CN114592048A - 预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT‑ATP8、MT‑COX1、MT‑COX2、MT‑COX3、MT‑ND5、MT‑TRNA的甲基化水平；本发明的优点在于：通过选择与URSA相关的线粒体位点进行甲基化水平检测，利用AUC评估生物标志物的诊断效能，提高了对凝血功能异常发病风险的预测能力。

Description

预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法
技术领域
本发明涉及一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，具体地说是一种利用表观遗传学标志物预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，属于遗传学领域。
背景技术
自然流产占全部妊娠的发生率的15%-40%，连续2次或2次以上的自然流产称为复发性自然流产（RSA）, 引起RSA的因素复杂多样，主要包括遗传因素、感染因素、内分泌因素、解剖因素、免疫因素及凝血因素等。其中有40%~50%的患者流产原因未明，称为不明原因复发性流产（URSA）。凝血功能异常被认为是导致RSA主要原因。研究显示，在不良妊娠结局的患者中，有近55%-62%患者表现出凝血功能异常，通常表现为血液高凝状态，血栓形成风险增加等。凝血功能可影响全身、胎盘血液循环状态，当凝血功能指标超过正常生理范围时，可导致胎盘缺血、缺氧，提高流产、胎儿窘迫等发生率，影响妊娠安全性和妊娠结局。血浆中的D-二聚体（D-Dimer）、蛋白S（PS）、蛋白C（PC）和血同型半胱氨酸（HCY）水平是由凝血功能异常引起的RSA独立危险因素和干预治疗的靶点和目标。近年来，在多种凝血因素的相互影响下， RSA的概率逐年上升， RSA概率的增高对女性妊娠有不利影响。因此，需要尽早采取有效方式进行诊断以明确引起RSA的凝血因素，同时应密切监测凝血功能相关指标，必要时加以干预，以维持凝血功能正常，避免RSA的发生，已经成为当今社会的急切需求。
凝血因素导致的URSA多在临床中难以明确其具体发病机制，通常是多个基因之间或多个基因与环境因素之间长期相互作用的结果。线粒体在维持细胞内能量稳态中发挥重要作用，并参与氧化磷酸化、活性氧ROS调节、钙离子动态平衡以及信号转导等多种重要生物过程。血小板凝血功能与血小板线粒体存在密切关系。因此，分析血小板线粒体DNA（mtDNA）关键位点的甲基化水平与URSA人群中凝血功能异常的关联，明确对凝血功能异常发生风险有预测作用的血小板mtDNA中的敏感CpG位点，并以此作为潜在生物标志物，将有助于孕期凝血功能异常事件的发病风险预测、诊断和个体化治疗。但是到目前为止，还未发现有相关的人群研究和探索，并缺乏相应的人群研究数据。因此亟需确定URSA人群中凝血功能异常的CpG位点和甲基化水平。
发明内容
本发明的目的在于，设计了一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，通过选择与URSA相关的线粒体位点进行甲基化水平检测，利用AUC评估生物标志物的诊断效能，提高了对凝血功能异常发病风险的预测能力。
本发明的技术方案为：
预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，包括以下步骤：
步骤（1）：应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT-ATP8、MT-COX1、MT-COX2、MT-COX3、MT-ND5、MT-TRNA的甲基化水平；
其中，焦磷酸测序法作为一种新的序列分析方法，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行精确的定性及定量检测。
本发明通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同CpG位点的甲基化率变化就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态便可以序列形式呈现。使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与凝血功能异常发病风险的关系并计算危险甲基化位点的相对危险度OR，利用ROC曲线下面积AUC对血小板mtDNA位点的甲基化水平与凝血功能异常的关系进行预测。结合传统风险因素，并根据单个位点或多个联合位点结果建立预测模型分组，筛选出能较准确预测孕期凝血功能异常的血小板mtDNA位点。
另外，URSA风险人群的纳入标准为：（1）既往有2次/2次以上妊娠28周前的胎儿丢失史；（2）夫妇双方外周血染色体核型正常；（3）经妇科、B超、宫腔镜及子宫输卵管造影等确诊无生殖器管解剖学畸形；（4）内分泌功能无异常，包括月经周期正常、排卵正常、甲状腺功能正常、无糖尿病、多囊卵巢综合征；（5）磷脂抗体谱、抗核抗体谱、狼疮抗凝物检测正常，甲状腺抗体阴性；（6）血栓前状态检测包括凝血功能、同型半胱氨酸、蛋白C/S无异常；（7）生殖道感染相关病原微生物检测为阴性，无生殖道病变及感染；（8）无心脏、肝脏及肾脏急、慢性疾病，无传染病。
进一步的，凝血功能异常指标的测量方法为：利用真空采血针静脉穿刺采集静脉血，测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平。
进一步的，采用全自动凝血分析仪测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平。凝血功能异常的诊断标准为：D-二聚体即D-Dimer≥500 ug/L和/或孕前蛋白S即PS＜55％和/或蛋白C即PC＜87％或PC＞133％和/或血同型半胱氨酸即HCY≥10umol/L。
步骤（2）血小板mtDNA位点选择和预测模型分组：选择与孕期凝血功能异常包括D-Dimer、PS、PC、HCY相关的血小板mtDNA位点，分别为ATP8、COX1、COX2、COX3、ND5、TRNA的位点一、位点二及其位点的平均甲基化水平，首先利用焦磷酸测序法检测相应位点的甲基化水平；然后利用ROC曲线下面积AUC得出血小板mtDNA单个位点或者多个联合位点对孕期凝血功能异常的预测效果，根据预测效能的准确程度并考虑其经济成本，结合传统风险因素建立凝血功能异常预测模型分组；
步骤（3）统计：使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与孕期凝血功能异常事件发生的相关性，并利用ROC曲线下面积AUC，结合传统风险因素建立预测模型分组，以评估不同血小板mtDNA位点对凝血功能异常预测的准确性。
早期识别孕期凝血功能异常高危人群，并采取针对性的治疗措施，是减少URSA发生，获得健康妊娠结局的关键。危险预测可为疾病预防、政府决策和卫生干预方案效果评价，以及临床治疗提供可参考的信息。ROC曲线下面积（AUC）是评估预测效果准确性的综合评价指标之一，具有较为准确的预测效能。使用AUC对线粒体位点的甲基化水平进行预测，以判断血小板mtDNA中的相关位点的甲基化水平是否可以作为预测孕期凝血功能异常的标志物。将表观遗传学技术与流行病学方法相结合，评估个体患病风险，并据此采取更早或更强的干预措施，使患者从中受益，有效提高疾病风险预测的能力。
本发明的有益效果为：通过选择与URSA相关的线粒体位点进行甲基化水平检测，利用AUC评估生物标志物的诊断效能，提高了对凝血功能异常发病风险的预测能力。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为传统风险因素预测孕期凝血功能异常图；
图2为ATP8p1+ATP8p2++COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1+ND5p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能异常；
图3为COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图4为COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图5为ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图6为COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图7为COX2p1+COX2p2+ND5p1+ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图8为传统风险因素结合ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1+ND5p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图9为传统风险因素结合COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1+ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图10为传统风险因素结合COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图11为传统风险因素结合ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血异常图；
图12为传统风险因素结合COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血功能异常图；
图13为传统风险因素结合COX2p1+COX2p2+ND5p1+ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，包括以下内容：
一、研究实验方案
选取141名URSA患者作为研究对象，并对其孕期、妊娠结局、新生儿情况进行随访。采集研究对象血液样本并以问卷调查方式收集既往疾病史、家病史、生育史、社会经济学地位、职业/环境暴露、心理压力、焦虑状况、吸烟/被动吸烟/饮酒情况、药物使用、生活方式（包括运动）、与URSA有关药物使用情况（糖皮质激素、叶酸、孕激素、阿司匹林和低分子肝素等）、睡眠情况以及体检/孕检情况等数据。
应用差速离心法对血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法（Pyrosequencing）检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因（MT-ATP8、MT-COX1、MT-COX2、MT-COX3、MT-ND5、MT-TRNA）位点的甲基化水平。
焦磷酸测序技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行精确的定性及定量检测。通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同CpG位点的甲基化率变化就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态便可以序列形式呈现。使用标准化程序进行操作、检测，所有样品检测数值重复两次取平均值。使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与凝血功能异常发病风险的关系并计算危险甲基化位点的相对危险度（OR），利用ROC曲线下面积（AUC）对血小板mtDNA位点的甲基化水平与凝血功能异常的关系进行预测。结合传统风险因素，并根据单个位点或多个联合位点结果建立预测模型分组，筛选出能较准确预测孕期凝血功能异常的血小板mtDNA位点。
二、研究人群及纳入标准
研究对象为不明原因复发性流产（URSA）巢式病例对照人群，来源于天津医科大学、天津医科大学总医院以及天津市计划生育研究所合作建立的天津市ELEFANT自然人群队列。研究方案经当地研究机构伦理委员会批准，参加者全部签署书面知情同意书。
URSA风险人群的纳入标准为：（1）既往有2次/2次以上妊娠28周前的胎儿丢失史（同一性伴）。（2）夫妇双方外周血染色体核型正常。（3）经妇科、B超、宫腔镜及子宫输卵管造影等确诊无生殖器管解剖学畸形。（4）内分泌功能无异常，包括月经周期正常、排卵正常、甲状腺功能正常、无糖尿病、多囊卵巢综合征。（5）磷脂抗体谱、抗核抗体谱、狼疮抗凝物检测正常，甲状腺抗体阴性。（6）血栓前状态检测（凝血功能、同型半胱氨酸、蛋白C/S）无异常。（7）生殖道感染相关病原微生物检测为阴性，无生殖道病变及感染。（8）无心脏、肝脏及肾脏急、慢性疾病，无传染病。
根据风险人群纳入标准，分析选取随访资料和血小板mtDNA位点甲基化水平都有完整数据的参与者共141人。排除基线凝血功能异常后，经过随访，有14名研究对象的D-Dimer、PS、PC、HCY指标分别发生变化、进而导致孕期凝血功能异常。
三、凝血异常指标测量方法
利用真空采血针静脉穿刺采集静脉血，测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平。血液样本测定在天津医科大学总医院妇产科医学遗传室的临床检验中心完成。该遗传室创立于1970年，是我国最早开展细胞遗传学检测的实验室之一，从2000年开始进行有关RSA凝血因素的研究和临床工作。
采用全自动凝血分析仪(ACL-TOP 700)测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平。凝血功能异常的诊断标准为：D-二聚体（D-Dimer≥500 ug/L）和/或孕前蛋白S（PS＜55％）和/或蛋白C（PC＜87％或PC＞133％）和/或血同型半胱氨酸（HCY≥10umol/L）。诊断标准参考《H型高血压诊断与治疗专家共识》和《高同型半胱氨酸血症诊疗专家共识》。
四、血小板mtDNA位点选择和预测模型分组
选择与孕期凝血功能异常（D-Dimer、PS、PC、HCY）相关的血小板mtDNA位点，分别为ATP8、COX1、COX2、COX3、ND5、TRNA的位点一、位点二及其位点的平均甲基化水平，首先利用焦磷酸测序法检测相应位点的甲基化水平。然后利用ROC曲线下面积（AUC）得出血小板mtDNA单个位点或者多个联合位点对孕期凝血功能异常的预测效果，根据预测效能的准确程度并考虑其经济成本，结合传统风险因素建立凝血功能异常预测模型分组。
五、统计方法
使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与孕期凝血功能异常事件发生的相关性，并利用ROC曲线下面积（AUC），结合传统风险因素建立预测模型分组，以评估不同血小板mtDNA位点对凝血功能异常预测的准确性。
实验例
1研究人群的基本特征
选取的141名URSA研究对象基线特征如表1所示，其中D-Dimer、PS、PC、HCY的平均水平分别为350.2±438.4、74.04±18.95、105.1±18.03、9.511±6.682，均处于正常诊断范围内，未发生孕期凝血异常。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2单个血小板mtDNA位点与孕期凝血功能异常的关系
在随访人群中，与凝血功能异常相关的单个血小板mtDNA位点如表2所示，共涉及到18个位点（ATP8p1、ATP8p2、ATP8、COX1p1、COX1p2、COX1、COX2p1、COX2p2、COX2、COX3p1、COX3p2、COX3、ND5p1、ND5p2、ND5、TRNAp1、TRNAp2、TRNA）。结果表明，孕期凝血异常与上述单个血小板mtDNA位点均无显著统计学意义（p＞0.05）。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
3传统风险因素以及多个血小板mtDNA位点联合预测孕期凝血功能异常
由上述结果看出，单个血小板mtDNA位点的甲基化水平变化对预测孕期凝血功能异常作用相对较弱，因此本发明联合多个血小板mtDNA位点，并结合ROC曲线下面积(AUC),可以显著增加预测能力。AUC是预测效果准确性的综合评价指标之一，通常用AUC表示一般分级标准，预测效能较低表示为0.5<AUC≤0.7，预测效能中等表示为0.7<AUC≤0.9，预测效能较高表示为AUC＞0.9。
3.1传统风险因素
常见的传统风险因素主要有年龄、孕前BMI、孕次等因素，结果表明，孕期凝血异常与年龄、孕前BMI以及孕次等因素无显著统计学意义（p＞0.05）。如图1所示，传统风险因素预测孕期凝血异常AUC为0.6168（0.5<AUC≤0.7），表明其预测效能较低。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
3.2多个血小板mtDNA位点联合
如下表3.2-3.7所示，孕期凝血异常与以下6组联合血小板mtDNA位点均无显著统计学意义（p＞0.05）。
第1组：
ATP8p1+ATP8p2++COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1+ND5p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测凝血功能异常AUC为0.7652，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第2组：
COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1联合位点预测凝血功能异常AUC为0.7548，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第3组：
COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+TRNAp1+
TRNAp2联合位点预测凝血功能异常AUC为0.7213，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第4组：
ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2
联合位点预测凝血功能异常AUC为0.7548，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第5组：
COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测凝血功能异常AUC为0.6942，表明其预测效能较低（0.5<AUC≤0.7）。
第6组：
COX2p1+COX2p2+ND5p1+ND5p2联合位点预测凝血功能异常AUC为0.6890，表明其预测效能较低（0.5<AUC≤0.7）。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE016
Figure DEST_PATH_IMAGE018
3.3传统风险因素结合血小板mtDNA联合位点
上述结果表明，仅凭借单一传统风险因素或血小板mtDNA位点预测孕期凝血功能异常效能中等、甚至较低。因此，需采用传统风险因素结合血小板mtDNA联合位点共同预测孕期凝血异常发生风险。
如下表3.8-3.13所示，传统风险因素结合ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+ COX1p2+COX2p1+ COX2p2+COX3p1+ COX3p2位点中，ATP8p2位点的甲基化水平变化与孕期凝血功能异常具有显著统计学意义（p=0.031），其中ATP8p2位点（OR:15.20 95% CI:1.29-178.89）的甲基化水平变化与孕期凝血功能异常呈正相关，综上所述，表明ATP8p2位点可作为孕期发生凝血功能异常的独立危险因素。
第1组：
传统风险因素结合ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ND5p1+ND5p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能异常AUC为0.8035，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第2组：
传统风险因素结合COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2+ ND5p1+ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常AUC为0.7794，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第3组：
传统风险因素结合COX1p1+COX1p1+COX2p1+ COX2p2+ COX3p1+ COX3p2+TRNAp1+TRNAp2联合位点预测孕期凝血功能AUC为0.7391，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第4组：
传统风险因素结ATP8p1+ATP8p2+COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血功能异常AUC为0.7842，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第5组：
传统风险因素结合COX1p1+COX1p2+COX2p1+COX2p2+COX3p1+COX3p2联合位点预测孕期凝血功能异常AUC为0.7069，表明其预测效能中等（0.7<AUC≤0.9）。
第6组：
传统风险因素结合COX2p1+COX2p2+ND5p1+ND5p2联合位点预测孕期凝血功能异常AUC为0.6973，表明其预测效能较低（0.5<AUC≤0.7）。
Figure DEST_PATH_IMAGE020
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4 孕期凝血异常风险预测模型分组
根据上述结果，将传统风险因素（年龄、孕前BMI、孕次）和血小板mtDNA位点的预测效能进行分组。
Figure DEST_PATH_IMAGE032
因此，采用传统因素结合ATP8+COX1+COX2+COX3+ND5+TRNA联合位点来预测孕期凝血异常，如综合考虑预测效能和经济成本，可采用ATP8+COX1+COX2+COX3+ND5+TRNA联合位点来预测孕期凝血异常。

Claims (5)

1.预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：应用差速离心法对URSA患者血浆中的血小板进行分离，然后使用DNA限制性内切酶对血小板沉淀进行核基因组DNA干扰的处理消化，然后直接对消化产物进行重亚硫酸盐处理，并结合焦磷酸测序法检测血小板mtDNA中呼吸链相关基因位点包括MT-ATP8、MT-COX1、MT-COX2、MT-COX3、MT-ND5、MT-TRNA的甲基化水平；
步骤（2）血小板mtDNA位点选择和预测模型分组：选择与孕期凝血功能异常包括D-Dimer、PS、PC、HCY相关的血小板mtDNA位点，分别为ATP8、COX1、COX2、COX3、ND5、TRNA的位点一、位点二及其位点的平均甲基化水平，首先利用焦磷酸测序法检测相应位点的甲基化水平；然后利用ROC曲线下面积AUC得出血小板mtDNA单个位点或者多个联合位点对孕期凝血功能异常的预测效果，根据预测效能的准确程度并考虑其经济成本，结合传统风险因素建立凝血功能异常预测模型分组；
步骤（3）统计：使用logistic回归分析评估血小板mtDNA单个位点与孕期凝血功能异常事件发生的相关性，并利用ROC曲线下面积AUC，结合传统风险因素建立预测模型分组，以评估不同血小板mtDNA位点对凝血功能异常预测的准确性。
2.根据权利要求1所述的预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于：其中，焦磷酸测序法作为一种新的序列分析方法，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行精确的定性及定量检测。
3.根据权利要求1或2所述的预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于：URSA风险人群的纳入标准为：（1）既往有2次/2次以上妊娠28周前的胎儿丢失史；（2）夫妇双方外周血染色体核型正常；（3）经妇科、B超、宫腔镜及子宫输卵管造影等确诊无生殖器管解剖学畸形；（4）内分泌功能无异常，包括月经周期正常、排卵正常、甲状腺功能正常、无糖尿病、多囊卵巢综合征；（5）磷脂抗体谱、抗核抗体谱、狼疮抗凝物检测正常，甲状腺抗体阴性；（6）血栓前状态检测无异常；（7）生殖道感染相关病原微生物检测为阴性，无生殖道病变及感染；（8）无心脏、肝脏及肾脏急、慢性疾病，无传染病。
4.根据权利要求1或2所述的预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于：U凝血功能异常指标的测量方法为：利用真空采血针静脉穿刺采集静脉血，测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平。
5.根据权利要求1或2所述的预测复发性流产人群孕期凝血功能异常的方法，其特征在于：U采用全自动凝血分析仪测定D-Dimer、PS、PC、HCY水平；凝血功能异常的诊断标准为：D-二聚体即D-Dimer≥500 ug/L和/或孕前蛋白S即PS＜55％和/或蛋白C即PC＜87％或PC＞133％和/或血同型半胱氨酸即HCY≥10umol/L。
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