CN113908292B - 靶向物介导的核酸纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向物介导的核酸纳米制剂及其制备方法。本发明特别涉及一种转铁蛋白(Tf)介导的LNP(Tf‑LNP)及其制备方法和应用。

Description

靶向物介导的核酸纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于核酸药物递送技术领域。
背景技术
癌症是一类常年困扰人们的病症。常规化药治疗往往具有毒副作用大、容易产生耐药性、存在无法靶标位点等缺点。
近年来通过核酸药物治疗癌症取得了较大进展。核酸药物包括反义核苷酸、小干扰RNA、质粒DNA、信使RNA、CRISPR/Cas9等。核酸分子由于其较高的负电荷密度和亲水性，通常难以被细胞有效的摄取，因此核酸药物对递送载体具有较强的依赖性。目前已有多种核酸药物及其递送载体进入临床实验阶段，包括脂质复合物(LPX)、腺相关病毒(AAV)、腺病毒(AdV)、脂质纳米颗粒(LNP)、聚合物载体等。
对于核酸药物的递送，通常需要关注如下方面：(1)转染效率。递送载体不仅需要能够被肿瘤细胞快速摄取，还要能够实现内涵体逃逸，将核酸药物释放至细胞质或细胞核。(2)粒径和粒径分布。在较理想的情况下，递送载体的粒径应不大于150nm，PDI不高于0.2，这样核酸药物制剂能够更好地在血管、淋巴管、毛细血管、细胞间质等空间内转运，更有效地将药物递送至目标细胞。(3)免疫原性。载体本身通常不应对生物体的免疫系统有显著的激活效应，因为这些内源性免疫反应会增强生物体对核酸药物制剂的清除、降低转染效率，并可能产生程度不等的不良反应。(4)包封率。即排除游离核酸药物后，有多少核酸药物是被牢固装载在递送载体内部的。包封率较低的制剂不仅会浪费核酸药物、提高生产成本，同时游离核酸药物也更容易激活生物体的免疫系统，进一步降低药效、增加安全性风险。(5)药代动力学研究。需要明确载体的给药途径、体内循环时间、各脏器富集效率、目标细胞群转染效率等，从而评估递送载体与适应症是否匹配。同时，一些递送载体由于代谢速率较慢，长期多次给药是否会产生累计毒性也是值得关注的。
与其他类型的载体相比，LNP在上述多个方面具有较显著的优势：(1)可离子化脂质一方面在生理条件下近中性，降低了阳离子材料带来的潜在毒性；同时能够在细胞内的低pH条件下通过膜融合机制破坏内涵体、提高转染效率；(2)通过微流控设备制备，LNP的粒径、粒径分布和包封率均能够实现较好的质量控制；(3)作为非病毒类载体，LNP在降低免疫原性方面有较大优势；(4)通过控制给药途径、剂量、频次，LNP可分别以肝脏、淋巴结、肿瘤等组织作为治疗靶点。然而，LNP的递送通常不具有明确的器官/细胞选择性，可能存在靶向性差、对目标细胞转染效率差等原因进而造成较强的不良反应及不稳定的药效等结果，限制了LNP在包括肿瘤治疗在内的某些适应症方面的应用。因此，在LNP粒子表面修饰肿瘤细胞特异性的靶向物，可以显著提高LNP在特定肿瘤细胞系的摄取效率、降低由于脱靶效应带来的不良反应。
靶向物，例如转铁蛋白(Transferrin,Tf)，是和生物体内铁元素转运、代谢密切相关的一种蛋白。Tf的分子量约为77kDa，在人体内可以脱铁形式(apo-Tf)或含铁形式(holo-Tf)存在，holo-Tf通常结合有2个铁原子。Tf的细胞表面受体为转铁蛋白受体(Transferrinreceptor,TfR)。有研究表明，在许多肿瘤细胞系和从患者获得的肿瘤样本中均检测到了高表达的TfR。已有研究者尝试将Tf作为纳米药物递送载体的靶向物，例如，Wang等人(Wang,et al,International Journal of Nanomedicine,2012,7,2513-2522)首先制备了固体脂质纳米粒(SLNs)，与pDNA复合后，通过向溶液中掺入Tf-PEG-PE，以对SLNs表面进行修饰，将SLNs对于HepG2实体瘤的pDNA体内递送效率相较于无靶向组提高了约2倍；Zhang等人(Zhang,et al,Oncology Reports,2017,37,937-944)通过掺入法制备了Tf-PEG-DSPE和HA-PEG-DSPE双靶向修饰的纳米结构脂质载体(NLCs)，将NLCs对A549实体瘤的pDNA体内递送效率相较于无靶向组提高了约2倍；Li等人(Li,et al.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,and Medicine,2017,13,371-381)通过三通道微流控芯片，首先制备了包载存活蛋白(survivin)siRNA的LNP中间体，然后将Tf-PEG-chol插入LNPs表面，所得的靶向LNP对HepG2实体瘤的生长抑制效率相较于无靶向组提高了约50％。同时，目前已有两项以Tf作为靶向物的抗肿瘤纳米制剂进入了临床阶段。MBP-426是由Mebiopharm公司开发的脂质体制剂，在包载奥沙利铂后，将脂质体表面的活性基团键合Tf的氨基，实现了对脂质体的Tf修饰。该一期临床试验中，对进展期肿瘤或转移型肿瘤的患者每三周静脉输注该靶向脂质体制剂，耐受性良好。CALAA-01是由Arrowhead主导的全球首款进入临床试验的肿瘤治疗siRNA靶向纳米制剂。其主要成分为环糊精、PEG-金刚烷和Tf-PEG-金刚烷，由环糊精静电结合siRNA后，PEG-金刚烷对载体进行稳定，Tf对患者的实体瘤进行靶向。由于该载体的体内稳定性较差，约21％的患者由于不良反应而退出了临床试验。尽管如此，对患者的黑色素瘤样本切片的分析结果表明，siRNA在肿瘤组织中有剂量相关性积累，相关基因的表达受到了抑制，并且癌旁组织中siRNA蓄积量显著低于肿瘤，表明Tf确实有良好的体内肿瘤靶向性。
目前在LNP、脂质体、SLN、NLC等以脂质为主要成分的脂质载体表面修饰靶向物(如Tf)的方式主要为以下两种：(1)掺入法，首先制备脂质载体，然后在经过透析、超滤、切向流过滤等方法去除有机溶剂、使脂质载体稳定后，向溶液中加入连接有靶向物(如Tf)的脂质。靶向物脂质具有两亲性，其疏水基团会插入到脂质载体的脂质层中，从而完成对脂质载体的靶向物修饰。掺入法的具体方法可参考前述Zhang等人和Wang等人公开的方法。(2)化学键合法，在制备脂质载体时加入含有活性基团A的脂质材料，这里的脂质主要指PEG化脂质，如PEG-DMG、PEG-DSPE等，活性基团A主要指可以在无需额外添加催化剂的温和条件下与另一基团B高效反应的基团对，如叠氮(A)—大环炔(B)，N-羟基琥珀酰亚胺(A)—氨基(B)，马来酰亚胺(A)—巯基(B)等，活性基团通常连接在PEG末端。完成脂质载体的制备后，将靶向物(如Tf)首先用活性基团B修饰，然后加入到脂质载体的溶液中，匀速搅拌混合使A与B反应，完成对脂质载体的靶向物修饰。化学键合法的具体方法可参考专利CN101170995B和专利US20190062788A1。
然而，以上脂质载体表面靶向物(如Tf)修饰方式存在诸多缺陷：
对于掺入法，其存在的缺陷包括但不限于：(1)靶向物修饰的聚合物缀合脂质的插入效率不明确/低下，由于靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG-DMG)是在LNP已组装完成的情况下加入的，因此所述靶向物修饰的聚合物缀合脂质需要插入LNP的脂质层才能完成修饰，否则会以单分子胶束或聚集胶束的形式存在于溶液中，成为杂质。由于组装完成的LNP表面已覆盖有一层聚合物缀合脂质(如PEG-DMG)，聚合物(如PEG)的空间位阻会导致新加入的靶向物脂质难以高效插入LNP脂质层，因此掺入法修饰效率不明确/低下，而过量加入靶向物修饰的聚合物缀合脂质会造成原料浪费并使得后续纯化未掺入LNP中的游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如游离的Tf-PEG脂质)的工作更为繁琐复杂；(2)靶向物修饰的聚合物缀合脂质的投料量大且需要在制备靶向物介导的LNP(如Tf-LNP后)去除游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG脂质)，费时费力；(3)修饰过程中脂质纳米颗粒的结构变化可能降低药效、生产批间差较大等，因此难以进行放大生产，未能进入临床研究阶段。此外，由于核酸药物通常对温度比较敏感，因此相关药物制剂的制备流程应尽可能短、制备工艺尽可能简单，减少核酸药物在4℃-25℃范围内的降解过程。
对于化学键合法，其存在的缺陷包括但不限于：(1)需要对A—B基团的反应温度、反应时长、投料比、反应效率进行详细的研究，且反应完毕后还需要额外步骤来去除未反应的靶向物；(2)活性基团的稳定性难以完全得到保证，如N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺比较容易水解，大环炔比较容易氧化。因此，若脂质纳米颗粒在完成制备到进行靶向物(如Tf)修饰之间的间隔过长，会较大地降低修饰效率；(3)化学修饰后需要去除未反应的靶向物(如Tf)，费时费力。
另外，而无论是化学键合法还是掺入法，在脂质纳米颗粒的标准生产流程之外都需要额外加入修饰步骤，为核酸药物的稳定性带来了不利影响，进一步增加了质量控制的难度。
为了克服以上缺陷，本发明以微流控生产技术为基础，通过将靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG2k-DMG脂质)与初始物料按一定顺序和比例混合后，采用一步法实现对核酸药物的包封，达到制备靶向物修饰LNP的目的。具体地，本方法具有以下优势：(1)微流控生产LNP的技术是一项比较成熟的核酸药物制剂生产技术，工艺稳定性好、流程简单，放大参数可预期，有相关产品上市(
Figure BDA0003301212540000031
等)；(2)本发明的制备方法中，靶向物修饰的聚合物缀合脂质使用量低，减少制备工艺过程中的物料浪费，大大降低生产成本；(3)本发明的方法与已有策略相比，无需检测和去除未反应的靶向物基团，因此具有更精准的质控，且制备靶向物修饰的LNP(如Tf-LNP)后无需去除未掺入到LNP中的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG脂质)(相对于掺入法)或未与LNP反应的靶向物(如Tf)(相对于化学键合法)；(4)本发明的方法采用一步法制备工艺，简单快速，可最大程度地降低制备过程中对核酸药物的破坏和降解，有利于核酸原料药的稳定和完整；(5)与靶向脂质体相比，该制备过程中LNP的形成机制与传统LNP相似，即靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG脂质)会暴露在制剂表面，进而排除在脂质体制备过程中靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG脂质)被包裹于内侧的比例，达到靶向物发挥效率的最优化。(6)该方法中靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如Tf-PEG脂质)的投料量在总脂质中的投料量小，有较好的规模化生产和应用推广潜力。例如，本发明中Tf-PEG2k-DMG的投料量仅占总脂质投料量的2.68％，且对肿瘤细胞的靶向效率提高3-5倍；连续多次生产批次得到的产品质量一致性良好，有优异的规模化生产和应用推广潜力。
发明内容
本发明涉及一种制备靶向物介导的脂质纳米颗粒(LNP)的方法，包括以下步骤：
将靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如转铁蛋白(Transferrin,Tf)修饰的PEG脂质，优选Tf-PEG2k-DMG)溶于二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1,4-二氧六环，或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，即为溶液A；
将可离子化脂质(优选可离子化阳离子脂质)、中性脂质、胆固醇或其类似物和聚合物缀合脂质(如PEG脂质)溶于乙醇中，即为溶液B；
将所述溶液A加入所述溶液B中进行预混合，即为溶液C；
将核酸(如mRNA、siRNA、反义寡核苷酸(ASO)、saRNA，或miRNA)溶于pH3.0-5.0的缓冲液(如苹果酸或柠檬酸或醋酸缓冲液)中，即为溶液D；
将所述溶液C与所述溶液D以体积比为约1:3的比例混合(优选在微流控芯片中混合)，即为溶液E；
其中所述溶液E中所述核酸的量优选占所述溶液E中所述可离子化脂质量的2％至10％质量百分比(优选6％-9％质量百分比，更优选8.8％质量百分比)；和
纯化所述溶液E，并收集靶向物介导的LNP。
在进一步的实施方案中，所述纯化步骤包括将充分混合后的溶液E在pH＝7.4PBS，或pH＝8.0Tris中透析16h，以去除乙醇，得到靶向物修饰的LNP产品。
在进一步的实施方案中，纯化步骤包括将充分混合后的溶液E在含有冷冻保护剂的pH＝7.4PBS，或pH＝8.0Tris中透析16h，以去除乙醇，得到LNP产品。冷冻保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖等，优选为质量浓度为5％-8％的蔗糖。
在溶液A与溶液B中预混合后，由于游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质(如游离的Tf-PEG脂质，优选如游离的Tf-PEG2k-DMG)是预先和其他脂质溶液混合的，在通过微流控制备LNP时，每个纳米粒子已包含了脂质混合溶液中的所有脂质，因此在后续的步骤中溶液中不会存在游离的靶向物修饰的聚合物缀合脂质等杂质，进而在溶液E中制备了靶向物修饰的LNP(如Tf-LNP)后，不需要从溶液E中除去游离的靶向物修饰的缀合物聚合物脂质(如游离的Tf-PEG脂质，优选如游离的Tf-PEG2k-DMG)的步骤。
在进一步的实施方案中，所述溶液C中各脂质成分的摩尔百分比分别为：可离子化脂质50-65％、中性脂质3-15％、胆固醇30-40％、聚合物缀合脂质0.5-2％、靶向物修饰的聚合物缀合脂质0.001-1％。
在进一步的实施方案中，所述溶液C中的靶向物修饰的聚合物缀合脂质为Tf修饰的PEG脂质(如Tf-PEG2k-DMG)，其中各脂质成分在溶液C中的摩尔百分比分别为：可离子化脂质50-65％、中性脂质3-15％、胆固醇30-40％、PEG脂质0.5-2％、Tf修饰的PEG脂质0.001-0.02％。
在进一步的实施方案中，所述溶液C中的可离子化脂质为Dlin-MC3-DMA或SM102、中性脂质为DSPC、聚合物脂质为PEG2k-DMG、靶向物修饰的聚合物脂质为Tf-PEG2k-DMG，其中各脂质成分在溶液C中的摩尔百分比分别为：Dlin-MC3-DMA或SM102 50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.495-1.48％、Tf-PEG2k-DMG 0.005-0.02％。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备Tf介导的LNP的方法，包括如下步骤：
将Tf-PEG2k-DMG溶于DMSO、DMF，1,4-二氧六环，或NMP中，即为溶液A；
将可离子化脂质(优选Dlin-MC3-DMA或SM102)、中性脂质(优选DSPC)、胆固醇和PEG2k-DMG溶于乙醇中，即为溶液B；
将所述溶液A加入所述溶液B中进行预混合，即为溶液C，其中各脂质成分在溶液C中的摩尔百分比分别为：Dlin-MC3-DMA或SM102 50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.495-1.48％、Tf-PEG2k-DMG 0.005-0.02％；
将核酸(优选mRNA)溶于pH3.0-5.0的苹果酸或柠檬酸或醋酸缓冲液中，即为溶液D；
将所述溶液C与所述溶液D以体积比为约1:3的比例混合(优选在微流控芯片中混合)，即为溶液E；
其中所述溶液E中所述核酸的量优选占所述溶液E中所述可离子化脂质量的2％至10％质量百分比(优选6％-9％质量百分比，更优选8.8％质量百分比)；
纯化所述溶液E，并优选收集靶向物介导的LNP；
在进一步的实施方案中，所述纯化步骤包括将充分混合后的溶液E在pH＝7.4PBS，或pH＝8.0Tris中透析16h，以去除乙醇，得到靶向物介导的LNP。
在进一步的实施方案中，纯化步骤包括将充分混合后的溶液E在含有冷冻保护剂的pH＝7.4PBS，或pH＝8.0Tris中透析16h，以去除乙醇，得到LNP产品。冷冻保护剂为甘油、海藻糖、蔗糖等，更优选地，所述pH＝7.4PBS或pH＝8.0Tris缓冲液中含有5-8％质量浓度的蔗糖。
LNP中的可电离的脂质或阳离子脂质可以是可阳离子化的(可离子化脂质)，即当pH降低到脂质的可电离基团的pK以下时，它会质子化，但它在较高的pH值下逐渐变为中性。在低于pK的pH值下，脂质能够与带负电荷的核酸缔合。在一些实施方案中，阳离子脂质包括两性离子脂质，该两性离子脂质在pH降低时呈现正电荷。
在一些实施方案中，本发明的LNP可包含可离子化脂质(ionizable lipids)，此类脂质包括但不限于：N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、1，2-二油酰基三甲基丙烷氯化铵(DOTAP)(也称为N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵和1，2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二甲基-2，3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1，2-二-γ-亚油酰氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1，2-二亚油酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二油酰氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1，2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N，N-二亚油酰基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油酰氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油酰氧基-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3，或称为二亚油酰基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA))、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮杂二基)双十二-2-醇(C12-200)、2，2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2，2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、3-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基氧)-N，N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-基氧)-N，N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、
Figure BDA0003301212540000051
(可从纽约州格兰德岛的GIBCO/BRL商购获得的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1，2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE))；
Figure BDA0003301212540000052
(可从GIBCO/BRL商购获得的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2，3-二油酰氧基丙基)-N-(2-(精胺羧酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE))；和
Figure BDA0003301212540000053
(可从威斯康星州麦迪逊市的Promega Corp.商购获得的阳离子脂质，其包含在乙醇中的二十八烷基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(DOGS))，SM-102(或称为SM102、十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((癸氧基)己基)氨基)辛酸酯)；CAS号：2089251-47-6)或上述的任意组合。
在一些实施方案中，本发明的可离子化脂质是可离子化阳离子脂质(ionizablecationic lipid)，如Dlin-MC3-DMA或SM-102。
在一些实施方案中，本发明的中性脂质是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷。此外，本发明的中性脂质还可以选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰脂酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰脂酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1，2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)，优选地，中性脂质选自DSPC。
在一些实施方案中，本发明的胆固醇类似物可以是胆固醇、β-谷甾醇、粪甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸，或α-生育酚。
在一些实施方案中，本发明的聚合物缀合脂质可以是PEG脂质，所述PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8’-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3’,6’-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，获自Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama，USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOFTokyo，Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C18。
在一些实施方案中，用于本发明LNP的靶向物可以是特异性靶向肿瘤细胞或其他感兴趣细胞的受体的配体。术语“配体”指特异性针对特定靶物的的结合部分。靶向物可以是配体、受体、蛋白质、小分子、半抗原和/或任何其他相关分子。此外，“靶向物”也指抗体或其抗原结合片段，包括但不限于：Fv片段、scFv片段、F(ab’)2片段、单域抗体、骆驼化抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段等。此外，抗体还可以是多价抗体(如二价抗体、三价抗体、四价抗体等)。
在一些实施方案中，术语“核酸”或“核酸分子”将被本领域普通技术人员认识和理解，例如旨在表示包括核酸组分，优选由核酸组分组成的分子。术语核酸分子优选是指DNA或RNA分子。优选与术语多核苷酸同义使用。优选地，核酸或核酸分子是包含核苷酸单体或由核苷酸单体组成的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸酯骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。术语“核酸分子”还涵盖经修饰的核酸分子，例如本文所定义的碱基修饰的、糖修饰的或骨架修饰的DNA或RNA分子。核酸可以包括天然核酸和人工核酸。如本文所使用的术语“人工核酸”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示非天然存在的人工核酸。人工核酸可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂交分子。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸以对应于所需的人工核苷酸序列(异源性序列)。在本发明的上下文中，人工序列通常是天然不存在的序列，即它与野生型序列相差至少一个核苷酸。如本文所使用的术语“野生型”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在表示天然存在的序列。此外，术语“人工核酸”不限于意指“单个分子”，而是通常应理解为包括基本上相同的分子的集合。人工RNA：如本文所使用的术语“人工RNA”旨在表示非天然存在的RNA。换句话说，人工RNA可以被理解为非天然核酸分子。这样的RNA分子由于其单独的序列(其不是天然存在的，例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或由于其他修饰，例如不是天然存在的核苷酸的结构修饰而可以是非天然的。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工RNA以对应于所需的人工核苷酸序列(异源性序列)。在本发明的上下文中，人工RNA序列通常是天然不存在的序列，即它与野生型序列相差至少一个核苷酸。术语“人工RNA”不限于指“单个分子”，而是通常应理解为包括基本上相同的分子的集合。因此，它可以涉及等分试样或样品中包含的多个基本上相同的RNA分子。在本发明的上下文中，本发明的RNA是如本文定义的人工RNA。
在一些实施方案中，所述mRNA包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括，例如，5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)、和/或2-硫代-尿苷(“2sU”)。参见，例如，用于论述此类残基及其并入mRNA内的美国专利No.8,278,036或WO2011012316。mRNA可以是RNA，其被定义为RNA，其中25％的U残基为2-硫代-尿苷且25％的C残基为5-甲基胞苷。用于使用RNA的教义是公开的美国专利公布US20120195936和国际公布WO2011012316，这两者据此通过引用整体并入。非标准核苷酸残基的存在可致使mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA具有更高的稳定性和/或更低的免疫原性。在另外的实施方案中，所述mRNA可包含选自以下的一个或多个非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶、以及这些修饰与其它核碱基修饰的组合。某些实施方案还可以包括对呋喃糖环或核碱基的额外修饰。额外修饰可以包括，例如，糖修饰或取代(例如，2’-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)的一种或多种)。在一些实施方案中，RNA可与额外多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰为2’-O-烷基修饰的实施方案中，此类修饰可以包括但不限于2’-脱氧-2’-氟修饰、2’-O-甲基修饰、2’-O-甲氧基乙基修饰和2’-脱氧修饰。在某些实施方案中，任何这些修饰可存在于0-100％的核苷酸中-例如，大于0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％、或100％的单独或组合的组分核苷酸。
信使RNA(mRNA)：如本文所使用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一个多肽的多核苷酸。如本文所使用的mRNA涵盖修饰和未修饰的RNA。mRNA可含有一个或多个编码和非编码区域。mRNA可从天然来源纯化、使用重组表达系统来产生并且任选地纯化、化学合成等。在适当情况下，例如，在化学合成分子的情况下，mRNA可包括核苷类似物如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另外指示，否则mRNA序列以5’至3’方向来呈现。在一些实施方案中，mRNA为或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；夹层碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。
在一些实施方案中，mRNA可含有RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是RNA中含有的核苷酸的骨架的磷酸被化学修饰的修饰。示例性骨架修饰通常包括但不限于，由以下组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5’-O-(1-硫代磷酸酯))、硼代磷酸酯、荷正电的胍盐基团等，这意指用其它阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键联。
在一些实施方案中，本发明LPN中使用的mRNA可以包含以下结构元件的一个或多个：增强子、启动子、5’UTR、Kozak、目标多肽/蛋白编码序列、WPRE、3’UTR、polyA序列等。在一些实施方案中，前述目标多肽/蛋白编码序列可以仅编码一个多肽/蛋白，也可以也可以编码多个多肽或蛋白。例如，目标多肽/蛋白编码序列可以包含ORF1、可切割序列(如T2A或P2A)、ORF2。若目标基因所编码的多肽为分泌肽，则目标基因也可以包含信号肽序列。
在一些实施方案中，本发明的LNP中的核酸为mRNA、siRNA、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide(ASO))、saRNA，或miRNA。
在一些实施方案中，本发明的LNP含编码Cas核酸酶的mRNA(如Cas9)。在进一步的实施方案中，本发明的LNP含编码Cas核酸酶的mRNA(如Cas9)和gRNA(如dgRNA或sgRNA)。
在一个实施方案中，本发明的LNP中的核酸为mRNA，其编码针对感兴趣的蛋白质(如肿瘤抗原、VEGF、ApoE、Apo(a)等)的抗体、抗原(如病毒来源的免疫原性肽(如HPV E6或HPV E7))、细胞因子(如白介素(如IL-2、IL-7、IL-12)、肿瘤坏死因子、干扰素)、治疗性蛋白(如FIX因子、人精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、人运动神经元生存蛋白1(SMN))等感兴趣的蛋白质。
在一个实施方案中，siRNA或antisense RNA针对的靶标包括但不限于：apo(a)、APOE4、VEGF等。
在一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的方法制备得到的靶向物介导的LNP(如Tf-LNP)。
在一个实施方案中，本发明的涉及向细胞中递送核酸的方法，包括向细胞中递送本发明所述的靶向物介导的LNP。优选地，所述细胞为哺乳动物细胞。优选地，所述细胞为肿瘤细胞。优选地，所述哺乳动物为人。所述方法不用于受试者的疾病的诊断和/或治疗。
在一个实施方案中，本发明涉及通过本发明方法制备的靶向物介导的脂质纳米颗粒在制备药物中的用途。
附图说明
图1示出了掺入法制备本发明Tf-LNP的流程图。
图2示出了通过掺入法制备包载luciferase mRNA的Tf-LNP后，体外转染Hela细胞24h后的细胞内luciferase表达水平。
图3示出了化学键合法制备本发明Tf-LNP的流程图。
图4示出了通过化学键合法制备包载luciferase mRNA的Tf-LNP后，体外转染Hela细胞24h后的细胞内luciferase表达水平。
图5示出了水相预混法制备本发明Tf-LNP的流程图。
图6示出了通过水相预混法制备包载luciferase mRNA的Tf-LNP后，体外转染Hela细胞24h后的细胞内luciferase表达水平。
图7示出了乙醇相预混法制备本发明Tf-LNP的流程图。
图8至图10示出了本发明一些实施方案中乙醇相预混法制备的Tf-LNP的体外转染实验结果。
图11示出了通过本发明乙醇相预混法制备包载luciferase mRNA的Tf-LNP后，体外转染Hela细胞24h后的细胞内luciferase表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.材料和方法
以下实施例所用mRNA为购自APExBIO Technology LLC的Firefly luciferasemRNA(Fluc mRNA)，长度为1.9kb，包含5’-cap和3’-polyA尾。所用脂质材料如下：Dlin-MC3-DMA、SM102、DSPC、胆固醇、PEG2k-DMG、Tf-PEG2k-DMG(西安瑞禧生物科技有限公司)。
LNP制备使用的设备为迈安纳的小试级别微流控设备。
粒径检测、PDI检测使用动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,MalvernPanalytical Ltd)。检测时将样品用5mM NaCl溶液稀释50倍后，移入DTS1070比色皿。检测模式为173°背散射光，每个样品均在设备中平衡120s、达到25℃后再开始检测。
包封率通过
Figure BDA0003301212540000092
(Thermo Fisher Scientific Inc)荧光法检测。使用1XPBS 100倍稀释LNP样品得到供试液用来测定样品中游离及总量的mRNA。使用1X PBS稀释游离mRNA溶液配制一系列浓度梯度的标准液，将LNP样品供试液和mRNA标准液加入到96孔黑板中。按照说明书配制TritonX100和Ribogreen工作液，加入96孔黑板中与LNP样品供试液和mRNA标准液混合，然后避光室温缓慢振摇10min。使用酶标仪在激发光480nm，发射光520nm处测定样品荧光，通过样品荧光值计算样品包封率。
细胞实验方法如下：将Hela细胞用DMEM+10％FBS培养基进行常规的培养，确保细胞处于对数生长期；转染前一天，以合适的细胞密度接种到96孔培养板上，生长过夜。转染时，细胞要达到70-90％的融合；用无血清培养基配制不同浓度的LNP-mRNA，并取10μl加入到96细胞培养板中，使每孔浓度分别达到100、50、25ng，并用对应浓度的Fireflyluciferase mRNA作为阳性参照，使用
Figure BDA0003301212540000091
MessengerMax(Thermo)进行mRNA的转染。在37℃，5％的CO2培养箱中孵育24h后，往孔中加入等体积ONE GLOTM(Promega)检测试剂，吹打均匀后转移到96孔白板中，在酶标仪Lumi模式下检测光强。
实施例2通过掺入法制备Tf-LNP
为了考察通过掺入法制备Tf-LNP的可行性，参考Wang等人的实验方案，通过掺入法对LNP表面进行修饰。掺入法制备Tf-LNP的流程图如图1所示。
分别配制下述溶液：溶液A：脂质的乙醇溶液，其中各脂质的摩尔百分比为：Dlin-MC3-DMA50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.5％；溶液B：其为含有mRNA的苹果酸盐缓冲液，pH＝4.0；溶液C：其为含有Tf-PEG2k-DMG的PBS缓冲液，pH＝7.4。制备方法为：首先将溶液A与溶液B按体积比1:3在微流控芯片中混合，从而得到溶液D，其中溶液D中mRNA的量为Dlin-MC3-DMA在溶液D中量的8.8％质量百分比。将溶液D转移至透析盒(Slide-A-LyzerTM，MWCO＝20k)，在pH＝7.4PBS中透析16h，去除乙醇，得到未修饰的LNP产品。向未修饰的LNP产品中加入溶液C，在4℃磁力搅拌1h，完成对LNP的Tf掺入修饰。
通过动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,Malvern)检测产品粒径、粒径分布(PDI)和Zeta电位，并通过基于Ribogreen的核酸荧光法检测产品的包封率(表1)。
通过对Hela细胞的转染实验评估各组制剂的转染效率(图2)。
下表1示出了产品的粒径、粒径分布(PDI)、Zeta电位及包封率：
表1
Figure BDA0003301212540000101
结论：
(1)掺入Tf后的Tf-LNP样品(即表1样品2和样品3)的PDI均＞0.2，因此不具备产业应用价值。
(2)通过掺入法制备的Tf-LNP(样品2和样品3)在包封率上均较原处方LNP(样品1)存在一定程度的劣化。
(3)由于Tf-PEG2k-DMG是在LNP已组装完成的情况下加入的，因此Tf-PEG-DMG需要插入LNP的脂质层才能完成修饰，否则会以单分子胶束或聚集胶束的形式存在于溶液中，成为杂质。然而，由于组装完成的LNP表面已覆盖有一层PEG(PEG2K-DMG)，而PEG的空间位阻会导致新加入的Tf-PEG2k-DMG难以完全插入LNP脂质层，因此掺入法修饰效率低下，需要后续纯化步骤除去游离的产品中游离的Tf-PEG2K-DMG杂质。
(4)由于新加入的Tf-PEG2k-DMG难以完全插入LNP脂质层，因此Tf表面修饰效率不明确。
(5)此外，从图2可以看出，样品2、样品3的细胞转染效率也逊于样品1，这表明，通过掺入法对LNP进行Tf表面修饰，会在一定程度上破坏Tf-LNP的纳米结构，因此说明通过掺入法制备的Tf-LNP并不能达到提高LNP进入靶细胞的能力，也从而无法改善LNP的治疗效果。
实施例3化学键合法制备Tf修饰的LNP
为了考察通过掺入法制备Tf-LNP的可行性，参考专利CN101170995B的实验方案，通过化学键合法对LNP表面进行修饰，并与乙醇修饰法制得的Tf-LNP进行比较。
将含有活性基团N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的脂质NHS-PEG2k-DMG溶解于DMSO，将该溶液与其他LNP脂质共混作为乙醇相，然后与mRNA溶液混合、制备LNP。通过透析去除有机溶剂，然后向LNP中加入转铁蛋白(人源重组蛋白，Tf)，使Tf在LNP表面发生化学键合，从而得到Tf-LNP。具体而言，分别配制下述溶液：溶液A：脂质的乙醇溶液，其含有Dlin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇，和PEG2k-DMG；溶液B：其含有mRNA的苹果酸盐缓冲液，pH＝4.0；溶液C：其含有NHS-PEG2k-DMG的DMSO溶液；溶液D：Tf的水溶液。首先将溶液A与溶液C混合，得到乙醇相溶液，其中该乙醇相溶液中各脂质的摩尔百分比为：Dlin-MC3-DMA50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.5％或1.49％或1.48％、NHS-PEG2k-DMG 0％或0.01％或0.02％。然后将该乙醇相溶液在微流控芯片中与溶液B按体积比1:3混合，从而得到含待修饰的LNP的溶液E，其中该溶液E中mRNA的量为Dlin-MC3-DMA在溶液E中量的8.8％质量百分比。将该LNP中间体转移至透析盒(Slide-A-LyzerTM，MWCO＝20k)，在pH＝7.4PBS中透析16h，去除乙醇，得到未修饰的LNP产品。向未修饰的LNP产品中加入溶液D，在4℃磁力搅拌1h，完成对LNP的Tf修饰。为了保证化学键合效率，Tf的总摩尔量是LNP中NHS-PEG2k-DMG的2倍。整体工艺流程如图3所示。
作为对照，通过本发明实施例5所述的乙醇预混法制备Tf-LNP。
通过动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,Malvern)检测产品粒径、粒径分布(PDI)和Zeta电位，并通过基于Ribogreen的核酸荧光法检测产品的包封率(表2)。通过对Hela细胞的转染实验评估各组制剂的转染效率(图4)。
下表2示出了产品的粒径、粒径分布(PDI)、Zeta电位及包封率：
表2
Figure BDA0003301212540000111
结论：
(1)化学键合法修饰后的LNP粒径分布较修饰前变差。
(2)从Hela细胞体外转染结果(图4)可知，与未修饰的LNP相比(表2中样品1)，通过化学键合法制备的Tf-LNP(表2中样品4b(图4中NHS0.01％-MC3 LNP+Tf组)和样品5b(图4中NHS0.02％-MC3 LNP+Tf组))并未显著提升细胞转染效率，说明通过化学键合法制备Tf修饰的LNP效率低下。
(3)化学键合法制备Tf-LNP时，由于Tf是过量加入的，且Tf修饰率不高，因此在制备了Tf-LNP终产品后，还需额外的纯化步骤去除游离的Tf杂质。
实施例4水相预混法制备Tf修饰的LNP
本实施例研究了通过将Tf-PEG2k-DMG与mRNA在水相中共混，然后再通过微流控与其他脂质混合、制备Tf-LNP的可行性。
由于Tf-PEG2k-DMG在DMSO中溶解性好，因此先将Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液与mRNA共混作为水相，然后与其他LNP脂质组成的乙醇相混合、制备LNP。分别配制下述溶液：溶液A：脂质的乙醇溶液，其中各脂质在下述溶液D中的摩尔百分比为：Dlin-MC3-DMA50％、DSPC10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.48％；溶液B：其为含有mRNA的苹果酸盐缓冲液，pH＝4.0；溶液C：其为含有Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液，其在下述溶液D中的摩尔百分比为0.02％。首先将溶液B与溶液C混合，得到水相溶液，然后将该水相溶液按体积比3:1在微流控芯片中与溶液A混合得到溶液D，其中溶液D中mRNA的量为Dlin-MC3-DMA在溶液D中量的8.8％质量百分比。将前述溶液D转移至透析盒(Slide-A-LyzerTM，MWCO＝20k)，在pH＝7.4PBS中透析16h，去除乙醇，得到LNP产品。整体工艺流程如图5所示。
通过动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,Malvern)检测产品粒径、粒径分布(PDI)和Zeta电位，并通过基于Ribogreen的核酸荧光法检测产品的包封率(表3)。通过对Hela细胞的转染实验评估各组制剂的转染效率(图6)。
下表3示出了产品的粒径、粒径分布(PDI)、Zeta电位及包封率：
表3
Figure BDA0003301212540000121
结论：通过水相预混法制备Tf-LNP并将Tf-PEG2k-DMG比例调整至0.02％时，虽然获得了粒径分布较窄的脂质纳米粒子，但包封率偏低，表明通过该方法制备时Tf-PEG2k-DMG可能会干扰LNP的组装结构。细胞转染实验结果显示，Tf-PEG2k-DMG修饰比例为0.02％时，转染效率较原处方有较显著的提升，证明Tf修饰是成功的。
实施例5乙醇预混法制备Tf修饰的LNP
本实施例研究了通过将Tf-PEG2k-DMG与其他脂质在乙醇相中共混，然后再通过微流控与mRNA混合、制备Tf-LNP的可行性。
先将含Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液与其他LNP脂质共混作为乙醇相，然后与mRNA溶液混合、制备LNP。
分别配制下述溶液：
溶液A：其含有Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液，其在下述溶液C中的摩尔比为0或0.02％或0.05％；
溶液B1：脂质的乙醇溶液，各脂质在下述溶液C中的摩尔百分比为：Dlin-MC3-DMA50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.5％或1.48％或1.45％；溶液B2：脂质的乙醇溶液，各脂质在下述溶液C中的摩尔比为：SM-102 50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.5％或1.48％或1.45％；
将溶液A与溶液B1或B2混合，得到乙醇相溶液C1或C2；
溶液D：其为含mRNA的苹果酸盐缓冲液，pH＝4.0；
将乙醇相溶液C1或C2在微流控芯片中与溶液D按体积比1:3混合，从而得到溶液E。其中溶液E中mRNA的量为可离子化脂质(Dlin-MC3-DMA或SM-102)在溶液E中量的8.8％质量百分比。将该溶液E转移至透析盒(Slide-A-LyzerTM，MWCO＝20k)，在pH＝7.4PBS中透析16h，去除乙醇，得到LNP产品。整体工艺流程如图7所示。
通过动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,Malvern)检测产品粒径、粒径分布(PDI)和Zeta电位，并通过基于Ribogreen的核酸荧光法检测产品的包封率(表4)。通过对Hela细胞的转染实验评估各组制剂的转染效率(图8、图9和图10)。
下表4示出了产品的粒径、粒径分布(PDI)、Zeta电位及包封率：
表4
Figure BDA0003301212540000131
结论：
(1)通过乙醇相预混法制备Tf-LNP并将Tf-PEG2k-DMG比例降低，获得了粒径分布和包封率均较好的LNP，且连续三个批次制备所得LNP的质量数据基本一致，表明该工艺能够得到组装行为良好、LNP结构稳定的制剂产品。
(2)乙醇预混法中，由于游离的Tf-PEG2k-DMG是预先和其他脂质溶液混合的，在通过微流控制备LNP时，每个纳米粒子已包含了脂质混合溶液中的所有脂质，因此在后续的步骤中溶液中不会存在游离的靶向物修饰的聚合物脂质等杂质，进而在制备了包含核酸的Tf-LNP终产品后，无需额外的纯化步骤去除游离的Tf-PEG2k-DMG杂质。
(3)由于所有加入的Tf-PEG2k-DMG均形成了Tf-LNP的组分，因此，与掺入法无法明确控制LNP的Tf表面修饰效率不同，通过乙醇预混法制备的Tf-LNP产品的Tf表面修饰效率明确可控。
(4)Tf-PEG2k-DMG的肿瘤细胞靶向效果在MC3、SM102处方中均得到了验证，表明该生产工艺对其他以可离子化脂质为基础的LNP处方都是适用的。
实施例6.乙醇预混法制备Tf修饰的LNP的比例研究
本实施例研究了通过乙醇预混法制备Tf-LNP时，Tf-PEG2k-DMG适合的投料比例。
先将Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液与其他LNP脂质共混作为乙醇相，然后与mRNA溶液混合、制备LNP。分别配制下述溶液：
溶液A：其含有Tf-PEG2k-DMG的DMSO溶液，其在下述溶液C中的摩尔百分比为0或0.005％或0.01％或0.02％；
溶液B：脂质的乙醇溶液，各脂质在下述溶液C中的摩尔百分比为：Dlin-MC3-DMA50％、DSPC 10％、胆固醇38.5％、PEG2k-DMG 1.5％或1.495％或1.49％或1.48％；
将溶液A与溶液B混合，得到乙醇相溶液C；
溶液D：其为含有mRNA的苹果酸盐缓冲液，pH＝4.0；
将该乙醇相溶液C按体积比1:3在微流控芯片中与溶液D混合，从而得到溶液E。其中溶液E中mRNA的量为Dlin-MC3-DMA在溶液E中量的8.8％质量百分比。将该溶液E转移至透析盒(Slide-A-LyzerTM，MWCO＝20k)，在pH＝7.4PBS中透析16h，去除乙醇，得到LNP产品。整体工艺流程如图7所示。
通过动态光散射激光粒度仪(Zetasizer Ultra,Malvern)检测产品粒径、粒径分布(PDI)和Zeta电位，并通过基于Ribogreen的核酸荧光法检测产品的包封率(表5)。通过对Hela细胞的转染实验评估各组制剂的转染效率(图11)。
下表5示出了产品的粒径、粒径分布(PDI)、Zeta电位及包封率：
表5
Figure BDA0003301212540000141
结论：通过乙醇相预混法制备Tf-LNP，Tf-PEG2k-DMG的投料比例与细胞转染效率有较显著的量效相关性。当Tf-PEG2k-DMG的投料比例由0.01％增至0.02％时，转染效率无显著提升，可能表明LNP的表面修饰已趋于饱和。

Claims (4)

1.一种制备靶向物介导的脂质纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
将靶向物修饰的聚合物缀合脂质Tf-PEG2k-DMG溶于二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环或N-甲基吡咯烷酮中，即为溶液A；
将可离子化阳离子脂质Dlin-MC3-DMA或SM-102、中性脂质DSPC、胆固醇或其类似物β-谷甾醇、粪甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、熊果酸或α-生育酚，和聚合物缀合脂质PEG2k-DMG溶于乙醇中，即为溶液B；
将所述溶液A加入所述溶液B中进行混合，即为溶液C，其中各脂质成分的摩尔百分比分别为：Dlin-MC3-DMA或SM-102为50-65%、DSPC为3-15%、胆固醇或其类似物为30-40%、PEG2k-DMG为0.5-2%、Tf-PEG2k-DMG为0.001-1%；
将核酸mRNA溶于pH3.0-5.0的苹果酸、柠檬酸或醋酸缓冲液中，即为溶液D；
将所述溶液C与所述溶液D以体积比1:3的比例在微流控芯片中混合即为溶液E，其中核酸mRNA的量占Dlin-MC3-DMA或SM-102的2%至10%质量百分比；
将所述溶液E在pH=7.4 PBS或pH=8.0 Tris缓冲液中透析、去除乙醇得到靶向物介导的脂质纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述pH=7.4 PBS或pH=8.0 Tris缓冲液中含有冷冻保护剂甘油、海藻糖或蔗糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述冻干保护剂为含有5-8%质量浓度的蔗糖。
4.权利要求1-3任一所述方法制备得到的靶向物介导的脂质纳米颗粒在制备药物中的应用。
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