CN114231599A

CN114231599A - 基于金属-dna配位的杂化纳米球及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114231599A
Application number: CN202010940431.1A
Authority: CN
Inventors: 欧阳津; 贾轶静; 那娜
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN114231599B

Abstract

本发明公开了一种基于金属‑DNA配位的杂化纳米球及其制备方法与应用。本发明杂化纳米球NWs的制备方法，包括：1)设计并合成能够特异性识别靶标microRNA的两个HCR发夹探针，记为探针H1、探针H2；2)将所述探针H1和所述探针H2在HEPES缓冲液中分别进行退火；3)将步骤2)中退火后的探针H1和探针H2的HEPES缓冲液分别用水稀释，然后混合得到混合体系，将所述混合体系与含Zn离子的溶液经涡旋混合，得到混合物，将其静置后离心，收集沉淀物即得到杂化纳米球NWs。该方法构建的基于金属‑DNA配位的高效靶向递送平台，提供了广泛适用的方法用于细胞内低丰度核酸的可视化检测和基因表达水平的评估，表明其作为纳米载体在生物学研究和疾病诊断领域具有巨大的应用潜力。

Description

基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法与应用，具体涉及一种基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法和其在原位杂交检测microRNA方面的应用，属于生物化学领域。

背景技术

金属-配体配位化学在开发高效、功能性纳米材料用于生物传感和生物成像方面显示出巨大的潜力，为医学诊断的作用机制和靶向治疗提供了新思路。作为遗传材料，DNA分子由于其良好的生物相容性、可编程性和热力学稳定性，已成为材料科学和纳米技术领域中分子机器设计的优良底物。最近，金属-DNA配位驱动自组装被证明是合成具有特定的形态功能性DNA纳米结构的有效策略。随着功能DNA纳米材料的研究发展，细胞微环境响应型仿生纳米平台已被设计为小分子药物、生物大分子的纳米递送载体，这对于生物学研究以及疾病诊断和治疗具有重要意义。开发简单、通用的策略设计合成功能DNA纳米结构，用于细胞内生物标志物的靶向检测和成像成为精密纳米医学和药物输送系统的研究热点。

microRNA(又称miRNA)是一类大小约19-25个核苷酸(nt)的内源性非蛋白编码调控单链小分子RNA，具有高度保守性，一般来源于染色体的非编码区域，能够调节基因合成以及其他重要的生物功能，在肿瘤的早期诊断，代谢性疾病筛查，基因调控等方面都有着重要的作用。但由于miRNA序列短，同源序列间相似度高以及表达量少，致使单个细胞中miRNA原位成像及精准检测面临挑战。目前，无酶扩增策略，特别是杂交链式反应(HCR)，由于其操作简单、扩增效率高、无需酶介导等优点，已广泛用于细胞内多种分析物检测。因此，利用HCR恒温无酶扩增策略将可编程的DNA自组装和细胞内扩增检测有效结合，实现细胞内基因传递和目标miRNA原位成像对于拓展DNA纳米材料在生化分析领域的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法与应用，具体提供一种基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法和其在原位杂交检测microRNA方面的应用。

第一方面，本发明要求保护一种基于金属-DNA配位的杂化纳米球的制备方法。

本发明所要求保护的基于金属-DNA配位的杂化纳米球(英文名称为nano-wireballs，简称NWs)的制备方法，可包括如下步骤：1)设计并合成能够特异性识别靶标miRNA-21的两个HCR发夹探针，记为探针H1、探针H2；

2)将所述探针H1和所述探针H2在HEPES缓冲液中分别进行退火；

3)将步骤2)中退火后的所述探针H1和所述探针H2的HEPES缓冲液分别用水稀释，然后混合得到混合体系，将所述混合体系与含Zn离子的溶液经涡旋混合，得到混合物，将其静置后离心，收集沉淀物即得到杂化纳米球NWs。

进一步地，所述HEPES缓冲液浓度可为10mM，通过HEPES溶解于100mM NaCl和20mMMgCl₂配制而成，其pH值可为7.2。

进一步地，所述探针H1和所述探针H2在所述HEPES缓冲液中浓度均可为10μM。

进一步地，步骤2)中所述退火是通过如下实现的：分别加热含有所述探针H1的HEPES缓冲液和含有所述探针H2的HEPES缓冲液至其变性后自然冷却。

所述加热至变性的反应温度可为95℃，时间可为5～10分钟，具体可为5分钟。

进一步地，所述冷却后温度为室温，所述冷却的时间可为2～4小时，具体可为2小时。

本发明中，所述室温为本领域中公知的常识，具体可为10～30℃。

进一步地，所述步骤3)中所述混合体系中所述探针H1和所述探针H2的浓度分别可为2.5μM。

进一步地，所述含Zn离子的溶液中Zn离子的浓度为4mM。

进一步地，所述混合体系中所含探针H1和所述探针H2的总量与所述含Zn离子的溶液中Zn离子的摩尔比为1:42。

进一步地，所述含Zn离子的溶液为ZnCl₂溶液，其具体可为无水ZnCl₂(99.95％)配制成的ZnCl₂水溶液。

进一步地，所述涡旋的时间可为20～30s，具体可为20s。

进一步地，所述静置的温度可为95℃，时间可为3小时。

进一步地，所述离心的离心力为10919g～17744g，具体可为17744g或13648g～17744g，上述离心力对应的所述离心的速率可为8000～13000rpm，具体可为13000rpm或10000～13000rpm；时间可为15～25分钟，具体可为15分钟或15～20分钟。

进一步地，步骤3)中所述离心后还包括将所述沉淀物用水清洗2～3次的步骤，具体可采用去离子水清洗。

进一步地，步骤3)之后还包括将所述杂化纳米球NWs分散在水中储存备用的步骤，具体可分散在去离子水中。

进一步地，所述探针H2的茎环结构中标记有荧光基团和荧光淬灭基团。

更进一步地，所述荧光基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

在本发明的具体实施方式中，所述靶标microRNA具体为miRNA-21(miR-21)。

相应的，所述探针H1的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.1所示；所述探针H2的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明要求保护利用前文所述的制备方法制备得到的所述杂化纳米球NWs。

在第一方面和第二方面中，所述杂化纳米球NWs的粒径具体可为30～100nm。

第三方面，本发明要求保护前文所述杂化纳米球NWs在如下任一中的应用：

(a1)对所述靶标microRNA进行原位杂交检测；

(a2)制备用于诊断或辅助诊断表达所述靶标microRNA的肿瘤的产品。

其中，(a1)所述应用即可为非疾病诊断治疗性应用，也可为疾病诊断治疗性应用。

在本发明的具体实施方式中，所述检测为细胞水平检测。

第四方面，本发明要求保护用于检测miRNA-21的HCR发夹探针。

本发明所要求保护的用于检测miRNA-21的HCR发夹探针，由前文所述的探针H1(SEQ ID No.1)和所述的探针H2(SEQ ID No.2)组成；

第五方面，本发明要求保护前文所述用于检测miRNA-21的HCR发夹探针在制备前文所述的杂化纳米球NWs中的应用。

本发明涉及一种基于金属-DNA配位自组装纳米材料，结合稳定的HCR恒温扩增策略，发展了活细胞内miRNA-21的原位、高灵敏、高特异性成像检测技术(见图13和图14)。包括1)杂化纳米球NWs的合成方法：体系中两种HCR可编程的能够特异性识别miRNA-21的发夹探针(H1，H2)，和Zn离子通过一锅法反应制备出具有较大的比表面积、良好生物相容性、低毒性以及高效的装载能力的功能化杂化纳米球NWs；2)杂化纳米球NWs用于原位杂交检测microRNA的方案设计：当癌细胞内靶标miRNA-21出现，捕获探针H1与靶标序列特异性杂交，使H1序列的茎环打开，暴露立足点区域，引发两种发夹序列H1、H2交替杂交形成双螺旋结构，释放出原先被猝灭H2上的FAM荧光基团，实现信号增强富集。因此，增加的FAM荧光强度可实现活细胞中miRNA的灵敏检测，为实现核酸递送和低丰度的生物标志物成像提供了有价值的平台。本发明发展了活细胞内miRNA-21的原位、高灵敏、高特异性成像检测技术；由于良好的稳定性、高效的封装能力、优越的生物相容性、以及合成策略的简单性和通用性，该传递系统通过将核酸试剂有效地传递至靶细胞，引发细胞内杂交链反应的信号放大，从而实现了活细胞内miRNA-21的高特异性原位成像，并且可以有效区分不同活细胞中miRNA-21表达水平的差异。该方法构建的基于金属-DNA配位的高效靶向递送平台，提供了广泛适用的方法用于细胞内低丰度核酸的可视化检测和基因表达水平的评估，表明其作为纳米载体在生物学研究和疾病诊断领域具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1为本发明H1和H2的理想发夹结构和热动力学参数。

图2为本发明杂化纳米球NWs的Zeta电势。

图3为本发明杂化纳米球NWs的表征；图3中A为SEM图像；B为TEM图像；C为DLS数据；D为HAADF-STEM图像以及相对应的元素分布图；E为紫外可见吸收图；F为红外光谱图。

图4为本发明基于NWs-HCR方法检测miR-21-DNA；图4中A不同浓度的靶标miR-21-DNA对应的体外荧光光谱；B荧光信号与靶标miR-21-DNA浓度对数(lg值)的线性关系。误差线代表三个独立测量值的标准偏差。

图5为本发明扩增产物的4％琼脂糖凝胶电泳分析和体外FL对不同浓度的miR-21的反应。图5中A为扩增产物的4％琼脂糖凝胶电泳分析，泳道M：DNA marker；泳道1：400nMH1；泳道2：400nM H2；泳道3：400nM H1和400nM H2混合物；泳道4：200nM H1和200nM H2混合物；泳道5：100nM靶标miR-21与400nM H1和400nM H2混合物传统HCR杂交反应；泳道6：100nM靶标miR-21与400nM NWs的HCR杂交反应；B为体外FL对不同浓度的miR-21的反应，浓度分别为：0,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM,10nM和50nM。插图是荧光信号与靶标miR-21浓度对数(lg值)之间的线性关系，误差线代表三个独立测量的标准偏差。

图6为该策略用于miR-21和其他干扰物质的选择性验证和10％人实际血清中不同浓度靶标miR-21的荧光数据图。图6中A为该策略用于miR-21和其他干扰物质的选择性验证，误差线代表三个独立测量的标准偏差；B为10％人实际血清中不同浓度靶标miR-21的荧光数据图。

图7为NWs-HCR方法的特异性验证。

图8为NWs对HepG2细胞的毒性检测，误差线代表三个独立测量值的标准偏差。

图9为HepG2细胞内对不同浓度靶标扩增的荧光成像图，比例尺＝20μm。

图10为NWs与HepG2细胞共同培养不同的时间后的共聚焦荧光显微镜图片，比例尺＝20μm。

图11为通过共聚焦荧光显微镜基于NWs成像系统对细胞内miR-21荧光成像检测分析；图11中A为HepG2细胞成像；B为miR-21寡核苷酸抑制剂处理的HepG2细胞成像。比例尺＝20μm。

图12为细胞内miR-21荧光成像检测。图12中A为基于NWs成像系统处理HepG2细胞；B为游离的H1+H2处理HepG2细胞；C为基于NWs成像系统处理CCC-HEL-1细胞；D为游离的H1+H2处理CCC-HEL-1细胞，比例尺＝20μm。

图13为本发明中机理图，其中图13中A为NWs合成的示意图；B为HCR的详细说明。

图14为本发明基于NWs的活细胞中miR-21成像的机理示意图，其中FAM和BHQ1荧光团分别由多边形和球表示。

具体实施方式

本发明的技术方案(图13和图14)包括：

(1)杂化纳米球NWs的合成：设计两种HCR可编程的能够特异性识别miRNA-21的发夹探针(H1，H2)，和Zn离子通过一锅法反应制备出具有较大的比表面积、良好生物相容性、细胞内传递高效、低毒性以及高效的装载能力的功能化杂化纳米球NWs。

(2)自组装纳米球NWs用于细胞中原位杂交检测microRNA：当癌细胞内靶标miRNA-21出现，捕获探针H1与靶标序列特异性杂交，使H1序列的茎环打开，暴露立足点区域，引发两种发夹序列H1、H2交替杂交形成双螺旋结构，释放出原先被猝灭H2上的FAM荧光基团，实现信号增强富集，实现活细胞中miRNA的灵敏原位成像检测。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、自组装杂化纳米球(NWs)的合成

本发明自行设计了针对miRNA-21的两条发夹型探针H1和H2(其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)。探针H2的茎环结构中标记有荧光基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。

探针H1：5′-ATCAGACTGATGTTGATAGGTCTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′

探针H2：5′-GACCTATCAACATC-FAM-AGTCTGATTAGCTTATCAGACT-BHQ1-GATGTTGA-3′。

其中，H1包括S，T2′，S′和立足点T1四个部分，其中S和S′有16对碱基互补成双链作为H1的茎部，T2′为发夹结构的环部，T1为在发夹结构茎部延伸出的单链粘性末端，即立足点区域；H2包括T2，S′，T1′和S四个部分。其设计和H1相似，S，T1，T2可分别与S′，T1′，T2′互补。其中，信号探针H2用5-羧基荧光素(FAM)染料标记，该染料通过黑洞淬灭剂(BHQ1)淬灭，因此，没有引发链的情况下荧光背景信号非常低。当靶标miRNA-21不存在时，虽然H1和H2中有部分链可以互补，但由于H1和H2分别形成茎环，二者在溶液中均能稳定存在，不会相互杂交而彼此打开；当加入靶标miRNA-21时，首先与H1茎部的粘性末端T1立足点区域特异性杂交，使H1的茎环结构打开，作为引发链，暴露出ST2′单链，打开H2的发夹结构，FAM荧光团立即与BHQ1淬灭剂分离，荧光恢复。接着暴露出与H1互补的T1′S，可以继续打开H1，依次循环往复。H1和H2在引发链引导杂交反应后，陆续打开发夹H1和H2，形成由H1和H2交替杂交形成的长链带缺口的双链DNA聚合物。

将每种功能性的发夹型探针H1，H2分别在HEPES缓冲液(10mM，100mM NaCl，20mMMgCl₂，pH 7.2)中稀释至10μM，加热至95℃，反应5分钟，然后冷却至室温(25℃)2小时。该步骤的目的是为了使探针H1和H2分别退火形成各自的颈环结构。

然后在1.5mL离心管中，将上述退火的10μM探针H1和H2的HEPES缓冲液分别用水稀释，稀释为5μM探针H1和H2的水溶液，然后取285μL 5μM探针H1的水溶液和285μL 5μM探针H2的水溶液混合得到混合体系(即含2.5μM H1和2.5μM H2的水溶液)。将30μL 4mM ZnCl₂溶液添加到570μL含2.5μM H1和2.5μM H2的水溶液中(即Zn离子与所含探针H1和探针H2的总量的摩尔比为42)。涡旋20s后，将混合物保持在95℃。静置3小时后，将所得溶液以13000rpm(离心机型号是湖南恒诺小型台式高速离心机3-18N，换算比例为18500rpm对应25250g，即13000rpm为17743g)离心15分钟，并用去离子水洗涤两次。最后将收集到的杂化纳米球NWs重新分散在去离子水中，储存备用。

本实验设计合成的两种HCR可编程的能够特异性识别miRNA-21的发夹探针(H1，H2)的理想发夹结构和热动力学参数见图1。Zeta电位测量表明，NWs的表面电势为-24.9mV(图2)。为了验证NWs的成功合成，对其进行形态表征。如图3中A-B所示，通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)可以清楚地观察到平均直径约为52±3nm的均匀球形NWs。结果与图3中C中NWs的动态光散射(DLS)测量结果一致。此外，EDS谱图证实了核酸中的磷和氮以及Zn离子在NWs中的均匀分布(图3中D)。UV-vis吸收光谱(图3中E)中DNA特征吸收峰移至275nm左右，表明DNA已成功封装到NWs结构中。如图3中F所示，傅立叶红外(FTIR)光谱显示DNA中主链磷酸酯基团的特征性不对称拉伸振动从1213cm^-1移至1194cm^-1，表明通过锌离子与DNA配位作用成功合成了本发明基于金属-DNA配位的杂化纳米球(NWs)。

实施例2、体外荧光光谱实验

miR-21触发的HCR策略通过体外荧光分析验证。基于NWs的HCR反应在HEPES缓冲液(10mM，100mM NaCl，20mM MgCl₂，pH 7.2)中进行。将不同浓度的靶标miR-21加入200nM本发明实施例1中制备的基于金属-DNA配位的杂化纳米球NWs混合溶液(浓度以所含探针H1和探针H2的总量计)中，在HEPES缓冲液中于37℃引发DNA自组装HCR反应2h。在室温下，以490nm的固定激发，520nm的固定发射波长下监测每个样品的荧光光谱。选择性验证实验中，使用其他miRNAs代替靶标miR-21。

本实验通过与靶标miR-21对应的miR-21-DNA序列(SEQ ID No.3)来验证NWs-HCR对不同类型靶标的检测能力。以不同浓度miR-21-DNA为靶标，应用NWs-HCR进行体外扩增，反应结束后采集FL信号，发现信号强度随miR-21-DNA浓度的增加而增加(图4)，且显示了良好的线性关系，R²＝0.9866，检测限能达到27.8fM。

实施例3、凝胶电泳验证

扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：HCR扩增子本发明实施例1中制备的杂化纳米球NWs(400nM，浓度以所含探针H1和探针H2的总量计)和靶标miR-21(T1，100nM)的凝胶电泳样品在HEPES缓冲液中于37℃孵育2h。然后将10μL这些样品与2μL上样缓冲液混匀，并上样到4％琼脂糖凝胶中。在室温下，在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA，pH 8.0-8.4)中以120V的恒定电位进行电泳50分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统(Vilber Lourmat，法国)对凝胶进行拍照。

本实验采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物进一步验证miR-21的体外检测的可行性。图5中A电泳实验结果表明使用两个DNA探针H1和H2(传统HCR)或H1和H2自组装形成的NWs(本发明基于NWs的HCR)，与靶标反应均形成明亮条带，证明了基于NWs的HCR的成功运行，并具有预期的有效信号放大效果。可行性得到验证后，如图5中B所示，对不同浓度的靶标miR-21(100fM～10nM)进行了体外荧光检测。FL值与靶标浓度的对数(lg)值呈线性关系，R²＝0.9941，检测限约为83.6fM。此外，在人血清等复杂生物环境下也有着良好的检测效果。该方法能够特异性识别靶标miR-21，当发生单碱基错配时，荧光信号明显减弱，成功用于单碱基突变的检测，表现出高特异性和良好的选择性(图6，图7)。

实施例4、细胞培养

实验中使用了HepG2细胞和CCC-HEL-1细胞。将这两种细胞系在含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的培养皿中培养，并在37℃的含5％CO₂的恒温箱中生长。

实施例5、体外细胞毒性测定

标准的CCK-8实验分析用于评估HepG2细胞毒性。对于CCK-8实验分析，将HepG2细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种在96孔板中，并在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37℃和5％CO₂下培养12小时。然后，小心地弃去DMEM培养基，并用PBS洗涤HepG2细胞3次。加入含有不同浓度本发明实施例1中制备的杂化纳米球NWs(浓度以所含探针H1和探针H2的总量计)的新鲜细胞培养基，共同孵育24小时后，用PBS洗涤洗涤HepG2细胞。再加入100μL含10％CCK-8的新鲜培养基，孵育2小时后，使用酶标仪在450nm处测量吸光度。

本实验采用标准CCK-8实验，证明浓度为1～200μg/mL的NWs与HepG2细胞孵化24h后，细胞存活率超过87％(图8)。为了优化NWs的浓度，我们将HepG2细胞与浓度范围为50～100μg/mL的NWs于37℃和5％CO₂下孵育2h，然后通过激光扫描共聚焦显微镜获得细胞图像(图9)，证实了在活细胞中基于NWs的荧光传感系统具有出色的成像能力。此外，将HepG2细胞与NWs于37℃和5％CO₂下孵育不同时间(1h，2h和4h)，以优化NW与细胞的孵育时间(图10)。通过优化NWs浓度和在该系统中的孵育时间，间接证明了NWs荧光成像提高了细胞内扩增效率，这与先前的荧光实验结果吻合。基于自组装NWs策略实现共聚焦成像响应和有效的胞质递送，为活细胞中miR-21超灵敏成像的提供了有力的可能性。

实施例6、细胞摄取测定和成像分析

将HepG2细胞接种在含1mL DMEM培养基的共聚焦显微镜培养皿中，于37℃和5％CO₂下孵育24小时后，小心除去培养基，加入500μL含有400nM本发明实施例1中制备的杂化纳米球NWs(浓度以所含探针H1和探针H2的总量计)的新鲜DMEM培养基，分别孵育预定时间后，将细胞用PBS洗涤3次，以去除未内在化的纳米颗粒。

然后，将细胞与Hoechst 33342在37℃下孵育20分钟，以进行细胞核复染。随后再用PBS洗涤3次。最后，将细胞与1mL冷却的甲醇在-20℃下混合10分钟，并用PBS冲洗3次。再通过激光共聚焦显微镜进行荧光成像分析。

本实验我们研究了具有不同靶标浓度的HepG2细胞的细胞内miR-21成像。我们通过设计miR-21寡核苷酸抑制剂(5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′)以降低细胞内miR-21的浓度，证明所产生的荧光信号是由细胞内miR-21产生的，而非其他miRNA。如图11中A所示，在与NWs孵育2小时后，HepG2细胞显示出强烈的绿色荧光。作为对照，与未处理的细胞相比，在miR-21抑制剂处理的HepG2细胞中观察到了轻微的荧光信号(图11中B)，这表明由靶标miR-21产生的绿色荧光信号是与细胞内的靶标miR-21表达水平密切相关。这些结果共同验证了该方法对特定miRNA靶标的特异性，表明基于NWs成像策略能够区分癌细胞中表达水平不同的miR-21。

本实验中我们通过对同一组织的肿瘤细胞和正常细胞的荧光成像进行对比，证明了不同细胞内miR-21的相对表达水平的差异，进一步验证了基于NWs成像策略的多功能性和普遍性。本实验选取两种肝部细胞HepG2肿瘤细胞和CCC-HEL-1正常细胞进行检测。通过NWs-HCR方法扩增的HepG2肿瘤细胞组，观察到miR-21的明亮的绿色荧光成像信号(图12中A)，而CCC-HEL-1正常细胞中获得微弱的荧光信号(图12中C)，结果与miR-21表达水平非常对应，表明该方法可根据基因表达水平准确地将癌细胞与正常细胞区分开。此外，与游离的H1+H2孵育相比，NWs孵育的HepG2细胞的绿色荧光强度更高(图12中B)，这表明NWs-HCR方法的信号放大可以在细胞内环境中有效地起作用。如图12中C-D所示，在CCC-HEL-1正常细胞中也观察到类似现象，进一步证实NWs-HCR反应可增强扩增效率，提高靶标检测限。实验结果表明该策略可以有效区分细胞内靶标miRNA的不同表达水平相关的不同细胞，具有量化各种活细胞中miRNA表达水平的潜力。

<110> 北京师范大学

<120> 基于金属-DNA配位的杂化纳米球及其制备方法与应用

<130> GNCLN200944

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atcagactga tgttgatagg tctcaacatc agtctgataa gcta 44

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gacctatcaa catcagtctg attagcttat cagactgatg ttga 44

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tagcttatca gactgatgtt ga 22

Claims

1.一种基于金属-DNA配位的杂化纳米球的制备方法，包括如下步骤：1)设计并合成能够特异性识别靶标microRNA的两个HCR发夹探针，记为探针H1、探针H2；

2)将所述探针H1和所述探针H2在HEPES缓冲液中分别进行退火；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述HEPES缓冲液浓度为10mM，通过HEPES溶解于100mM NaCl和20mM MgCl₂配制而成，其pH值为7.2；和/或

在步骤2)中，所述探针H1和所述探针H2在所述HEPES缓冲液中浓度为10μM；和/或

在步骤2)中，所述退火是通过如下实现的：分别加热含有所述探针H1的HEPES缓冲液和含有所述探针H2的HEPES缓冲液至其变性后自然冷却；

进一步地，所述加热至变性的反应温度为95℃，时间为5～10分钟；和/或

进一步地，所述冷却后温度为室温，所述冷却的时间为2～4小时。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中所述混合体系中所述探针H1和所述探针H2的浓度均为2.5μM；和/或

所述含Zn离子的溶液中Zn离子的浓度为4mM；和/或

所述混合体系中所述探针H1和所述探针H2的总量与所述含Zn离子的溶液中Zn离子的摩尔比为1:42；和/或

所述含Zn离子的溶液为ZnCl₂溶液；和/或

所述涡旋的时间为20～30s；和/或

所述静置的温度为95℃；时间为3小时；和/或

所述离心的离心力为10919g～17744g，时间为15～25分钟；和/或

步骤3)中所述离心后还包括将所述沉淀物用水清洗2～3次的步骤；和/或

步骤3)之后还包括将所述杂化纳米球NWs分散在水中储存备用的步骤。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述探针H2的茎环结构中标记有荧光基团和荧光淬灭基团；

进一步地，所述荧光基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述靶标microRNA为miRNA-21；

进一步地，所述探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.利用权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的所述基于金属-DNA配位的杂化纳米球。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法或所述基于金属-DNA配位的杂化纳米球，其特征在于：所述基于金属-DNA配位的杂化纳米球的粒径为30～100nm。

8.权利要求6或7所述基于金属-DNA配位的杂化纳米球在如下任一中的应用：

(a1)对所述靶标microRNA进行原位杂交检测；

9.用于检测miRNA-21的HCR发夹探针，由权利要求5中所述的探针H1和所述的探针H2组成。

10.权利要求9所述用于检测miRNA-21的HCR发夹探针在制备权利要求6或7所述基于金属-DNA配位的杂化纳米球中的应用。