CN114025605A - 一种用于生产转基因种子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产转基因种子的方法。具体来说，提供了一种生产可萌发成植物的转基因大麻种子的方法，该方法包括：(a)制备包含基因工程化的大麻细胞的细胞培养物，所述基因工程化的大麻细胞删除至少一个表达精神活性大麻素的基因；(b)建立愈伤组织培养以形成体细胞胚；(c)形成包含体细胞胚的生物墨水，该体细胞胚被水凝胶包裹并用作人工种子；和(d)三维(3D)打印包含在生物墨水中的人工种子。还提供了三维打印的人工大麻种子，其具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状。

Description

一种用于生产转基因种子的方法

技术领域

本发明涉及一种用于生产转基因种子的方法。具体来说，本申请涉及一种生产可萌发成植物的转基因大麻种子的方法。更具体地说，本发明涉及一种具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状的转基因大麻种子。

背景技术

有史以来大麻被用于药用目的。大麻已被证明可以作为食欲刺激剂、止吐剂、镇痛剂和在治疗各种疾病(包括青光眼、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症和慢性炎症)方面提供治疗益处。

大麻包含许多化学上不同的成分，其中许多具有治疗特性。医用大麻的主要治疗成分是δ-9-四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)。

THC是大麻的主要精神活性成分，已被证明可作为止吐剂、镇痛剂和在治疗青光眼方面提供治疗益处。相反，具有高比例THC的医用大麻品系可能会引起焦虑和/或迷失方向的感觉。

CBD是大麻中主要的非精神活性成分。CBD是血清素受体的激动剂，已被证明在神经性疼痛和神经炎症的治疗中具有治疗益处。

大麻(Cannabis sativa)是众所周知的并广泛用于生产医用大麻。然而，除了关键的大麻化合物四氢大麻酚酸(THC)外，大麻还产生一系列其它次级代谢物，这些次级代谢物已被证明作为药物具有潜在的价值。然而，植物内只有较低的生产水平，因此高生产和纯化成本是这些药物商业可行性的主要障碍。对大麻次级代谢物生物合成途径进行代谢工程改造可以将生化反应、中间体和能量从THC的生物合成重新定向到替代化合物。该方法可导致开发新的大麻品系，生产具有附加值的新型药物。

各种研究和出版物表明了大麻素分子如何与人类内源性大麻素系统相互作用。

目前，工业大麻(hemp)在一些国家是合法的，但食用性大麻(marijuana)在几乎所有国家都是非法的。但是，工业大麻在医疗上有用的CBD的含量很低(只有3.5％)，而食用性大麻的CBD含量更高，为20％，具有医疗用途。

一些国家允许工业大麻广泛种植的事实是因为它的THC含量低于0.3％，但它仅限于工业应用。CBD具有很好的医疗应用。最近，CBD已被用于制造有用的药物，使得医用大麻或更准确的医用CBD疗法在未来有效药物的开发中变得非常重要和相关。一项治疗癫痫的申请已获得美国FDA批准。

世界各地有许多热点研究通过自然选择育种来获得最好的大麻品系，但这将非常繁琐和缓慢。此外，还尝试使用植物干细胞在组织培养中制造组培苗，但在产生高水平的CBD方面取得的成功很少。

最大的问题不在于获得足够的CBD，最大的问题是我们能否让更广泛的全球研究团体获得这些有益的药用作物，并加快对慢性病潜在治疗方法的更多研究突破，并允许这些治疗方法帮助全世界需要它们的患者，而不仅限于少数几个国家或有能力负担得起的特权患者。

通过允许在许多国家广泛种植有益作物，我们可以帮助农民开启有效的全球经济，解决大多数国家的贫困问题，因为非THC医用大麻将是高收入作物。在获得全球认可的过程中，CBD的价格只会下降，这对全世界的患者来说只会是好消息，因为由于采用大规模市场进行生产，来自大麻的可能药物会更便宜。

全世界大多数国家将食用性大麻视为受控物质的主要原因是因为它含有精神活性成分THC，这会导致成瘾、药物滥用，从而对大众造成脑损伤。

因此，通过去除食用性大麻植物中的有害成分THC，即我们的最新发明，我们将能够创造出THC含量为零但CBD含量尽可能高的食用性大麻植物，从而使全球社会能够种植它。

尽管随着获得大麻的国家进行的研究越来越多，大麻已被发现具有许多医疗益处，但是由于精神活性化合物THC的存在，大麻植物及其产品通常仍然无法为世界上的大多数人所获得，并且被许多人认为是非法的。THC会让人上瘾，过量服用THC会伤害和破坏我们的大脑。

该植物已被少数国家垄断。随着越来越多的研究正在进行以了解大麻素化合物的功能和作用，特别是在慢性疾病的治疗领域，例如，慢性疼痛和无法治愈的神经退行性疾病，例如帕金森症、痴呆症、精神分裂症、多发性硬化症等。

随着越来越多的国家开始承认这种植物的医疗益处，他们将慢慢走向将大麻用于医疗的合法化。大麻植物有100多种大麻素化合物，目前只有少数正在研究。在已研究的这些分子中，研究发现了治疗癫痫、疼痛治疗等的有希望的医学成果。

还有很多未知的大麻素分子尚未研究。医疗费用过高，大麻素药物只有富人才能获得。

发明内容

在本说明书中列出或讨论明显在先公开的文件并非必然被视为承认该文件是现有技术的一部分或者是公知常识。

在此引用的任何文件均以其全文形式被援引加入本文。

在本发明的第一方面，提供了一种生产可萌发成植物的转基因大麻种子的方法，该方法包括：(a)制备包含基因工程化的大麻细胞的细胞培养物，所述基因工程化的大麻细胞删除至少一个表达精神活性大麻素的基因；(b)建立愈伤组织培养以形成体细胞胚；(c)形成包含体细胞胚的生物墨水；以及，(d)三维(3D)打印种子。

在各种实施方案中，步骤(a)包括从野生型大麻植物获得细胞并遗传删除至少一个表达精神活性大麻素的基因，其中大麻植物包含高水平的CBDV含量。例如，合适的野生型大麻植物可以是具有至少20％量的非精神活性大麻素化合物(即CBD、CBDV等)的植物。

在各种实施方案中，缺失的至少一个表达精神活性大麻素的基因是编码选自由THCA、THC、THCVA和THCV组成的组的精神活性大麻素的基因。优选地，从细胞基因组中删除所有表达精神活性大麻素化合物的基因。此类基因可包括与THCA、THC、THCVA和THCV中的任何一个有关的通路有关的任何化合物。

在各种实施方案中，基因是THCA合成酶基因。

在各种实施方案中，该方法进一步包括用报告基因替换至少一个表达精神活性大麻素的基因的步骤。

在各种实施方案中，至少一个报告基因包括可检测标记。

在各种实施方案中，报告基因是萤火虫萤光素酶基因。

在各种实施方案中，该方法进一步包括包裹体细胞胚。

在各种实施方案中，步骤(d)打印具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状的种子。

在本发明的第二方面，提供了可萌发成植物的转基因大麻种子，其中种子具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状。

在本发明的第三方面，提供了由根据本发明的第一方面的方法生产的种子或根据权利要求10的种子产生的植物。

本发明不仅通过基因工程生产出用于形成不具有非法性精神活性大麻素的有害影响的种子或植物的大麻细胞培养物，而且提供通过三维(3D)打印从所述基因工程化的大麻细胞培养物生产种子的方法，其中种子的形状不同于天然存在的野生型大麻种子的形状。此类形状包括长方体、三角形等。

有利地，本发明提供了生产易于验证的不含精神活性大麻素的转基因大麻植物的方法。通过生产具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状的种子，本发明提供了快速简便的方法来鉴定和验证安全合法，即不含精神活性大麻素的大麻种子。这意味着用于确定种子是否不含精神活性化合物的任何验证或鉴定方法都可以直观地进行，而不需要进行任何需要更多资源如时间和金钱的实验室测试(如基因)。

“大麻(cannabis)”是指该属下的所有物种，这里也可与食用性大麻和工业大麻互换使用。

“精神活性大麻素(psychoactive cannabinoid)”是指包括例如THCA(四氢大麻酚酸(Tetrahydrocannabinolic Acid))和THC(四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol))、THCVA(四氢次大麻酚酸(Tetrahydrocanabivarinic acid))和THCV(四氢次大麻酚(Tetrahydrocanabivarinol))等化合物。

“非精神活性大麻素(non-psychoactive cannabinoid)”是指包括例如CBGA(大麻萜酚酸(Cannabigerolic acid))、CBDA(大麻二酚酸(Cannabidiolic acid))、CBCA(大麻环萜酚酸(Cannabichromenenic acid))、CBGVA(次大麻萜酚酸(Cannabigerovarinicacid))、CBDVA(次大麻二酚酸(Cannabidivarinic acid))、CBCVA(次大麻环萜酚酸(Cannabichromevarinic acid))和CBG(大麻萜酚(Cannabigerol))、CBD(大麻二酚(Cannabidiol))、CBC(大麻环萜酚(Cannabichromenenol))、CBGV(次大麻萜酚(Cannabigerovarinol))、CBDV(次大麻二酚(Cannabidivarinol))和CBCV(次大麻环萜酚(Cannabichromevarinol))等化合物。

存在基因工程化的大麻细胞，即不含精神活性大麻素或不含THC的大麻细胞；但这些基于实验室的生产方法只会剥夺全世界农民种植农业形式的自由，并且还可能根除大麻植物的全球农业经济，其中可以生产其他植物部分并对世界具有价值。这种实验室生产方法最终也会导致一种重要植物从世界上日益减少的有价值植物多样性中消失或促进其灭绝。

我们希望让世界上所有人都能更多地接触到这种对医学有益的植物，以便对该植物进行更多的研究，以发现治疗慢性病和神经退行性疾病的更多医学突破。

通过去除被认为对人体有害的精神活性大麻素成分(例如THCA、THC、THCVA、THCV)，从而大麻植物将不再产生THC和THCV，只含有可用于医疗并使人类受益的有益的非精神活性大麻素分子。因此，这种非精神活性大麻植物被认为对公众是安全的。

为了使这种新型大麻植物易于识别和追溯，我们将加入生物标志物(例如带有可检测标记的报告基因)，使得植物材料易于检测。生物标志物可以是GFP或荧光素酶蛋白表达或任何其他合适的标志物的形式。

这可能是标准DNA测试的补充，以确定基因工程化的植物的基因序列。此外，可以使用合成种子生产方法进一步区分大麻种子，以促进种子萌发以及区分基因工程化的种子材料的外观。

此外，我们可以应用3D生物打印技术将大麻种子/细胞材料3D打印成可定制的种子状形状或结构。

这种基因工程化的大麻植物将使农业国家的农民能够合法种植这种基因工程化的大麻植物，并通过为失业工人提供就业机会和收入、减少贫困、增加社会经济、提高生活水平、改善基础设施建设、减少精神活性食用性大麻的滥用和非法种植来支持全球经济，特别是来自第三世界国家的那些。

附图说明

为了可以充分理解本发明并容易地将其付诸实施，现在仅通过非限制性实例来描述本发明的优选实施例，描述参考附图。

在图中：

图1是显示根据本发明的实施例生产转基因大麻种子的过程的流程图；

图2是显示基因编辑CRISPR方法的敲除过程的示意图；

图3是显示种子内部细胞层的示意图；

图4是显示根据本发明的实施方案生产人工种子(需要作为3D打印独特种子的生物墨水材料的拟胚体(embryoid body))的示意图；

图5是显示根据本发明的实施方案生产人工种子(需要作为3D打印独特种子的生物墨水材料的拟胚体)的示意图；

图6是用于打印根据本发明的实施方案的种子的3D打印机的照片；

图7显示了根据本发明的实施方案的用于种子微环境(即“硬件”)的3D打印的萌发阵列和种子托盘；

图8显示了根据本发明的实施方案的3层的种子微环境(“硬件”)的3D打印图像；

图9显示了根据本发明的实施方案的生物打印方法；

图10、11、12和13显示了与萤火虫荧光素酶报告基因相关的各种信息；

图14(a)和(b)是显示根据本发明的实施方案的具有心形和立方体形状的打印种子的照片；和

图15(a)和(b)显示了来自蛋白质印迹分析和PCR的结果以显示THC合成酶基因的成功基因缺失，图15(c)显示了根据本发明的实施例的萤火虫荧光素酶基因的PCR。

具体实施方式

参考图1，生产转基因大麻种子的过程可以从首先选择表现出或含有高水平精神活性和非精神活性大麻素化合物的野生型大麻植物开始。在各种实施方案中，选择具有高含量THCV和CBDV的植物。技术人员已知多种方法来确定精神活性和非精神活性大麻素化合物的含量，例如使用蛋白质印迹分析和PCR检测我们的基因敲除种子和植物。请参见图15(a)和(b)，了解蛋白质印迹分析和PCR实验中的成功数据。

一旦选择了合适的植物，然后从所述植物中获得细胞或植物提取物，以便使用CRISPR基因编辑方法进行基因编辑以去除或删除那些编码精神活性大麻素化合物的基因。在各种实施方案中，植物细胞被基因工程化，例如THCA合成酶基因被删除。为免生疑问，本发明包括删除编码THCA、THC、THCVA和/或THCV的那些基因的过程步骤。

通过了解食用性大麻植物中THCA合成酶和CBDA合成酶的特定cDNA序列(相似度仅为84％)，我们将能够使用基因工程从食用性大麻基因组中去除THCA合成酶基因。

然后通过报告基因分析来鉴定成功删除编码精神活性大麻素化合物的基因的细胞。

然后将这些细胞用于建立愈伤组织培养并诱导体细胞胚发生。体细胞胚成熟然后包裹，例如用水凝胶包裹。包裹的拟胚体被溶解，然后用作3D打印的生物墨水。然后让这些基因工程人工种子长成植物，然后分析长出的植物以验证成功。

一旦得到验证，相同的体细胞胚可以用作原材料，成为生物墨水，用于三维(3D)打印以打印具有基因工程基因组的种子。特别是，本发明的独特之处在于打印具有非野生型大麻种子所固有的非常规形状的种子(例如，请参见图14(a)和(b)，其显示打印的种子具有心形和立方体形状)。然后可以让这些3D打印的种子长成完整的基因工程大麻植物。

任何细胞或组织生长的培养条件是技术人员已知的标准培养基和条件。

因此，以下提供了关于本发明的简短概述。

1.选择具有最佳大麻素特征和生长特性的食用性大麻杂交植物。

2.靶向删除THCA合成酶基因并将报告基因插入同一基因座。

3.促使大麻素合成途径朝向divarinic acid途径而不是橄榄醇酸(olivetolicacid)途径。

4.靶向失活己酰辅酶A合成酶或橄榄醇酸环化酶。

5.靶向插入醛脱氢酶或烯酰辅酶A水合酶。

6.表达报告基因的植物细胞将是没有THCA基因的植物细胞，即不含THC和THCV的食用性大麻植物。

7.使用合成种子生产方法包裹食用性大麻植物细胞/种子。

8.使用3D打印技术，基于不含GM THC(非精神活性)的食用性大麻植物细胞材料产生统一的可定制的种子结构，创造出独特地可识别的不含GM THC的食用性大麻种子产品。

实例

PCT申请号PCT/IB2016/000814的公开内容被援引加入本文。

描述了转基因大麻植物和大麻植物衍生产品以及表达盒、载体、组合物和生产它们的材料和方法。具体来说，本发明涉及制备不含THC和THCV并且通过删除THCA合成酶基因并用报告基因盒替换THCA合成酶基因而易于认证的转基因食用性大麻植物的方法。

描述了通过下调一种或更多种具有共享生物合成途径的代谢物的产生来增加一种或更多种次级代谢物的产生的某些实施方案。某些实施方案提供了通过去除THC的产生来增加一种或更多种共享THC生物合成途径中的步骤和中间体的次级代谢物的产生的方法。在具体的实施方案中，提供了通过去除THC的产生来增加CBD和/或大麻素的产生的方法。下图显示了生物合成途径。

THC、CBD或大麻色烯(Cannabichromene)产生的中断将增加该共享途径中剩余代谢物的产生。例如，通过去除THC的产生来提高CBD和/或大麻素的产生。将通过去除四氢大麻酚酸(THCA)合成酶的表达和/或活性来去除THC的产生。同样，它也会破坏THCV的产生并增加共享途径中其他代谢物的产生。

还提供了具有共同生物合成途径的一种或更多种代谢物的改进生产的植物和植物细胞。在某些实施方案中，提供了增加一种或更多种次级代谢物的产生而下调具有共享生物合成途径的一种或更多种其他代谢物的大麻植物和细胞。在某些实施方案中，提供了在THC和THCV生物合成途径中具有增加的一种或更多种次级代谢物的产生而下调一种或更多种其他代谢物的大麻植物和细胞。

在某些实施方案中，提供了在THC和THCV生物合成途径中具有增加的一种或更多种次级代谢物的产生且不产生THC的大麻植物和细胞。

在具体的实施方案中，提供了具有增加的CBD和/或大麻色烯的产生且不产生THC的大麻植物和细胞。

某些实施方案提供了具有增加的一种或更多种次级代谢物的产生并且没有THCA合成酶的表达和/或活性的大麻植物和/或细胞，这些次级代谢物共享THC和THCV生物合成途径中的步骤和中间体。在具体的实施方案中，提供了具有增加的CBD和/或大麻色烯的产生和下调的THCA合成酶的表达和/或活性的大麻植物和/或细胞。

定义

在本文的描述和表格中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清晰和一致的理解，提供了以下定义。除非另有说明，术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。在术语以单数形式提供的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本发明的方面。

如本文所用的，术语“表达盒”是指包括选定的待转录DNA的DNA分子。此外，表达盒至少包括表达所需的所有DNA元件。成功转化后，表达盒引导细胞的机器将选定的DNA转录为RNA。在某些实施方案中，表达盒表达双sgRNA，其通过删除THCA合成酶的基因来停止其表达。

只要使用正确的调控序列，不同的表达盒就可以转化到不同的生物体中，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞。

如本文所用的，术语“表达”是指细胞内过程的组合，包括通过编码DNA分子例如结构基因进行的转录和翻译，以产生多肽。

如本文所用的，术语“遗传转化”是指将DNA序列或构建体(例如，载体或表达盒)引入细胞或原生质体的过程，其中外源DNA加入染色体或能够自主复制。

如本文所用的，术语“异源”是指在当前发现该序列的遗传环境中的给定宿主基因组中通常不存在的序列。在这方面，该序列对于宿主基因组可以是天然的，但相对于宿主序列内的其他基因序列进行重排。例如，调控序列可以是异源的，因为它与相对于天然调控序列不同的编码序列相连。

如本文所用的，术语“转基因(transgene)”是指已加入宿主基因组或能够在宿主细胞中自主复制并且能够引起一个或更多个编码序列表达的DNA片段。

示例性的转基因将为宿主细胞或由其再生的植物提供相对于相应的非转化细胞或植物具有新的表型。转基因可以通过遗传转化直接引入植物中，或者可以从用DNA片段转化的任何前代植物遗传。

如本文所用的，术语“转基因植物”是指植物或来源于该植物的任何后续世代的后代植物，其中该植物或其后代的DNA包含引入的外源DNA片段，该外源DNA片段并非天然存在于相同品系的非转基因植物中。转基因植物可以另外包含被转化植物所固有的序列，但是其中“外源”基因已经被改变以改变基因的表达水平或模式，例如，通过使用一种或更多种异源调控或其他元件。

如本文所用的，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列、选定的DNA或多核苷酸与第二核酸序列“可操作地”相连(connect)或“连接(link)”。例如，如果启动子提供RNA或编码序列的转录或表达，则启动子与RNA和/或蛋白质编码序列可操作地连接。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时在同一阅读框中。

如本文所用的，术语“转录物”对应于通过转录过程从基因产生的任何RNA。因此，基因的转录物可包括初级转录产物，其可包含内含子或可包括缺乏内含子的成熟RNA。

如本文所用的，“核酸酶”是指具有核酸酶活性的天然和工程化的(即修饰的)多肽，例如具有“LAGLIDADG”、“GIY-YIG”、“His-Cys盒”和HNH家族的序列基序和催化活性的核酸内切酶(例如Chevalier和Stoddard，2001)，以及锌指核酸酶(ZFN)，其中是天然存在的或针对给定的靶向特异性进行工程化(例如Durai等人，2005；美国专利7,220,719)。其他预期的核酸内切酶是酿酒酵母HO核酸酶(例如Nickoloff等人，1986)或其变体。

如本文所用的，“定制核酸内切酶”是指已经进化或经合理设计在一个或更多个识别序列内或附近切割的核酸内切酶(例如WO06097853、WO06097784、WO04067736或US20070117128)。这种定制核酸内切酶将具有使其易于遗传修饰的特性，从而可以操纵其识别、结合和/或核酸酶活性。

如本文所用的，“等位基因”是指特定基因座处的替代序列；等位基因的长度可以小到1个核苷酸碱基，但通常更大。等位基因序列可以表示为核酸序列或由核酸序列编码的氨基酸序列。或者，等位基因可以是基因的一种形式，并且可以表现出简单的显性或隐性行为，或更复杂的遗传关系，例如不完全优势、共同优势、条件优势、上位性或其相对于一个或更多个其他等位基因的一种或更多种组合。

“基因座”是基因组序列上通常通过参考点找到的位置；例如，作为基因或基因或基因间区域的一部分的短DNA序列。本发明的基因座包括群体中的一个或更多个多态性；即，一些个体中存在的替代等位基因。

选择杂交植物

选择THC和CBD含量同样高的食用性大麻植物的杂交品系，例如Cannatonic品系。可以在此处找到品系的示例和列表：

https://www.medicalmarijuanainc.com/top-5-high-cbd-high-thc-cannabis-strains/

https://www.marijuanabreak.com/5-best-11-thc-to-cbd-marijuana-strains

或者，我们也可以选择THCV和CBDV同样高的杂交品系(https://www.civilized.life/articles/cannabis-strains-high-levels-of-tetrahydrocannabivarin/)。食用性大麻植物(Cannabis Sativa X Indica)的杂交品系已被证明可以产生平均最高的THC和CBD含量(https://www.leafly.com/news/cannabis-101/indica-vs-sativa-which-produces-more-cbd-thc)。由于其栽培(https://www.royalqueenseeds.com/blog-top-fastest-growth-cannabis-seeds-by-categories-n519)，选择具有Ruderalis质量的大麻杂交品系也将是有益的。优点包括更快的生长、自动开花等。

基因编辑/删除

论文内容“Giuliano,C.J.Lin,A.,Girish,V.,&Sheltzer,J.M.(2019).Generating single cell-derived knockout clones in mammalian cells withCRISPR/Cas9.Current Protocols in Molecular Biology,128,e100.Doi:10.1002/cpmb.100”被援引加入本文。它规定了CRISPR方案。

CRISPR系统最初进化为靶向核酸的细菌防御机制，能够赋予对病毒感染的抵抗力(Barrangou等人，2007)。此后，科学家们将其作为产生序列特异性双链断裂(DSB)和诱导细胞和生物体基因组内其他精确改变的手段(Cong等人，2013)。CRISPR在哺乳动物遗传学和细胞生物学研究中特别有用，因为哺乳动物体细胞历来被证明对基因修饰具有高度抵抗力(Komor,Badran,&Liu,2017)。通过在哺乳动物细胞中表达Cas9核酸酶和合适的向导RNA(gRNA)，可以在感兴趣的基因座引入双链断裂。然后，细胞有多种选择来修复该断裂。如果提供了合适的模板，细胞可以使用同源定向修复在靶向位点整合新的等位基因或转基因(Ceasar,Rajan,Prykhozhij,Berman,&Ignacimuthu,2016)。或者，细胞可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复损伤，这是一种容易出错的过程，通常会导致DSB位置的插入或缺失(indel)突变(Brinkman等人，2018)。通过这种方式，CRISPR可用于向哺乳动物基因引入稳定、不可逆转的改变。下面，我们描述了使用CRISPR在哺乳动物体细胞系中产生敲除克隆的有效方法。

方案分为五个部分，概述如下：

1.选择敲除策略；

图2显示了敲除策略的概要。

2.选择gRNA靶向位点并进行载体克隆(最初提交的文件中列出的所有靶向基因都可以从下面给出的网络链接中获得其序列)；

3.通过转染或转导引入gRNA；

4.单细胞克隆的分离和扩增；

5.通过蛋白质印迹分析、PCR和/或Sanger测序进行敲除验证。

使用Xie等人在2016年报道的双sgRNA/Cas9 CRISPR基因编辑方法。使用双sgRNA/Cas9设计(Nature’s Scientific Reports volume 6,Article number:23890https://www.nature.com/articles/srep23890)或PSA已知的其他类似方法在植物中进行靶向基因替换的替代策略。

为了设计在THCA合成酶基因的5’和3’末端具有双sgRNA序列的双sgRNA CRISPR/Cas9构建体：

(a)设计携带例如eGFP或荧光素酶基因靶标等报告基因的供体载体来完全取代THCA合成酶基因。

(b)使用CRISPR/cas9技术，THCAS基因的5’和3’末端都将被cas9核酸酶切割，导致DSB。然后通过同源定向的修复活性将报告基因表达盒插入到靶向基因座中来代替THCAS基因。

因此，成功编辑的大麻植物将不再表达THCAS基因，因此将不再在植物中产生精神活性化合物。此外，可以使用报告基因轻松检测和验证工程食用性大麻植物，例如，在荧光灯下的GFP或使用鲁米诺的荧光素酶。

以下是使用双sgRNA/Cas9设计在AtTFLl基因座处靶向基因替换的替代策略的设计说明。

类似的双sgRNA/Cas9基因删除方法也可以应用于任何其他大麻素合成酶，以增加其他非精神活性大麻素化合物的产量。

除上述内容外，我们还提供了对食用性大麻进行基因工程化的方法，以阻止通过橄榄醇酸途径生产大麻素，而是将大麻素的生产引导到divaricnic acid途径。这将允许divarinic衍生的大麻素(例如CDBV、CBCV、CBGV)的产生增加，以便更多此类化合物可用于进一步的研究工作，以了解其医疗益处。

为了破坏橄榄醇酸途径，我们将靶向参与将己醇上游转化为己醇辅酶A的己醇辅酶A合成酶(CsAAE1基因)，如在Stout,Joke M.et al.“The hexanoyl-CoA precursor forcannabinoid biosynthesis is formed by an acyl-activating enzyme in Cannabissativa trichomes.”The Plant journal:for cell and molecular biology 71 3(2012):353-65中报道的。

使用前面讨论的CRISPR/Cas9技术或双sgRNA/Cas9方法，我们将能够破坏或删除CsAAE1基因，从而破坏橄榄醇酸途径，因此橄榄醇酸衍生的大麻素，例如，CBD、CBC、CBG。(https://www.semanticscholar.org/paper/The-hexanoyl-CoA-precursor-for-cannabinoid-is-by-an-Stout-Boubakir/fafdc68adbf8bfb132eb700cfc9d44d47d866f30)

或者，我们还可以靶向橄榄醇酸环化酶基因以防止己酰辅酶A转化为橄榄醇酸。(https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝4.4.1.26#UNIPROT)

或者或另外，为了破坏橄榄醇酸途径，我们还可以插入并表达AdhE2，即醛脱氢酶基因，以将己酰辅酶A转化为1-己醇。(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21707101)

或者，我们也可以插入并表达烯酰辅酶A水合酶基因，以将己酰辅酶A转化为乙酰辅酶A。一旦插入成功，我们将能够破坏橄榄醇酸途径。我们可以包括任何其他可以将己酰辅酶A分解或转化为其他衍生物的酶。

可以在此处找到本发明感兴趣的DNA和肽序列：

THCA合成酶

https://www.uniprot.org/uniprot/Q8GTB6

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/pubmed/15190053-the-gene-controlling-marijuana-psychoactivity-molecular-cloning-and-heterologous-expression-of-delta1-tetrahydrocannabinolic-acid-synthase-from-cannabis-sativa-I/？i＝2&from＝/16143478/related

己酰辅酶A合成酶

https://www.uniprot.org/uniprot/H9A1V3

橄榄醇酸环化酶

https://www.brenda-enzymes.org/sequences.php？ID＝180962

醛脱氢酶

https://www.uniprot.org/uniprot/Q9ANR5

烯酰辅酶A水合酶

https://www.uniprot.org/uniprot/？query＝Enoyl-CoA+hydratase+&sort-score

删除的基因可以用报告基因替换，该报告基因可以是具有可检测标记的“二合一”报告基因。在各种实施方案中，报告基因是萤火虫荧光素酶基因。

来自萤火虫Photinus pyralis的荧光素酶基因的核苷酸序列是通过cDNA和基因组克隆的分析确定的。基因包含六个内含子，长度均小于60个碱基。荧光素酶mRNA的5’端由Si核酸酶分析和引物延伸确定。尽管荧光素酶cDNA克隆缺少开放阅读框的六个N末端密码子，但我们能够使用基因组克隆作为缺失5’序列的来源重建全长cDNA的等效物。将全长无内含子荧光素酶基因插入哺乳动物表达载体并引入猴(CV-1)细胞，在其中瞬时表达具有酶活性的萤火虫荧光素酶。此外，分离出稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞基因。删除荧光素酶基因5’-非翻译区的一部分去除了上游起始(AUG)密码子，并导致荧光素酶表达水平增加两倍。全长荧光素酶基因激活隐性或无增强子启动子的能力也因这种5’缺失而大大降低或消除。测定荧光素酶的表达提供了用于监测启动子活性的快速且廉价的方法。根据用于检测荧光素酶活性的仪器，我们估计该测定比测定氯霉素乙酰转移酶表达的灵敏度高30到1,000倍。

图10到13和表1提供了关于荧光素酶报告基因的更多细节。

表1.CV-1细胞中荧光素酶和CAT基因的相对瞬时表达水平a

^a荧光素酶表达水平相对于pSV2/L被标准化，pSV2/L被定义为100％。CAT表达水平相对于pSV2CAT被标准化，pSV2CAT被定义为100％。每个值是至少四次独立转染实验结果的平均。在细胞的重复平板的平行转染中，给定荧光素酶表达载体产生的光单位的绝对数小于±15％。

制作种子

图3显示了本发明旨在实现的种子微环境。

种子微环境是种子正常萌发所需的周围环境，包括提供营养素和除植物干细胞(拟胚体细胞)以外的前体细胞的支架。作为种子微环境的一部分，种子还需要良好的土壤成分，如下所示：

土壤成分

·保水性：50％至70％水分

·pH值为5.8-6.3

·营养素：有机物质，例如腐殖质、堆肥、蚯蚓粪、鸟粪等。

·土壤中的微生物：菌根真菌(20％)、放线菌(30％)、固氮菌(50％)

我们将创建干细胞-其他前体细胞共培养系统，以在比传统2D培养更能代表内源性3D微环境的模型中研究细胞间相互作用。该方法可以在由我们的支架生物墨水制造的生物打印的支架内可靠地接种原代细胞。

人工种子是活的种子样结构，通过一种技术实验性地制造，其中来自植物组织培养的体细胞拟胚体被水凝胶包裹，如果在土壤中生长，这种包裹的拟胚体表现得像真正的种子，并且可以用作天然种子的替代品。

人工种子的生产涉及以下步骤。

(1)愈伤组织培养的建立

(2)愈伤组织培养中体细胞胚发生的诱导

(3)体细胞胚的成熟

(4)体细胞胚的包裹

包裹后，人工种子分两步进行检测：

(1)拟胚体向植物转化的检测

(2)温室和田间种植。

体细胞胚的成熟是指胚的发育通过某些阶段完成。最初，胚发育为球形阶段，然后是心形阶段，最后是鱼雷形阶段。在最后阶段，胚达到成熟并在两端发育出用于芽和根发育的相反极。

然后这个胚开始萌发并产生组培苗。然而，在一些植物物种中，可能不会遵循这种顺序发育。同样，在一些需要冷处理以进行胚萌发的物种中，可能需要冷却年轻或成熟的胚以使其正常成熟并发育成组培苗。

在柑橘的胚萌发过程中，根和芽发育也需要应用GA3。已经发现水溶性水凝胶适用于制造人工种子。表8.1中给出了用于包裹体细胞胚的一些有用水凝胶的列表。

表8.1用于包裹的有用水凝胶

已使用两种标准化方法来包被体细胞胚：

(i)通过滴落程序进行凝胶复合；

(ii)成型。

在第一种方法中，将分离的体细胞胚与0.5至5％(W/V)海藻酸钠混合，然后滴入30-100μM硝酸钙溶液中。表面复合立即开始，液滴在30分钟内完全胶凝(见图5)。

在第二种方法中，将分离的体细胞胚与温度相关的凝胶(例如Gel-rite)混合，然后放入微量滴定板的孔中，当温度降低时，它会形成凝胶。

为了取得令人满意的结果，需要在多个领域进行研究以制造人工种子。体细胞胚需要大规模生产，成熟到以高速率和频率萌发的阶段，并且可能需要对包裹的胚进行包被以防止胶囊干燥并允许在种植过程中分离。

包裹后，最初，很难评估包被对体细胞胚的影响，因为在种植到土壤中后，包裹的胚的萌发和持续发育有时非常不一致。

因此，为了克服这个问题，在无菌条件下测试胚对植物发育或转化的胚反应。胚转化频率是产生具有正常表型的绿色植物的体细胞胚的百分比。

胚向植物的转化包括以下步骤：

(i)包裹的胚无菌放置在营养素最少的简单琼脂培养基上。

(ii)体细胞胚的均匀萌发以及根和芽系统的生长发育。

(iii)真正叶子的产生。

(iv)不存在下胚轴不足生长。

(v)具有正常表型的绿色植物。

在温室中或在田间展示人工种子之前，该测定方法应该非常重要。否则，需要进行一些修改。最终评估将是与源自真正种子的植物相比，人工种子的温室或田间性能及其产量。

人工种子的储存是很大的限制。当人工种子在低温下储存时，胚表现出转化方面的特征性下降。人工种子有限的储存时间可能是由于胶囊中的厌氧环境。

这对体细胞胚来说是一个问题，因为它们并没有发育停滞，并继续非常活跃的呼吸作用。为了克服这一限制，两种可能的解决方案是，具有较小的胶囊体积与胚体积的比值，以便气体扩散可以容易地发生，或者在包裹介质中使用生长控制剂来诱导胚中的停滞状态。

虽然人工种子的初始成本，即用于组织培养过程和包裹的劳动力和材料成本，远高于真正的种子，但使用人工种子仍然可能有一些优势。

该拟胚体材料将包括：经验证和测试的选定克隆胚材料(见下文给出的图中的“包裹的拟胚体”)证明能够在0.5-5％海藻酸钠溶液和30-100mM硝酸钙溶液中转化并生长为植物。这是个“软件”，因为它包含所有必要的信息和说明，使“独特的种子”能够萌发成我们先前设计的选定的基因工程植物。

一旦“胚向植物的转化”被证实是成功的，胚内容物或成分将被用作生物墨水的成分(包括报告基因，其指示已成功进行基因重组并删除期望的基因)用于后续的3D打印。

3D打印种子

美国专利公开号20180184702和“3D bioprinting of vascularized,heterogeneous cell-laden tissue constructs”Kolesky et al.Advanced Materials2014,Materials Science,Medicine DOI:10.1002/adma.201305506中包含的公开内容被援引加入本文。

我们开发了合适的3D打印机(如图6所示)，可将植物矿物营养物质和种子混合物打印成可定制的形状。如果轻轻地给打印的种子浇水，种子就会萌发。

报道了新的用于制造充满脉管系统、多种类型的细胞和细胞外基质的3D组织构建体的生物打印方法。这些错综复杂的异质结构是通过在三个维度上精确地共同打印多种材料(称为生物墨水)来创建的。这些3D微工程环境为药物筛选和伤口愈合、血管生成和干细胞生态位的基础研究开辟了新途径。

三维(3D)体外建模越来越重要，因为二维(2D)培养物已被认为对再现植物体内复杂的内源性条件具有局限性。此外，制造技术比以往任何时候都更容易获得。尤其是生物打印是增材制造技术，它通过精确地将细胞嵌入充当临时细胞外基质(ECM)的3D生物材料支架中来扩展体外研究的能力。更重要的是，生物打印具有巨大的定制潜力。这允许用户操纵支架设计、生物材料选择和细胞类型等参数，以创建专门的仿生3D系统。3D系统的开发对于再现种子微环境很重要。植物干细胞是种子中的关键群体，已知可以与其他前体细胞进行交流，以帮助它们过渡到萌发阶段。

我们将创建干细胞-其他前体细胞共培养系统，以在比传统2D培养更能代表内源性3D微环境的模型中研究细胞间相互作用。该方法可以在由CELLINK Bioink制造的生物打印的支架内可靠地接种原代细胞。由于生物打印是高度可定制的技术，因此可以容易地改变该方法中描述的参数(即细胞-细胞比值、支架尺寸)以服务于其他应用，包括对3D生物打印的不含THC大麻种子的生产的研究。

生物墨水还含有不含THC的大麻品系的细胞外基质。由于转基因干细胞会通过愈伤组织培养生长成愈伤组织。愈伤组织是未特化的、无组织的、生长和分裂的细胞团。它是在外植体(这里我们指的是基因工程化的无THC的植物细胞)在适当的固体培养基上培养时产生的，生长素和细胞分裂素都处于正确的条件下。来源于基因工程化的外植体的人工种子(胚)将形成组合物以制造生物墨水，该生物墨水然后是3D打印专有形状的种子所需的。

然后可以使用这种愈伤组织来诱导体细胞胚发生(见图4和5)。体细胞胚发生是发育过程，其中植物体细胞可以去分化为全能胚胎干细胞，该全能胚胎干细胞具有在适当条件下产生胚的能力。这个新胚可以进一步发育成整株植物。并非所有新胚都可以发育成植物，因此我们需要先验证这一点，然后才能使用该经验证的胚的内容物或成分(包括其血管网络)作为生物墨水，用于制造具有独特形状的专有3D打印的种子。这些具有独特形状的打印的种子将是专有的，因为它们既非显而易见也不是自然发生。用3D支架打印种子以允许它们发育成适当的茎和根血管结构也可能是专有的。

从胚中产生的不含GM THC的食用性大麻植物干细胞和其他细胞生物材料可用作生物墨水和生物材料(“软件”)，以创建3D生物打印的不含THC的食用性大麻种子/荚果品系，所述胚是由成功基因工程化的食用性大麻植物干细胞的高产大麻素品系生长而成的愈伤组织产生的。

不含THC的食用性大麻品系使用3D生物打印创建出与传统种子相比具有不同形状的种子，作为监管机构易于识别的独特标记，证明这些大麻确实是不含THC的大麻。

种子可以打印成任何形状、大小或颜色，例如方形而不是椭圆形，或粉红色而不是正常的种子颜色。

种子包括可以再生并长成新植物的任何植物干细胞或细胞材料。

使用含有土壤成分(如上所述)和前体细胞(顶端分生组织、侧生分生组织和维管系统)和植物生长调节剂(比例为80％生长素和20％细胞分裂素)的生物墨水，将支架、发芽阵列和播种系统打印为一个种子微环境系统(“硬件”)。

图7、8和9显示了3D生物打印过程。实现以下层，即3层支架和阵列(“硬件”)：

第1层：70％植物生长调节剂、20％前体细胞(80％顶端分生组织、20％维管系统细胞)和10％土壤成分。

第2层：20％植物生长调节剂、30％前体细胞(50％侧生分生组织、50％维管系统细胞)和50％土壤成分。

第3层：10％植物生长调节剂、20％前体细胞(80％顶端分生组织、20％维管系统细胞)和70％土壤成分。

生物墨水(“软件”)(打印5层)：

最内层：含有植物生长的胚状细胞混合物，包括转基因DNA指令(instruction)(70％)加上顶端分生组织细胞混合物(10％)加上侧生分生组织混合物(10％)加上维管系统(包括形成层)细胞混合物(10％)

相邻胚的层：心皮细胞混合物

相邻心皮的层：壳斗(cupule)细胞混合物

相邻壳斗的层：花萼细胞混合物

相邻花萼的层：托叶细胞混合物

该生物打印机在三个按钮正上方显示温度(5摄氏度至25摄氏度)、压力(1至120PSI)和液滴/喷嘴(每秒1-10,000个液滴)设置。分辨率/液滴大小，我们使用了10微米到1毫米。

下面介绍生物打印机的各个部分：

打印头安装——在生物打印机上，打印头连接到沿水平轨道运行的金属板上。x轴电机推动金属板(和打印头)从一侧到另一侧，允许材料沿任一水平方向沉积。

升降机——金属轨道在机器后部垂直运行，升降机由z轴电机驱动，上下移动打印头。这使得可以堆叠连续的材料层，一层在下一层之上。

平台——机器底部的架子为器官在生产过程中提供了停留的平台。平台可以支撑支架、有盖培养皿或孔板，其中可以包含多达24个小凹陷以容纳用于测试的器官组织样本。第三个电机沿y轴前后移动平台。

储液器——储液器连接到打印头并在打印过程中保存要沉积的生物材料。这些相当于喷墨打印机中的墨盒。

打印头/注射器——泵迫使材料从储液器向下通过位于平台正上方的小喷嘴或注射器。当材料被挤出时，它在平台上形成一层。

三角测量传感器——当打印头沿x、y和z轴移动时，小型传感器跟踪每个打印头的尖端。软件与机器进行通信，以便在整个过程中知道打印头的精确位置。

微凝胶——与您在家中装入打印机的墨水不同，生物墨水是有生命的，因此它需要食物、水和氧气才能生存。这种滋养环境由微凝胶提供——想想富含维生素、蛋白质和其他维持生命的化合物的明胶。研究人员要么在打印前将细胞与凝胶混合，要么从一个打印头挤出细胞，从另一个打印头挤出微凝胶。无论哪种方式，凝胶都有助于细胞保持悬浮状态并防止它们沉降和结块。

使用的生物墨水：如上所述的两种与种子相关的专有生物墨水。“硬件”生物墨水用于打印具有支架和萌发阵列等的种子微环境集成系统。“软件”生物墨水用于打印具有生长能力以萌发成植物的实际种子，包含胚状细胞材料和其他分生组织和维管干细胞材料。使用上面的两种生物墨水(“软件”和“硬件”类型)，我们始终可以对3D生物打印机进行编程，以根据所需的专有形状或颜色打印种子，这些特定功能与野生型种子完全不同。

在一个示例中，3D生物打印机如图6所示。它具有用于打印细胞生物墨水5和水凝胶10的打印头、加热站15和冷却站20、用于容纳生物墨水的储液器、玻璃毛细管30、激光校准模块35和打印台40。还包括紧急停止按钮45。

结论

独特之处在于，我们的3D打印种子不仅包含转基因细胞内容物，还包含种子萌发成发育完全的植株所需的拟胚体材料。特别是，我们已经在我们独特的种子中产生了THCA合成酶表达的永久性转化，并且我们已经进行了验证分析来证明这一点。

传统的3D打印只打印我们在绿色部分给出的支架，这本身并没有创造性，但我们打印的种子必须有种子微环境，构建为分子支架，以支持其随后作为萌发种子的生长。

创建人工种子的益处包括以下方面：

易于处理—在储存、运输和种植期间，因为它们体积小。

运输成本低—背后的原因是体积小。

储存期—更长，种子活力在更长的时间内保持良好。

产品一致性—因为使用的体细胞胚在基因上是相同的。

为了避免濒危物种的灭绝—例如，刺猬仙人掌(hedgehog cacti)(Echinocereussp.)

大规模繁殖—非常适合大规模单一栽培。

混合基因型种植—也适用于此，如单一栽培。

种质保存—在种质保存中很重要。

优良植物基因型—人工种子技术保存/保护并允许优良植物基因型的经济大规模繁殖。

非季节依赖性的技术

允许直接在田间使用—生根、硬化是必要的，就像在组织培养植物中一样。它允许直接田间播种。

有助于研究种皮形成、胚乳在胚发育和种子萌发中的功能、体细胞克隆变异。

有益佐剂的供应—有益佐剂如植物营养素、植物生长调节剂、微生物、杀真菌剂、菌根、抗生素可以根据需要添加到基质中，以供发育中的植物胚使用。

无法产生有活力的种子的植物的繁殖。

杂交生产—合成种子生产技术可用于生产基因型不稳定或种子不育的杂交种。它可以与胚拯救技术结合使用。用这种技术可以将获救的胚包裹起来。

易于识别和标记—可以引入示踪剂/标记物，例如，可见染料/荧光标记物/微芯片，便于标记和识别。

(1)真正的种子是在生殖阶段结束时通过复杂的有性繁殖过程在植物中产生的。植物可能需要很长或很短的时间才能达到生殖阶段。因此，我们必须等到植物生殖阶段结束才能获得种子。但是人工种子至少在一个月内就可以获得。不需要等待很长时间。

(2)植物在一年中的特定季节开花并产生种子。但人工种子的生产与时间或季节无关。在任何时间或季节，人们都可能获得植物的人工种子。

(3)偶尔，由于一些植物的种子存在较长的休眠期，对这些植物的工作会被推迟。通过种植人工种子，这个时期可以缩短。使用人工种子，可以缩短植物的生命周期。

(4)迄今为止，已经在许多物种中观察到体细胞胚发生，这表明在几乎任何想要的作物中生产人工种子都是可能的。在一些作物中已经取得了成功的结果，例如芹菜、胡萝卜、玉米、莴苣、苜蓿、芸苔属、陆地棉等。

(5)人工种子将适用于大规模单一栽培以及混合基因型种植。

(6)它为减数分裂的不稳定的优良基因型提供保护。

(7)人工种子种皮(coating)还具有保持和递送有益佐剂用于精确放置的潜力，所述佐剂例如促进生长的根寄生细菌(thizobacteria)、植物营养素和生长控制剂以及杀虫剂。

(8)人工种子有助于研究胚乳和种皮形成的作用。

优于基因工程突变体。相同的形状，很难区分不含THC的品系和非不含THC的品系，因为形状是相同的。

即使是识别此类品系的最佳认证方法，在本质上也只是预防性和威慑性的，而不是绝对可靠的解决方案。

虽然在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行许多变化或修改。

Claims (11)

1.一种用于生产可萌发成植物的转基因大麻种子的方法，所述方法包括：

(a)制备包含基因工程化的大麻细胞的细胞培养物，所述基因工程化的大麻细胞删除至少一个表达精神活性大麻素的基因；

(b)建立愈伤组织培养以形成体细胞胚；

(c)形成包含体细胞胚的生物墨水；和

(d)三维(3D)打印种子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括从野生型大麻植物获得细胞并遗传删除至少一个表达精神活性大麻素的基因，其中大麻植物包含高水平的CBDV含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中删除的至少一个表达精神活性大麻素的基因是编码选自由THCA、THC、THCVA和THCV组成的组的精神活性大麻素的基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是THCA合成酶基因。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括用报告基因替换所述至少一个表达精神活性大麻素的基因的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个报告基因还包括可检测标记。

7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述报告基因是萤火虫荧光素酶基因。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在3D打印步骤(d)之前包裹体细胞胚。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(d)打印具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状的种子。

10.一种萌发成植物的转基因大麻种子，其中所述种子具有不同于天然存在的野生型大麻种子的形状。

11.由根据权利要求1至9中任一项所述的方法产生的种子产生的植物，或由根据权利要求10所述的种子产生的植物。

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