用氮气干燥，除去氯仿溶剂，脂膜用5份的MnSO4·H2O和5份的Cu(NO3)2·3H2O溶液水化，搅拌混合物，直到薄膜完全重新悬浮后在细胞粉碎仪中超声作用，得到阳离子脂质体lipid 1-M。
进一步地，一种阳离子脂质体复合物，所述阳离子脂质体复合物由权利要求4-5任一项所述的阳离子脂质体和质粒DNA结合得到。
进一步地，具体步骤如下：
将阳离子脂质体和质粒DNA按照N/P＝1～11完全混合并在室温下孵育30min，得到阳离子脂质体复合物。
进一步地，所述的新型氮杂冠醚化合物，或所述的阳离子脂质体，或所述的阳离子脂质体复合物在制备基因载体材料中的应用。
采用以上方案，本发明具有如下优点：
1、本发明设计和合成了一类基于氮杂冠醚结构的新型化合物作为阳离子脂质体，并对其作为基因载体用于基因递送系统的研究，利用氮杂冠醚的优势，首次提出将它作为基因载体研究。
2、本发明首先提供了一种阳离子脂质体/pDNA复合物作为基因载体，所述载体由作为内核的DNA和作为外壳层的阳离子脂质体形成，所述阳离子脂质体是以二氮杂18-冠醚-6为原料，通过亲核取代反应、水解反应、与不同碳链的烷基胺进行HBTU缩合反应得到新型氮杂冠醚化合物，新型氮杂冠醚化合物再与二烯酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组装得到稳定的阳离子脂质体lipid 1-M，进而阳离子脂质体与pDNA通过静电相互作用得到阳离子脂质体/pDNA复合物。
3、本发明中的阳离子脂质体可与质粒DNA结合并能够有效压缩成纳米粒，可作为病毒载体，为基因载体的研究提供了新的思路，拓宽了氮杂冠醚结构衍生物的应用范围。
4、本发明中，发明人设计并合成了新型氮杂冠醚结构的阳离子脂质体。氮杂冠醚是具有空腔的大环多胺配体，因其独特的结构性质，在催化、化学与生物探针、分离以及细胞成像等领域被研究。氮杂冠醚衍生物在其生物性能的研究中，证实其具有低细胞毒性，减少多药耐药性等优势。因此，我们设计和合成了一类基于氮杂冠醚结构的新型化合物作为阳离子脂质体，并对其作为基因载体用于基因递送系统的研究。研究结果证实，lipid 1-M(M＝Mn2+，Cu2+)可以完全的包裹DNA，具有合适的粒径电位，并且可以成功地靶向正向细胞和肿瘤细胞，其细胞毒性随着碳链的增长而降低，而转染效率随着碳链的增长而升高。且氮杂冠醚结构衍生物首次被作为基因载体研究，其结果也证实其具有一定的转染效果，本发明致力于利用氮杂冠醚的结构优势，设计出不同的基因载体，有望得到更加理想的基因载体，进一步可以进入临床诊断从而促进基因治疗的发展。
5、本发明通过亲核取代反应，水解反应，HBTU缩合反应等合成新型氮杂冠醚化合物，并制备成脂质体lipid 1-M。采用琼脂糖电泳实验，溴化乙锭(EB)嵌插实验，粒径电位的测定以及细胞毒性和细胞转染实验对lipid 1-M作为病毒载体的可行性。琼脂糖电泳实验证明，lipid 1-M可以成功的与DNA发生相互作用，N/P＝9时可使DNA迁移率完全延迟。细胞毒性和细胞转染实验结果表明，lipid 1-M的细胞毒性随着碳链的增长，细胞毒性逐渐减小，且细胞转染效率也逐渐升高。因此，新型氮杂冠醚结构的阳离子脂质体为基因载体的研究提供了新的思路，进一步希望在生物医学方面得到深入应用，扩大了此类材料在化学生物学领域的应用范围。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
图1为新型氮杂冠醚化合物的合成路线；
图2为新型氮杂冠醚化合物与Cu2+离子络合后形成的配合物质谱图；
图3为脂质体与质粒DNA的结合能力；
图4为不同N/P下脂质体的平均粒径和表面电荷；
图5为CCK-8细胞毒性实验结果；
图6为lipid 1-M和bPEI25k转染的L02细胞的荧光显微镜图像。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述，但实施例并不对本发明作任何形式的限定，除非特别说明，本发明所涉及的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明的实施例中：
定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；
实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
1,2-二(2-氯乙氧基)乙烷为成都艾科试剂有限公司，CAS:112-26-5；1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷为成都艾科试剂有限公司产品，CAS:929-59-9；二碳酸二叔丁酯为北京杨村化工有限责任公司产品，CAS:24424-99-5；溴乙酸乙酯为damas-beta公司产品，CAS:105-36-2；苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐为damas-beta公司产品，CAS:94790-37-1；辛胺为ΛCMEC公司产品，CAS:111-86-4；十二烷基伯胺为damas-beta公司产品，CAS:124-22-1；十六胺为damas-beta公司产品，CAS:143-27-1；二油酰磷脂酰乙醇胺为阿拉丁公司产品；pDNA(pUC-19)为BBI公司产品；pEGFP、pGL3为提取基因产品；L02细胞为上海翼和应用生物技术有限公司产品。
实施例1：新型氮杂冠醚化合物的制备及检测
1、实验方法
1)1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷的制备，合成路线如图1所示
将1,2-二(2-氯乙氧基)乙烷(19.03g，101.7mmol)和碘化钠(33.4g，222.8mmol)加入到丙酮(50mL)中，搅拌回流72h；冷却至室温抽滤，取滤液旋干，得到淡黄色油状粘稠状残余物，将上述残余物溶解于甲基叔丁基醚(MTBE)中，用无水硫酸钠(60.3g，240mL)作为水相，静置分液，取上层MTBE相，将MTBE相旋干，得到中间产物无色油状液体1,2-双(2-碘乙氧基)乙烷；
将1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(32.46g，219.0mmol)溶于乙腈(100mL)并加入到含有1,2-双(2-碘乙氧基)乙烷(36.79g，99.4mmol)、碳酸钠(52.68g)和乙腈(400ml)的混合物中，于82℃回流18h后，过滤后取滤液旋干，得微黄色粘稠液体；将所得微黄色粘稠液体溶解在含有丙酮(50mL)和1,4-二氧六环(50mL)的混合溶液中，于85℃加热半个小时，冷却至室温放置冰箱冷却过夜析出白色晶体，抽滤，将晶体溶于水(50mL)中，加入氯仿(40mL)于61℃加热回流萃取1.5h；经分液得氯仿层，旋干得粗产品为淡黄色固体，经真空干燥，用正庚烷重结晶得目标产物，即1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷，其结构式图1中(1)所示；
2)1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯的制备
将1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷(1.38g,5.26mmol)和TEA(1.06g,10.52mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，然后将二叔丁基二碳酸酯(1.15g，5.26mmol溶于二氯甲烷(30ml)再缓慢滴加到上述溶液中，使其在室温下搅拌24h后浓缩溶剂，残余物在硅胶柱上用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到目标产物，即1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯，其结构式图1中(2)所示；
3)16-(2-乙氧基-2-氧乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯的制备
将化合物2(1.18g,3.2mmoL)，溴乙酸乙酯(0.57g,3.4mmoL)，碳酸钾(3.24g,23.4mmoL)，乙腈(50ml)的混合物加热到82℃反应24h。反应后溶液过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到目标产物，即16-(2-乙氧基-2-氧乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯，其结构式图1中(3)所示；
4)2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸的制备
将化合物(30.96g,2.1mmol)、氢氧化钠(0.59g,14.8mmol)于乙醇(15mL)中，在室温下搅拌24h。将混合液PH调至4，过滤掉固体，挥发溶剂得到目标产物，即2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸，其结构式图1中(4)所示；
5)新型氮杂冠醚化合物的制备
将2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸(1eq)与辛烷-1-胺(1eq)混合，然后与O-(1h-苯并三唑-1-基)-N-四甲基六氟磷酸铵(1.4eq)、TEA(2eq)和乙腈在室温下搅拌过夜。反应溶液过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用乙酸乙酯/甲醇＝60/1洗脱后得到目标产物新型氮杂冠醚化合物，其结构式如图1中(5)n＝7时所示，即16-(2-辛氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯(5a)；
将2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸(1eq)与十二烷-1-胺(1eq)混合，然后与O-(1h-苯并三唑-1-基)-N-四甲基六氟磷酸铵(1.4eq)、TEA(2eq)和乙腈在室温下搅拌过夜。反应溶液过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用乙酸乙酯/甲醇＝60/1洗脱后得到目标产物新型氮杂冠醚化合物，其结构式如图1中(5)n＝11时所示，即16-(2-十二烷基氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯(5b)；
将2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸(1eq)与十六烷-1-胺(1eq)混合，然后与O-(1h-苯并三唑-1-基)-N-四甲基六氟磷酸铵(1.4eq)、TEA(2eq)和乙腈在室温下搅拌过夜。反应溶液过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用乙酸乙酯/甲醇＝60/1洗脱后得到目标产物新型氮杂冠醚化合物，其结构式如图1中(5)n＝15时所示，即16-(2-十六烷基氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯(5c)。
6)新型氮杂冠醚化合物的检测
采用Bruker AVANCE Ⅲ 600MHz型光谱仪对合成的新型氮杂冠醚化合物5a、5b、5c做1H NMR和13C NMR测试，测其氢元素的化学位以及个数和碳元素的信息以及确定其级数。
2、实验结果
如图2所示，测试值与理论值十分接近，所得产物与预期合成结构吻合；
5a:16-(2-辛氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯，其结构式为：
Figure BDA0003610200850000081
1H NMR(600MHz,CDCl3)δH:3.45～3.71(m,-CH2O-,-CH2NCH2-,-NCH2O-,-NHCH2-,28H),1.45(s,-CH3,1H),1.26(s,-CH2-,1H),0.88(s,-CH3,1H).
5b:16-(2-十二烷基氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯，其结构式为：
Figure BDA0003610200850000082
1H NMR(600MHz,CDCl3)δH:3.59(s,-CH2O-,18H),3.50(s,-CH2O-,-CH2NCH2-,-NHCH2-,10H),0.78～1.63(m,-CH2-,-CH3,32H).
5c:16-(2-十六烷基氨基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯，其结构式为：
Figure BDA0003610200850000091
1H NMR(600MHz,CDCl3)δH:3.55(d,J＝54.1Hz,-CH2O-,-CH2NCH2-,-NCH2O-,-NHCH2-,28H),1.60(s,-CH2-,5H),1.45(s,-CH2-,-CH3,19H),1.25(s,-CH2-,13H),0.89(s,-CH3,3H).
实施例2：阳离子脂质体的制备
将中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(0.005mmol)分别与新型氮杂冠醚化合物，即5a、5b、5c中，在氯仿中结合，在减压下用氮气干燥，除去氯仿溶剂。脂膜用MnSO4·H2O(5mL,1mM)和Cu(NO3)2·3H2O(5mL,1mM)溶液水化，最终脂质浓度为1mM。搅拌混合物，直到薄膜完全重新悬浮后在细胞粉碎仪中超声作用(60℃)，得到阳离子脂质体lipid 1-M(1＝1a、1b、1c，M＝Mn2+和Cu2+)，储存在4℃。
实施例3：阳离子脂质体/pDNA复合物(脂复合物)的制备
将0ul、1.050ul、1.125ul、1.875ul、2.625ul、3.375ul和4.125ul阳离子脂质分别与0.125ug的DNA以0、1、3、5、7、9和11的N/P比完全混合，并在室温下孵育30min，得到脂复合物。理论N/P比表示阳离子脂与核苷酸碱基的电荷比(摩尔比)，并考虑到平均核苷酸质量为330g/mol。
实施例4：质粒DNA结合能力的测定
1、实验方法
将实施例3中制备的脂复合物做琼脂糖凝胶电泳实验和溴化乙锭嵌插试验表征质粒DNA结合能力，具体操作如下：
在0.125μg pUC-19溶液中分别加入0ul、1.050ul、1.125ul、1.875ul、2.625ul、3.375ul和4.125ul阳离子脂质体，制备了N/P比(脂质的氨基与磷酸基团)为1～11的脂复合物。将脂复合物在室温下孵育30min。然后，以1xTBE为运行缓冲液，用含0.5％(W/V)琼脂糖凝胶在电压80V下电泳40min，用Quantum-ST41100/26M在波长为312nm的紫外灯下观察DNA；
在室温下用荧光光谱法分析了脂复合物对溴化乙锭的猝灭(RF-6000型光谱荧光光度计，日本东京岛津)，将EB(10μL,0.025μg/μL)放入含200μL磷酸盐缓冲液(PBS；pH7.4)的石英比色皿中，振荡后测定EB的荧光强度。然后，将pUC-19DNA(20μL,0.025μg/μL)混合加入到溶液中，再测DNA与EB相互作用荧光强度。随后，将lipid 1-M(1mM,每次加1.6μL)加入上述溶液，并测量其荧光强度。所有样品的激发波长为520nm，发射波长为620nm。样品的相对荧光强度(％FI)按以下公式计算：
Figure BDA0003610200850000101
式中，FEB是纯EB溶液的强光强度，F0是EB和DNA相互作用后的荧光强度。
2、实验结果
结果如图3所示，图3中的(a)为不同N/P比下lipid 1-M与pDNA结合的电泳凝胶滞留分析，图3中的(b-c)为溴化乙锭嵌插实验测定不同N/P比的lipid 1-M(M＝Mn2+和Cu2+)在PBS缓冲溶液中与pDNA的结合；
图3(a)表明，lipid M(M＝Mn2+,Cu2+)能有效地与DNA结合(包裹DNA)并延缓其电泳迁移率，用这三种脂质体，当N/P比为9时，DNA迁移率完全延迟。进一步用EB嵌插实验测定不同N/P比的lipid 1-M在PBS缓冲溶液中与pDNA的结合；
图3(b-c)表明，在pH7.4的PBS溶液中，相对荧光强度随N/P比变化的EB嵌插分析结果，实验结果发现随着N/P的增加，荧光强度逐渐降低，是因为当EB嵌插进DNA后荧光强度增强，随着lipid M的加入，脂复合物阻碍了EB的嵌插作用，导致荧光强度降低。当N/P电荷比达到10时，lipid c-Mn2+，lipid c-Mn2+和lipid a-Cu2+复合物可观察到25％以下相对于EB和DNA相互作用后的荧光强度。与lipid a-M和lipid c-M相比，lipid b-M猝灭的荧光强度更低。结合琼脂糖电泳实验和EB嵌插实验结果可知，lipid M与质粒DNA具有良好的结合能力。
实施例5：脂复合物的颗粒尺寸和粒径电位
1、实验方法
用25℃动态光散射系统(NanoBrook 90PlusPALS,Brookhaven Instruments,Brookhaven,USA)在室温下测量了脂质/pDNA脂质复合物的粒径和zeta电位。将lipid M与50μL DNA(0.025μg/μL)混合，在1mL超纯水中制备脂质体颗粒。
2、实验结果
结果如图4所示，图4中的(a)图为lipid 1-Mn2+；图4中的(b)图为lipid 1-Cu2+；
lipid 1-M复合物的粒径随N/P比的增加而减小；图4(a)表明，与lipid 1c-Mn2+复合物相比，lipid 1a-Mn2+复合物和lipid 1b-Mn2+复合物的颗粒尺寸更小，最小纳米粒径分别为177nm和174nm。另一方面，用差示扫描量热法(DLS)测定了不同N/P比的复合物的表面电荷，lipid 1-Mn2+复合物的表面电荷几乎为正电荷，其范围为-6.67～+24.77mV；
图4(b)表明，与lipid 1c-Cu2+复合物和lipid b-Cu2+复合物相比，lipid a-Cu2+复合物的粒径最小，最小粒径为166.5nm(N/P＝15)，而三个脂复合物的Zeta电位都相对稳定，范围在-0.65～+1.85mV。lipid 1-M复合物中碳链较短的lipid 1a-M复合物具有更小的纳米粒子尺寸和Zeta正电荷，而与lipid Cu2+复合物相比，lipid 1-Mn2+复合物具有更合适的纳米粒径和Zeta电位，为后续的细胞转染实验奠定了基础。
实施例6：CCK-8细胞毒性实验
1、实验方法
细胞培养：L02细胞用含10％胎牛血清和0.1％抗生素(青霉素和链霉素)的1640培养基，在37℃，5％CO2潮湿环境的细胞培养箱中孵育；
脂质体和脂复合物对L02细胞的毒性采用CCK-8法测定。将5×105万个/孔细胞接种到96孔板中，放入37℃培养箱中培养24小时。分别加入不同浓度(分别为0μg/μL，0.025μg/μL，0.05μg/μL，0.075μg/μL，0.10μg/μL)的lipid M和不同N/P(9,11,13)的lipid M复合物，以bPEI25k和bPEI25k复合物(w/w:1.4)为对照，然后放入37℃培养箱中培养24小时。再加入10μL CCK-8后轻轻敲击孔板混匀，放入37℃培养箱中培养2小时，用酶标仪测定450nm的吸光度。
2、实验结果
结果如图5所示，图5中(a-b)以bPEI25k为对照，在不同浓度(0-0.1μg/μL)下，lipid 1-M在L02细胞中的细胞毒性，L02细胞与lipid 1-M孵育24h；图5中(c-d)以不同N/P比制备的lipid 1-M/pEGFP形成的细胞毒性，bPEI25k作为对照，细胞与脂复合物一起孵育24h；
如图5(a-b)所示，以bPEI25k为对照，不同浓度的lipid 1-M溶液在正常细胞(L02)中的细胞毒性，结果表明，随着lipid 1-M和bPEI25k溶液浓度增加，细胞存活率逐渐降低，即细胞毒性显著增加。其中lipid 1c-Mn2+比参照物bPEI25k的毒性更低，lipid 1b-Mn2+溶液的浓度超过0.05μg/μL时，细胞毒性比参照物bPEI25k的毒性高，而lipid 1-Cu2+的细胞毒性均比bPEI25k高。此外，同样以bPEI25k复合物为参照，验证了lipid 1c-Mn2+脂复合物在正常细胞(L02)中的细胞毒性；
如图5(c-d)所示，不同N/P的脂复合物细胞毒性差异较大。在N/P＝9时，lipid b-Mn2+脂复合物和lipid 1c-Mn2+脂复合物细胞存活率高于bPEI25k，分别为104.84％和97.83％，表现出无更低的细胞毒性，其中lipid 1b-Mn2+脂复合物为无细胞毒性。另外，不同N/P的lipid 1-Cu2+细胞毒性均高于bPEI25k复合物，不同金属离子的lipid 1a-M脂复合物细胞毒性都较大，与浓度梯度结果显示一致。
实施例7：体外转染实验
1、实验方法
细胞培养：L02细胞用含10％胎牛血清和0.1％抗生素(青霉素和链霉素)的1640培养基，在37℃，5％CO2潮湿环境的细胞培养箱中孵育；
将正常细胞(L02)接种于48孔板中，密度为1×105万个/孔，每孔加入0.25mL完全培养基，在37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养24小时。转染实验前移去旧的培养基，转染细胞用PBS冲洗细胞2次，每孔加入0.2μg质粒DNA的lipid 1-M/DNA复合物用含血清和不含血清的新培养基，按所需的N/P比与细胞在培养箱中孵育4h。4h后更换含血清的新培养基，继续放入培养箱中培养24h，然后用40x倒置荧光显微镜下检测含pEGFP的复合物转染细胞，并用Cellsence Standard软件记录。用含pGL3质粒DNA的脂质体转染细胞进行荧光素酶检测。荧光素酶分析使用Picagene荧光素酶分析试剂盒(Toyo Ink，日本东京)进行。转染细胞用PBS洗涤3次，裂解于细胞裂解缓冲液中。裂解液在4℃下10 000x g离心2min，上清液进行荧光素酶活性测定。使用发光计(Turner Design，20/20；Promega)测量化学发光的相对发光单位(RLU)，用bPEI25k/pDNA作为阳性对照。
2、实验结果
结果如图6所示，图6中的(a)为lipid M不含血清下的细胞转染图，其中(A-C)为lipid a-Mn2+；N/P＝9,11,13；(D-F)为lipid a-Cu2+；N/P＝9,11,13；(G-I)为lipid b-Mn2+；N/P＝9,11,13；(J-L)为lipid b-Cu2+；N/P＝9,11,13；(M-O)为lipid c-Mn2+；N/P＝9,11,13；(P-R)为lipid c-Cu2+；N/P＝9,11,13；(S)为bPEI25k；图6中的(b)为lipid M含10％胎牛血清下的细胞转染图，其中(A)为lipid a-Mn2+；N/P＝13；(B-D)为lipid a-Cu2+；N/P＝9,11,13；(E)为lipid b-Mn2+；N/P＝11；(F)为lipid b-Cu2+；N/P＝9；(G-H)为lipid c-Mn2+；N/P＝11,13；(I-J)为lipid c-Cu2+；N/P＝11,13；(K)为bPEI25k；图6中的(c)为lipid 1b-Cu2+脂复合物、lipid 1c-Cu2+脂复合物、lipid 1c-Mn2+脂复合物和bPEI25k复合物的荧光素酶定量分析；
以bPEI25k为对照，在不含血清时，经lipid 1-M促进转染后获得的质粒pEGFP荧光显微镜图像，结果发现，lipid 1c-M在促进转染过程中，绿色荧光表达较高，随后，采用荧光素酶实验方法定量分析lipid M在同一细胞系中的转染效率，结果与pEGFP实验结果一致。
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种新型氮杂冠醚化合物，其特征在于，所述新型氮杂冠醚化合物的结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0004169312090000011
其中，n选自7、11、15。
2.根据权利要求1所述的一种新型氮杂冠醚化合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将1份1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷和0.77份TEA溶于30份二氯甲烷Ⅰ，得到溶液Ⅰ，然后将0.83份二叔丁基二碳酸酯溶于30份二氯甲烷Ⅱ，得到溶液Ⅱ，将溶液Ⅱ缓慢滴加到溶液Ⅰ中，使其在室温下搅拌24h后，浓缩溶剂，残余物在硅胶柱上用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯；
2)将1份1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯、0.48份溴乙酸乙酯、0.75份碳酸钾、50份乙腈混合并加热到82℃反应24h，反应后得到溶液Ⅲ，将溶液Ⅲ过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用二氯甲烷/甲醇＝20/1洗脱后得到16-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯；
3)将1份16-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-羧酸叔丁酯、0.61份氢氧化钠于15份乙醇中，在室温下搅拌24h，得到溶液Ⅳ，将溶液ⅣpH调至4，过滤掉固体，挥发溶剂得到2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸；
4)将1份2-(16-(叔丁氧羰基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙酸与胺类化合物混合，然后再与1.27份的O-(1h-苯并三唑-1-基)-N-四甲基六氟磷酸铵、0.60份的TEA、20份的乙腈在室温下搅拌过夜，得到溶液Ⅴ，将溶液Ⅴ过滤，挥发，残渣经硅胶柱净化，用乙酸乙酯/甲醇＝60/1洗脱后得到新型氮杂冠醚化合物。
3.根据权利要求2所述的一种新型氮杂冠醚化合物的制备方法，其特征在于，所述胺类化合物选自0.31份的辛烷-1-胺、0.44份的十二烷-1-胺、0.57份的十六烷-1-胺中的一种或多种。
4.一种阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体由权利要求1-3任一项所述的新型氮杂冠醚化合物和二油酰磷脂酰乙醇胺制备得到。
5.根据权利要求4所述的一种阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
将中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺与新型氮杂冠醚化合物按照1:1摩尔比混合后在氯仿中结合，在减压条件下用氮气干燥，除去氯仿溶剂，脂膜用5份的MnSO4·H2O和5份的Cu(NO3)2·3H2O溶液水化，搅拌混合物，直到薄膜完全重新悬浮后在细胞粉碎仪中超声作用，得到阳离子脂质体lipid 1-M。
6.一种阳离子脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质体复合物由权利要求4-5任一项所述的阳离子脂质体和质粒DNA结合得到。
7.根据权利要求6所述的一种阳离子脂质体复合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
将阳离子脂质体和质粒DNA按照N/P＝1～11完全混合并在室温下孵育30min，得到阳离子脂质体复合物。
8.根据权利要求1-3任一项所述的新型氮杂冠醚化合物或权利要求4-5任一项所述的阳离子脂质体或权利要求6-7任一项所述的阳离子脂质体复合物在制备基因载体材料中的应用。
CN202210430570.9A 2022-04-22 2022-04-22 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用 Active CN114656422B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210430570.9A CN114656422B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210430570.9A CN114656422B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114656422A CN114656422A (zh) 2022-06-24
CN114656422B true CN114656422B (zh) 2023-05-23

Family

ID=82036437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210430570.9A Active CN114656422B (zh) 2022-04-22 2022-04-22 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114656422B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114949259B (zh) * 2022-07-11 2023-09-19 重庆理工大学 一种氮杂冠醚结构的基因递送载体及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010048939A1 (en) * 1996-11-04 2001-12-06 Christoph Erbacher Cationic reagents of transfection
CN1434870A (zh) * 1999-12-23 2003-08-06 三菱制药株式会社 病毒核心蛋白－阳离子脂质－核酸－递送复合物
WO2003077906A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Nihon University Cyclic etheramine derivatives as medicaments for malignant tumors
WO2009051451A2 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Ldl-like cationic nanoparticles for deliverying nucleic acid gene, method for preparing thereof and method for deliverying nucleic acid gene using the same
US20100144848A1 (en) * 2007-01-24 2010-06-10 Syddansk Universitet Dna controlled assembly of lipid membranes
WO2010146404A1 (en) * 2009-06-19 2010-12-23 Rudjer Boskovic Institute Adamantane derivatives of aza-crown ethers and their use in treatment of tumor
CN105561790A (zh) * 2015-12-23 2016-05-11 中国科学院上海高等研究院 苯并氮杂冠醚类化合物分离锂同位素的应用
US20200353105A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-12 Janssen Biotech, Inc. Macrocyclic Chelators and Methods of Use Thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212042A (zh) * 2011-04-18 2011-10-12 北京师范大学 一种四氮杂冠醚的合成方法
CN102584739A (zh) * 2011-12-21 2012-07-18 北京师范大学 羧苄基取代二氮杂冠醚衍生物及其合成方法
WO2019046809A1 (en) * 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010048939A1 (en) * 1996-11-04 2001-12-06 Christoph Erbacher Cationic reagents of transfection
CN1434870A (zh) * 1999-12-23 2003-08-06 三菱制药株式会社 病毒核心蛋白－阳离子脂质－核酸－递送复合物
WO2003077906A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Nihon University Cyclic etheramine derivatives as medicaments for malignant tumors
US20100144848A1 (en) * 2007-01-24 2010-06-10 Syddansk Universitet Dna controlled assembly of lipid membranes
WO2009051451A2 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Ldl-like cationic nanoparticles for deliverying nucleic acid gene, method for preparing thereof and method for deliverying nucleic acid gene using the same
WO2010146404A1 (en) * 2009-06-19 2010-12-23 Rudjer Boskovic Institute Adamantane derivatives of aza-crown ethers and their use in treatment of tumor
CN105561790A (zh) * 2015-12-23 2016-05-11 中国科学院上海高等研究院 苯并氮杂冠醚类化合物分离锂同位素的应用
US20200353105A1 (en) * 2019-05-10 2020-11-12 Janssen Biotech, Inc. Macrocyclic Chelators and Methods of Use Thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
14-冠-4冠醚衍生物与Li(I)的络合过程理论研究;侯雪 等;化学研究;第31卷(第01期);第52-61页 *
A far-red aza-crown ether fluorescent probe for selective G-quadruplex DNA targeting;Donghui You等;Dyes and Pigments;第176卷;第108222页 *
Supramolecular chemistry. Part 62. Ligand and cosubstrate effects on the hydrolysis of phosphate esters and DNA with lanthanoids;Joerg Rammo等;Liebigs Annalen;第11卷;第1757-1767页 *
仿病毒基因递送系统研究进展;李硕 等;中国材料进展;第34卷(第03期);第177-190页 *
含大环多胺的两亲性小分子的设计合成及与DNA的相互作用;马丽芳 等;高等学校化学学报;第32卷(第04期);第874-878页 *
含酯键的可降解聚合物基因载体研究进展;李硕 等;高分子通报(第6期);第46-61页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114656422A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Novel imidazole-functionalized cyclen cationic lipids: Synthesis and application as non-viral gene vectors
EP2532649B1 (en) Amino lipids, their synthesis and uses thereof
JP3210019B2 (ja) カチオン性脂質
US6153434A (en) Methods for the intracellular delivery of substances
Uritu et al. Hybrid fullerene conjugates as vectors for DNA cell-delivery
CN108478807B (zh) 一种核酸药物递送系统及其应用
CN114656422B (zh) 一种新型氮杂冠醚化合物及其阳离子脂质体、制备方法与应用
WO2016192150A1 (zh) 一类丙烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用
CN114213295B (zh) 一种阳离子化合物、制备方法及其复合物和用途
Boulanger et al. Synthesis of acridine-nuclear localization signal (NLS) conjugates and evaluation of their impact on lipoplex and polyplex-based transfection
Wang et al. Cyclen-based cationic lipids with double hydrophobic tails for efficient gene delivery
Du et al. Redox-sensitive dendrimersomes assembled from amphiphilic Janus dendrimers for siRNA delivery
WO2023029928A1 (zh) 一种氨基脂质及其应用
CN110003185B (zh) 基于绿色荧光蛋白生色团bi的大环多胺类两亲化合物及其制备方法和用途
CN114805113B (zh) 一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
Illescas et al. Multivalent cationic dendrofullerenes for gene transfer: Synthesis and DNA complexation
US10597678B2 (en) Bis-alkoxyl amide alkyl cationic peptide lipids, synthesis method thereof, and application thereof
CN102911252A (zh) 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN114949259B (zh) 一种氮杂冠醚结构的基因递送载体及其制备方法和应用
Liu et al. Biotinylated cyclen‐contained cationic lipids as non‐viral gene delivery vectors
Kim et al. Synthesis of novel cholesterol-based cationic lipids for gene delivery
EP1455834A2 (en) Post-coated liposome/lipoplex for targeted drug/gene delivery and lipid linked to a delivery, targeting or stabilising moiety
CN112851934B (zh) 一种含N-氧化三级胺基团的聚(β-氨基酯)及其制备方法和应用
Assali et al. Covalent functionalization of graphene sheets for plasmid DNA delivery: experimental and theoretical study
Xiang et al. Linear cyclen-based polyamine as a novel and efficient reagent in gene delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant