CN114561302B - 一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(Aspergillusniger)，所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oahA，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexA、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxkA，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfkA、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb获得而获得的。本发明从消除发酵中副产物草酸的合成，从而提高底物合成柠檬酸的转化率。

Description

一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，尤其是一种合成柠檬酸黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，及其在发酵生产柠檬酸中的应用。

背景技术

柠檬酸(Citric acid)是中国工业化生产中产量最大的有机酸，在世界范围内，也是需求量最大的一种有机酸。柠檬酸在医药化工、食品工业、精密仪器清洗、化妆品等方面都有广泛运用(BeheraBC.Crit Rev Microbiol.2020,46(6):727-749)。

黑曲霉为GRAS(generally recognized as safe)菌株，且具有营养要求简单、耐受低pH、等优势，在工业酶制剂、有机酸发酵等方面都应用广泛(Papagianni M.BiotechnolAdv.2007,25(3):244-63)。

目前，全球柠檬酸产量达到150万吨，其中99％的柠檬酸是通过黑曲霉发酵生产而来(郭艳梅等，生物工程学报，2010，26(10):1410-1418)。随着全球对柠檬酸需求量不断增加，而利润空间狭小，因此通过增加柠檬酸的发酵强度和转化率，提高柠檬酸发酵水平是缓解行业困境的研究方向。消除发酵中副产物草酸的合成，有利于提高转化率。通过增强底物摄取能力，强化糖酵解途径，提高柠檬酸外泌能力是提高柠檬酸发酵水平的潜在策略。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oahA，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexA、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxkA，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfkA、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb获得而获得的。

进一步地，所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA的DNA序列为SEQ NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC的DNA序列为SEQ NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。

进一步地，所述己糖激酶基因hxkA的DNA序列为SEQ NO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQNO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列。

进一步地，所述磷酸果糖激酶基因pfkA的DNA序列为SEQ NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列。

进一步地，所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA的DNA序列为SEQ NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的DNA序列为SEQ NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。

进一步地，生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉S469；黑曲霉S469是发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)中所用菌株。

或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，其他的可在黑曲霉中发挥转录作用的启动子也可实现使上述基因表达上调的目的；

或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oahA是利用oahA基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oahA基因表达盒从基因组中删除。

进一步地，所述oahA基因上下游同源序列片段序列分别为SEQ NO.1以及相似性为70％以上的DNA序列、SEQ NO.2以及相似性为70％以上的DNA序列。

如上所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。

利用如上所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0～45℃条件下培养，直至产生新鲜孢子；

收集孢子，以1×10⁵～2×10⁶个/mL的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10～45℃，100～350rpm条件下振荡培养0～30h，得到种子液；

将种子液以0～15％的接种量接种至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；

其中，种子培养基的配方是：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(NH₄)₂SO₄，溶剂为水；

所述述发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水；

上述百分数均为质量百分数。

进一步地，所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为PDA培养平板。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明从消除发酵中副产物草酸的合成，从而提高底物合成柠檬酸的转化率。

2、本发明通过增强细胞对底物的摄取能力，强化糖酵解途径，提高柠檬酸外泌能力等多个维度提高柠檬酸的发酵水平和生产强度。

3、本发明黑曲霉菌株最优条件35℃，250rpm振荡培养72h、120h条件下，发酵液中柠檬酸浓度为81.5g/L、143.2g/L，发酵强度为1.19g/L/h。

4、本发明对产柠檬酸菌株普遍适用，可使柠檬酸发酵产量提高近20％。利用ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA，mstA，vgb)/OE菌株发酵，3天柠檬酸产量提升32.8％，5天柠檬酸产量提升18.3％，整体生产强度提高了近20％，发酵周期缩短了10小时。

附图说明

图1为本发明中构建的oahA敲除质粒pLH398图谱；

图2为本发明中对oahA敲除质粒pLH398的双酶切验证图(EcoR I/HindⅢ，7543bp/3850bp)，其中M为DNAMarker，1为EcoR I/HindⅢ双酶切验证质粒；

图3为本发明中构建的cexA表达质粒pLH664图谱；

图4为本发明中对cexA表达质粒pLH664的双酶切验证图(EcoR I/Kpn I，9981bp/1582bp)，其中M为DNA Marker，1为EcoR I/Kpn I双酶切验证质粒；

图5为本发明中构建的mstC表达质粒pLH684图谱；

图6为本发明中对mstC表达质粒pLH684的双酶切验证图(EcoR I/BglⅡ，1689bp/10110bp)，其中M为DNAMarker，1为EcoR I/BglⅡ双酶切验证质粒；

图7为本发明中构建的hxkA和pfkA表达质粒pLH1536图谱；

图8本发明中对hxkA和pfkA表达质粒pLH1536的单酶切验证图(HindⅢ，4670bp/7692bp)，其中M为DNAMarker，1为HindⅢ单酶切验证质粒；

图9为本发明中对hxkA和pfkA表达质粒pLH1536的单酶切验证图(ApaⅠ，3267bp/12462bp)，其中M为DNAMarker，1为ApaⅠ单酶切验证质粒；

图10为本发明中质粒pLH1517图谱；

图11为本发明中对mstA和vgb表达质粒pLH1517的单酶切验证图(HindⅢ，903bp/1220bp/11709bp)，其中M为DNA Marker，1为HindⅢ单酶切验证质粒；

图12为本发明中单过表达菌株柠檬酸发酵产量分析图；

图13为本发明中菌株柠檬酸发酵液进行高效液相色谱法分析图；

图14为本发明中菌株发酵生产强度分析图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oahA，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexA、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxkA，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfkA、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb获得而获得的。

较优地，所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA的DNA序列为SEQ NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC的DNA序列为SEQ NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，所述己糖激酶基因hxkA的DNA序列为SEQ NO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，所述磷酸果糖激酶基因pfkA的DNA序列为SEQ NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQNO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA的DNA序列为SEQ NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的DNA序列为SEQ NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉S469；黑曲霉S469是发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)中所用菌株。

或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，其他的可在黑曲霉中发挥转录作用的启动子也可实现使上述基因表达上调的目的；

或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oahA是利用oahA基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oahA基因表达盒从基因组中删除。

较优地，所述oahA基因上下游同源序列片段序列分别为SEQ NO.1以及相似性为70％以上的DNA序列、SEQNO.2以及相似性为70％以上的DNA序列。

如上所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。

利用如上所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，步骤如下：

将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0～45℃条件下培养，直至产生足够的新鲜孢子；

收集孢子，以1×10⁵～2×10⁶个/mL的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10～45℃，100～350rpm条件下振荡培养0～30h，得到种子液；

将种子液以0～15％的接种量接种至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；

其中，种子培养基的配方是：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(NH₄)₂SO₄，溶剂为水；

所述述发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水；

上述百分数均为质量百分数。

进一步地，所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为PDA培养平板。

具体地，相关的制备及检测如下：

具体地，所述高产柠檬酸的黑曲霉菌株的构建步骤如下：

实施例1-oahA敲除质粒的构建：质粒pLH398(图1)是由pLH314(XuYongxue,etal.Applied Microbiology andBiotechnology,2019,103(19):8105-8114)载体改造而来。

具体获取过程如下：以黑曲霉基因组为模板，PoahA-L-F、PoahA-L-R和PoahA-R-F、PoahA-R-R为引物进行PCR扩增oahA上下游同源臂片段oahA-L和oahA-R，所述上下游同源臂序列片段的核苷酸序列分别为SEQ NO.1，SEQ NO.2，长度分别为1100bp、1241bp；然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将oahA-L和oahA-R依次与经EcoR I/BamH I、Spe I/Hind I II双酶切线性化后的出发载体pLH314进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图2)获得质粒pLH398。为扩增oahA-L和oahA-R设计引物PoahA-L-F、PoahA-L-R和PoahA-R-F、PoahA-R-R(表1)。

实施例2-敲除oahA基因菌株的获得：将质粒pLH398上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的oahA基因敲除菌株ΔoahA。

实施例3-cexA表达质粒的构建：质粒pLH664(图3)是由pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)载体经改造而来。所述基因cexA序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录。

具体获取过程如下：以黑曲霉cDNA为模板，PcexA-F、PcexA-R为引物进行PCR扩增cexA基因序列片段，核苷酸序列为SEQ NO.3，长度为1575bp；然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将cexA基因序列片段与经EcoR I和Kpn I双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图4)获得质粒pLH664。为扩增cexA基因序列片段设计引物PcexA-F、PcexA-R(表1)。

实施例4-过表达cexA基因菌株的获得：将质粒pLH664上的表达框扩增下来，与黑曲霉ΔoahA菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的cexA基因过表达菌株ΔoahA(cexA)/OE。

实施例5-mstC表达质粒的构建：质粒pLH684(图5)是由pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)载体经改造而来。所述基因mstC序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制转录。

具体获取过程如下：以黑曲霉cDNA为模板，PmstC-F、PmstC-R为引物进行PCR扩增mstC基因序列片段，其核苷酸序列为SEQNO.5，长度为1683bp；然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将mstC基因序列片段与经EcoR I和BglⅡ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图6)获得质粒pLH684。为扩增mstC基因序列片段设计引物PmstC-F、PmstC-R(表1)。

实施例6-过表达mstC基因菌株的获得:将质粒pLH684上的表达框扩增下来，与黑曲霉ΔoahA(cexA)/OE菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstC基因过表达菌株ΔoahA(cexA，mstC)/OE。

实施例7-hxkA、pfkA表达质粒的构建：质粒pLH1536(图7)是由pLH331(发明人前期授权专利，专利号：CN201910283994.5)载体经改造而来。所述基因hxkA序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制转录，所述基因pfkA序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录。

具体获取过程如下：以黑曲霉cDNA为模板，PhxkA-F、PhxkA-R为引物进行PCR扩增hxkA基因序列片段，PpfkA-F、PpfkA-R为引物进行PCR扩增pfkA基因序列片段，其核苷酸序列分别为SEQ NO.7、SEQ NO.9，长度为1473bp、2352bp。先用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将pfkA基因序列片段经Sac I/BamH I双酶切线性化后的载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证获得质粒pLH838。再用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将hxkA基因序列片段经EcoR I单酶切线性化后的载体pLH509(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获得质粒pLH667。再以质粒pLH838为模板，P2968、P2969为引物扩增PgpdA-pfkA-TtrpC序列片段，以质粒pLH667为模板P2970、P2971为引物进行PCR扩增PpkiA-hxkA-TtrpC序列片段，然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒分别将PgpdA-pfkA-TtrpC和PpkiA-hxkA-TtrpC依次经EcoR I/BamH I、Apa I酶切线性化后的出发载体pLH331进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，分别经酶切验证(图8、图9)获得质粒pLH1536。为扩增hxkA基因序列片段设计引物PhxkA-F、PhxkA-R，为扩增pfkA基因序列片段设计引物PpfkA-F、PpfkA-R，为扩增PgpdA-pfkA-TtrpC序列片段设计引物P2968、P2969，为扩增PpkiA-hxkA-TtrpC序列片段设计引物P2970、P2971(表1)。

实施例8-过表达hxkA、pfkA基因菌株的获得：将质粒pLH1536上的表达框扩增下来，与黑曲霉ΔoahA(cexA,mstC)/OE菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的hxkA、pfkA基因共过表达菌株ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA)/OE。

实施例9-mstA、vgb表达质粒的构建：质粒pLH1517(图10)是由载体pLH509(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)经改造而来，质粒pLH1466是在华大基因合成的。所述基因mstA序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制转录，所述基因vgb序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录。

具体获取过程如下：以黑曲霉cDNA为模板，PmstA-F、PmstA-R为引物进行PCR扩增hxkA基因序列片段，以质粒pLH1466为模板，Pvgb-F、Pvgb-R为引物进行PCR扩增vgb基因序列片段，其核苷酸序列分别为SEQ NO.11、SEQNO.13，长度为1593bp、441bp。用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将mstA基因序列片段经Sac I/EcoR I双酶切线性化后的载体pLH509进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获得质粒pLH668。用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将vgb基因序列片段与经EcoR I/BamH I双酶切线性化后的载体pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经酶切验证获得质粒pLH1261。再以质粒pLH1261为模板，Pvgb/oe-p1、Pvgb/oe-p2为引物扩增PgpdA-vgb-TtrpC序列片段，然后应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将PgpdA-vgb-TtrpC与经HindⅢ单酶切线性化后的载体pLH668进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经HindⅢ单酶切验证(图11)获得质粒pLH1517。为扩增mstA基因序列片段设计引物PmstA-F、PmstA-R，为扩增vgb基因序列片段设计引物Pvgb-F、Pvgb-R，为扩增PgpdA-vgb-TtrpC序列片段设计引物Pvgb/oe-p1、Pvgb/oe-p2(表1)。

实施例10-过表达mstA、vgb基因菌株的获得：将质粒pLH1517上的表达框扩增下来，与黑曲霉ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA)/OE菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstA、vgb基因共过表达菌株ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA，mstA，vgb)/OE。

实施例11-单独过表达cexA基因菌株的获得：将实施例3中的质粒pLH664上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的cexA基因过表达菌株cexA/OE。

实施例12-单独过表达mstC基因菌株的获得:将实施例5中的质粒pLH684上的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstC基因过表达菌株mstC/OE。

实施例13-过表达hxkA基因菌株的获得：将实施例7中的质粒pLH1536上hxkA基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的hxkA基因过表达菌株hxkA/OE。

实施例13-过表达pfkA基因菌株的获得：将实施例7中的质粒pLH1536上pfkA基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌菌株的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的pfkA基因过表达菌株pfkA/OE。

实施例14-过表达mstA基因菌株的获得：将实施例9中的质粒pLH1517上mstA基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的mstA基因过表达菌株mstA/OE。

实施例15-过表达vgb基因菌株的获得：将实施例9中的质粒pLH1517上vgb基因的表达框扩增下来，与黑曲霉宿主菌的原生质体在PEG的介导下进行转化。在下层培养基平板上培养4-6天，至长出单克隆后经过含有潮霉素B的PDA平板上进行筛选，进而提基因组验证获得正确的转化子,收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的vgb基因过表达菌株vgb/OE。

实施例16-利用如上所述的生产柠檬酸的黑曲霉菌株制备柠檬酸的方法，步骤如下：

首先，将黑曲霉菌株接种在PDA培养平板上，在0～45℃条件下培养4-5天直至产生足够的新鲜分生孢子；

然后，将孢子粉接到种子培养基中，孢子的终浓度为1×10⁵～2×10⁶个孢子/mL，在10～35℃，100～350rpm条件下发酵0～30h后，再转接0％～15％种子液至发酵培养基中，在0～35℃，100～350rpm条件下发酵0～120h，即得柠檬酸；

其中，所述培养基的组成为：种子培养基为：0％～55％玉米淀粉浊液，0％～10％(NH₄)₂SO₄，溶剂为水；发酵培养基为：0％～85％玉米淀粉清液，0％～50％玉米淀粉浊液，溶剂为水。

实施例17-本发明高产柠檬酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的相关应用检测：

柠檬酸样品制备：摇匀发酵液，取1mL发酵液离心取上清，稀释20倍，经0.22μm滤膜过滤后滤液用于HPLC检测。

柠檬酸的测定方法：Aminex HPX-87H柱(300mm×7.8mm)，UV检测器。流动相：5mMH₂SO₄。流速0.6mL/min，柱温65℃，波长210nm，进样体积为20μL。

1、分别将出发菌S469和获得的黑曲霉cexA/OE、mstC/OE、hxkA/OE、pfkA/OE、mstA/OE、vgb/OE菌株的分生孢子接种于含有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，在10～45℃，100～350rpm条件下进行发酵测试。在最优条件下，经过5天柠檬酸摇瓶发酵，与出发菌株S469相比，cexA/OE、mstC/OE、hxkA/OE、pfkA/OE、mstA/OE、vgb/OE菌株的柠檬酸产量在3天时分别提升了22.56％、11.47％、8.05％、14.41％、7.07％、17.67％，在5天时分别提升了13.31％、9.75％、8.43％、9.09％、6.12％、11.74％(见图12)。表明单独使柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA、葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、己糖激酶基因hxkA、磷酸果糖激酶基因pfkA、葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA和透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的表达量上调而获得的黑曲霉菌株均柠檬酸的产量均有不同程度的提高。

2、分别将出发菌株S469和获得的黑曲霉ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA，mstA，vgb)/OE菌株的分生孢子接种于含有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，在10～45℃，100～350rpm条件下进行发酵测试。在最优条件下，经过5天柠檬酸摇瓶发酵，与出发菌株S469相比，ΔoahA(cexA，mstC，hxkA，pfkA，mstA，vgb)/OE菌株柠檬酸产量为0～143.2g/L(图13)，柠檬酸产量在3天和5天分别提升了32.8％、18.3％；生产强度达到1.19g/L/h(图14)，且在整个发酵周期中都较S469高出近20％，发酵周期缩短了10小时。由此可见，本发明黑曲霉菌株是一株高产柠檬酸的黑曲霉菌株。

其中，上述LB培养基组分为：

胰蛋白胨0～10.0g/L，NaCl 0～10.0g/L，酵母浸出物0～5.0g/L，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(W/V)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL。

表1所用引物序列

本专利申请中所使用到的序列如下：

SEQ NO.1：oahA基因上游同源臂的核苷酸序列1100bp

AATTCGAGCCCTGGCAGTCTATCGGTGCAGATCTGCTCCCTCGGCCAAGCGCCAATCACGTCCGATTCATCCCATTCCTCATCCAGCTGGCGAACTCCGGAGGTTGATTGCTCGCTCGCTCTCAGTTGGCCACCAAACTTACTCGTCCCCCTCCTTCACCCTCCCTCCTCTGCCAATGCTACAGAGTACTTGGCTAGGCTACTATCTTCTCAGCTGGGTGAAGAACAACGGGCCCCGTGCGTGATGAGCAAAAGCGTCTGACATGCAGCAACTGCAGTATACTGGAGCCCGCGGCTACCGAGGAACTCGTGCTCGTGTGCCACCACATCGAAGTGAGTTGATGCGTCTTGTCCATGCAGTGTCGGCGTGGCCTAAAGTACGGGCCAAACCTGTCTGACTTCATCCCACACTATTACCCCCTCCCTCATTCTCCCCTGATTCGGCCCAATAAGGAAATCACTTAGTCAATCAATCCTGCCATTACCGGCGCGTAATCTGAAACTACGCGCGGACTGTCTCTTACTCCCCTCGCGGTGGGCGGCCCAGCCAGCCCCATCCTTACTAGATTTAGCGAATTACTGGTCATTAGCCCTGTACGGGGGAGGGGCGGGAAAACAAAAATGCGAATAATAGAATAAATTTAATAAAGAAAAAAGAGGGGGGGGGAGCTTATCTAGGCCCCTGCTGCATTGCATTCGGACATTTTTCGACTTGTCACAGGCACAAATCATAGTCCGCCGATGGCGTCGATTGACCATTTTCTTTTCTTTTCTCGGCGCTGGGATGGTGGCCAAGAAAATTGAATGGCAATGGTTCGTTCACCGGAGTAGGGTGTACGTGCATTGTGTGGATTGACGATGATTCTCGGCCAAGGGCTTGCGTTGCAATCCCACCAGGAGGGGAATGTTGCAGACAGACAGAAAGCAAAAGAAGTATTGGAGGGAAAAAAACAATTCTTGAAAAATGATCTTCTCAGGTAATGAATATTGGTTGCTGGCGGGCTGATCTTCTCCCGACACGTCTATATAAACTGGTCACCTTCTGGCCCTTCCTTTCTATCTCTTCCTTCTCATCATCAGTCTCAAACAAGCCTCTTTCTG

SEQ NO.2：oahA基因下游同源臂的核苷酸序列1241bp

CTAGTTTTGTTTCACCCAGCAGAACCTTATTGCATTAACAATCATATTCTCAGTAAGCACGAGACACAGAAACGAGAAAAGTATTCTAGACCCTGACAGAACACCCTGATCGACAGTCACTTACCCAACAAAGTAAGTGGTCTCTACCCTCTGATTACAGTTAAGGCAGGCAGTAGTAAGCAAGAATAAGAAAGAAAGAATAATTAACTACTAAGTTGCTCGCTACTGCATGCACGACCACGGAGTCGCCGTGCAAAAACAATTGGTGCGTGCTCAGCTAGCTGCACTCTGCACACTGCCACCCTCGCCCTACAAAAGAAACCATGCTGTTTCTCCACTATACTGTTCCCGCGATGAAACTAGGGCCAATAACCATGCAGTTACTATTGGTCCCACTGGGGTGGGTTGGGTAGCCTTATGGTATTAAAAGGAGTAGGGGTCTTTGTCGATCGCTTTTCCATTATTATTTTTGTATTTTTATTTTTGTTGGTTTCTGTTTGTGTTATGTTGGGCCGTTTTTGTTTTTCTTTGGGTAACGAGGGATGGGAATATATTCATATGGAAATGGAAATGGATTATGCTATTGATTGATGAATGGTGATGATCTGCGTGGAAATTAATGTCAGAGTCTTGTCTGATTCAAACTCCGTCGTCCGTCTGATGTCAGCCAGCCACAATCACACATCCACGCAAGCACATTCAACCCCCTGAATGGAAAAGCAGGGTCCAAAGAAAAAAAGAAAAAATGATAAAAATGTAACAAGAAATAGAATATTCATCAGCGAACTGCATCAAAACAAATCATGATTCGTTCATTCTCTCCATCCCCTACTGTCACTCCTTCCCTCCCCCTCTCATTGTCCCCCCCCTGCATCTGAATCTCAGGATCTCACATTAATGTCTCCTGATGCACCACAATCCGCCACTCTCCATCACTTGCCTGACTCCATGTCGTCGACCCGGTGCCCCGGTACGTCTCCTCGCCGCGCCGCGCATTGATCTTGTATGTTACTGATCCGGCCATCAGGTCGATGACGATCACGCGCACTTCCTGCAGTTCGTACTCGTCGAAGTGATGGAAGGGTGGCTTCAGCGCCTCGCTGATTGATGGCTTCGAATGCAGGTGCAGAATCTCGCGCTGCGGGAAAAGTAAGTTGGCTTCTTCGTTACACATCTTCTTGATTTCGGGCCCCGGATCGGCGGAGGTGAGCGCCGTCCAGAGACGACGCTCCTTGCCGATA

SEQ NO.3：cexA基因的核苷酸序列1575bp

ATGTCTTCAACCACGTCTTCATCAAGATCAGACCTTGAAAAGGTCCCCGTACCACAGGTCATCCCTAGAGACAGTGACTCCGATAAGGGATCCCTCTCTCCGGAGCCTTCGACCCTAGAGGCTCAGTCATCCGAGAAGCCACCGCATCATATCTTCACACGGTCTCGCAAGCTGCAAATGGTTTGCATCGTCTCCCTCGCTGCCATATTTTCTCCGCTTTCGTCGAACATTTACTTCCCTGCCCTGGATGATGTCTCGAAATCCCTCAACATCAGCATGTCGCTCGCAACACTCACCATCACGGTGTACATGATCGTCCAAGGCCTCGCTCCCAGCTTCTGGGGTTCCATGTCAGACGCCACAGGTAGACGGCCTGTCTTTATTGGAACATTCATTGTTTACCTCGTAGCCAATATTGCTCTGGCCGAATCCAAGAACTATGGTGAGCTCATGGCCTTCCGAGCCTTGCAGGCTGCTGGTAGCGCGGCCACCATCTCAATCGGAGCTGGAGTGATTGGTGATATCACAAACTCGGAAGAAAGAGGTAGCTTGGTGGGTATCTTCGGTGGAGTTCGCATGCTTGGACAGGGAATCGGGCCGGTTTTCGGCGGCATTTTCACCCAGTATCTCGGATATCGATCTATCTTTTGGTTCCTCACGATTGCTGGAGGCGTGAGTCTCCTGTCCATTCTGGTGCTTCTTCCGGAGACATTGAGACCAATTGCTGGAAATGGAACTGTGAAGCTCAATGGCATTCATAAGCCCTTCATCTACACGATCACCGGCCAGACGGGGGTTGTCGAGGGAGCGCAACCGGAAGCGAAAAAGACCAAAACCAGCTGGAAGTCTGTTTTTGCTCCTTTGACATTCCTCGTCGAAAAGGACGTTTTCATCACCCTGTTCTTTGGAAGTATCGTGTACACAGTGTGGAGCATGGTGACATCCAGTACCACCGACCTCTTCAGCGAAGTGTACGGCCTGTCATCCCTGGACATTGGACTCACTTTCCTAGGCAATGGCTTTGGATGTATGTCTGGCTCTTATCTGGTCGGCTACCTTATGGATTACAACCACCGTCTTACCGAACGCGAATATTGCGAGAAACACGGTTATCCGGCAGGCACACGTGTCAATCTGAAATCACACCCCGACTTCCCCATTGAGGTCGCCCGGATGCGCAATACCTGGTGGGTGATTGCGATCTTCATCGTGACAGTTGCTTTGTACGGCGTGTCTTTGCGGACACATCTGGCGGTGCCTATCATTCTGCAGTACTTCATTGCGTTCTGCTCAACAGGACTCTTCACCATCAACAGCGCCCTGGTCATCGATCTTTACCCAGGTGCTAGCGCCAGTGCGACAGCAGTGAACAATCTGATGCGGTGCCTGCTTGGAGCTGGCGGTGTGGCTATCGTGCAACCTATCCTGGACGCCTTGAAGCCGGATTATACTTTCCTCTTGCTTGCCGGCATCACCCTCGTGATGACTCCGTTGCTGTACGTCGAAGATCGATGGGGTCCTGGCTGGCGACATGCCCGCGAAAGGAGACTCAAGGCCAAAGCCAACGGCAACTAG

SEQ NO.4：cexA基因的氨基酸序列524aa

MSSTTSSSRSDLEKVPVPQVIPRDSDSDKGSLSPEPSTLEAQSSEKPPHHIFTRSRKLQMVCIVSLAAIFSPLSSNIYFPALDDVSKSLNISMSLATLTITVYMIVQGLAPSFWGSMSDATGRRPVFIGTFIVYLVANIALAESKNYGELMAFRALQAAGSAATISIGAGVIGDITNSEERGSLVGIFGGVRMLGQGIGPVFGGIFTQYLGYRSIFWFLTIAGGVSLLSILVLLPETLRPIAGNGTVKLNGIHKPFIYTITGQTGVVEGAQPEAKKTKTSWKSVFAPLTFLVEKDVFITLFFGSIVYTVWSMVTSSTTDLFSEVYGLSSLDIGLTFLGNGFGCMSGSYLVGYLMDYNHRLTEREYCEKHGYPAGTRVNLKSHPDFPIEVARMRNTWWVIAIFIVTVALYGVSLRTHLAVPIILQYFIAFCSTGLFTINSALVIDLYPGASASATAVNNLMRCLLGAGGVAIVQPILDALKPDYTFLLLAGITLVMTPLLYVEDRWGPGWRHARERRLKAKANGN

SEQ NO.5：mstC基因的核苷酸序列1683bp

ATGGGTGTCTCTAATATGATGTCCCGGTTCAAGCCTCAGGCGGACCACTCTGAGTCCTCCACTGAGGCTCCTACTCCTGCTCGCTCCAACTCCGCCGTCGAGAAGGACAATGTCTTGCTCGATGACAGTCCCGTCAAGTACTTGACCTGGCGCTCCTTCATCCTGGGTATCGTCGTGTCCATGGGTGGTTTCATCTTCGGTTACTCTACTGGTCAAATCTCTGGTTTCGAGACTATGGATGACTTCCTCCAACGTTTCGGTCAGGAACAGGCGGATGGATCCTATGCTTTCAGCAACGTCCGTAGTGGTCTCATTGTCGGTCTGCTGTGTATCGGTACTATGATCGGTGCCCTGGTTGCTGCTCCTATCGCAGACCGCATGGGCCGCAAGCTCTCCATCTGTCTCTGGTCTGTCATCCACATCGTCGGTATCATCATTCAGATTGCCACCGACTCCAACTGGGTCCAGGTCGCTATGGGTCGTTGGGTTGCCGGTCTGGGTGTTGGTGCCCTCTCCAGCATTGTCCCCATGTACCAGAGTGAATCTGCTCCCCGTCAGGTCCGTGGTGCCATGGTCAGTGCCTTCCAGCTGTTCGTTGCCTTCGGTATCTTCATCTCCTACATCATCAACTTCGGTACCGAGAGAATCCAGTCGACTGCTTCCTGGCGTATCACCATGGGCATTGGCTTCGCCTGGCCCTTGATTCTGGCTGTTGGCTCTCTCTTCCTGCCCGAGTCTCCTCGTTTCGCCTACCGTCAGGGTCGTATCGATGAGGCCCGTGAGGTTATGTGCAAGCTGTACGGTGTCAGCCCGAACCACCGCGTCATCGCCCAGGAGATGAAGGACATGAAGGACAAGCTCGACGAGGAGAAGGCCGCCGGTCAGGCTGCCTGGCACGAGCTGTTCACCGGCCCTCGCATGCTCTACCGTACCCTGCTCGGTATTGCTCTGCAGTCCCTCCAGCAGCTGACCGGTGCCAACTTTATCTTCTACTACGGAAACAGTATCTTCACCTCCACTGGTCTGAGCAACAGCTACGTCACTCAGATCATTCTGGGTGCTGTCAACTTCGGTATGACCCTGCCCGGTCTGTACGTCGTCGAGCACTTCGGTCGTCGTAACAGTCTGATGGTTGGTGCTGCCTGGATGTTCATTTGCTTCATGATCTGGGCTTCCGTTGGTCACTTCGCTCTGGATCTTGCCGACCCTCAGGCCACTCCTGCCGCTGGTAAGGCCATGATCATCTTCACTTGCTTCTTCATTGTCGGTTTCGCCACCACCTGGGGTCCTATCGTCTGGGCCATCTGTGGTGAGATGTACCCCGCCCGCTACCGTGCTCTCTGCATTGGTATTGCCACCGCTGCCAACTGGACCTGGAACTTCCTCATCTCCTTCTTCACCCCCTTCATCTCTAGCTCCATTGACTTCGCCTACGGCTACGTCTTTGCTGGATGCTGTTTCGCCGCCATCTTCGTTGTCTTCTTCTTCGTCAATGAGACCCAGGGTCGCACTCTTGAGGAGGTTGACACCATGTACGTGCTCCACGTCAAGCCCTGGCAGAGTGCCAGCTGGGTTCCCCCGGAGGGCATTGTCCAGGACATGCACCGCCCCCCTTCCTCTTCCAAGCAGGAGGGTCAGGCTGAGATGGCTGAGCACACCGAGCCCACTGAGCTCCGCGAGTAA

SEQ NO.6：mstC基因的氨基酸序列560aa

MGVSNMMSRFKPQADHSESSTEAPTPARSNSAVEKDNVLLDDSPVKYLTWRSFILGIVVSMGGFIFGYSTGQISGFETMDDFLQRFGQEQADGSYAFSNVRSGLIVGLLCIGTMIGALVAAPIADRMGRKLSICLWSVIHIVGIIIQIATDSNWVQVAMGRWVAGLGVGALSSIVPMYQSESAPRQVRGAMVSAFQLFVAFGIFISYIINFGTERIQSTASWRITMGIGFAWPLILAVGSLFLPESPRFAYRQGRIDEAREVMCKLYGVSPNHRVIAQEMKDMKDKLDEEKAAGQAAWHELFTGPRMLYRTLLGIALQSLQQLTGANFIFYYGNSIFTSTGLSNSYVTQIILGAVNFGMTLPGLYVVEHFGRRNSLMVGAAWMFICFMIWASVGHFALDLADPQATPAAGKAMIIFTCFFIVGFATTWGPIVWAICGEMYPARYRALCIGIATAANWTWNFLISFFTPFISSSIDFAYGYVFAGCCFAAIFVVFFFVNETQGRTLEEVDTMYVLHVKPWQSASWVPPEGIVQDMHRPPSSSKQEGQAEMAEHTEPTELRE

SEQ NO.7：hxkA基因的核苷酸序列1473bp

ATGGTTGGAATCGGTCCTAAGCGTCCCCCCTCCCGCAAGGGTTCCATGGCCGATGTTCCCCAGAACCTCTTGCAGCAGATCAAGGACTTCGAGGACCAATTCACCGTCGATCGCTCCAAGCTCAAGCAGATTGTCAACCACTTTGTCAAGGAATTGGAAAAGGGTCTCTCTGTCGAGGGTGGAAACATCCCTATGAACGTCACCTGGGTTCTGGGATTCCCCGATGGCGACGAACAGGGTACTTTCCTCGCCCTCGACATGGGTGGCACCAACCTGCGTGTTTGTGAGATCACCCTGACCCAGGAGAAGGGTGCCTTCGACATCACCCAGTCCAAGTACCGCATGCCCGAGGAATTGAAGACCGGTACCGCCGAGGAGCTGTGGGAATACATCGCCGACTGCCTGCAGCAATTCATCGAGTCCCACCACGAGAACGAGAAGATCTCCAAGCTGCCCCTGGGTTTCACCTTCTCCTACCCCGCCACCCAGGATTACATCGACCACGGTGTCCTGCAGCGCTGGACCAAGGGTTTCGACATTGATGGTGTCGAGGGCCACGACGTCGTCCCGCCGTTGGAGGCCATCCTGCAGAAGCGCGGCCTGCCCATCAAGGTGGCTGCACTGATCAACGACACCACCGGAACCCTCATCGCCTCTTCTTACACCGACTCCGACATGAAGATCGGCTGCATCTTCGGTACCGGTGTCAACGCCGCCTACATGGAGAACGCCGGCTCCATCCCCAAGCTGGCTCACATGAACCTGCCCGCCGACATGCCCGTGGCTATCAACTGCGAGTACGGTGCTTTCGACAACGAGCACATCGTGCTGCCTCTGACCAAGTACGACCACATCATCGACCGCGACTCGCCCCGTCCCGGTCAGCAGGCCTTCGAGAAGATGACCGCCGGTCTGTACCTGGGTGAGATCTTCCGTCTGGCCCTGATGGACCTGGTGGAGAACCGCCCCGGCCTCATCTTCAACGGCCAGGACACCACCAAGCTGCGCAAGCCCTACATCCTGGATGCCTCCTTCCTGGCAGCCATCGAGGAGGACCCCTACGAGAACCTGGAGGAGACCGAGGAGCTCATGGAGCGCGAGCTCAACATCAAGGCCACCCCGGCGGAGCTGGAGATGATCCGCCGCCTGGCCGAGCTGATCGGTACGCGTGCCGCTCGCCTGTCGGCCTGCGGTGTTGCCGCCATTTGCACGAAGAAGAAGATCGACTCGTGCCACGTTGGTGCCGACGGCTCCGTCTTCACCAAGTACCCTCACTTCAAGGCGCGCGGAGCCAAGGCTCTGCGCGAGATCCTGGACTGGGCTCCGGAGGAGCAGGACAAGGTGACCATCATGGCGGCCGAGGATGGATCTGGTGTGGGAGCTGCGCTGATTGCGGCGCTGACCCTGAAGCGGGTCAAGGCCGGCAACCTGGCCGGTATCCGAAACATGGCTGACATGAAGACCCTGCTATAA

SEQ NO.8：hxkA基因的氨基酸序列490aa

MVGIGPKRPPSRKGSMADVPQNLLQQIKDFEDQFTVDRSKLKQIVNHFVKELEKGLSVEGGNIPMNVTWVLGFPDGDEQGTFLALDMGGTNLRVCEITLTQEKGAFDITQSKYRMPEELKTGTAEELWEYIADCLQQFIESHHENEKISKLPLGFTFSYPATQDYIDHGVLQRWTKGFDIDGVEGHDVVPPLEAILQKRGLPIKVAALINDTTGTLIASSYTDSDMKIGCIFGTGVNAAYMENAGSIPKLAHMNLPADMPVAINCEYGAFDNEHIVLPLTKYDHIIDRDSPRPGQQAFEKMTAGLYLGEIFRLALMDLVENRPGLIFNGQDTTKLRKPYILDASFLAAIEEDPYENLEETEELMERELNIKATPAELEMIRRLAELIGTRAARLSACGVAAICTKKKIDSCHVGADGSVFTKYPHFKARGAKALREILDWAPEEQDKVTIMAAEDGSGVGAALIAALTLKRVKAGNLAGIRNMADMKTLL

SEQ NO.9：pfkA基因的核苷酸序列2352bp

ATGGCTCCCCCCCAAGCTCCCGTGCAACCGCCCAAGAGACGCCGCATCGGTGTCTTGACCTCTGGTGGCGATGCTCCCGGTATGAACGGTGTCGTCCGGGCCGTCGTCCGGATGGCTATCCACTCCGACTGTGAGGCTTTCGCCGTCTACGAAGGTTACGAGGGTCTCGTCAATGGCGGCGACATGATCCGTCAGCTTCACTGGGAGGATGTTCGCGGCTGGTTGTCCCGTGGTGGTACCTTGATCGGTTCCGCCCGCTGCATGACCTTCCGTGAGCGCCCCGGTCGTCTGCGGGCTGCCAAGAACATGGTCCTCCGTGGCATTGACGCCCTTGTCGTCTGTGGTGGTGATGGCAGTTTGACTGGTGCCGACGTTTTTCGTTCCGAGTGGCCCGGTCTGTTGAAGGAATTGGTCGAGACGGGCGAGTTGACCGAAGAGCAGGTCAAGCCATACCAGATTCTGAACATCGTCGGTTTGGTGGGTTCGATCGATAACGACATGTCCGGCACCGACGCCACCATCGGTTGCTACTCCTCCCTCACTCGCATCTGTGACGCCGTCGACGACGTCTTCGATACTGCCTTTTCCCACCAGCGTGGATTCGTCATTGAGGTCATGGGTCGTCACTGCGGTTGGCTGGCCTTGATGTCTGCTATCAGTACCGGTGCCGACTGGCTGTTCGTGCCCGAGATGCCGCCCAAGGACGGATGGGAGGATGACATGTGCGCTATCATTACCAAGAACAGAAAGGAGCGTGGAAAGCGTAGGACGATCGTCATCGTGGCCGAGGGTGCCCAGGATCGCCATCTCAACAAGATCTCGAGTTCGAAGATCAAGGATATTTTGACGGAGCGGTTGAACCTGGATACCCGTGTGACTGTGTTGGGTCACACTCAGAGAGGTGGAGCCGCCTGTGCGTACGACCGCTGGCTGTCCACACTGCAGGGTGTCGAGGCTGTCCGCGCGGTGCTGGACATGAAGCCCGAAGCCCCGTCCCCGGTCATCACCATCCGTGAGAACAAGATCTTGCGCATGCCGTTGATGGACGCCGTGCAGCACACCAAGACTGTCACCAAGCACATTCAGAACAAGGAGTTCGCCGAAGCCATGGCCCTCCGCGACTCGGAATTCAAAGAGTACCACTTTTCCTACATCAACACTTCCACGCCCGACCACCCGAAGCTGCTCCTCCCAGAGAACAAGAGAATGCGCATCGGTATTATTCACGTTGGCGCCCCCGCTGGTGGTATGAACCAGGCTACCCGCGCGGCCGTTGCCTACTGCCTGACTCGTGGCCACACCCCCCTGGCCATTCACAACGGTTTCCCCGGTCTGTGCCGGCACTATGATGACACCCCGATCTGCTCTGTGCGCGAGGTGGCATGGCAGGAATCGGACGCCTGGGTCAACGAGGGTGGTTCGGATATCGGTACCAACCGTGGTCTGCCCGGCGATGACCTCGCGACCACGGCGAAGAGCTTCAAGAAGTTCGGATTCGATGCGTTGTTCGTCGTGGGTGGATTTGAGGCGTTCACCGCCGTCAGCCAGCTTCGCCAGGCGCGCGAGAAGTACCCCGAATTCAAGATTCCCATGACCGTGCTGCCGGCGACCATTTCCAACAACGTGCCGGGCACAGAATACTCTCTGGGTAGCGACACCTGCCTTAACACCTTGATCGACTTCTGCGACGCCATCCGCCAGTCGGCCTCGTCCTCTCGTCGCCGTGTGTTCGTCATCGAGACGCAGGGTGGCAAGTCGGGTTACATCGCCACGACGGCTGGTCTGTCGGTGGGCGCGGTAGCCGTGTACATTCCCGAGGAGGGCATCGACATTAAGATGCTGGCCCGCGACATTGACTTCCTGCGTGACAACTTTGCGCGCGACAAGGGAGCGAACCGCGCCGGTAAGATCATCCTGCGTAACGAGTGCGCGTCCAGCACGTACACGACACAGGTGGTGGCCGACATGATCAAGGAGGAAGCCAAGGGACGTTTCGAGAGTCGTGCGGCGGTGCCGGGACACTTCCAGCAGGGTGGCAAGCCGTCGCCGATGGACCGTATCCGGGCGTTGCGGATGGCCACCAAGTGTATGCTGCACCTGGAGAGCTATGCGGGCAAGTCGGCGGATGAGATTGCGGCCGATGAGCTGTCTGCGTCGGTCATTGGTATCAAGGGCTCGCAGGTGTTGTTCTCGCCGATGGGTGGAGAGACCGGCCTGGAGGCGACCGAGACGGACTGGGCGCGCCGTCGACCCAAGACGGAGTTCTGGCTGGAGCTGCAGGACACGGTGAACATTCTGTCGGGACGGGCGAGCGTGAACAACGCGACGTGGAGTTGCTATGAGAATGCTTAA

SEQ NO.10：pfkA基因的氨基酸序列783aa

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVYEGYEGLVNGGDMIRQLHWED

VRGWLSRGGTLIGSARCMTFRERPGRLRAAKNMVLRGIDALVVCGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDMSGTDATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGFVIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVPEMPPKDGWEDDMCAIITKNRKERGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNLDTRVTVLGHTQRGGAACAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMPLMDAVQHTKTVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMRIGIIHVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDDTPICSVREVAWQESDAWVNEGGSDIGTNRGLPGDDLATTAKSFKKFGFDALFVVGGFEAFTAVSQLRQAREKYPEFKIPMTVLPATISNNVPGTEYSLGSDTCLNTLIDFCDAIRQSASSSRRRVFVIETQGGKSGYIATTAGLSVGAVAVYIPEEGIDIKMLARDIDFLRDNFARDKGANRAGKIILRNECASSTYTTQVVADMIKEEAKGRFESRAAVPGHFQQGGKPSPMDRIRALRMATKCMLHLESYAGKSADEIAADELSASVIGIKGSQVLFSPMGGETGLEATETDWARRRPKTEFWLELQDTVNILSGRA SVNNATWSCYENA

SEQ NO.11：mstA基因的核苷酸序列1593bp

ATGGCTGAAGGCTTCGTTGACGCCTCGCGCGTCGAGGCCCCAGTCACCCTCAAGACCTACTTGATGTGTGCCTTTGCGGCTTTTGGTGGTATCTTCTTCGGTTATGACTCTGGTTATATCAGCGGTGTCATGGGAATGAGATACTTCATCGAGGAGTTTGAGGGCTTGGACTATAACACTACCCCCACCGATTCCTTCGTCCTCCCGTCCTGGAAAAAATCGTTGATCACGTCGATCCTCTCGGCTGGAACCTTCTTTGGTGCCCTCATTGCTGGTGACTTGGCAGACTGGTTCGGTCGTCGCACTACCATTGTCAGTGGTTGTGTTGTCTTCATCGTTGGTGTTATCCTGCAGACCGCTTCGACCTCCTTGGGTCTGCTTGTTGCCGGCCGTCTGGTCGCGGGATTTGGTGTGGGCTTCGTCTCCGCCATCATTATCCTGTACATGTCTGAGATTGCACCTCGCAAGGTTCGCGGTGCTATTGTCTCAGGGTACCAGTTCTGCATCACCATCGGGCTCATGTTGGCCTCGTGCGTCGACTACGGCACTGAGAACCGTCTCGACTCTGGCTCCTACCGTATCCCAATCGGCCTCCAGCTCGCCTGGGCCTTGATCCTGGGAGGTGGTCTGCTCTGCCTGCCCGAGTCCCCTCGTTACTTTGTTAAAAAGGGCGACCTGGCTAAGGCTGCGGAGGTTCTTGCCCGCGTTCGTGGTCAACCCCAAGACTCGGATTATATCAAGGATGAGCTGGCGGAGATTGTGGCAAATCATGAGTACGAGATGCAGGTGATTCCGGAAGGTGGATATTTCGTCAGCTGGATGAACTGCTTCCGTGGCAGTATATTCTCGCCCAACAGCAATCTCCGTCGGACTGTCCTAGGTACTTCTCTGCAGATGATGCAACAGTGGACCGGTGTCAACTTTGTCTTCTACTTTGGAACGACCTTTTTCCAGTCGCTGGGAACCATCGATGACCCCTTCCTCATCAGCATGATTACCACTATCGTCAACGTCTGCTCGACCCCCGTCTCGTTCTACACAATTGAGAAGTTTGGCCGCCGTTCGCTCCTTTTGTGGGGAGCACTTGGTATGGTCATCTGCCAGTTCATTGTCGCTATCGTCGGCACCGTGGACGGTAGCAATAAGCACGCTGTCAGTGCAGAGATTTCTTTCATCTGCATTTACATCTTCTTCTTTGCTAGCACGTGGGGCCCGGGCGCCTGGGTTGTGATTGGCGAGATTTTCCCCCTACCTATTCGGTCGCGTGGTGTGGCTCTGTCGACGGCATCGAACTGGCTGTGGAATTGCATCATCGCTGTCATCACCCCTTACATGGTCGACAAGGACAAGGGTGACTTGAAGGCCAAGGTGTTCTTCATCTGGGGCTCGCTGTGTGCCTGCGCTTTTGTCTACACGTACTTCCTAATTCCGGAGACCAAGGGTCTTACTCTTGAGCAGGTGGACAAGATGATGGAAGAGACCACGCCTCGCACCTCAGCCAAGTGGACTCCACATGGCACCTTCACGGCCGAGATGGGTCTTACTGCGAATGCCGTGGCCGAAAAGGCTACTGCGGTTCACCAGGAGGTGTGA

SEQ NO.12：mstA基因的氨基酸序列530aa

MAEGFVDASRVEAPVTLKTYLMCAFAAFGGIFFGYDSGYISGVMGMRYFIEEFEGLDYNTTPTDSFVLPSWKKSLITSILSAGTFFGALIAGDLADWFGRRTTIVSGCVVFIVGVILQTASTSLGLLVAGRLVAGFGVGFVSAIIILYMSEIAPRKVRGAIVSGYQFCITIGLMLASCVDYGTENRLDSGSYRIPIGLQLAWALILGGGLLCLPESPRYFVKKGDLAKAAEVLARVRGQPQDSDYIKDELAEIVANHEYEMQVIPEGGYFVSWMNCFRGSIFSPNSNLRRTVLGTSLQMMQQWTGVNFVFYFGTTFFQSLGTIDDPFLISMITTIVNVCSTPVSFYTIEKFGRRSLLLWGALGMVICQFIVAIVGTVDGSNKHAVSAEISFICIYIFFFASTWGPGAWVVIGEIFPLPIRSRGVALSTASNWLWNCIIAVITPYMVDKDKGDLKAKVFFIWGSLCACAFVYTYFLIPETKGLTLEQVDKMMEETTPRTSAKWTPHGTFTAEMGLTANAVAEKATAVHQEV

SEQ NO.13：vgb基因的核苷酸序列441bp

ATGCTGGATCAGCAGACCATCAACATCATCAAGGCCACCGTCCCCGTCCTGAAGGAGCACGGTGTCACTATTACCACCACCTTCTACAAGAACCTGTTCGCCAAGCACCCCGAGGTCCGCCCTTTGTTTGATATGGGCCGCCAGGAGTCCCTGGAGCAGCCTAAAGCTCTGGCTATGACCGTCCTGGCTGCTGCTCAAAATATCGAGAACCTGCCCGCTATTCTGCCCGCCGTCAAAAAGATCGCCGTCAAGCACTGCCAGGCCGGCGTTGCCGCTGCTCATTATCCTATTGTCGGTCAGGAGCTGCTGGGCGCCATTAAGGAAGTCCTGGGCGATGCCGCCACCGATGATATCCTGGATGCCTGGGGCAAGGCCTACGGCGTTATTGCCGATGTCTTTATCCAGGTCGAGGCCGATCTGTACGCCCAGGCCGTTGAA

SEQ NO.14：vgb基因的氨基酸序列146aaMLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNI

ENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQELLGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株、方法和应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1100

<212> DNA

<213> oahA基因上游同源臂的核苷酸序列1100 bp(Unknown)

<400> 1

aattcgagcc ctggcagtct atcggtgcag atctgctccc tcggccaagc gccaatcacg 60

tccgattcat cccattcctc atccagctgg cgaactccgg aggttgattg ctcgctcgct 120

ctcagttggc caccaaactt actcgtcccc ctccttcacc ctccctcctc tgccaatgct 180

acagagtact tggctaggct actatcttct cagctgggtg aagaacaacg ggccccgtgc 240

gtgatgagca aaagcgtctg acatgcagca actgcagtat actggagccc gcggctaccg 300

aggaactcgt gctcgtgtgc caccacatcg aagtgagttg atgcgtcttg tccatgcagt 360

gtcggcgtgg cctaaagtac gggccaaacc tgtctgactt catcccacac tattaccccc 420

tccctcattc tcccctgatt cggcccaata aggaaatcac ttagtcaatc aatcctgcca 480

ttaccggcgc gtaatctgaa actacgcgcg gactgtctct tactcccctc gcggtgggcg 540

gcccagccag ccccatcctt actagattta gcgaattact ggtcattagc cctgtacggg 600

ggaggggcgg gaaaacaaaa atgcgaataa tagaataaat ttaataaaga aaaaagaggg 660

ggggggagct tatctaggcc cctgctgcat tgcattcgga catttttcga cttgtcacag 720

gcacaaatca tagtccgccg atggcgtcga ttgaccattt tcttttcttt tctcggcgct 780

gggatggtgg ccaagaaaat tgaatggcaa tggttcgttc accggagtag ggtgtacgtg 840

cattgtgtgg attgacgatg attctcggcc aagggcttgc gttgcaatcc caccaggagg 900

ggaatgttgc agacagacag aaagcaaaag aagtattgga gggaaaaaaa caattcttga 960

aaaatgatct tctcaggtaa tgaatattgg ttgctggcgg gctgatcttc tcccgacacg 1020

tctatataaa ctggtcacct tctggccctt cctttctatc tcttccttct catcatcagt 1080

ctcaaacaag cctctttctg 1100

<210> 2

<211> 1241

<212> DNA

<213> oahA基因下游同源臂的核苷酸序列1241 bp(Unknown)

<400> 2

ctagttttgt ttcacccagc agaaccttat tgcattaaca atcatattct cagtaagcac 60

gagacacaga aacgagaaaa gtattctaga ccctgacaga acaccctgat cgacagtcac 120

ttacccaaca aagtaagtgg tctctaccct ctgattacag ttaaggcagg cagtagtaag 180

caagaataag aaagaaagaa taattaacta ctaagttgct cgctactgca tgcacgacca 240

cggagtcgcc gtgcaaaaac aattggtgcg tgctcagcta gctgcactct gcacactgcc 300

accctcgccc tacaaaagaa accatgctgt ttctccacta tactgttccc gcgatgaaac 360

tagggccaat aaccatgcag ttactattgg tcccactggg gtgggttggg tagccttatg 420

gtattaaaag gagtaggggt ctttgtcgat cgcttttcca ttattatttt tgtattttta 480

tttttgttgg tttctgtttg tgttatgttg ggccgttttt gtttttcttt gggtaacgag 540

ggatgggaat atattcatat ggaaatggaa atggattatg ctattgattg atgaatggtg 600

atgatctgcg tggaaattaa tgtcagagtc ttgtctgatt caaactccgt cgtccgtctg 660

atgtcagcca gccacaatca cacatccacg caagcacatt caaccccctg aatggaaaag 720

cagggtccaa agaaaaaaag aaaaaatgat aaaaatgtaa caagaaatag aatattcatc 780

agcgaactgc atcaaaacaa atcatgattc gttcattctc tccatcccct actgtcactc 840

cttccctccc cctctcattg tcccccccct gcatctgaat ctcaggatct cacattaatg 900

tctcctgatg caccacaatc cgccactctc catcacttgc ctgactccat gtcgtcgacc 960

cggtgccccg gtacgtctcc tcgccgcgcc gcgcattgat cttgtatgtt actgatccgg 1020

ccatcaggtc gatgacgatc acgcgcactt cctgcagttc gtactcgtcg aagtgatgga 1080

agggtggctt cagcgcctcg ctgattgatg gcttcgaatg caggtgcaga atctcgcgct 1140

gcgggaaaag taagttggct tcttcgttac acatcttctt gatttcgggc cccggatcgg 1200

cggaggtgag cgccgtccag agacgacgct ccttgccgat a 1241

<210> 3

<211> 1575

<212> DNA

<213> cexA基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 3

atgtcttcaa ccacgtcttc atcaagatca gaccttgaaa aggtccccgt accacaggtc 60

atccctagag acagtgactc cgataaggga tccctctctc cggagccttc gaccctagag 120

gctcagtcat ccgagaagcc accgcatcat atcttcacac ggtctcgcaa gctgcaaatg 180

gtttgcatcg tctccctcgc tgccatattt tctccgcttt cgtcgaacat ttacttccct 240

gccctggatg atgtctcgaa atccctcaac atcagcatgt cgctcgcaac actcaccatc 300

acggtgtaca tgatcgtcca aggcctcgct cccagcttct ggggttccat gtcagacgcc 360

acaggtagac ggcctgtctt tattggaaca ttcattgttt acctcgtagc caatattgct 420

ctggccgaat ccaagaacta tggtgagctc atggccttcc gagccttgca ggctgctggt 480

agcgcggcca ccatctcaat cggagctgga gtgattggtg atatcacaaa ctcggaagaa 540

agaggtagct tggtgggtat cttcggtgga gttcgcatgc ttggacaggg aatcgggccg 600

gttttcggcg gcattttcac ccagtatctc ggatatcgat ctatcttttg gttcctcacg 660

attgctggag gcgtgagtct cctgtccatt ctggtgcttc ttccggagac attgagacca 720

attgctggaa atggaactgt gaagctcaat ggcattcata agcccttcat ctacacgatc 780

accggccaga cgggggttgt cgagggagcg caaccggaag cgaaaaagac caaaaccagc 840

tggaagtctg tttttgctcc tttgacattc ctcgtcgaaa aggacgtttt catcaccctg 900

ttctttggaa gtatcgtgta cacagtgtgg agcatggtga catccagtac caccgacctc 960

ttcagcgaag tgtacggcct gtcatccctg gacattggac tcactttcct aggcaatggc 1020

tttggatgta tgtctggctc ttatctggtc ggctacctta tggattacaa ccaccgtctt 1080

accgaacgcg aatattgcga gaaacacggt tatccggcag gcacacgtgt caatctgaaa 1140

tcacaccccg acttccccat tgaggtcgcc cggatgcgca atacctggtg ggtgattgcg 1200

atcttcatcg tgacagttgc tttgtacggc gtgtctttgc ggacacatct ggcggtgcct 1260

atcattctgc agtacttcat tgcgttctgc tcaacaggac tcttcaccat caacagcgcc 1320

ctggtcatcg atctttaccc aggtgctagc gccagtgcga cagcagtgaa caatctgatg 1380

cggtgcctgc ttggagctgg cggtgtggct atcgtgcaac ctatcctgga cgccttgaag 1440

ccggattata ctttcctctt gcttgccggc atcaccctcg tgatgactcc gttgctgtac 1500

gtcgaagatc gatggggtcc tggctggcga catgcccgcg aaaggagact caaggccaaa 1560

gccaacggca actag 1575

<210> 4

<211> 524

<212> PRT

<213> cexA基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 4

Met Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Arg Ser Asp Leu Glu Lys Val Pro

1 5 10 15

Val Pro Gln Val Ile Pro Arg Asp Ser Asp Ser Asp Lys Gly Ser Leu

20 25 30

Ser Pro Glu Pro Ser Thr Leu Glu Ala Gln Ser Ser Glu Lys Pro Pro

35 40 45

His His Ile Phe Thr Arg Ser Arg Lys Leu Gln Met Val Cys Ile Val

50 55 60

Ser Leu Ala Ala Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ser Asn Ile Tyr Phe Pro

65 70 75 80

Ala Leu Asp Asp Val Ser Lys Ser Leu Asn Ile Ser Met Ser Leu Ala

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Thr Val Tyr Met Ile Val Gln Gly Leu Ala Pro Ser

100 105 110

Phe Trp Gly Ser Met Ser Asp Ala Thr Gly Arg Arg Pro Val Phe Ile

115 120 125

Gly Thr Phe Ile Val Tyr Leu Val Ala Asn Ile Ala Leu Ala Glu Ser

130 135 140

Lys Asn Tyr Gly Glu Leu Met Ala Phe Arg Ala Leu Gln Ala Ala Gly

145 150 155 160

Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Gly Ala Gly Val Ile Gly Asp Ile Thr

165 170 175

Asn Ser Glu Glu Arg Gly Ser Leu Val Gly Ile Phe Gly Gly Val Arg

180 185 190

Met Leu Gly Gln Gly Ile Gly Pro Val Phe Gly Gly Ile Phe Thr Gln

195 200 205

Tyr Leu Gly Tyr Arg Ser Ile Phe Trp Phe Leu Thr Ile Ala Gly Gly

210 215 220

Val Ser Leu Leu Ser Ile Leu Val Leu Leu Pro Glu Thr Leu Arg Pro

225 230 235 240

Ile Ala Gly Asn Gly Thr Val Lys Leu Asn Gly Ile His Lys Pro Phe

245 250 255

Ile Tyr Thr Ile Thr Gly Gln Thr Gly Val Val Glu Gly Ala Gln Pro

260 265 270

Glu Ala Lys Lys Thr Lys Thr Ser Trp Lys Ser Val Phe Ala Pro Leu

275 280 285

Thr Phe Leu Val Glu Lys Asp Val Phe Ile Thr Leu Phe Phe Gly Ser

290 295 300

Ile Val Tyr Thr Val Trp Ser Met Val Thr Ser Ser Thr Thr Asp Leu

305 310 315 320

Phe Ser Glu Val Tyr Gly Leu Ser Ser Leu Asp Ile Gly Leu Thr Phe

325 330 335

Leu Gly Asn Gly Phe Gly Cys Met Ser Gly Ser Tyr Leu Val Gly Tyr

340 345 350

Leu Met Asp Tyr Asn His Arg Leu Thr Glu Arg Glu Tyr Cys Glu Lys

355 360 365

His Gly Tyr Pro Ala Gly Thr Arg Val Asn Leu Lys Ser His Pro Asp

370 375 380

Phe Pro Ile Glu Val Ala Arg Met Arg Asn Thr Trp Trp Val Ile Ala

385 390 395 400

Ile Phe Ile Val Thr Val Ala Leu Tyr Gly Val Ser Leu Arg Thr His

405 410 415

Leu Ala Val Pro Ile Ile Leu Gln Tyr Phe Ile Ala Phe Cys Ser Thr

420 425 430

Gly Leu Phe Thr Ile Asn Ser Ala Leu Val Ile Asp Leu Tyr Pro Gly

435 440 445

Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ala Val Asn Asn Leu Met Arg Cys Leu Leu

450 455 460

Gly Ala Gly Gly Val Ala Ile Val Gln Pro Ile Leu Asp Ala Leu Lys

465 470 475 480

Pro Asp Tyr Thr Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Thr Leu Val Met Thr

485 490 495

Pro Leu Leu Tyr Val Glu Asp Arg Trp Gly Pro Gly Trp Arg His Ala

500 505 510

Arg Glu Arg Arg Leu Lys Ala Lys Ala Asn Gly Asn

515 520

<210> 5

<211> 1683

<212> DNA

<213> mstC基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 5

atgggtgtct ctaatatgat gtcccggttc aagcctcagg cggaccactc tgagtcctcc 60

actgaggctc ctactcctgc tcgctccaac tccgccgtcg agaaggacaa tgtcttgctc 120

gatgacagtc ccgtcaagta cttgacctgg cgctccttca tcctgggtat cgtcgtgtcc 180

atgggtggtt tcatcttcgg ttactctact ggtcaaatct ctggtttcga gactatggat 240

gacttcctcc aacgtttcgg tcaggaacag gcggatggat cctatgcttt cagcaacgtc 300

cgtagtggtc tcattgtcgg tctgctgtgt atcggtacta tgatcggtgc cctggttgct 360

gctcctatcg cagaccgcat gggccgcaag ctctccatct gtctctggtc tgtcatccac 420

atcgtcggta tcatcattca gattgccacc gactccaact gggtccaggt cgctatgggt 480

cgttgggttg ccggtctggg tgttggtgcc ctctccagca ttgtccccat gtaccagagt 540

gaatctgctc cccgtcaggt ccgtggtgcc atggtcagtg ccttccagct gttcgttgcc 600

ttcggtatct tcatctccta catcatcaac ttcggtaccg agagaatcca gtcgactgct 660

tcctggcgta tcaccatggg cattggcttc gcctggccct tgattctggc tgttggctct 720

ctcttcctgc ccgagtctcc tcgtttcgcc taccgtcagg gtcgtatcga tgaggcccgt 780

gaggttatgt gcaagctgta cggtgtcagc ccgaaccacc gcgtcatcgc ccaggagatg 840

aaggacatga aggacaagct cgacgaggag aaggccgccg gtcaggctgc ctggcacgag 900

ctgttcaccg gccctcgcat gctctaccgt accctgctcg gtattgctct gcagtccctc 960

cagcagctga ccggtgccaa ctttatcttc tactacggaa acagtatctt cacctccact 1020

ggtctgagca acagctacgt cactcagatc attctgggtg ctgtcaactt cggtatgacc 1080

ctgcccggtc tgtacgtcgt cgagcacttc ggtcgtcgta acagtctgat ggttggtgct 1140

gcctggatgt tcatttgctt catgatctgg gcttccgttg gtcacttcgc tctggatctt 1200

gccgaccctc aggccactcc tgccgctggt aaggccatga tcatcttcac ttgcttcttc 1260

attgtcggtt tcgccaccac ctggggtcct atcgtctggg ccatctgtgg tgagatgtac 1320

cccgcccgct accgtgctct ctgcattggt attgccaccg ctgccaactg gacctggaac 1380

ttcctcatct ccttcttcac ccccttcatc tctagctcca ttgacttcgc ctacggctac 1440

gtctttgctg gatgctgttt cgccgccatc ttcgttgtct tcttcttcgt caatgagacc 1500

cagggtcgca ctcttgagga ggttgacacc atgtacgtgc tccacgtcaa gccctggcag 1560

agtgccagct gggttccccc ggagggcatt gtccaggaca tgcaccgccc cccttcctct 1620

tccaagcagg agggtcaggc tgagatggct gagcacaccg agcccactga gctccgcgag 1680

taa 1683

<210> 6

<211> 560

<212> PRT

<213> mstC基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 6

Met Gly Val Ser Asn Met Met Ser Arg Phe Lys Pro Gln Ala Asp His

1 5 10 15

Ser Glu Ser Ser Thr Glu Ala Pro Thr Pro Ala Arg Ser Asn Ser Ala

20 25 30

Val Glu Lys Asp Asn Val Leu Leu Asp Asp Ser Pro Val Lys Tyr Leu

35 40 45

Thr Trp Arg Ser Phe Ile Leu Gly Ile Val Val Ser Met Gly Gly Phe

50 55 60

Ile Phe Gly Tyr Ser Thr Gly Gln Ile Ser Gly Phe Glu Thr Met Asp

65 70 75 80

Asp Phe Leu Gln Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala Asp Gly Ser Tyr Ala

85 90 95

Phe Ser Asn Val Arg Ser Gly Leu Ile Val Gly Leu Leu Cys Ile Gly

100 105 110

Thr Met Ile Gly Ala Leu Val Ala Ala Pro Ile Ala Asp Arg Met Gly

115 120 125

Arg Lys Leu Ser Ile Cys Leu Trp Ser Val Ile His Ile Val Gly Ile

130 135 140

Ile Ile Gln Ile Ala Thr Asp Ser Asn Trp Val Gln Val Ala Met Gly

145 150 155 160

Arg Trp Val Ala Gly Leu Gly Val Gly Ala Leu Ser Ser Ile Val Pro

165 170 175

Met Tyr Gln Ser Glu Ser Ala Pro Arg Gln Val Arg Gly Ala Met Val

180 185 190

Ser Ala Phe Gln Leu Phe Val Ala Phe Gly Ile Phe Ile Ser Tyr Ile

195 200 205

Ile Asn Phe Gly Thr Glu Arg Ile Gln Ser Thr Ala Ser Trp Arg Ile

210 215 220

Thr Met Gly Ile Gly Phe Ala Trp Pro Leu Ile Leu Ala Val Gly Ser

225 230 235 240

Leu Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Phe Ala Tyr Arg Gln Gly Arg Ile

245 250 255

Asp Glu Ala Arg Glu Val Met Cys Lys Leu Tyr Gly Val Ser Pro Asn

260 265 270

His Arg Val Ile Ala Gln Glu Met Lys Asp Met Lys Asp Lys Leu Asp

275 280 285

Glu Glu Lys Ala Ala Gly Gln Ala Ala Trp His Glu Leu Phe Thr Gly

290 295 300

Pro Arg Met Leu Tyr Arg Thr Leu Leu Gly Ile Ala Leu Gln Ser Leu

305 310 315 320

Gln Gln Leu Thr Gly Ala Asn Phe Ile Phe Tyr Tyr Gly Asn Ser Ile

325 330 335

Phe Thr Ser Thr Gly Leu Ser Asn Ser Tyr Val Thr Gln Ile Ile Leu

340 345 350

Gly Ala Val Asn Phe Gly Met Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Val Val Glu

355 360 365

His Phe Gly Arg Arg Asn Ser Leu Met Val Gly Ala Ala Trp Met Phe

370 375 380

Ile Cys Phe Met Ile Trp Ala Ser Val Gly His Phe Ala Leu Asp Leu

385 390 395 400

Ala Asp Pro Gln Ala Thr Pro Ala Ala Gly Lys Ala Met Ile Ile Phe

405 410 415

Thr Cys Phe Phe Ile Val Gly Phe Ala Thr Thr Trp Gly Pro Ile Val

420 425 430

Trp Ala Ile Cys Gly Glu Met Tyr Pro Ala Arg Tyr Arg Ala Leu Cys

435 440 445

Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Asn Trp Thr Trp Asn Phe Leu Ile Ser

450 455 460

Phe Phe Thr Pro Phe Ile Ser Ser Ser Ile Asp Phe Ala Tyr Gly Tyr

465 470 475 480

Val Phe Ala Gly Cys Cys Phe Ala Ala Ile Phe Val Val Phe Phe Phe

485 490 495

Val Asn Glu Thr Gln Gly Arg Thr Leu Glu Glu Val Asp Thr Met Tyr

500 505 510

Val Leu His Val Lys Pro Trp Gln Ser Ala Ser Trp Val Pro Pro Glu

515 520 525

Gly Ile Val Gln Asp Met His Arg Pro Pro Ser Ser Ser Lys Gln Glu

530 535 540

Gly Gln Ala Glu Met Ala Glu His Thr Glu Pro Thr Glu Leu Arg Glu

545 550 555 560

<210> 7

<211> 1473

<212> DNA

<213> hxkA基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 7

atggttggaa tcggtcctaa gcgtcccccc tcccgcaagg gttccatggc cgatgttccc 60

cagaacctct tgcagcagat caaggacttc gaggaccaat tcaccgtcga tcgctccaag 120

ctcaagcaga ttgtcaacca ctttgtcaag gaattggaaa agggtctctc tgtcgagggt 180

ggaaacatcc ctatgaacgt cacctgggtt ctgggattcc ccgatggcga cgaacagggt 240

actttcctcg ccctcgacat gggtggcacc aacctgcgtg tttgtgagat caccctgacc 300

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accggtaccg ccgaggagct gtgggaatac atcgccgact gcctgcagca attcatcgag 420

tcccaccacg agaacgagaa gatctccaag ctgcccctgg gtttcacctt ctcctacccc 480

gccacccagg attacatcga ccacggtgtc ctgcagcgct ggaccaaggg tttcgacatt 540

gatggtgtcg agggccacga cgtcgtcccg ccgttggagg ccatcctgca gaagcgcggc 600

ctgcccatca aggtggctgc actgatcaac gacaccaccg gaaccctcat cgcctcttct 660

tacaccgact ccgacatgaa gatcggctgc atcttcggta ccggtgtcaa cgccgcctac 720

atggagaacg ccggctccat ccccaagctg gctcacatga acctgcccgc cgacatgccc 780

gtggctatca actgcgagta cggtgctttc gacaacgagc acatcgtgct gcctctgacc 840

aagtacgacc acatcatcga ccgcgactcg ccccgtcccg gtcagcaggc cttcgagaag 900

atgaccgccg gtctgtacct gggtgagatc ttccgtctgg ccctgatgga cctggtggag 960

aaccgccccg gcctcatctt caacggccag gacaccacca agctgcgcaa gccctacatc 1020

ctggatgcct ccttcctggc agccatcgag gaggacccct acgagaacct ggaggagacc 1080

gaggagctca tggagcgcga gctcaacatc aaggccaccc cggcggagct ggagatgatc 1140

cgccgcctgg ccgagctgat cggtacgcgt gccgctcgcc tgtcggcctg cggtgttgcc 1200

gccatttgca cgaagaagaa gatcgactcg tgccacgttg gtgccgacgg ctccgtcttc 1260

accaagtacc ctcacttcaa ggcgcgcgga gccaaggctc tgcgcgagat cctggactgg 1320

gctccggagg agcaggacaa ggtgaccatc atggcggccg aggatggatc tggtgtggga 1380

gctgcgctga ttgcggcgct gaccctgaag cgggtcaagg ccggcaacct ggccggtatc 1440

cgaaacatgg ctgacatgaa gaccctgcta taa 1473

<210> 8

<211> 490

<212> PRT

<213> hxkA基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 8

Met Val Gly Ile Gly Pro Lys Arg Pro Pro Ser Arg Lys Gly Ser Met

1 5 10 15

Ala Asp Val Pro Gln Asn Leu Leu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Glu Asp

20 25 30

Gln Phe Thr Val Asp Arg Ser Lys Leu Lys Gln Ile Val Asn His Phe

35 40 45

Val Lys Glu Leu Glu Lys Gly Leu Ser Val Glu Gly Gly Asn Ile Pro

50 55 60

Met Asn Val Thr Trp Val Leu Gly Phe Pro Asp Gly Asp Glu Gln Gly

65 70 75 80

Thr Phe Leu Ala Leu Asp Met Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Cys Glu

85 90 95

Ile Thr Leu Thr Gln Glu Lys Gly Ala Phe Asp Ile Thr Gln Ser Lys

100 105 110

Tyr Arg Met Pro Glu Glu Leu Lys Thr Gly Thr Ala Glu Glu Leu Trp

115 120 125

Glu Tyr Ile Ala Asp Cys Leu Gln Gln Phe Ile Glu Ser His His Glu

130 135 140

Asn Glu Lys Ile Ser Lys Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro

145 150 155 160

Ala Thr Gln Asp Tyr Ile Asp His Gly Val Leu Gln Arg Trp Thr Lys

165 170 175

Gly Phe Asp Ile Asp Gly Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Pro Leu

180 185 190

Glu Ala Ile Leu Gln Lys Arg Gly Leu Pro Ile Lys Val Ala Ala Leu

195 200 205

Ile Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Ile Ala Ser Ser Tyr Thr Asp Ser

210 215 220

Asp Met Lys Ile Gly Cys Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Ala Ala Tyr

225 230 235 240

Met Glu Asn Ala Gly Ser Ile Pro Lys Leu Ala His Met Asn Leu Pro

245 250 255

Ala Asp Met Pro Val Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ala Phe Asp Asn

260 265 270

Glu His Ile Val Leu Pro Leu Thr Lys Tyr Asp His Ile Ile Asp Arg

275 280 285

Asp Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met Thr Ala Gly

290 295 300

Leu Tyr Leu Gly Glu Ile Phe Arg Leu Ala Leu Met Asp Leu Val Glu

305 310 315 320

Asn Arg Pro Gly Leu Ile Phe Asn Gly Gln Asp Thr Thr Lys Leu Arg

325 330 335

Lys Pro Tyr Ile Leu Asp Ala Ser Phe Leu Ala Ala Ile Glu Glu Asp

340 345 350

Pro Tyr Glu Asn Leu Glu Glu Thr Glu Glu Leu Met Glu Arg Glu Leu

355 360 365

Asn Ile Lys Ala Thr Pro Ala Glu Leu Glu Met Ile Arg Arg Leu Ala

370 375 380

Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ser Ala Cys Gly Val Ala

385 390 395 400

Ala Ile Cys Thr Lys Lys Lys Ile Asp Ser Cys His Val Gly Ala Asp

405 410 415

Gly Ser Val Phe Thr Lys Tyr Pro His Phe Lys Ala Arg Gly Ala Lys

420 425 430

Ala Leu Arg Glu Ile Leu Asp Trp Ala Pro Glu Glu Gln Asp Lys Val

435 440 445

Thr Ile Met Ala Ala Glu Asp Gly Ser Gly Val Gly Ala Ala Leu Ile

450 455 460

Ala Ala Leu Thr Leu Lys Arg Val Lys Ala Gly Asn Leu Ala Gly Ile

465 470 475 480

Arg Asn Met Ala Asp Met Lys Thr Leu Leu

485 490

<210> 9

<211> 2352

<212> DNA

<213> pfkA基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 9

atggctcccc cccaagctcc cgtgcaaccg cccaagagac gccgcatcgg tgtcttgacc 60

tctggtggcg atgctcccgg tatgaacggt gtcgtccggg ccgtcgtccg gatggctatc 120

cactccgact gtgaggcttt cgccgtctac gaaggttacg agggtctcgt caatggcggc 180

gacatgatcc gtcagcttca ctgggaggat gttcgcggct ggttgtcccg tggtggtacc 240

ttgatcggtt ccgcccgctg catgaccttc cgtgagcgcc ccggtcgtct gcgggctgcc 300

aagaacatgg tcctccgtgg cattgacgcc cttgtcgtct gtggtggtga tggcagtttg 360

actggtgccg acgtttttcg ttccgagtgg cccggtctgt tgaaggaatt ggtcgagacg 420

ggcgagttga ccgaagagca ggtcaagcca taccagattc tgaacatcgt cggtttggtg 480

ggttcgatcg ataacgacat gtccggcacc gacgccacca tcggttgcta ctcctccctc 540

actcgcatct gtgacgccgt cgacgacgtc ttcgatactg ccttttccca ccagcgtgga 600

ttcgtcattg aggtcatggg tcgtcactgc ggttggctgg ccttgatgtc tgctatcagt 660

accggtgccg actggctgtt cgtgcccgag atgccgccca aggacggatg ggaggatgac 720

atgtgcgcta tcattaccaa gaacagaaag gagcgtggaa agcgtaggac gatcgtcatc 780

gtggccgagg gtgcccagga tcgccatctc aacaagatct cgagttcgaa gatcaaggat 840

attttgacgg agcggttgaa cctggatacc cgtgtgactg tgttgggtca cactcagaga 900

ggtggagccg cctgtgcgta cgaccgctgg ctgtccacac tgcagggtgt cgaggctgtc 960

cgcgcggtgc tggacatgaa gcccgaagcc ccgtccccgg tcatcaccat ccgtgagaac 1020

aagatcttgc gcatgccgtt gatggacgcc gtgcagcaca ccaagactgt caccaagcac 1080

attcagaaca aggagttcgc cgaagccatg gccctccgcg actcggaatt caaagagtac 1140

cacttttcct acatcaacac ttccacgccc gaccacccga agctgctcct cccagagaac 1200

aagagaatgc gcatcggtat tattcacgtt ggcgcccccg ctggtggtat gaaccaggct 1260

acccgcgcgg ccgttgccta ctgcctgact cgtggccaca cccccctggc cattcacaac 1320

ggtttccccg gtctgtgccg gcactatgat gacaccccga tctgctctgt gcgcgaggtg 1380

gcatggcagg aatcggacgc ctgggtcaac gagggtggtt cggatatcgg taccaaccgt 1440

ggtctgcccg gcgatgacct cgcgaccacg gcgaagagct tcaagaagtt cggattcgat 1500

gcgttgttcg tcgtgggtgg atttgaggcg ttcaccgccg tcagccagct tcgccaggcg 1560

cgcgagaagt accccgaatt caagattccc atgaccgtgc tgccggcgac catttccaac 1620

aacgtgccgg gcacagaata ctctctgggt agcgacacct gccttaacac cttgatcgac 1680

ttctgcgacg ccatccgcca gtcggcctcg tcctctcgtc gccgtgtgtt cgtcatcgag 1740

acgcagggtg gcaagtcggg ttacatcgcc acgacggctg gtctgtcggt gggcgcggta 1800

gccgtgtaca ttcccgagga gggcatcgac attaagatgc tggcccgcga cattgacttc 1860

ctgcgtgaca actttgcgcg cgacaaggga gcgaaccgcg ccggtaagat catcctgcgt 1920

aacgagtgcg cgtccagcac gtacacgaca caggtggtgg ccgacatgat caaggaggaa 1980

gccaagggac gtttcgagag tcgtgcggcg gtgccgggac acttccagca gggtggcaag 2040

ccgtcgccga tggaccgtat ccgggcgttg cggatggcca ccaagtgtat gctgcacctg 2100

gagagctatg cgggcaagtc ggcggatgag attgcggccg atgagctgtc tgcgtcggtc 2160

attggtatca agggctcgca ggtgttgttc tcgccgatgg gtggagagac cggcctggag 2220

gcgaccgaga cggactgggc gcgccgtcga cccaagacgg agttctggct ggagctgcag 2280

gacacggtga acattctgtc gggacgggcg agcgtgaaca acgcgacgtg gagttgctat 2340

gagaatgctt aa 2352

<210> 10

<211> 783

<212> PRT

<213> pfkA基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 10

Met Ala Pro Pro Gln Ala Pro Val Gln Pro Pro Lys Arg Arg Arg Ile

1 5 10 15

Gly Val Leu Thr Ser Gly Gly Asp Ala Pro Gly Met Asn Gly Val Val

20 25 30

Arg Ala Val Val Arg Met Ala Ile His Ser Asp Cys Glu Ala Phe Ala

35 40 45

Val Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Leu Val Asn Gly Gly Asp Met Ile Arg

50 55 60

Gln Leu His Trp Glu Asp Val Arg Gly Trp Leu Ser Arg Gly Gly Thr

65 70 75 80

Leu Ile Gly Ser Ala Arg Cys Met Thr Phe Arg Glu Arg Pro Gly Arg

85 90 95

Leu Arg Ala Ala Lys Asn Met Val Leu Arg Gly Ile Asp Ala Leu Val

100 105 110

Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Leu Thr Gly Ala Asp Val Phe Arg Ser

115 120 125

Glu Trp Pro Gly Leu Leu Lys Glu Leu Val Glu Thr Gly Glu Leu Thr

130 135 140

Glu Glu Gln Val Lys Pro Tyr Gln Ile Leu Asn Ile Val Gly Leu Val

145 150 155 160

Gly Ser Ile Asp Asn Asp Met Ser Gly Thr Asp Ala Thr Ile Gly Cys

165 170 175

Tyr Ser Ser Leu Thr Arg Ile Cys Asp Ala Val Asp Asp Val Phe Asp

180 185 190

Thr Ala Phe Ser His Gln Arg Gly Phe Val Ile Glu Val Met Gly Arg

195 200 205

His Cys Gly Trp Leu Ala Leu Met Ser Ala Ile Ser Thr Gly Ala Asp

210 215 220

Trp Leu Phe Val Pro Glu Met Pro Pro Lys Asp Gly Trp Glu Asp Asp

225 230 235 240

Met Cys Ala Ile Ile Thr Lys Asn Arg Lys Glu Arg Gly Lys Arg Arg

245 250 255

Thr Ile Val Ile Val Ala Glu Gly Ala Gln Asp Arg His Leu Asn Lys

260 265 270

Ile Ser Ser Ser Lys Ile Lys Asp Ile Leu Thr Glu Arg Leu Asn Leu

275 280 285

Asp Thr Arg Val Thr Val Leu Gly His Thr Gln Arg Gly Gly Ala Ala

290 295 300

Cys Ala Tyr Asp Arg Trp Leu Ser Thr Leu Gln Gly Val Glu Ala Val

305 310 315 320

Arg Ala Val Leu Asp Met Lys Pro Glu Ala Pro Ser Pro Val Ile Thr

325 330 335

Ile Arg Glu Asn Lys Ile Leu Arg Met Pro Leu Met Asp Ala Val Gln

340 345 350

His Thr Lys Thr Val Thr Lys His Ile Gln Asn Lys Glu Phe Ala Glu

355 360 365

Ala Met Ala Leu Arg Asp Ser Glu Phe Lys Glu Tyr His Phe Ser Tyr

370 375 380

Ile Asn Thr Ser Thr Pro Asp His Pro Lys Leu Leu Leu Pro Glu Asn

385 390 395 400

Lys Arg Met Arg Ile Gly Ile Ile His Val Gly Ala Pro Ala Gly Gly

405 410 415

Met Asn Gln Ala Thr Arg Ala Ala Val Ala Tyr Cys Leu Thr Arg Gly

420 425 430

His Thr Pro Leu Ala Ile His Asn Gly Phe Pro Gly Leu Cys Arg His

435 440 445

Tyr Asp Asp Thr Pro Ile Cys Ser Val Arg Glu Val Ala Trp Gln Glu

450 455 460

Ser Asp Ala Trp Val Asn Glu Gly Gly Ser Asp Ile Gly Thr Asn Arg

465 470 475 480

Gly Leu Pro Gly Asp Asp Leu Ala Thr Thr Ala Lys Ser Phe Lys Lys

485 490 495

Phe Gly Phe Asp Ala Leu Phe Val Val Gly Gly Phe Glu Ala Phe Thr

500 505 510

Ala Val Ser Gln Leu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Tyr Pro Glu Phe Lys

515 520 525

Ile Pro Met Thr Val Leu Pro Ala Thr Ile Ser Asn Asn Val Pro Gly

530 535 540

Thr Glu Tyr Ser Leu Gly Ser Asp Thr Cys Leu Asn Thr Leu Ile Asp

545 550 555 560

Phe Cys Asp Ala Ile Arg Gln Ser Ala Ser Ser Ser Arg Arg Arg Val

565 570 575

Phe Val Ile Glu Thr Gln Gly Gly Lys Ser Gly Tyr Ile Ala Thr Thr

580 585 590

Ala Gly Leu Ser Val Gly Ala Val Ala Val Tyr Ile Pro Glu Glu Gly

595 600 605

Ile Asp Ile Lys Met Leu Ala Arg Asp Ile Asp Phe Leu Arg Asp Asn

610 615 620

Phe Ala Arg Asp Lys Gly Ala Asn Arg Ala Gly Lys Ile Ile Leu Arg

625 630 635 640

Asn Glu Cys Ala Ser Ser Thr Tyr Thr Thr Gln Val Val Ala Asp Met

645 650 655

Ile Lys Glu Glu Ala Lys Gly Arg Phe Glu Ser Arg Ala Ala Val Pro

660 665 670

Gly His Phe Gln Gln Gly Gly Lys Pro Ser Pro Met Asp Arg Ile Arg

675 680 685

Ala Leu Arg Met Ala Thr Lys Cys Met Leu His Leu Glu Ser Tyr Ala

690 695 700

Gly Lys Ser Ala Asp Glu Ile Ala Ala Asp Glu Leu Ser Ala Ser Val

705 710 715 720

Ile Gly Ile Lys Gly Ser Gln Val Leu Phe Ser Pro Met Gly Gly Glu

725 730 735

Thr Gly Leu Glu Ala Thr Glu Thr Asp Trp Ala Arg Arg Arg Pro Lys

740 745 750

Thr Glu Phe Trp Leu Glu Leu Gln Asp Thr Val Asn Ile Leu Ser Gly

755 760 765

Arg Ala Ser Val Asn Asn Ala Thr Trp Ser Cys Tyr Glu Asn Ala

770 775 780

<210> 11

<211> 1593

<212> DNA

<213> mstA基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 11

atggctgaag gcttcgttga cgcctcgcgc gtcgaggccc cagtcaccct caagacctac 60

ttgatgtgtg cctttgcggc ttttggtggt atcttcttcg gttatgactc tggttatatc 120

agcggtgtca tgggaatgag atacttcatc gaggagtttg agggcttgga ctataacact 180

acccccaccg attccttcgt cctcccgtcc tggaaaaaat cgttgatcac gtcgatcctc 240

tcggctggaa ccttctttgg tgccctcatt gctggtgact tggcagactg gttcggtcgt 300

cgcactacca ttgtcagtgg ttgtgttgtc ttcatcgttg gtgttatcct gcagaccgct 360

tcgacctcct tgggtctgct tgttgccggc cgtctggtcg cgggatttgg tgtgggcttc 420

gtctccgcca tcattatcct gtacatgtct gagattgcac ctcgcaaggt tcgcggtgct 480

attgtctcag ggtaccagtt ctgcatcacc atcgggctca tgttggcctc gtgcgtcgac 540

tacggcactg agaaccgtct cgactctggc tcctaccgta tcccaatcgg cctccagctc 600

gcctgggcct tgatcctggg aggtggtctg ctctgcctgc ccgagtcccc tcgttacttt 660

gttaaaaagg gcgacctggc taaggctgcg gaggttcttg cccgcgttcg tggtcaaccc 720

caagactcgg attatatcaa ggatgagctg gcggagattg tggcaaatca tgagtacgag 780

atgcaggtga ttccggaagg tggatatttc gtcagctgga tgaactgctt ccgtggcagt 840

atattctcgc ccaacagcaa tctccgtcgg actgtcctag gtacttctct gcagatgatg 900

caacagtgga ccggtgtcaa ctttgtcttc tactttggaa cgaccttttt ccagtcgctg 960

ggaaccatcg atgacccctt cctcatcagc atgattacca ctatcgtcaa cgtctgctcg 1020

acccccgtct cgttctacac aattgagaag tttggccgcc gttcgctcct tttgtgggga 1080

gcacttggta tggtcatctg ccagttcatt gtcgctatcg tcggcaccgt ggacggtagc 1140

aataagcacg ctgtcagtgc agagatttct ttcatctgca tttacatctt cttctttgct 1200

agcacgtggg gcccgggcgc ctgggttgtg attggcgaga ttttccccct acctattcgg 1260

tcgcgtggtg tggctctgtc gacggcatcg aactggctgt ggaattgcat catcgctgtc 1320

atcacccctt acatggtcga caaggacaag ggtgacttga aggccaaggt gttcttcatc 1380

tggggctcgc tgtgtgcctg cgcttttgtc tacacgtact tcctaattcc ggagaccaag 1440

ggtcttactc ttgagcaggt ggacaagatg atggaagaga ccacgcctcg cacctcagcc 1500

aagtggactc cacatggcac cttcacggcc gagatgggtc ttactgcgaa tgccgtggcc 1560

gaaaaggcta ctgcggttca ccaggaggtg tga 1593

<210> 12

<211> 530

<212> PRT

<213> mstA基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 12

Met Ala Glu Gly Phe Val Asp Ala Ser Arg Val Glu Ala Pro Val Thr

1 5 10 15

Leu Lys Thr Tyr Leu Met Cys Ala Phe Ala Ala Phe Gly Gly Ile Phe

20 25 30

Phe Gly Tyr Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gly Val Met Gly Met Arg Tyr

35 40 45

Phe Ile Glu Glu Phe Glu Gly Leu Asp Tyr Asn Thr Thr Pro Thr Asp

50 55 60

Ser Phe Val Leu Pro Ser Trp Lys Lys Ser Leu Ile Thr Ser Ile Leu

65 70 75 80

Ser Ala Gly Thr Phe Phe Gly Ala Leu Ile Ala Gly Asp Leu Ala Asp

85 90 95

Trp Phe Gly Arg Arg Thr Thr Ile Val Ser Gly Cys Val Val Phe Ile

100 105 110

Val Gly Val Ile Leu Gln Thr Ala Ser Thr Ser Leu Gly Leu Leu Val

115 120 125

Ala Gly Arg Leu Val Ala Gly Phe Gly Val Gly Phe Val Ser Ala Ile

130 135 140

Ile Ile Leu Tyr Met Ser Glu Ile Ala Pro Arg Lys Val Arg Gly Ala

145 150 155 160

Ile Val Ser Gly Tyr Gln Phe Cys Ile Thr Ile Gly Leu Met Leu Ala

165 170 175

Ser Cys Val Asp Tyr Gly Thr Glu Asn Arg Leu Asp Ser Gly Ser Tyr

180 185 190

Arg Ile Pro Ile Gly Leu Gln Leu Ala Trp Ala Leu Ile Leu Gly Gly

195 200 205

Gly Leu Leu Cys Leu Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Phe Val Lys Lys Gly

210 215 220

Asp Leu Ala Lys Ala Ala Glu Val Leu Ala Arg Val Arg Gly Gln Pro

225 230 235 240

Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Lys Asp Glu Leu Ala Glu Ile Val Ala Asn

245 250 255

His Glu Tyr Glu Met Gln Val Ile Pro Glu Gly Gly Tyr Phe Val Ser

260 265 270

Trp Met Asn Cys Phe Arg Gly Ser Ile Phe Ser Pro Asn Ser Asn Leu

275 280 285

Arg Arg Thr Val Leu Gly Thr Ser Leu Gln Met Met Gln Gln Trp Thr

290 295 300

Gly Val Asn Phe Val Phe Tyr Phe Gly Thr Thr Phe Phe Gln Ser Leu

305 310 315 320

Gly Thr Ile Asp Asp Pro Phe Leu Ile Ser Met Ile Thr Thr Ile Val

325 330 335

Asn Val Cys Ser Thr Pro Val Ser Phe Tyr Thr Ile Glu Lys Phe Gly

340 345 350

Arg Arg Ser Leu Leu Leu Trp Gly Ala Leu Gly Met Val Ile Cys Gln

355 360 365

Phe Ile Val Ala Ile Val Gly Thr Val Asp Gly Ser Asn Lys His Ala

370 375 380

Val Ser Ala Glu Ile Ser Phe Ile Cys Ile Tyr Ile Phe Phe Phe Ala

385 390 395 400

Ser Thr Trp Gly Pro Gly Ala Trp Val Val Ile Gly Glu Ile Phe Pro

405 410 415

Leu Pro Ile Arg Ser Arg Gly Val Ala Leu Ser Thr Ala Ser Asn Trp

420 425 430

Leu Trp Asn Cys Ile Ile Ala Val Ile Thr Pro Tyr Met Val Asp Lys

435 440 445

Asp Lys Gly Asp Leu Lys Ala Lys Val Phe Phe Ile Trp Gly Ser Leu

450 455 460

Cys Ala Cys Ala Phe Val Tyr Thr Tyr Phe Leu Ile Pro Glu Thr Lys

465 470 475 480

Gly Leu Thr Leu Glu Gln Val Asp Lys Met Met Glu Glu Thr Thr Pro

485 490 495

Arg Thr Ser Ala Lys Trp Thr Pro His Gly Thr Phe Thr Ala Glu Met

500 505 510

Gly Leu Thr Ala Asn Ala Val Ala Glu Lys Ala Thr Ala Val His Gln

515 520 525

Glu Val

530

<210> 13

<211> 438

<212> DNA

<213> vgb基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 13

atgctggatc agcagaccat caacatcatc aaggccaccg tccccgtcct gaaggagcac 60

ggtgtcacta ttaccaccac cttctacaag aacctgttcg ccaagcaccc cgaggtccgc 120

cctttgtttg atatgggccg ccaggagtcc ctggagcagc ctaaagctct ggctatgacc 180

gtcctggctg ctgctcaaaa tatcgagaac ctgcccgcta ttctgcccgc cgtcaaaaag 240

atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtt gccgctgctc attatcctat tgtcggtcag 300

gagctgctgg gcgccattaa ggaagtcctg ggcgatgccg ccaccgatga tatcctggat 360

gcctggggca aggcctacgg cgttattgcc gatgtcttta tccaggtcga ggccgatctg 420

tacgcccagg ccgttgaa 438

<210> 14

<211> 146

<212> PRT

<213> vgb基因的氨基酸序列(Unknown)

<400> 14

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> PoahA-L-F(Unknown)

<400> 15

cggaattcga gccctggcag tctatcgg 28

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> PoahA-L-R(Unknown)

<400> 16

cgggatccag aaagaggctt gtttgagact gat 33

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> PoahA-R-F(Unknown)

<400> 17

ggactagttt tgtttcaccc agcagaacct ta 32

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> PoahA-R-R(Unknown)

<400> 18

cccaagctta tcggcaagga gcgtcgtct 29

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> PcexA-F(Unknown)

<400> 19

cacatctaaa caatggaatt catgtcttca accacgtctt cat 43

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> PcexA-R(Unknown)

<400> 20

agtggatccc tgcagggtac cctagttgcc gttggctttg g 41

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> PmstC-F(Unknown)

<400> 21

tcatccgtca agatggaatt catgggtgtc tctaatatga tgtcccggtt 50

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> PmstC-R(Unknown)

<400> 22

tctgcagggt accgagctct tactcgcgga gctcagtggg c 41

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> PhxkA-F(Unknown)

<400> 23

cgtcaagatg gaattgaatt catggttgga atcggtccta agc 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> PhxkA-R(Unknown)

<400> 24

gcagggtacc gagctgagct cttatagcag ggtcttcatg tca 43

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> PpfkA-F(Unknown)

<400> 25

taaacaatgg aattcgagct catggctccc ccccaagct 39

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> PpfkA-R(Unknown)

<400> 26

tcagtaacgt taagtggatc cttaagcatt ctcatagcaa ctc 43

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> P2968(Unknown)

<400> 27

atggagaaac tcgaggaatt cgagactagt ggactaacat tattc 45

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> P2969(Unknown)

<400> 28

attatacgaa gttatggatc cgtctagaaa gaaggattac ctc 43

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> P2970(Unknown)

<400> 29

tattctagaa ctagtgggcc catggaagag aaaacctccg 40

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> P2971(Unknown)

<400> 30

cttgcatgcc tgcaggggcc cggattacct ctaaacaagt g 41

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> PmstA-F(Unknown)

<400> 31

cgtcaagatg gaattgaatt catggctgaa ggcttcgttg ac 42

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> PmstA-R(Unknown)

<400> 32

gcagggtacc gagctgagct ctcacacctc ctggtgaacc gc 42

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> Pvgb-L(Unknown)

<400> 33

cacatctaaa caatggaatt catgctggat cagcagacca tc 42

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Pvgb-R(Unknown)

<400> 34

tcagtaacgt taagtggatc cttattcaac ggcctgggc 39

<210> 35

<211> 46

<212> DNA

<213> Pvgb/oe-p1(Unknown)

<400> 35

gctatacgaa gttataagct tgagactagt ggactaacat tattcc 46

<210> 36

<211> 44

<212> DNA

<213> Pvgb/oe-p2(Unknown)

<400> 36

acgacggcca gtgccaagct tgtctagaaa gaaggattac ctct 44

Claims (4)

1.一种高产柠檬酸的黑曲霉菌株（Aspergillus niger），其特征在于：所述菌株是通过在黑曲霉中敲除敲除草酰乙酸水解酶基因oahA，单独或共同强化表达柠檬酸转运蛋白编码基因cexA、单独或共同强化表达葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC、单独或共同强化表达己糖激酶基因hxkA，单独或共同强化表达磷酸果糖激酶基因pfkA、单独或共同强化表达葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA，单独或共同强化表达透明颤菌血红蛋白编码基因vgb而获得的；

所述柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA的DNA序列为SEQ NO. 3，其氨基酸序列为SEQ NO.4；

或者，所述葡萄糖低亲和力转运蛋白基因mstC的DNA序列为SEQ NO. 5，其氨基酸序列为SEQ NO. 6；

所述己糖激酶基因hxkA的DNA序列为SEQ NO. 7，其氨基酸序列为SEQ NO. 8；

所述磷酸果糖激酶基因pfkA的DNA序列为SEQ NO. 9，其氨基酸序列为SEQ NO. 10；

所述葡萄糖高亲和力转运蛋白基因mstA的DNA序列为SEQ NO. 11，其氨基酸序列为SEQNO. 12；

或者，所述透明颤菌血红蛋白编码基因vgb的DNA序列为SEQ NO. 13，其氨基酸序列为SEQ NO. 14；

生产柠檬酸的黑曲霉的出发菌株为黑曲霉S469；

或者，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA；

或者，敲除草酰乙酸水解酶编码基因oahA是利用oahA基因上下游同源序列，通过同源重组的方式将oahA基因表达盒从基因组中删除；

所述oahA基因上下游同源序列片段序列分别为SEQNO.1、SEQNO.2。

2.如权利要求1所述的高产柠檬酸的黑曲霉菌株在柠檬酸发酵生产中的应用。

3.利用如权利要求1所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：步骤如下：

将黑曲霉菌株接种在能够使黑曲霉产孢子的培养基上，在0~45℃条件下培养，直至产生新鲜孢子；

收集孢子，以1×10⁵~2×10⁶个/mL的孢子浓度接种于种子培养基，然后进行种子液的培养，种子液的培养条件是：10~45℃，100~350rpm条件下振荡培养0~30 h，得到种子液；

将种子液以0~15%的接种量接种至发酵培养基中，在0~35℃，100~350rpm条件下发酵，即得柠檬酸；

其中，种子培养基的配方是：0%~55%玉米淀粉浊液，0%~10% (NH₄)₂SO₄，溶剂为水；

所述发酵培养基为：0%~85%玉米淀粉清液，0%~50%玉米淀粉浊液，溶剂为水；

上述百分数均为质量百分数。

4.根据权利要求3所述的黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述能够使黑曲霉产孢子的培养基为PDA培养平板。