CN114163345B - 一种可离子化脂质化合物及核酸体外细胞转染试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可离子化脂质化合物及核酸体外细胞转染试剂。为了丰富可离子化脂质化合物种类，为脱氧核糖核酸DNA向细胞的转染提供更多选择，为核糖核酸RNA向细胞的转染提供便利的研究工具，本发明提供一种高效且毒性低的可离子化脂质化合物，该可离子化脂质化合物形成的脂质体可高效装载核酸，并携带核酸穿越细胞膜，进入多种类型细胞，在内吞囊泡的酸性环境下质子化而带正电荷，提高内含体逃逸的能力，所以该可离子化脂质化合物形成的脂质体具有较高的转染效率。同时能够实现有效降解，降低了脂质体对细胞的毒副作用。不仅适用于DNA的体外细胞转染也可用于RNA的体外细胞转染。

Description

一种可离子化脂质化合物及核酸体外细胞转染试剂
技术领域
本发明属于体外细胞转染试剂技术领域，具体涉及一种可离子化脂质化合物及核酸转染试剂。
背景技术
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。
以往，由于mRNA难以成药的特点，在体外将mRNA转入细胞的应用相对于DNA的转染应用非常少。如今，mRNA药物迅速发展，体外转染mRNA进入细胞的需求快速增长，但是可用的转染试剂屈指可数。科研与生产急需开发适用于mRNA的体外转染试剂。
目前，常用的DNA细胞转染方法主要分为三类途径：物理介导(电穿孔法，基因枪法、显微注射法)、化学介导(脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物介导法)、生物介导(病毒介导转染、原生质体转染)。电穿孔法的缺点是细胞致死率高；显微注射和基因枪的缺点是操作复杂、所需设备昂贵且会导致核酸片段缺失或突变；原生质体转染的缺点是转染效率低且成本高；磷酸钙共沉淀法的缺点是对DNA浓度要求高且适用性有局限；阳离子脂质体转染法对DNA浓度有一定要求且对细胞有一定的毒性。病毒介导的转染技术，虽然转染效率较高，同时具有低细胞毒性的优势，但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
现有的商业化体外细胞脂质转染试剂多数为阳离子脂质体，为带正电荷的脂质体，其靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物，然后通过细胞的内吞作用进入细胞，具有操作简单、适用性广等优势，但是对不同细胞的转染效率还有待进一步提高、对细胞仍然存在一定的毒性。理想细胞转染试剂，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。虽然现有阳离子脂质体转染试剂在包封效率、转染效率和细胞毒性等方面相比病毒载体和其他类型的非病毒载体都具有明显的优势，但是依然存在一定的细胞毒性，转染效率也需进一步提高，因此，需要开发更多转染效率高且细胞毒性低的体外细胞转染试剂，为细胞转染提供更多的选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种易与DNA以及RNA结合且易降解的可离子化脂质化合物，其丰富了可离子化脂质化合物的种类，可用于制备DNA体外细胞转染试剂或RNA体外细胞转染试剂，为细胞体外DNA转染或RNA转染提供更多的选择。
本发明的另一目的是提供一种转染效率高且细胞毒性小的细胞体外核酸转染试剂，可用于体外细胞体外DNA转染或RNA转染。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种可离子化脂质化合物，所述可离子化脂质化合物为通式(Ⅰ)、通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)所示的化合物中的一种或多种：
Figure BDA0003412135470000021
其中，
R为-OC(＝O)-或-C(＝O)O-。
本发明中，R的结构以其所在链的靠近N的一端向另一端的方向进行限定的，即当R为-OC(＝O)-，靠近N的是酯基中的O，当R为-C(＝O)O-时，靠近N的是酯基中的C。
R1为氢、甲基、乙基或异丙基。
m为1～10之间的整数，例如m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
n为1～3之间的整数，例如n为1、2或3。
f为1～5之间的整数，例如f为1、2、3、4或5。
x为1～8之间的整数，例如x为1、2、3、4、5、6、7或8。
y为1～9之间的整数，例如y为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基。
p为1～5之间的整数，例如p为1、2、3、4或5。
q为1～3之间的整数，例如q为1、2或3。
优选地，所述的R为-C(＝O)O-。
优选地，所述的R1为氢。
优选地，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基、乙基或异丙基。
进一步优选地，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基。
优选地，所述的m为3～8之间的整数，进一步优选为4～6之间的整数。
优选地，所述的f为1～4之间的整数，进一步优选为2或3。
优选地，所述的x为2～5之间的整数，进一步优选为2～4之间的整数。
优选地，所述的y为3～9之间的整数，进一步优选为5～9之间的整数。
优选地，所述的R为-C(＝O)O-，所述的R1为氢，所述的n为2，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基，所述的p为5。
根据一些实施例，通式(I)中，R1为氢，m为4～6之间的整数，n为2，f为1～3之间的整数。
根据一些实施例，通式(Ⅱ)中，x为3，y为6～9之间的整数。
根据一些实施例，通式(Ⅲ)中，R2为甲基，R3为氢，p为5，q为1～3之间的整数。
根据一些具有且优选地实施方式，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种或多种：
Figure BDA0003412135470000031
Figure BDA0003412135470000041
一种核酸体外细胞转染试剂，所述的核酸体外细胞转染试剂包括权利要求1至7中任一项所述的可离子化脂质化合物与辅助脂质分子形成的组合物。
优选地，所述的核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸，所述的脱氧核糖核酸为质粒DNA，核糖核酸为mRNA。
优选地，所述的辅助脂质分子包括胆固醇、卡泊三醇、豆甾醇、β-谷甾醇、白桦脂醇、熊果酸、羽扇豆醇、齐墩果酸、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺、(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、活性炭、二氧化硅以及磷酸钙中的一种或多种中的一种或多种。
优选地，所述的可离子化脂质化合物与所述的辅助脂质分子的投料摩尔比为1:(0.5～2)。
优选地，所述的核酸与所述的组合物的质量比为1:(5～50)，进一步优选为1:(5～40)，再进一步优选为1:(5～30)，更进一步优选为1:(5～20)。
优选地，所述的核酸与所述的组合物的N：P比值为5～10:1。
进一步优选地，所述的核酸与所述的组合物的N：P比值为5～8:1。
可离子化的脂质分子其组合物最近被发展成为重要的药物递送载体，但是应用于DNA体外细胞的转染的实例还很少，应用于RNA体外细胞的转染的实例还未见报道。我们发现可离子化的脂质分子其组合物作为DNA体外细胞的转染试剂具有明显的毒性小的优势，同时我们发明的一系列可离子化脂质化合物其组合物对于DNA难转染的悬浮细胞例如Jurkat细胞的转染效率明显高于常用的其它脂质转染试剂lipo2000。可离子化脂质化合物及其组合物在DNA体外细胞转染以及mRNA体外细胞转染领域的应用将促进真核细胞基因功能研究和广泛应用。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明提供了一种新的可离子化脂质化合物，丰富了可离子化脂质化合物种类，为脱氧核糖核酸以及核糖核酸转染体外细胞提供更多选择，其形成的脂质体颗粒大小均匀、稳定性好、包封效率高、递送效率高且毒性低，可作为体外细胞DNA转染及RNA转染的转染试剂，对相关领域的发展和应用具有重要的意义。
附图说明
图1为化合物1-1的氢谱图；
图2为2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)的氢谱图；
图3为化合物1的氢谱图；
图4为化合物1的质谱图；
图5为化合物2-1的氢谱图；
图6为化合物2的氢谱图；
图7为化合物2的质谱图；
图8为化合物3-1的氢谱图；
图9为1,3-二氨基-2-丙醇的氢谱图；
图10为化合物3的氢谱图；
图11为化合物3的质谱图；
图12为pDNA脂质纳米颗粒Lipid-1的透射电镜图以及zeta电位测试结果图；
图13为mRNA脂质纳米颗粒的粒径分布图；
图14为mRNA脂质纳米颗粒Lipid-3的凝胶阻滞实验电泳图；
图15为不同pDNA与脂质分子用量比例下的pDNA脂质纳米颗粒的凝胶阻滞实验电泳图；
图16为mRNA脂质纳米颗粒Lipid-1转染293T细胞和Hela细胞的平均荧光强度随时间的变化；
图17为mRNA脂质纳米颗粒Lipid-1对悬浮细胞系Jurkat细胞的体外转染荧光显微镜图及阳性细胞占比；
图18为pDNA脂质纳米颗粒Lipid-1对多种贴壁细胞(MCF-7细胞、Hela细胞及293T细胞)进行体外转染的荧光显微镜图；
图19为mRNA纳米脂质颗粒在RNA水解酶的环境下的稳定性测试实验结果图；
图20为脂质纳米颗粒Lipid-1体外转染293T细胞的毒性测定试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
当前，基于脂质体转染载体结构简单、操作方便、生物安全性高等优点，其已成为目前应用最为广泛的非病毒载体，但是大多脂质体载体转染效率仍然不够高，核酸体内表达效果不好，而且对细胞具有一定的毒性，从而限制了脂质体载体的更广泛的应用。因此，为了提高脂质体的递送效率，同时降低细胞毒性，发明人经过大量的研究和实验，开发了一种新的可离子化脂质化合物及包括该可离子化脂质化合物的体外细胞转染试剂。
通常将可离子化脂质分子分为三个部分，包括头基、连接基和尾基。头基(Head)在弱酸性的环境下能够发生质子化，使可离子化脂质整体带有正电荷，使可离子脂质分子与显负电性的核酸结合成紧实的球状结构，即形成纳米脂质颗粒，纳米脂质颗粒在进入细胞后先进入早期内体，然后进入晚期内体，最后进入溶酶体，其中大部分的核酸会被内质网中的酶降解。晚期内涵体酸性降低，会促进脂质纳米粒质子化，破坏内体膜，部分脂质纳米颗粒能够通过内体逃逸而使核酸免受降解，因此避免了核酸过早降解。连接基(Linker)是另一个重要的功能部分，用以连接可离子化脂质分子的头基和尾基。该部位不仅会影响脂质体的整体pKa，还会影响脂质体的电位及生物降解性。尾基(Tail)是第三重要的功能部分，通常具有长的疏水碳链而使脂质长链具有“脂质性质”。因此，头基、连接基和尾基的结构都对脂质体的转染效率、毒性程度等有关。
发明人从头基、连接基和尾基三个部分进行了充分的研究，最终提供了通式(Ⅰ)、通式(Ⅱ)或通式(Ⅲ)所示的可离子化脂质化合物，
Figure BDA0003412135470000061
Figure BDA0003412135470000071
其中，
R为-OC(＝O)-或-C(＝O)O-；
R1为氢、甲基、乙基或异丙基；
m为1～10之间的整数；
n为1～3之间的整数；
f为1～5之间的整数；
x为1～8之间的整数；
y为1～9之间的整数；
R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基；
p为1～5之间的整数；
q为1～3之间的整数。
本发明的可离子化脂质化合物中的多个叔胺基团及特殊的对称性头基结构，在酸性环境下质子化而带正电荷，提高了与带负电荷的核酸的结合能力，并防止核酸在细胞内过早被核酸水解酶降解。
本发明中，优选R为-C(＝O)O-。
本发明中，通式(Ⅰ)中，优选R1为氢，m为1～10之间的整数，n为1～3之间的整数，f为1～5之间的整数，进一步优选R1为氢，m为3～8之间的整数，n为1～3之间的整数，f为1～4之间的整数，再进一步优选R1为氢，m为4～6之间的整数，n为1～3之间的整数，f为1～3之间的整数，更进一步优选R1为氢，m为4～6之间的整数，n为2，f为1～3之间的整数。
本发明中，通式(Ⅱ)中，优选x为1～6之间的整数，y为3～9之间的整数，进一步优选x为2～5之间的整数，y为5～9之间的整数，再进一步优选x为2～4之间的整数，y为6～9之间的整数，更进一步优选x为3，y为6～9之间的整数。
本发明中，通式(Ⅲ)中，优选R2和R3独立地为氢或甲基，p为1～5之间的整数，q为1～3之间的整数，进一步优选R2为甲基，R3为氢，p为1～5之间的整数，q为1～3之间的整数，再进一步优选R2为甲基，R3为氢，p为2～5之间的整数，q为1～3之间的整数，更进一步优选R2为甲基，R3为氢，p为5，q为1～3之间的整数。
合适的尾基结构能够提高核酸传递系统的效率，本发明的可离子化脂质化合物具有多条相同的烃基尾部，有利于装载核酸的脂质体穿越细胞膜，适用于多种类型细胞的转染，核酸递送效率与现有已商品化转染试剂相当或更高，结合其连接基的特殊结构设计，能够实现有效降解，从而实现细胞内快速清除，降低了脂质体的毒副作用。
本发明的可离子化脂质化合物具有以下优点：
(1)本发明的可离子化脂质化合物形成的脂质体，在pH＝7～8的缓冲环境下成电中性，在酸性的缓冲环境中带正电，能够有效地与显负电荷的DNA和RNA紧密结合成纳米颗粒，颗粒大小均匀，稳定性好且包封效率高。
(2)本发明的可离子化脂质化合物形成的脂质体，在晚期内涵体酸性环境下带正电荷，从而可以与内涵体膜中的磷脂阴离子作用，形成适应非双层结构的离子对，继而破坏内涵体膜，实现内涵体逃逸突破细胞内的障碍。因此，可有效地将核酸递送到细胞质中，后续实现有效基因表达。
(3)本发明的可离子化脂质化合物的连接基为经设计的带酯基基团，使脂质体容易降解，降低了细胞毒性。
(4)本发明的可离子化脂质化合物形成的脂质体，在多种类型的细胞中都表现出较好的转染效率，表明其作为核酸普通转染试剂应用的有效性和可转染悬浮细胞独特性。
(6)本发明中可离子化脂质化合物的合成步骤简单，反应条件温和、成本较低，值得推广利用。
下面根据一些具体实施例，进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂厂商购买得到的。
以下实施例中，Lipid-1仅是指使用实施例1制备的化合物1作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，Lipid-2仅是指使用实施例2制备的化合物2作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，Lipid-3仅是指使用实施例3制备的化合物3作为可电离脂质化合物与其他组分形成的纳米脂质颗粒，对各纳米脂质颗粒中包封的核酸类型没有限制。
实施例1
化合物1的合成路线：
Figure BDA0003412135470000091
步骤1：化合物1-1的合成：
将亚麻醇(0.267g，1mmol)和三乙胺(0.133g，1.3mmol)加入反应瓶中冰水浴，加入二氯甲烷(6mL)，将丙烯酰氯(0.11g，1.2mmol)溶于二氯甲烷(2.2mL)，缓慢滴加入反应瓶中，反应持续10分钟，该反应保持在10℃以下，最后冰浴移除，反应液在室温条件下反应2小时。用饱和食盐水洗涤，得到粗产物，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物1-1(2-烯丙酸(9Z，12Z)-十八碳二烯酯)(0.173g，收率：50％)化合物1-1的氢谱见图1。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.41(dd,J＝17.3,1.5Hz,1H),6.13(dd,J＝17.3,10.4Hz,1H),5.82(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H),5.47-5.26(m,4H),4.16(t,J＝6.7Hz,2H),2.78(t,J＝6.5Hz,2H),2.06(dd,J＝13.6,6.7Hz,4H),1.75-1.60(m,2H),1.39-1.17(m,16H),0.88(dt,J＝10.4,5.3Hz,3H).
步骤2：化合物1的合成：
将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)(0.0735g，0.50mmol，氢谱见图2)和2-烯丙酸(9Z，12Z)-十八碳二烯酯(0.64g，2mmol)加入反应瓶中，在80℃下反应48小时。反应冷却至室温后，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％甲醇(体积百分比)二氯甲烷纯化，并将纯产物蒸发，得到黄色油状化合物1(25.7mg，收率：3.6％)。化合物的氢谱见图3，质谱见图4。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45-5.30(m,16H),4.07(t,J＝6.8Hz,8H),3.52(s,1H),2.80(dd,J＝12.5,6.4Hz,16H),2.63(s,4H),2.54(s,3H),2.48(t,J＝7.2Hz,8H),2.07(q,J＝6.7Hz,16H),1.62(dd,J＝13.4,6.6Hz,8H),1.42-1.25(m,68H),0.91(t,J＝6.8Hz,12H),0.91(t,J＝6.8Hz,1H)。
实施例2
化合物2的合成路线
Figure BDA0003412135470000101
步骤1：化合物2-1的合成
将6-溴己酸(1.0g，5.13mmol)和十一醇(1.77g，10.25mmol)溶于二氯甲烷中(60mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐，0.98g，5.13mmol)和DMAP(0.125g，1.03mmol)。混合物在常温条件下搅拌18小时。反应结束后，用DCM(200mL)稀释，并用饱和的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物2-1(6-溴己酸十一酯)(0.69g，收率38.6％)。化合物2-1的氢谱见图5。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.10(t,J＝6.6Hz,2H),3.45(t,J＝6.7Hz,2H),2.36(t,J＝7.3Hz,2H),1.97-1.88(m,2H),1.68(tt,J＝14.5,7.3Hz,4H),1.53(dd,J＝15.1,7.9Hz,2H),1.33(d,J＝16.9Hz,16H),0.92(t,J＝6.5Hz,3H).
步骤2：化合物2的合成
将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙-1-醇)(0.044g，0.30mmol)和6-溴己酸十一酯(0.417g，1.20mmol)溶于THF/CH3CN(1:1，6mL)，之后再加入DIPEA(0.155g，1.20mmol)。反应物在63℃条件下搅拌72h，反应冷却至室温后，真空除去溶剂。粗产品用乙酸乙酯和饱和的NaHCO3萃取，合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有1-2％甲醇(体积百分比)二氯甲烷)纯化，并将纯产物蒸发，得到黄色油状化合物2(14.64mg，收率4％)。化合物2的氢谱见图6，质谱见图7。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.10-3.98(m,8H),3.63(d,J＝16.5Hz,2H),3.46(s,1H),3.22(d,J＝45.3Hz,3H),3.05(d,J＝4.0Hz,2H),3.01-2.73(m,9H),2.66(d,J＝14.3Hz,2H),2.33(dd,J＝16.6,7.4Hz,8H),1.98(s,2H),1.78(s,2H),1.64(dt,J＝23.5,7.0Hz,20H),1.41-1.20(m,74H),0.88(t,J＝6.7Hz,12H)。
实施例3
化合物3的合成路线
Figure BDA0003412135470000111
步骤1：化合物3-1的合成
将8-溴辛酸(1.139g，5.13mmol)和3,7-二甲基辛-6-烯-1-醇(香茅醇，1.599g，10.25mmol)溶于二氯甲烷(60mL)，充分溶解后，加入EDC盐酸盐(0.98g，5.13mmol)和DMAP(0.125g，1.03mmol)。混合物在常温条件下搅拌18小时。反应结束后，用DCM(200mL)稀释，并用饱和的NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品,将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有0.5％EA(体积百分比)的石油醚)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物3-1(6-溴己酸3,7-二甲基辛-6-烯酯)(0.648g，35％)化合物3-1的氢谱见图8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.09(s,1H),4.18-4.01(m,2H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),1.98(s,2H),1.84(dd,J＝14.3,7.0Hz,2H),1.70-1.60(m,9H),1.38(d,J＝37.7Hz,9H),0.89(t,J＝12.9Hz,4H).
步骤2：化合物3的合成
将1,3-二氨基-2-丙醇(0.027g，0.30mmol，氢谱见图9)和6-溴己酸3,7-二甲基辛-6-烯酯(0.398g，1.2mmol)加入反应瓶中溶于THF/CH3CN(1:1，6mL)，之后再加入DIPEA(0.155g，1.20mmol)。反应物在63℃条件下搅拌72h，反应冷却至室温后，真空除去溶剂。粗产品用乙酸乙酯和饱和的NaHCO3萃取，合并有机层用无水Na2SO4干燥，真空除去溶剂，得到粗产品，将粗产品通过色谱法将粗产品通过色谱法(硅胶柱，洗脱剂为含有1％甲醇(体积百分比)二氯甲烷)纯化，并将纯产物蒸发，得到浅黄色油状化合物3(11.63mg，收率3.2％)。化合物3的氢谱见图10，质谱见图11。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.30(s,1H),5.08(t,J＝6.4Hz,4H),4.10(h,J＝10.9Hz,8H),3.67(s,1H),2.46(s,10H),2.28(t,J＝7.3Hz,8H),1.97(d,J＝9.2Hz,8H),1.74-1.51(m,41H),1.49-1.37(m,12H),1.37-1.16(m,33H),0.91(d,J＝5.9Hz,12H)。
实施例4：纳米脂质颗粒的制备、粒径及电位的测定：
使用无水乙醇作为溶剂，将实施例1至3中制备的化合物1、化合物2以及化合物3分别与DSPC、DMG-PEG2000及胆固醇按照摩尔比为50:10:1.5:38.5溶解混合得到脂质体原料溶液，控制各组分浓度之和为50mM，完全溶解混匀后放置-20℃保存。
将pDNA分散于25mM的醋酸钠缓冲液中，加入上述脂质体原料溶液共孵育20分钟，使脂质体与pDNA紧密结合形成pDNA纳米脂质颗粒，分别标记为Lipid-1、Lipid-2和Lipid-3，合格的脂质纳米颗粒就可以用来转染准备好的细胞。利用Zetasizer Nano ZS(Malvern,Worcestershire,UK)检测纳米脂质体颗粒的粒径，PDI。粒径的测量通过将纳米脂质体颗粒溶液用1×PBS稀释50倍之后测量，Zeta电位的测定是通过将纳米脂质体颗粒稀释到15mM的PBS中进行测定，检测结果如表1和图12所示。
表1脂质分子包封pDNA形成的纳米粒的各项参数
Figure BDA0003412135470000121
表1和图12显示，pDNA纳米脂质颗粒Lipid-1、Lipid-2和Lipid-3的平均粒径在120-150nm范围内，粒径分布均匀，包封效率均在90％以上，电位在-18.6～-11.6mV。
将mRNA溶解在pH为5.2左右的25mM的醋酸钠缓冲液中，制得终浓度约为0.1mg/mL的核酸制剂。将上述配制的脂质体原料溶液和核酸制剂以两相体积比约为4:1，两相溶液总速率为12mL/min条件下，通过Nano Assemblr微流控系统，也可通过涡旋的方法快速地将两相溶液混匀，形成均一稳定的mRNA纳米脂质体颗粒，然后快速地将mRNA纳米脂质体颗粒环境从pH为5.2转变成7.0～7.4。具体操作为，用pH为7.2的PBS缓冲液或pH为7.4的醋酸钠缓冲液将其稀释20倍体积后，利用10kD的超滤管进行浓缩，离心机的转速不要超过超滤管的最高转速限制，经过2～3次换液之后，mRNA纳米脂质体颗粒的溶液环境的pH在7.2～7.4左右，将其浓缩至终浓度为200mM左右，放置在4℃环境下备用或添加稳定剂冻存于-70度。
采用与pDNA纳米脂质颗粒相同的检测方法测试mRNA纳米脂质体颗粒的粒径、PDI、包封率及电位，测试结果见表2和图13。
表2脂质分子包封mRNA形成的纳米粒的各项参数
Figure BDA0003412135470000131
表2及图13显示，mRNA纳米脂质体颗粒Lipid-1、Lipid-2和Lipid-3的平均粒径都在100-150nm，粒径分布均匀，包封效率均在90％以上，电位为-20.8～-10.2mV。
实施例5.凝胶阻滞实验检测mRNA纳米脂质体颗粒对mRNA的包封效果以及不同N：P比下pDNA纳米脂质体颗粒对pDNA的包封效果。
与pDNA不同，mRNA不稳定，特别容易受到RNA水解酶的降解，所以作为mRNA的转染试剂目前必须要将mRNA包封起来，以起到保护作用。我们通过凝胶阻滞实验重点比较Lipid-1、Lipid-2以及Lipid-3与参照物MC3(脂质体采用Dlin-MC3-DMA)对mRNA的包封效果，其琼脂糖凝胶电泳结果见图14。每一胶条右边的泳道里核酸分子被脂质体阻截在上样孔里，不能在琼脂糖凝胶里向下迁移，而左边泳道里的marker可以正常迁移。说明所有mRNA纳米脂质体颗粒对mRNA的包封效果很好。
为了探究脂质体与pDNA的结合能力，我们将不同N：P比的脂质体和pDNA分别在pH＝5.2的醋酸钠缓冲液中孵育20min之后，通过DNA琼脂糖凝胶观察脂质体和pDNA的结合情况，结果见图15，最左侧泳道为DNA mark，第二泳道为pDNA，第三泳道至第第七泳道依次为N：P为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，由图12可见，Lipid-1、Lipid-2和Lipid-3对pDNA的包封效果好，最适N：P比值为7:1
实施例6：采用mRNA纳米脂质体颗粒Lipid-1进行悬浮细胞293T细胞、Hela细胞以及Jurkat细胞的体外转染实验。
选用293T细胞系、Hela细胞系以及Jurkat细胞系，在培养瓶中培养至适量密度，接种到6孔板中，培养24小时之后，将通过体外转录得到的纯净的带有绿色荧光GPF的mRNA和实施例4中的DSPC、DMG-PEG2000及胆固醇在pH＝5.2的醋酸钠缓冲液中孵育20min，使脂质分子与mRNA的N:P为7:1使mRNA充分包封脂质体中，随后将该混合溶液加入到各六孔板中，进行细胞转染。2h后即可观察到绿色荧光，可持续表达长达72h。mRNA脂质纳米颗粒Lipid-1转染293T细胞和Hela细胞的平均荧光强度随时间的变化见图16(图16中每组左侧柱形表示293T细胞中平均荧光强度，右侧柱形表示Hela细胞中平均荧光强度)，mRNA脂质纳米颗粒Lipid-1对悬浮细胞系Jurkat细胞的体外转染荧光显微镜图及阳性细胞占比见图17，结果表明mRNA脂质纳米颗粒Lipid-1适用于悬浮细胞系的转染。
实施例7：采用pDNA纳米脂质体颗粒Lipid-1进行多种贴壁细胞的体外转染实验。
在转染细胞之前，将培养瓶中适量密度的Hela细胞、MCF-7细胞以及293T细胞转移到6孔板中，培养12小时之后，将带有绿色荧光GPF标签的质粒和实施例4中的DSPC、DMG-PEG2000及胆固醇在pH＝5.2的醋酸钠缓冲液中孵育20min，使质粒与脂质体以N:P比为7:1的比例充分结合，随后将该混合溶液加入到各六孔板中，进行细胞转染。4-6h后，去上清，换成新鲜的带血清的DMEM培养基，目的是将转染试剂去除。继续培养24小时，用倒置荧光显微镜观察脂质体对各细胞的转染效果，如图18所示，该结果表明pDNA纳米脂质体颗粒Lipid-1适用于多种类型细胞的转染。
实施例8：mRNA纳米脂质颗粒在RNA酶的环境下的稳定性测试实验。
为了探究我们的脂质体包封mRNA之后形成的纳米脂质颗粒是否能够保护mRNA免受RNA酶的降解，在实验之前，我们将mRNA包封成纳米脂质颗粒，并将未被脂质体包封的mRNA(简称Free mRNA)作为对照。首先将纳米脂质颗粒平均加入到离心管中，每只离心管中含有的mRNA的量为2ug，同时也将Free-mRNA按照2ug的剂量加入另外新的一系列离心管中。将RNase A以不同的浓度加入到各个离心管中，分散均匀，室温下放置1小时。最后通过琼脂糖凝胶电泳及胶图成像探究mRNA的降解情况。实验结果如图19所示，该结果表明，FreemRNA在RNase A的环境下能够被降解，而脂质体包封后的mRNA在RNase A浓度较高的的环境下能够稳定免受降解。
实施例9：体外转染细胞毒性测试实验。
所合成的脂质分子设计了其输水尾部可以通过酯基的细胞代谢来降解。采用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，具体步骤：将适量密度的细胞接种到96孔板中，使待测细胞的密度不超过80％，加入不同量的Lipid-1。孵育结束后，离心，去除上清液，加入150μL PBS稀释了10倍的LDH释放试剂，混匀，孵育1小时，离心，取上清，测定吸光度，脂质体的细胞毒性结果如图20示。随着脂质体浓度的增加，细胞的存活率均保持在98％以上，表明纳米脂质颗粒没有明显的细胞毒性。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种可离子化脂质化合物，其特征在于：所述可离子化脂质化合物为通式（Ⅰ）、通式（Ⅱ）、通式（Ⅲ）所示的化合物中的一种：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure DEST_PATH_IMAGE003
，
其中，
R为-C(=O)O-，R的结构以其所在链的靠近N的一端向另一端的方向进行限定的，靠近N的是酯基中的C；
R1为氢、甲基、乙基或异丙基；
m为1~10之间的整数；
n为1~3之间的整数；
f为1~5之间的整数；
x为1~8之间的整数；
y为1~9之间的整数；
R2和R3独立地为氢、甲基、乙基或异丙基；
p为1~5之间的整数；
q为1~3之间的整数。
2.根据权利要求1所述的可离子化脂质化合物，其特征在于，所述的R1为氢。
3.根据权利要求1所述的可离子化脂质化合物，其特征在于，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基、乙基或异丙基。
4.根据权利要求1所述的可离子化脂质化合物，其特征在于，所述的m为3~8之间的整数；和/或，所述的f为1~4之间的整数；和/或，所述的x为2~5之间的整数；和/或，y为3~9之间的整数。
5.根据权利要求1所述的可离子化脂质化合物，其特征在于，所述的R1为氢，所述的n为2，所述的R2和所述的R3中一个为氢，另一个为甲基，所述的p为5。
6.根据权利要求1所述的可离子化脂质化合物，其特征在于，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure DEST_PATH_IMAGE005
、
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
7.一种核酸体外细胞转染试剂，其特征在于，所述的核酸体外细胞转染试剂包括权利要求1至6中任一项所述的可离子化脂质化合物与辅助脂质分子形成的组合物。
8.根据权利要求7所述的核酸体外细胞转染试剂，其特征在于，所述的核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸，所述的脱氧核糖核酸为质粒DNA，核糖核酸为mRNA。
9.根据权利要求7所述的核酸体外细胞转染试剂，其特征在于，所述的辅助脂质分子包括胆固醇、卡泊三醇、豆甾醇、β-谷甾醇、白桦脂醇、熊果酸、羽扇豆醇、齐墩果酸、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺、(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、双十烷基二甲基溴化铵、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的核酸体外细胞转染试剂，其特征在于，所述的可离子化脂质化合物与所述的辅助脂质分子的投料摩尔比为1:（0.5~2）。
11.根据权利要求7所述的核酸体外细胞转染试剂，其特征在于，所述的核酸与所述的组合物的质量比为1:（5~50）。
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