CN113874502A - 补料分批体外转录方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供体外转录目标核糖核酸(RNA)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定核苷三磷酸(NTP)的消耗率。

Description

补料分批体外转录方法

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2019年3月11日提交的美国临时申请号62/816,734的权益，该文献通过引用整体并入本文。

背景技术

体外转录(IVT)使用噬菌体DNA依赖性核糖核酸(RNA)聚合酶(例如，SP6、T3和T7)来合成模板导向的mRNA转录物。IVT反应通常是“分批”反应，其中在反应开始时组合几种试剂，包括核苷三磷酸(NTP)、镁、RNA聚合酶、脱氧核糖核酸(DNA)和焦磷酸酶。然后培育这些组分，并且反应继续进行直到至少一种核苷酸耗尽。因此，反应具有至少一种可以导致低产量的RNA转录物(产物)的限量试剂。IVT反应的其他潜在缺点包括例如在反应过程中产生的流产(截短)转录物、连缀转录物、产生3’异质性的polyA尾变体、突变的转录物和/或双链污染物。

发明内容

在一些实施方案中，本公开提供了经验平衡补料分批体外转录(IVT)方法和组合物，所述方法和组合物尤其能够实现核糖核酸(RNA)如信使RNA(mRNA)的高产量、高完整性转录。令人惊讶的是，在一些实施方案中，长度为至少2000个核苷酸或更长的RNA转录物的产量可以比使用先前已知的IVT方法产生的RNA转录物的产量高至少100％，并且其中至少90％是使用共转录加帽正确加帽。在某些实施方案中，本公开的经验平衡补料分批IVT反应包括四种核苷酸(CTP、GTP、UTP和ATP)，它们各自的相对摩尔比可以变化以最大限度地使用反应物和/或改变RNA产物的属性。重要的是，四种核苷酸的比率是根据它们的消耗速率(消耗率)进行平衡，以便在IVT反应期间没有一种核苷酸是速率受限的。有利地，并且与先前描述的补料分批方法不同，该方法不需要RNA产物序列的先验知识或依赖于目标RNA产物的已知序列。

在一些实施方案中，该方法包括使用已知初始浓度的CTP、GTP、UTP和ATP(例如，等摩尔浓度，例如5mM)对编码目标RNA的DNA进行初始分批IVT反应，并测量实际反应期间每种核苷酸的浓度降低速率，直到至少一种NTP的浓度在20-40分钟的过程中降至阈值水平以下。然后可以使用测量的浓度和收集的时间来计算反应期间CTP、GTP、UTP和ATP的消耗率(单个NTP消耗率)。对于多个时间点，这可以是数据线性拟合的斜率(参见例如图1A)。单个NTP消耗率(针对CTP、GTP、UTP和ATP)被加在一起以确定所有核苷酸的消耗率(总NTP消耗率)(参见例如图1B)。然后通过将单个NTP消耗率除以总NTP消耗率来确定每种NTP的消耗百分比(％)值。

消耗百分比值可用于为IVT反应和“原料”混合物配制初始“预混”反应混合物。例如，为了允许分批反应中所有NTP的非限制性消耗，初始反应混合物可以包含摩尔比相当于针对每种NTP(ATP、UTP、GTP和CTP)计算的消耗百分比(％)值的NTP。

在一些实施方案中，初始NTP浓度包含[ATP]、[CTP]、[UTP]和[GTP]中每一个的等摩尔NTP浓度(例如，1∶1∶1∶1的摩尔比)。

在一些实施方案中，初始NTP浓度包含[ATP]、[CTP]、[UTP]和[GTP]中每一个的非等摩尔NTP浓度(例如，2∶1∶1∶4的摩尔比)。在一些实施方案中，[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的摩尔比为1∶1∶1∶1至2∶1∶1∶4。在一些实施方案中，[ATP]∶[CTP]的摩尔比为2∶1。在一些实施方案中，[ATP]∶[UTP]的摩尔比为2∶1。在一些实施方案中，[ATP]∶[GTP]的摩尔比为1∶2。在一些实施方案中，[CTP]∶[UTP]的摩尔比为1∶1。在一些实施方案中，[CTP]∶[GTP]的摩尔比为1∶4。在一些实施方案中，[UTP]∶[GTP]的摩尔比为1∶4。在一些实施方案中，初始NTP浓度包含1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和/或1∶1至2∶1的[GTP]∶[CTP]比率。在一些实施方案中，初始NTP浓度包含2∶1至4∶1的[ATP]∶[UTP]比率和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。在一些实施方案中，初始NTP浓度包含2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和/或4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

这些消耗％值是根据经验确定的，并且特定于目标RNA。在IVT反应期间，可以用包含NTP的原料混合物补充反应混合物，每种NTP以基于针对每种NTP计算的消耗％值的摩尔比存在于原料混合物中。在一些实施方案中，以维持反应混合物中的总NTP浓度高于0mM但至少在初始NTP浓度的5％至50％之间的量补充原料混合物。在一些实施方案中，以维持反应混合物中的总NTP浓度高于0mM但至少在初始NTP浓度的5％至100％之间或5％至200％之间的量补充原料混合物。在一些实施方案中，以维持反应混合物中的总NTP浓度在5mM至20mM之间和/或在初始NTP浓度的5％至-75％以内的量补充原料混合物。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[ATP]∶[UTP]的比率为1∶1至4∶1，任选地为1∶1至2∶1(例如，2∶1)的量补充。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[GTP]∶[CTP]的比率为1∶1至4∶1(例如，4∶1)的量补充。对IVT反应的改进导致了称为三核苷酸的盖帽类似物的开发和掺入(参见PCT/US2018/046989，其通过引用并入本文)。这允许对RNA产物进行共转录加帽，并消除对用于RNA加帽的后续处理步骤的需求。尽管这种三核苷酸比反应混合物中的单核苷酸优先掺入在RNA产物的5’末端，但有可能掺入一定数量的嘌呤(ATP和GTP)代替盖帽类似物。此类事件导致未加帽的RNA产物的产生，该产物是一种非所需的无活性产物变体。我们的研究表明，维持三核苷酸与嘌呤的比率≥1允许产物中相对于未加帽RNA的足够浓度的加帽RNA保持在可接受的水平。

当使用共转录加帽进行IVT反应时，与反应中生成mRNA的总核苷酸相比，盖帽类似物的消耗非常低。每摩尔加帽RNA产物仅消耗1摩尔盖帽类似物，而每摩尔加帽RNA产物消耗高达5,000或更多摩尔的核苷酸(实际消耗量因产物序列和长度而异)。因此，在消耗NTP后，大量过量的昂贵盖帽类似物在IVT反应中仍未被消耗。在分批反应中，盖帽类似物(例如三核苷酸加帽试剂)的这种低利用率导致更昂贵和浪费的方法。

本公开的补料分批方法提高了质粒DNA、盖帽类似物(例如，三核苷酸或四核苷酸加帽试剂)和其他昂贵试剂的利用率，同时维持RNA生产的高加帽％和高mRNA产量。例如，在本公开中，可以将NTP和镁添加到活性IVT反应中以防止反应物耗尽并提高RNA产物的产量，而无需提供额外的DNA或盖帽类似物(例如，三核苷酸)。在另一个实例中，NTP可以以较低的初始浓度加入，并在整个反应过程中保持这种低水平，从而使得能够使用较低浓度的盖帽类似物而不折损加帽效率。与先前描述的IVT方法分批和补料分批方法相比，本文提供的按经验确定的消耗％平衡补料分批IVT方法在进行共转录加帽的一些实施方案中已显示出相对于使用的盖帽类似物的量提高2倍以上的加帽RNA产量。此外，在如本文提供的补料分批IVT方法中产生的RNA与使用的输入DNA的摩尔比大大增加。在一些实施方案中，在如本文提供的补料分批IVT方法中产生的RNA与使用的输入DNA的摩尔比相对于非补料分批或分批方法增加了2倍或甚至3倍。

因此，在一些方面，本文提供了确定IVT反应的NTP消耗百分比(％)的方法，该方法包括：(a)用包含已知初始NTP浓度、编码目标mRNA的DNA、RNA聚合酶和焦磷酸酶的反应混合物进行IVT反应；和(b)计算反应混合物中每种NTP的消耗百分比(％)值。在一些实施方案中，步骤(b)包括(i)计算单个NTP消耗率(单个NTP浓度/时间)相对于总NTP消耗率(总NTP浓度/时间)。在一些实施方案中，已知的初始NTP浓度是等摩尔NTP浓度。

在一些方面，本文还提供了目标RNA的补料分批IVT方法包括：(a)用包含编码目标RNA的DNA、RNA聚合酶和NTP(和任选的镁和/或焦磷酸酶)的反应混合物进行IVT反应；和(b)随时间向IVT反应混合物递送包含NTP(和任选的镁和/或焦磷酸酶)的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对特定目标RNA中的每种NTP计算的消耗％值的摩尔比存在，其中消耗％值特定于目标RNA，并且其中原料混合物是以维持反应混合物中的总NTP浓度高于零的量递送。在一些实施方案中，步骤(a)的反应混合物中的每种NTP是以相当于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值的摩尔比存在。

在一些实施方案中，使用消耗百分比来平衡NTP。在其他实施方案中，维持不同比率的NTP以改变产物的属性或提高不同NTP的利用率。例如，消耗百分比可用于在整个反应过程中维持所需条件。

随时间的推移，例如每10-250分钟，任选地每20-200分钟，可以使用批式或连续进料将原料混合物递送至正在进行的IVT反应混合物中。连续进料包括以连续流速(例如，2-8mL/min或4-6mL/min)将原料混合物输送至正在进行的IVT反应混合物中。

在一些实施方案中，反应混合物进一步包含RNA盖帽类似物，从而产生掺入所述RNA盖帽类似物的转录RNA(例如，至少90％或至少95％的转录RNA包含RNA盖帽类似物)。初始和/或正在进行的IVT反应混合物可以包含1∶1至20∶1、1∶1至15∶1、1∶1至10∶1、1∶1至5∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[RNA盖帽类似物]∶[嘌呤]的比率。

附图说明

图1A-1B.核苷酸经验平衡的一个实例。用已知的初始核苷酸浓度进行体外转录(IVT)反应。随时间测量CTP、GTP、UTP和ATP的浓度(图1A)和总核苷酸浓度(图1B)。通过将单个NTP消耗的速率(例如，如图1A所确定)除以总NTP消耗的速率(例如，如图1B所确定)来计算每种核苷酸的消耗％。

图2.NTP和盖帽类似物浓度的监测。使用具有设置为260nm的紫外光检测器的超高效液相色谱(UPLC-UV)，可以随时间监测NTP和三核苷酸浓度。该方法还可用于计算单个NTP浓度或总NTP浓度。

图3A-3B.两种样品构建体RNA#1(图3A)和RNA#2(图3B)的核苷酸经验平衡的实例。随时间测量CTP、GTP、UTP和ATP的浓度和总核苷酸浓度。通过将单个NTP消耗的速率除以总NTP消耗的速率来计算每种核苷酸的消耗％。

图4A-4B.从针对RNA#1的消耗％值产生的两种NTP预混合物的实例，以实现不同的工艺要求。图4A中的分批IVT示出了所有四种核苷酸试剂大约同时达到0mM，从而最大限度地利用试剂。图4B中的分批IVT反应示出了所有四种核苷酸试剂同时达到2.5mM，从而使总[NTP]达到10mM。后一种情况尤其适用于开发在反应期间需要特定比率的NTP以产生所需的产物特征或充分利用特定试剂的补料分批IVT反应。

图5A-5B和图6A-6B.确定补料分批进料计划。使用目标DNA(分别如图5A和5B所示的RNA#1和RNA#2)、经验平衡核苷酸预混合物和基于预测的NTP消耗率的初始进料计划来运行侦察补料分批IVT反应。在整个实验过程中，在向IVT反应进料之前和之后的时间点立即测量核苷酸的总浓度(图5A-5B)。浓度和时间用于计算产生RNA#1或RNA#2的反应的每次进料之间的消耗率(图6A-6B)。

图7A-7C.对于RNA#1的侦察补料分批IVT，绘制了核苷酸消耗率与[DNA](图7A)、[mRNA](图7B)或反应时间(图7C)的关系图。用曲线进行拟合(示出的线性拟合)提供了在整个补料分批IVT反应过程中的核苷酸消耗率的经验模型。

图8-10.RNA#1的IVT反应建模。使用额外的构建体特异性参数(包括预混合物中CTP、GTP、UTP和ATP的比率；CTP、GTP、UTP和ATP的消耗率；盖帽类似物的初始浓度；初始加尾RNA产物％和随时间推移的加尾RNA产物％的速率)产生RNA#1的反应模型，以估算NTP或三核苷酸反应物的浓度(图8)、RNA产物的形成(图9)和加尾RNA产物％(图10)。

图11A-11B和图12A-12B.RNA#1和RNA#2的限定补料分批IVT反应的[NTP]测量值。图11A-11B示出了在RNA#1的补料分批IVT反应期间测量的总[NTP]和单个[NTP]。图12A-12B示出了在RNA#2的补料分批IVT反应期间测量的总[NTP]和单个[NTP]。

图13A-13B和图14A-14B.RNA#1和RNA#2的限定补料分批IVT反应的RNA产物产量的测量值。图13A-13B示出了RNA#1和RNA#2的总RNA和加尾RNA的浓度测量值。图14A-14B示出了RNA#1和RNA#2的总RNA和加尾RNA的质量测量值对初始IVT反应体积。

图15.RNA#1和RNA#2的限定补料分批IVT反应的加尾RNA％的测量值。

图16A-B.图16A中的图表示出了RNA#1和RNA#2的加帽RNA产物％的测量值。图16B示出了RNA#1的随时间推移的加帽RNA产物％的测量值。

图17A-17B.在RNA#3的示例性批式(图17A)和连续(图17B)补料分批IVT反应期间测量的总核苷酸浓度。

图18A-18B和图19A-19B.RNA#3的批式和连续补料分批IVT反应的RNA产物产量的测量值。图18A-18B示出了针对批式(图18A)和连续(图18B)过程的加尾RNA的浓度测量值。图19A-19B示出了针对批式(图19A)和连续(图19B)过程的加尾RNA的质量测量值对初始IVT反应体积。

图20A-20B.在RNA#3的批式(图20A)和连续(图20B)补料分批IVT反应期间测得的加尾RNA产物％。

图21A-21B.在RNA#3的批式(图21A)和连续(图21B)补料分批IVT反应期间测得的加帽RNA产物％。

图22.在整个连续补料分批反应过程中测得的平均ATP/GTP对三核苷酸比。

图23.在整个补料分批IVT反应和分批IVT反应过程中测量的[ATP]的比较。

图24.在两小时反应期间，补料分批IVT反应对比分批IVT反应的总RNA产量测量值(mg/mL初始IVT)。

图25.示出了在两小时反应时间后补料分批IVT反应对比分批IVT反应的加帽RNA产物％。

具体实施方式

本文提供了一种经验平衡补料分批体外转录(IVT)平台，其被开发用于提高单批次的总产物产量并保持高产品质量，同时提高反应物的利用率。与具有低反应组分利用率、高百分比的未使用NTP和需要高浓度RNA盖帽类似物或三核苷酸加帽试剂的现有IVT方法不同，本公开的经验平衡补料分批IVT方法最大限度地利用反应中存在的昂贵试剂，以在不损害产品完整性的情况下提高产品产量。在一些实施方案中，这种改进的补料分批IVT方法从初始核苷酸经验平衡反应开始，该反应用于计算初始反应中每种类型的NTP的消耗百分比(％)值，该值对于被转录的RNA是特定的。然后使用这些经验确定值来平衡后续补料分批IVT反应中的核苷酸比率，以实现高效、高产的RNA生产。

如本文中所用，消耗百分比通常是指单个NTP相比于针对编码目标RNA的给定DNA的所有NTP的消耗率的相对消耗率。在一些实施方案中，百分比消耗率通过将单个NTP消耗率除以总NTP消耗率来确定。在一些实施方案中，单个NTP消耗率是随时间推移(例如，在核苷酸经验平衡反应的整个过程中)的单个NTP浓度的量度，而总NTP消耗率是随时间推移(例如，在核苷酸经验平衡反应的整个过程中)的总NTP浓度的量度。

如本文中所用，NTP的经验平衡通常是指用于确定关于编码目标RNA的DNA的每种NTP的消耗百分比的过程。该过程涉及使用已知初始浓度的CTP、GTP、UTP和ATP进行分批IVT反应，并测量实际反应期间每种核苷酸的浓度降低速率，直到至少一种NTP的浓度在反应过程中(例如，20-40分钟内)降至低于阈值水平(例如，1-5mM或起始浓度的20-50％)。然后可以使用测量的浓度和收集的时间来计算反应期间CTP、GTP、UTP和ATP消耗的消耗百分比。

如本文中所用，分批IVT通常是指体外转录反应，其中反应的所有组分(例如，NTP、聚合酶、盐和/或DNA)被一次性添加到反应混合物中(例如在反应开始时)。在一些实施方案中，将反应混合物在特定条件(例如温度)下保持一段时间，之后收集转录的RNA产物。

如本文中所用，补料分批IVT通常是指体外转录反应，其中向活性反应混合物补充反应组分，例如NTP、聚合酶、盐和/或DNA，以随着反应的进行防止限量试剂的耗尽或抵抗不稳定组分的降解。在一些实施方案中，添加到反应中的混合物被称为原料。在一些实施方案中，使用批式进料将反应组分或原料补充到活性反应混合物中。在一些实施方案中，批式进料包括以限定的时间间隔将离散体积量的反应组分或原料添加到活性反应混合物中，例如每隔20分钟将5mL原料添加到反应混合物中。在一些实施方案中，使用连续进料将反应组分或原料补充到活性反应混合物中。在一些实施方案中，连续进料包括在限定的时间段内以反应组分原料的连续流速将反应组分或原料添加到活性反应混合物中，例如以2-8mL/min、2-6mL/min或4-6mL/min的连续流速或以0.0030-0.007mL/min/mL初始体积、0.0040-0.0060mL/min/mL初始体积、0.0050-0.0080mL/min/mL初始体积或0.0060-0.0090mL/min/mL初始体积的连续流速添加原料。

如本文中所用，侦察补料分批IVT通常是指使用批式进料的初始补料分批IVT反应，其用于建立随时间推移的反应速率的模型并在下游补料分批IVT反应中设置合适的进料体积和时间。

如本文中所用，加尾RNA百分比通常是指含有3’polyA尾部的转录RNA产物的相对丰度。在一些实施方案中，3’polyA尾部是A100polyA尾部(即，由100个丙氨酸残基组成)。在一些实施方案中，加尾RNA百分比(包含3’polyA尾部的转录RNA产物的百分比)大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在一些实施方案中，加尾RNA百分比大于90％、95％、97％或99％。在一些实施方案中，加尾RNA百分比(包含3’polyA尾部的转录RNA产物的百分比)在20-100％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、25-75％、30-50％、40-60％、50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％或95-99％之间。

如本文中所用，加帽RNA百分比通常是指在5’末端含有掺入的盖帽类似物的转录RNA产物的相对丰度。在一些实施方案中，盖帽类似物是RNA盖帽类似物。在一些实施方案中，RNA盖帽类似物是二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸。在一些实施方案中，加帽RNA百分比(包含5’盖帽类似物的转录RNA产物的百分比)大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在一些实施方案中，加帽RNA百分比大于90％、95％、97％或99％。在一些实施方案中，加帽RNA百分比在20-100％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、25-75％、30-50％、40-60％、50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％或95-99％之间。

在一些实施方案中，将RNA盖帽类似物添加到转录期间优先从RNA序列的5′末端起始的IVT反应混合物中。这允许“共转录加帽”IVT反应，其中IVT混合物包含RNA盖帽。允许“共转录加帽”IVT反应的RNA盖帽类似物的实例包括7-甲基鸟苷(m7G)和3′-O-me-7-meGpppG。

如本文中所用，用于补料分批应用的初始IVT反应混合物通常是指在补料分批IVT反应开始时和补充额外的反应组分或原料之前的IVT反应混合物。在一些实施方案中，初始IVT反应混合物包含NTP(例如，天然存在的和/或修饰的NTP，例如ATP、UTP、GTP和CTP)、缓冲液(例如，Tris和/或Good缓冲液)、辅因子(例如镁)、RNA盖帽类似物(例如三核苷酸盖帽类似物)、RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)、去污剂(例如Triton X-100)、编码目标RNA的DNA、还原剂(例如二硫苏糖醇)(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))、小分子添加剂(例如亚精胺)和/或酶添加剂(例如无机磷酸酶(PPiase))。

如本文中所用，用于补料分批应用的正在进行的IVT反应混合物通常是指在起始反应条件之后的IVT反应混合物。在一些实施方案中，正在进行的IVT反应混合物中的组分(例如NTP和RNA盖帽类似物)的浓度随时间变化。在一些实施方案中，正在进行的IVT反应混合物包含NTP(例如，天然存在的和/或修饰的NTP，例如ATP、UTP、GTP和CTP)、缓冲液(例如，Tris和/或Good缓冲液)、辅因子(例如镁)、RNA盖帽类似物(例如三核苷酸盖帽类似物)、RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)、去污剂(例如Triton X-100)、编码目标RNA的DNA、还原剂(例如，DTT、TCEP)、小分子添加剂(例如亚精胺)、酶添加剂(例如无机磷酸酶或PPiase)和/或目标转录RNA。

如本文中所用，目标RNA中的第一编码位置通常是指在启动子序列(例如，T7 RNA聚合酶启动子)之后转录的第一个核苷酸。在一些实施方案中，第一编码位置是任何NTP，例如ATP、UTP、GTP或CTP。

如本文中所用，目标RNA通常是指由IVT反应中的DNA编码的RNA分子。在一些实施方案中，目标RNA是目标转录RNA，其中目标转录RNA由IVT反应(例如补料分批IVT反应)产生。在一些实施方案中，目标RNA是mRNA，其任选地包含5’盖帽、5’非翻译区(5’UTR)、编码目标蛋白质的开放阅读框(ORF)、3’非翻译区(3’UTR)和/或polyA尾部。在一些实施方案中，5’盖帽类似物是5’三核苷酸盖帽。

核苷酸经验平衡

在一些方面，本文提供了确定体外转录(IVT)反应的核苷三磷酸(NTP)消耗百分比(％)的方法。NTP消耗百分比(％)(也更简单地称为“消耗％”)是使用以下等式计算针对初始核苷酸经验平衡反应的每种NTP获得的值：

消耗％＝(单个NTP消耗率)/(总NTP消耗率)，其中单个NTP消耗率是随时间推移(在核苷酸经验平衡反应的整个过程中)的单个NTP浓度的量度，而总NTP消耗率是随时间推移(在核苷酸经验平衡反应的整个过程中)的总NTP浓度的量度。

因此，通过测量在初始核苷酸经验平衡反应期间的不同时间点消耗的ATP的浓度直到ATP浓度或反应中另一种NTP的浓度降至低于阈值水平(例如，5mM至20mM)来计算单个ATP消耗率；通过测量在初始核苷酸经验平衡反应期间的不同时间点消耗的UTP的浓度直到UTP浓度或反应中另一种NTP的浓度降至低于阈值水平(例如，5mM至20mM)来计算单个UTP消耗率；通过测量在初始核苷酸经验平衡反应期间的不同时间点消耗的GTP的浓度直到GTP浓度或反应中另一种NTP的浓度降至低于阈值水平(例如，5mM至20mM)来计算单个GTP消耗率；并且通过测量在初始核苷酸经验平衡反应期间的不同时间点消耗的CTP浓度直到CTP浓度或反应中另一种NTP的浓度降至低于阈值水平(例如，5mM至20mM)来计算单个CTP消耗率。

通过测量在初始核苷酸经验平衡反应期间的不同时间点消耗的所有(例如，所有四种)NTP的浓度来计算总NTP消耗率。

然后通过将单个ATP消耗率除以总NTP消耗率来计算ATP的消耗％值。同样地，通过将单个UTP消耗率除以总NTP消耗率来计算UTP的消耗百分比值；通过将单个GTP消耗率除以总NTP消耗率来计算GTP的消耗百分比值；并且通过将单个CTP消耗率除以总NTP消耗率来计算CTP的消耗百分比值。

在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应包括DNA(例如，编码目的RNA的DNA质粒)、RNA聚合酶(例如，T7聚合酶)和NTP的混合物。在初始核苷酸经验平衡反应中，NTP(例如，ATP、UTP、GTP和CTP中的每一种)的起始浓度是已知的(预定的)。在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应还包括缓冲液(例如，Tris HCl)、镁(例如，乙酸镁)、焦磷酸酶和/或二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应还包括在本文别处讨论的RNA盖帽类似物，例如三核苷酸盖帽类似物(例如，GAG)。

在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应中每一种NTP的浓度保持在零(0)毫摩尔浓度(mM)以上。即，仅在初始核苷酸经验平衡反应期间收集NTP浓度(单个浓度和总浓度)(用于计算NTP消耗率)直到NTP浓度之一降至某个阈值水平以下。在一些实施方案中，阈值水平为1mM至50mM、1mM至40mM、1mM至30mM、1mM至20mM、1mM至10mM、2mM至50mM、2mM至40mM、2mM至30mM、2mM至20mM、2mM至10mM、3mM至50mM、3mM至40mM、3mM至30mM、3mM至20mM、3mM至10mM、4mM至50mM、4mM至40mM、4mM至30mM、4mM至20mM、4mM至10mM、5mM至50mM、5mM至40mM、5mM至30mM、5mM至20mM或5mM至10mM。在一些实施方案中，阈值水平为10mM至20mM。在一些实施方案中，阈值水平为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。在一些实施方案中，阈值水平为2mM的下限至10mM、高于2mM的下限至9mM、高于2mM的下限至8mM、高于2mM的下限至7mM、高于2mM的下限至6mM或高于2mM的下限至6mM。

在一些实施方案中，阈值水平在初始NTP浓度的5％至200％以内。例如，阈值水平可以在初始NTP浓度的5％至175％以内、5％至150％以内、5％至125％以内、5％至100％以内、5％至75％以内、5％至50％以内或5％至25％以内。在一些实施方案中，阈值水平在初始NTP浓度的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％以内。初始NTP浓度是转录开始前(在所有IVT反应组分已合并之后，但在聚合酶活化之前)IVT反应中的总NTP浓度。

因此，在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应的初始NTP浓度是已知的。在一些实施方案中，已知的初始NTP浓度是等摩尔NTP浓度。即，每种NTP(例如，ATP、UTP、GTP和UTP)是以等摩尔比(1∶1∶1∶1)存在于反应中。在其他实施方案中，已知的初始NTP浓度不是等摩尔NTP浓度。例如，一种或多种NTP(例如，ATP和/或UTP)的存在量可以超过其他NTP。

初始核苷酸经验平衡反应的时间安排可以变化。然而，有利地，反应时间可以短至10至60分钟。在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应时间是10到50分钟、10到40分钟、10到30分钟、10到20分钟、20到60分钟、20到50分钟、20到40分钟、20到30分钟、30到60分钟、30到50分钟或30到40分钟。在一些实施方案中，初始核苷酸经验平衡反应时间是10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。可以使用更长的反应时间，这取决于任何一种NTP的浓度何时低于阈值水平。

经验平衡补料分批体外转录反应

上述初始核苷酸经验平衡反应是针对编码目标RNA的特定DNA，并且从该初始反应计算的消耗百分比(％)值可用于后续补料分批IVT反应以合成该特定目标RNA。因此，在一些实施方案中，目标RNA的补料分批IVT方法包括：(a)用包含编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶和核苷三磷酸(NTP)的反应混合物进行IVT反应；和(b)随时间向IVT反应混合物递送包含NTP的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对每种NTP计算的消耗百分比值的摩尔比存在，其中消耗百分比值特定于目标RNA，并且其中原料混合物是以维持反应混合物中的总NTP浓度高于零的量递送。

在一些实施方案中，原料混合物是以维持[ATP]∶[UTP]的比率为1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的量递送。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[ATP]∶[UTP]的比率为2∶1的量递送。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[GTP]∶[CTP]的比率为1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的量递送。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[GTP]∶[CTP]的比率为4∶1的量递送。在一些实施方案中，原料混合物是以维持[ATP]∶[UTP]的比率为2∶1和[GTP]∶[CTP]的比率为4∶1的量递送。

在一些实施方案中，经验平衡补料分批IVT反应混合物包括选自以下的组分：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)聚合酶、核苷三磷酸(NTP)、RNA盖帽类似物、缓冲液、镁、焦磷酸酶和还原剂(例如二硫苏糖醇)。相比之下，原料混合物包括NTP、RNA聚合酶、缓冲液、镁、焦磷酸酶和/或还原剂，但通常不包括DNA和RNA盖帽类似物。IVT反应中使用的确切条件取决于例如特定应用所需的RNA量。同样地，总转录反应时间可以变化，但在一些实施方案中，总转录反应时间比常规IVT反应时间久。在一些实施方案中，总转录反应时间为100分钟至1000分钟。例如，总转录反应时间可以是100-800、100-600、100-400、150-1000、150-800、150-600、150-400、200-1000、200-800、200-600、200-400、200-800、200-600、200-400、300-1000、300-800、300-600、300-400、300-800、300-600、300-400、400-1000、400-800、400-600、400-400、400-800、400-600、500-1000、500-800、500-600、500-500、500-800或500-600分钟。在一些实施方案中，总转录反应时间为至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950或至少1000分钟。

编码目标RNA的DNA

DNA可以是单链或双链。在一些实施方案中，DNA存在于质粒或其他载体上。DNA可以包括编码目标多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA包括位于编码目标多肽的多核苷酸的5’端并与其可操作地连接的RNA聚合酶启动子(例如，T7RNA聚合酶启动子)。DNA还可以包括位于多核苷酸的3’末端的编码聚腺苷酸化(polyA)尾部的核苷酸序列。

DNA的长度和因此目标RNA的长度可以发生变化。例如，DNA(和/或目标RNA)的长度可以为200至10000个核苷酸。在一些实施方案中，DNA(和/或目标RNA)的长度为200-500个、200-1000个、200-1500个、200-2000个、200-2500个、200-3000个、200-3500个、200-4000个、200-4500个、200-5000个、200-5500个、200-6000个、200-6500个、200-7000个、200-7500个、200-8000个、200-8500个、200-9000个或200-9500个核苷酸。在一些实施方案中，DNA(和/或目标RNA)的长度为至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个、至少5000个、至少6000个、至少7000个、至少8000个、至少9000个或至少10,000个核苷酸。

在一些实施方案中，反应混合物在经验平衡补料分批IVT反应期间不补充DNA。即，在一些实施方案中，在整个IVT反应期间，唯一存在的DNA是转录开始前反应混合物中的DNA(不向IVT反应添加额外的DNA)。

在一些实施方案中，初始或正在进行的IVT反应混合物中的DNA浓度为约0.01-0.10mg/mL、0.01-0.09mg/mL、0.01-0.075mg/mL、0.025-0.075mg/mL、0.01-0.05mg/mL、0.02-0.08mg/mL、0.02-0.06mg/mL、0.03-0.055mg/mL、0.04-0.05mg/mL或0.05mg/mL。在一些实施方案中，DNA的浓度在整个IVT反应期间维持在高于0.01mg/mL的浓度。在一些实施方案中，DNA的浓度在整个IVT反应期间维持在约0.01-0.10mg/mL、0.01-0.09mg/mL、0.01-0.075mg/mL、0.025-0.075mg/mL、0.01-0.05mg/mL、0.02-0.08mg/mL、0.02-0.06mg/mL、0.03-0.055mg/mL或0.04-0.05mg/mL的浓度。

RNA产物

在一些实施方案中，本文提供的目标转录RNA为信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，存在于目标RNA的第一位置的NTP是ATP。在一些实施方案中，存在于目标RNA的第一位置的NTP是GTP。在一些实施方案中，存在于目标RNA的第一位置的NTP是UTP。在一些实施方案中，存在于目标RNA的第一位置的NTP是CTP。

在一些实施方案中，方法进一步包括从经验平衡的补料分批IVT反应混合物中分离(例如，纯化)RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，方法进一步包括在纳米颗粒中配制分离的RNA。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒，例如阳离子脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可以包含例如摩尔比为20-60％的可电离氨基脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的甾醇和0.5-15％的PEG修饰的脂质。参见例如2017年4月27日公布的WO 2017/070624，其通过引用并入本文。可以使用其他纳米颗粒。

在一些实施方案中，目标转录RNA的产量大于使用分批IVT反应或方法或常规补料分批方法(没有针对NTP消耗进行经验平衡的补料分批方法)转录的RNA的产量。参见Kerr等人，Biotechnol.Prog.15：174-184(1999)。例如，目标转录RNA的产量可以比使用分批IVT反应或方法转录的RNA的产量高20％至200％。在一些实施方案中，目标转录RNA的产量比使用分批IVT反应或方法转录的RNA的产量高20％-175％、20％-150％、20％-125％、20％-100％、20％-75％、20％-50％、30％-200％、30％-175％、30％-150％、30％-125％、30％-100％、30％-75％、30％-50％、40％-200％、40％-175％、40％-150％、40％-125％、40％-100％、40％-75％或40％-50％。在一些实施方案中，目标转录RNA的产量比使用分批IVT反应或方法转录的RNA的产量高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。

在一些实施方案中，目标转录RNA的产量大于5mg/mL初始反应体积。在一些实施方案中，目标转录RNA的产量大于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40mg/mL初始反应体积。在一些实施方案中，目标转录RNA的产量为5-10mg/mL初始反应体积、5-15mg/mL初始反应体积、10-20mg/mL初始反应体积、15-25mg/mL初始反应体积、20-30mg/mL初始反应体积、25-35mg/mL初始反应体积或30-40mg/mL初始反应体积。

在一些实施方案中，加尾目标RNA％(包含polyA尾部的RNA转录物的百分比)在补料分批反应的反应时间(分钟)达150分钟、180、210、240、270、300、330和/或360分钟时大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或大于95％。

RNA聚合酶

本文提供的可以使用的RNA聚合酶的实例包括但不限于T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶及其同源物、直系同源物和变体。在一些实施方案中，RNA聚合酶是T7聚合酶变体。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶经修饰以相对于野生型T7RNA聚合酶在选自以下各项的至少一个位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代：E42(例如，E42R)、S43(例如，S43A)、Y44(例如，Y44A)、E45(例如，E45R/L)、M46(例如，M46A)、G47(例如，G47A)、A255(例如，A255K/Q/Y/I)、R257(例如，R257A)、A258(例如，A258R/E/L)、G259(例如，G259A)、A260(例如，A260R/E/L)、L261(例如，L261A)和A262(例如，A262R/E/L)。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶还可以包含一个或多个额外的氨基酸取代(除了至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代之外)。因此，本公开包括用本文提供的一个或多个高螺旋倾向性氨基酸取代对现有的(例如，当前可用的和/或市售的)T7RNA聚合酶变体进行进一步修饰。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体(例如T7RNA聚合酶变体)在其C末端包含额外的氨基酸。在一些实施方案中，额外的氨基酸是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，额外的氨基酸是丙氨酸(A)。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体(例如T7RNA聚合酶变体)在其C末端包含至少两个(例如2、3、4、5个或更多个)额外的氨基酸。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体(例如，T7RNA聚合酶变体)经修饰以相对于野生型T7RNA聚合酶在选自以下各项的至少一个位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代：E42(例如，E42R)、S43(例如，S43A)、Y44(例如，Y44A)、E45(例如，E45R/L)、M46(例如，M46A)、G47(例如，G47A)、A255(例如，A255K/Q/Y/I)、R257(例如，R257A)、A258(例如，A258R/E/L)、G259(例如，G259A)、A260(例如，A260R/E/L)、L261(例如，L261A)和A262(例如，A262R/E/L)，并且在其C末端包含额外的氨基酸。

在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其经修饰以在选自E42(例如E42R)、S43(例如S43A)、Y44(例如Y44A)、E45(例如E45R/L)、M46(例如M46A)和G47(例如G47A)的位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包含G47A。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含额外的C末端氨基酸的RNA聚合酶。在一些实施方案中，额外的C末端氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸。在一些实施方案中，额外的C末端氨基酸(例如，相对于包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型RNA聚合酶在位置884处)是甘氨酸。

在一些实施方案中，T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶在C末端包含额外的甘氨酸。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶包含G47A取代。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶包含G47A取代和在C末端处的额外甘氨酸。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括RNA聚合酶，其相对于野生型RNA聚合酶包含(a)在选自位置350、351、387、394、425、427、437、441、632、811和880的位置处的氨基酸取代和(b)在C末端处的额外氨基酸取代和/或氨基酸修饰，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置350处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置350处的赖氨酸(K)(E350K)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置350处的天冬酰胺(N)(E350N)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置350处的丙氨酸(A)(E350A)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置350处的色氨酸(E350W)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置351处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置351处的缬氨酸(V)(D351V)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置387处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置387处的丝氨酸(K387S)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置387处的组氨酸(H)(K387H)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置387处的天冬酰胺(K387N)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置394处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置425处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置427处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置437处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置437处的苏氨酸(N437T)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置437处的异亮氨酸(N437I)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置437处的酪氨酸(N437Y)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置437处的苯丙氨酸(N437F)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置441处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置441处的精氨酸(K441R)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置632处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置811处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置880处的氨基酸取代和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括相对于野生型RNA聚合酶包含在位置47处的氨基酸取代(例如，G47A)、在位置880处的酪氨酸(F880Y)和/或在C末端处(在位置884处)的额外氨基酸(例如，G)的RNA聚合酶，其中野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包括RNA聚合酶，其相对于包含SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列的RNA聚合酶在选自由E350、D351、K387、N437、K441、D506、R632、D653、S628、P657、F880和G884组成的组的位置处包含氨基酸取代。

在一些实施方案中，RNA聚合酶在E350处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在D351处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在K387处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在N437处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在K441处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在D506处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在R632处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在D653处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在S628处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在P657处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在F880处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在G884处包含氨基酸取代。

在一些实施方案中，RNA聚合酶在选自由E350、D351、K387、N437、K441、D506、R632、D653、S628、P657、F880和G884组成的组的位置处包含至少两个、至少三个、至少四个或至少五个氨基酸取代。

在一些实施方案中，RNA聚合酶在选自由以下组成的组的位置处包含氨基酸取代：E350和D351；E350和K387；E350和N437；E350和K441；E350和D506；E350和R632；E350和D653；E350和S628；E350和P657；E350和F880；E350和G884；D351和K387、D351和N437；D351和K441；D351和D506；D351和R632；D351和D653；D351和S628；D351和P657；D351和F880；D351和G884；K387和N437；K387和K441；K387和D506；K387和R632；K387和D653；K387和S628；K387和P657；K387和F880；以及K387和G884；N437和K441；N437和D506；N437和R632；N437和D653；N437和S628；N437和P657；N437和F880；N437和G884；K441和D506；K441和R632；K441和D653；K441和S628；K441和P657；K441和F880；K441和G884；D506和R632；D506和D653；D506和S628；D506和P657；D506和F880；D506和G884；R632和D653；R632和S628；R632和P657；R632和F880；R632和G884；D653和S628；D653和P657；D653和F880；D653和G884；S628和P657；S628和F880；S628和G884；P657和F880；P657和G884；以及F880和G884。

在一些实施方案中，RNA聚合酶在选自由以下组成的组的位置处包含酸取代：K387、D653和G884；E350、D351和K387；以及D653、P657和R632。在一些实施方案中，E350处的氨基酸取代选自由E350A、E350K、E350N和E350W组成的组，任选地其中E350处的氨基酸取代是E350N。在一些实施方案中，D351处的氨基酸取代是D351V。在一些实施方案中，K387处的氨基酸取代选自由K387H、K387N和K387S组成的组，任选地其中K387处的氨基酸取代是K387N。在一些实施方案中，N437处的氨基酸取代选自由N437F、N437I、N437T和N437Y组成的组，任选地其中N437处的氨基酸取代是N437F。在一些实施方案中，K441处的氨基酸取代是K441R。在一些实施方案中，D506处的氨基酸取代选自由D506F、D506L、D506R、D506W和D506Y组成的组。在一些实施方案中，R632处的氨基酸取代是R632K或R632T。

在一些实施方案中，D653处的氨基酸取代选自由D653A、D653F、D653G、D653H、D653I、D653K、D653L、D653M、D653N、D653P、D653Q、D653R、D653S、D653T、D653V、D653W和D653Y组成的组，任选地其中D653处的氨基酸取代是D653W。在一些实施方案中，S628处的氨基酸取代是S628W。在一些实施方案中，P657处的氨基酸取代选自由P657A、P657R和P657W组成的组。在一些实施方案中，F880处的氨基酸取代是F880Y。在一些实施方案中，G884处的氨基酸取代选自由G884A、G884S、G884T和G884P组成的组。

在一些实施方案中，RNA聚合酶相对于包含SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列的RNA聚合酶在选自由E350、D351、K387和D653组成的组的两个位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在E350和D351处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在E350和K387处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶在K387和D653处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，位置E350处的氨基酸取代是E350W、E350A、E350K或E350N。在一些实施方案中，位置D351处的氨基酸取代是D351V。在一些实施方案中，位置K387处的氨基酸取代是K387N、K387S或K387H。在一些实施方案中，位置D653处的氨基酸取代是D653T或D653K。

在一些实施方案中，RNA聚合酶相对于包含SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列的RNA聚合酶在位置E350和K387处包含氨基酸取代，任选地其中所述取代是E350W和K387N。

在一些实施方案中，RNA聚合酶相对于包含SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列的RNA聚合酶在位置E350和D351处包含氨基酸取代，任选地其中所述取代是E350W和D351V。

在一些实施方案中，RNA聚合酶相对于包含SEQ ID NO：1-4中任一项的氨基酸序列的RNA聚合酶在位置K387和D653处包含氨基酸取代，任选地其中所述取代是K387N和D653T。

在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7RNA聚合酶包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

T7 RNA聚合酶序列

野生型T7 RNA聚合酶

C末端G T7 RNA聚合酶

G47A T7 RNA聚合酶

G47A；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；E350K；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；E350N；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；E350A；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；E350W；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；D351V；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；K487S；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；K387H；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；K387N；C末端G T7 RNA聚合酶

G47A；E350W；D351V；C末端G T7 RNA聚合酶

E350W；D351V；T7 RNA聚合酶

在一些实施方案中，RNA聚合酶(例如，T7RNA聚合酶变体)以0.01mg/m1至1mg/ml的浓度存在于经验平衡的补料分批IVT反应混合物中。例如，RNA聚合酶可以以0.01mg/mL、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1.0mg/ml的浓度存在于反应混合物中。

核苷三磷酸

本公开的NTP可以是天然存在的NTP、合成NTP和/或修饰的NTP。反应混合物可以包含天然存在的NTP、合成NTP、修饰的NTP或其任何组合。因此，反应混合物的NTP可以包含未修饰和/或修饰的三磷酸腺苷(ATP)、修饰和/或未修饰的三磷酸尿苷(UTP)、修饰和/或未修饰的三磷酸鸟苷(GTP)，和/或修饰和/或未修饰的三磷酸胞苷(CTP)。在一些实施方案中，NTP包括修饰的核碱基。本文提供的可以使用的修饰的核碱基的非限制性实例包括假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4′-硫代尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷(mo5U)和2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，NTP的混合物(并且因此RNA转录物)包括上述修饰的核碱基中的至少两个(例如，2、3、4个或更多个)的组合。在一些实施方案中，NTP的混合物包含1-甲基假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，NTP的混合物包含1-乙基假尿苷。

在一些实施方案中，补料分批IVT反应混合物中的每种NTP(例如，ATP、UTP、GTP和CTP)是以相当于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值(例如，在初始核苷酸经验平衡反应期间计算)的摩尔比存在。例如，如果在初始核苷酸经验平衡反应中针对特定目标RNA计算的ATP、UTP、GTP和CTP的消耗百分比值分别为35％、20％、25％和20％，则在包含20mM的总NTP浓度(用于转录相同的目标RNA)的IVT反应混合物中，ATP、UTP、GTP和CTP的当量摩尔比分别为7mM、4mM、5mM和4mM。

在一些实施方案中，补料分批IVT反应混合物中的每一种(并且因此总的)NTP浓度在整个反应过程中维持在零(0)毫摩尔浓度(mM)以上。例如，NTP浓度可以维持在1mM至50mM、1mM至40mM、1mM至30mM、1mM至20mM、1mM至10mM、2mM至50mM、2mM至40mM、2mM至30mM、2mM至20mM、2mM至10mM、3mM至50mM、3mM至40mM、3mM至30mM、3mM至20mM、3mM至10mM、4mM至50mM、4mM至40mM、4mM至30mM、4mM至20mM、4mM至10mM、5mM至50mM、5mM至40mM、5mM至30mM、5mM至20mM或5mM至10mM。在一些实施方案中，NTP浓度维持在10mM至20mM。在一些实施方案中，NTP浓度维持在(或至少在)1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。在一些实施方案中，NTP浓度维持在高于2mM的下限至10mM、高于2mM的下限至9mM、高于2mM的下限至8mM、高于2mM的下限至7mM、高于2mM的下限至6mM或高于2mM的下限至6mM。

在一些实施方案中，每种(并且因此总的)NTP浓度在整个补料分批IVT反应过程中维持在初始NTP浓度的5％至200％以内。例如，NTP浓度可以维持在初始NTP浓度的5％至175％以内、5％至150％以内、5％至125％以内、5％至100％以内、5％至75％以内、5％至50％以内或5％至25％以内。在一些实施方案中，NTP浓度维持在初始NTP浓度的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％以内。初始NTP浓度是转录开始前IVT反应中的总NTP浓度。如本文中所用，[NTP](即被括号包围的NTP)通常是指括号中包含的NTP的浓度。例如，[ATP]一般是指ATP的浓度；[GTP]一般是指GTP的浓度；[CTP]一般是指CTP的浓度；[UTP]一般是指UTP的浓度。

存在于IVT反应混合物中的NTP和盖帽类似物的浓度可以发生变化。在一些实施方案中，每种嘌呤NTP和RNA帽类似物(“盖帽类似物”)是以等摩尔(1∶1)浓度存在于反应中。在一些实施方案中，反应中盖帽类似物(例如，三核苷酸盖帽)与每种嘌呤NTP的摩尔比大于1∶1。例如，反应中盖帽类似物与NTP的摩尔比可以为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、50∶1或100∶1。在一些实施方案中，反应中盖帽类似物(例如，三核苷酸盖帽)与每种NTP的摩尔比小于1∶1。例如，反应中盖帽类似物(例如，三核苷酸盖帽)与每种NTP的摩尔比可以为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶50或1∶100。

IVT反应中的单个NTP的相对浓度也可以变化。例如，可以使用多于GTP、CTP和UTP的ATP。作为其他实例，可以使用多于ATP、CTP和UTP的GTP，可以使用多于ATP、GTP和UTP的CTP，或者可以使用多于ATP、GTP和CTP的UTP。

在一些实施方案中，初始IVT反应混合物中NTP的相对浓度包含1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]的比率。在一些实施方案中，初始IVT反应混合物中NTP的相对浓度包含2∶1的[ATP]∶[UTP]的比率。在一些实施方案中，初始IVT反应混合物中NTP的相对浓度包含1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[GTP]∶[CTP]的比率。在一些实施方案中，初始IVT反应混合物中NTP的相对浓度包含4∶1的[GTP]∶[CTP]的比率。在一些实施方案中，初始IVT反应混合物中NTP的相对浓度包含2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

在一些实施方案中，正在进行的IVT反应混合物中的总NTP浓度维持在高于0.5mM的下限。在一些实施方案中，正在进行的IVT反应混合物中的总NTP浓度维持在0.5-20mM、1-20mM、0.5-5mM、2-8mM、2-5mM、5-10mM、5-30mM、5-20mM、10-20mM或5-15mM。在一些实施方案中，正在进行的IVT反应混合物中的总NTP浓度维持在约10-20mM、约8-16mM、约6-14mM或约10-15mM。

RNA盖帽类似物

在一些实施方案中，经验平衡补料分批IVT反应是“共转录加帽”IVT反应，其中IVT反应混合物包含RNA盖帽。也就是说，mRNA是在“一锅法”反应中产生的，不需要单独的加帽反应。因此，在一些实施方案中，本公开的IVT反应混合物包含RNA盖帽类似物。RNA盖帽类似物通常增强mRNA稳定性和翻译效率。传统的盖帽类似物包括GpppG、m7GpppG和m2，2，7GpppG。在一些实施方案中，本公开的RNA盖帽类似物是二核苷酸盖帽、三核苷酸盖帽或四核苷酸盖帽。

在一些实施方案中，盖帽类似物是三核苷酸盖帽。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG和GUU。

在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：m⁷GpppApA、m⁷GpppApC、m⁷GpppApG、m⁷GpppApU、m⁷GpppCpA、m⁷GpppCpC、m⁷GpppCpG、m⁷GpppCpU、m⁷GpppGpA、m⁷GpppGpC、m⁷GpppGpG、m⁷GpppGpU、m⁷GpppUpA、m⁷GpppUpC、m⁷GpppUpG和m⁷GpppUpU。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：m⁷G_3′OMepppApA、m⁷G_3′OMepppApC、m⁷G_{3′ OMe}pppApG、m⁷G_3′OMepppApU、m⁷G_3′OMepppCpA、m⁷G_3′OMepppCpC、m⁷G_3′OMepppCpG、m⁷G_3′OMepppCpU、m⁷G_3′OMepppGpA、m⁷G_3′OMePppGpC、m⁷G_3′OMepppGpG、m⁷G_3′OMepppGpU、m⁷G_3′OMepppUpA、m⁷G_{3′ OMe}pppUpC、m⁷G_3′OMepppUpG和m⁷G_3′OMepppUpU。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：m⁷G_3′OMepppA_2′OMepA、m⁷G_3′OMepppA_2′OMepC、m⁷G_3′OMepppA_2′OMepG、m⁷G_3′OMepppA_2′OMepU、m⁷G_3′OMepppC_2′OMepA、m⁷G_3′OMepppC_2′OMepC、m⁷G_3′OMepppC_2′OMepG、m⁷G_3′OMepppC_2′OMepU、m⁷G_{3′ OMe}pppG_2′OMepA、m⁷G_3′OMepppG_2′OMepC、m⁷G_3′OMepppG_2′OMepG、m⁷G_3′OMepppG_2′OMepU、m⁷G_3′OMepppU_{2′ OMe}pA、m⁷G_3′OMepppU_2′OMepC、m⁷G₃′_OMepppU_2′OMepG和m⁷G_3′OMepppU_2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：m⁷GpppA_2′OMepA、m⁷GpppA_2′OMepC、m⁷GpppA_2′OMepG、m⁷GpppA_2′OMepU、m⁷GpppC_2′OMepA、m⁷GpppC_2′OMepC、m⁷GpppC_2′OMepG、m⁷GpppC_2′OMepU、m⁷GpppG_{2′ OMe}pA、m⁷GpppG_2′OMepC、m⁷GpppG_2′OMepG、m⁷GpppG_2′OMepU、m⁷GpppU_2′OMepA、m⁷GpppU_2′OMepC、m⁷GpppU_2′OMepG和m⁷GpppU_2′OMepU。

在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含选自以下序列的序列：GAG、GCG、GUG和GGG。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含序列GAG。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含m⁷GpppA_2′OmepG。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含m⁷GpppmA_2′OmepG。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含m⁷Gpppm⁶A_2′OmepG。在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含m⁷Gpppe⁶A_{2′ Ome}pG。

在一些实施方案中，三核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，三核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，三核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，三核苷酸盖帽包含以下结构：

在一些实施方案中，盖帽类似物是四核苷酸盖帽类似物。在一些实施方案中，盖帽类似物是包含GGAG序列的四核苷酸盖帽类似物。

在一些实施方案中，四核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，四核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，四核苷酸盖帽包含以下结构：

在其他实施方案中，四核苷酸盖帽包含以下结构：

在一些实施方案中，R是烷基(例如，C₁-C₆烷基)。在一些实施方案中，R是甲基(例如，C₁烷基)。在一些实施方案中，R是乙基(例如，C₂烷基)。在一些实施方案中，R为氢。

在一些实施方案中，由本公开的方法产生的RNA的20％至100％、30％至100％、40％至100％、50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100或90％至100％是加帽的(包含RNA盖帽类似物，例如m⁷GpppA_2′OmepG)。例如，由本公开的方法产生的RNA的大于70％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％是加帽的(包含RNA盖帽类似物，例如m⁷GpppA_2′OmepG)。在一些实施方案中，由本公开的方法产生的RNA的100％是加帽的(包含RNA盖帽类似物，例如m⁷GpppA_2′OmepG)。

在一些实施方案中，目标RNA的加帽％(包含RNA盖帽类似物的RNA转录物的百分比)在补料分批反应进行150、180、210、240、270、300、330和/或360分钟时高于80％、高于90％或高于95％。

在一些实施方案中，反应混合物在目标RNA的转录期间不补充RNA盖帽类似物。即，在整个IVT反应期间，唯一存在的RNA盖帽类似物是转录开始前反应混合物中的RNA盖帽类似物(不向IVT反应添加额外的RNA盖帽类似物)。

在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度(转录开始前RNA盖帽类似物的浓度)比具有最高消耗百分比值的NTP(例如，ATP、UTP、GTP或CTP(修饰或未修饰的))的浓度高至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度大于具有最高消耗百分比值的NTP(例如，ATP、UTP、GTP或CTP(修饰或未修饰的))的浓度。

在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度(转录开始前RNA盖帽类似物的浓度)比具有最高消耗百分比值的嘌呤(修饰或未修饰的)的浓度高至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度大于具有最高消耗百分比值的嘌呤(修饰或未修饰的)的浓度。

在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度(转录开始前RNA盖帽类似物的浓度)比存在于目标RNA的第一编码位置的单个NTP(例如，ATP、UTP、GTP或CTP(修饰或未修饰的))的浓度高至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％或至少100％)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含的起始RNA盖帽类似物浓度(转录开始前RNA盖帽类似物的浓度)比存在于目标RNA的第一编码位置的NTP(例如，ATP、UTP、GTP或CTP(修饰或未修饰的))的浓度高10％-100％、10％-50％、10％-40％或10％-30％。

在一些实施方案中，IVT反应混合物(例如，初始和正在进行的IVT反应混合物)包含1∶1至20∶1、1∶1至15∶1、1∶1至10∶1、1∶1至5∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[RNA盖帽类似物]∶[嘌呤]的比率。在一些实施方案中，RNA盖帽类似物的浓度相对于嘌呤核苷酸(例如ATP和GTP)的浓度为1∶1至20∶1、1∶1至15∶1、1∶1至10∶1、1∶1至5∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1。

其他IVT反应组分

在一些实施方案中，IVT反应混合物包含缓冲液，例如Tris、磷酸盐或古德(Good’s)缓冲液。经验平衡补料分批IVT反应混合物中使用的缓冲液的浓度可以是例如至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM或至少110mM磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐的浓度为20-60mM或10-100mM。在一些实施方案中，缓冲液包含Tris-HCl。例如，缓冲液可以包含10-100mM、10-80mM、10-60mM、20-100mM、20-18mM、20-60mM Tris-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含40mM Tris-HCl。

在一些实施方案中，补料分批IVT反应混合物包含还原剂或还原试剂如二硫苏糖醇(DTI)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。IVT反应混合物中使用的DTT的浓度可以是例如至少1mM、至少5mM或至少50mM。在一些实施方案中，IVT反应混合物中使用的DTT的浓度为1-50mM或5-50mM。在一些实施方案中，IVT反应混合物中使用的DTT的浓度为5mM。IVT反应混合物中使用的TCEP的浓度可以是例如至少1mM、至少5mM或至少50mM。在一些实施方案中，IVT反应混合物中使用的TCEP的浓度为1-50mM或5-50mM。在一些实施方案中，IVT反应混合物中使用的TCEP的浓度为2mM。

在一些实施方案中，经验平衡补料分批IVT反应混合物包含镁。在一些实施方案中，IVT反应中存在的NTP与镁离子(Mg²⁺；例如，Mg(OAc)₂)的摩尔比为1∶1至1∶5。例如，NTP与镁离子的摩尔比可以是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。

进料计划

补料分批IVT反应通常包括定期进料计划。可以使用定期进料计划将IVT反应内的NTP浓度维持在所需水平，例如高于阈值水平，例如高于初始NTP浓度的5％、10％、20％、30％或50％。在一些实施方案中，用于进料计划的时间安排和/或量是使用侦察补料分批IVT反应确定的。在一些实施方案中，如果IVT反应的进料过多(即，在反应过程中加入过多的任何给定NTP)，则盖帽类似物相对于嘌呤的比率可能降低至小于1∶1，其中进料过多可以导致低加帽RNA产物％。在其他实施方案中，如果IVT反应的进料不足(即，在反应过程中没有加入足够的任何给定NTP)，则一种或多种核苷酸可能被消耗至低于阈值水平，例如消耗至0mM，并且转录RNA的总产量可能偏低。在一些实施方案中，进料计划可以包括原料的批式进料。在一些实施方案中，进料计划可以包括原料的连续进料。

在一些实施方案中，将原料批式进料至正在进行的IVT反应中包括每10-250分钟、20-200分钟、10-175分钟、10-100分钟、10-20分钟、10-30分钟、30-60分钟、30-100分钟、30-150分钟、50-100分钟、50-150分钟、100-300分钟、100-250分钟或100-150分钟添加一次离散体积或数量的原料。在一些实施方案中，将原料批式进料至正在进行的IVT反应中包括每10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300分钟添加一次离散体积或数量的原料。在一些实施方案中，批式进料中涉及的离散体积为1-20mL、5-20mL、10-50mL、25-100mL、50-500mL、250-1000mL或更多。在一些实施方案中，批式进料中涉及的离散体积为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、500、750或1000mL。在一些实施方案中，原料的离散量是足以维持NTP浓度高于上述阈值水平(例如，在初始NTP浓度的5％至200％、5％-100％、5％-75％、20％-100％、20％-75％或25％-50％的范围内)的任何量。在一些实施方案中，离散量的原料是任何足以维持1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]的比率的量。在一些实施方案中，离散量的原料是任何足以维持2∶1的[ATP]∶[UTP]的比率的量。在一些实施方案中，离散量的原料是任何足以维持1∶1至5∶1、1∶1至4∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[GTP]∶[CTP]的比率的量。在一些实施方案中，离散量的原料是任何足以维持4∶1的[GTP]∶[CTP]的比率的量。在一些实施方案中，离散量的原料是任何足以维持2∶1的[ATP]∶[UTP]的比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]的比率的量。

在一些实施方案中，IVT反应在整个反应过程中补充批式进料的原料一次、两次或三次。在一些实施方案中，IVT反应在整个反应过程中补充批式进料的原料4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，IVT反应在整个反应过程中补充批式进料的原料1-5次、2-5次、2-10次、3-10次、3-7次、4-8次、5-10次、5-15次或更多次。

在一些实施方案中，将原料连续进料至正在进行的IVT反应中包括随时间(例如，在整个IVT反应过程中)连续或持续添加原料。在一些实施方案中，基于相同目标RNA的批式进料计划确定连续进料计划，例如通过将在反应期间的一段时间内添加的总体积或数量除以添加该体积或数量所经历的总时间。在一些实施方案中，连续进料包括以1-50mL/min、2-25mL/min、2-10mL/min、2-8mL/min、4-6mL/min、3-6mL/min的连续流速或任何可操作的流速向正在进行的IVT反应持续添加原料。在一些实施方案中，连续进料包括以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50mL/min的连续流速向正在进行的IVT反应持续添加原料。在一些实施方案中，连续进料包括以0.0030-0.007mL/min/mL初始体积、0.0040-0.0060mL/min/mL初始体积、0.0050-0.0080mL/min/mL初始体积或0.0060-0.0090mL/min/mL初始体积的连续流速向正在进行的IVT反应持续添加原料。在一些实施方案中，用于连续进料的原料中的NTP的浓度足以维持NTP浓度高于上述阈值水平(例如，在初始NTP浓度的5％至200％、5％-100％、5％-75％、20％-100％、20％-75％或25％-50％的范围内)。在一些实施方案中，使用蠕动泵进行连续进料以随时间准确地递送一致的流速(体积)。

在一些实施方案中，用于连续或批式进料的原料中的NTP的浓度足以将NTP浓度维持在阈值水平以上。在一些实施方案中，离散量的原料是足以将NTP浓度维持在阈值水平以上的任何量。在一些实施方案中，阈值水平为1mM至50mM、1mM至40mM、1mM至30mM、1mM至20mM、1mM至10mM、2mM至50mM、2mM至40mM、2mM至30mM、2mM至20mM、2mM至10mM、3mM至50mM、3mM至40mM、3mM至30mM、3mM至20mM、3mM至10mM、4mM至50mM、4mM至40mM、4mM至30mM、4mM至20mM、4mM至10mM、5mM至50mM、5mM至40mM、5mM至30mM、5mM至20mM或5mM至10mM。在一些实施方案中，阈值水平为10mM至20mM。在一些实施方案中，阈值水平为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。在一些实施方案中，阈值水平为2mM的下限至10mM、高于2mM的下限至9mM、高于2mM的下限至8mM、高于2mM的下限至7mM、高于2mM的下限至6mM或高于2mM的下限至6mM。在一些实施方案中，阈值水平在初始NTP浓度的5％至200％以内。例如，阈值水平可以在初始NTP浓度的5％至175％以内、5％至150％以内、5％至125％以内、5％至100％以内、5％至75％以内、5％至50％以内或5％至25％以内。在一些实施方案中，阈值水平在初始NTP浓度的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％以内。

补料分批IVT的结果始终显示反应速率(NTP的消耗和RNA的产生)在整个反应过程中降低。因此，进料速率也必须在整个反应过程中变化。如果使用单一连续进料速率(如前面所描述)向在整个持续时间内反应速率逐渐降低的IVT进料，则反应将会在开始时(速率最快时)进料不足，而在反应结束时(速率最慢时)进料过多。为了防止进料不足和过多的风险，可以将反应分成两个或多个连续进料速率，以在反应的指定时间间隔内使用。所需的不同进料速率的数量和切换时间可以根据在整个补料分批IVT过程中观察到的反应速率的降低而变化。

侦察补料分批IVT反应

为了确定合适的进料计划，可以进行侦察补料分批IVT反应，其中使用批式进料以限定的时间间隔和限定的体积或数量将原料添加到活性IVT反应中。在一些实施方案中，这些初始进料条件是基于使用编码不同RNA序列的其他DNA的补料分批IVT反应的先前结果来选择，并且不旨在产生高质量产物或高产量。在一些实施方案中，侦察IVT反应包括在每次批式进料前立即对活性补料分批IVT的时间点进行采样。然后可以使用这些样品中每一个的NTP浓度测量值来计算IVT反应中针对随时间被转录的独特DNA的NTP消耗率。然后可以调整进料计划以匹配观察到的NTP消耗并在整个反应过程中维持持目标NTP浓度。在一些实施方案中，这些离散的进料时间和体积构成用于补料分批IVT反应的批式进料计划。

其它实施方案

1.一种确定体外转录(IVT)反应的核苷三磷酸(NTP)消耗百分比(％)的方法，其包括：

(a)用包含已知初始NTP浓度、编码目标核糖核酸(RNA)的脱氧核糖核酸(DNA)和RNA聚合酶的反应混合物进行IVT反应；

(b)在一段时间内以离散时间间隔测量单个NTP浓度；和

(c)针对反应混合物中的每种NTP计算消耗百分比(％)值。

2.如段落1所述的方法，其中NTP包括腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鸟苷三磷酸(GTP)。

3.如段落1所述的方法，其中(b)包括(i)将单个NTP消耗率除以总NTP消耗率。

4.如段落3所述的方法，其中通过在一段时间内以离散时间间隔测量单个NTP浓度来计算单个NTP消耗率；并且通过在一段时间内以离散时间间隔测量总NTP浓度来计算总NTP消耗率。

5.如段落4所述的方法，其中收集单个NTP浓度和总NTP浓度测量值，直到至少一种NTP的浓度降至阈值浓度以下。

6.如段落5所述的方法，其中阈值浓度高于零(0)毫摩尔浓度(mM)，任选地其中阈值浓度为5mM至20mM，并且任选地其中阈值浓度在初始NTP浓度的5％-75％以内。

7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中已知初始NTP浓度包含[ATP]、[CTP]、[UTP]和[GTP]中每一个的等摩尔NTP浓度。

8.如段落1-6中任一项所述的方法，其中已知初始NTP浓度包含1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中已知初始NTP浓度包含2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

10.如前述段落中任一项所述的方法，其中NTP是化学修饰的NTP、天然存在的NTP或合成NTP。

11.如段落1-10中任一项所述的方法，其中在20至40分钟的时间间隔内进行IVT反应。

12.一种目标核糖核酸(RNA)的补料分批体外转录(IVT)方法，其包括：

(a)用包含编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶和核苷三磷酸(NTP)的初始反应混合物进行IVT反应；和

(b)随时间向正在进行的IVT反应混合物递送包含NTP的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对每种NTP分别计算的消耗百分比值的摩尔比存在于原料混合物中，其中消耗百分比值特定于目标RNA，并且其中原料混合物是以维持反应混合物中的总NTP浓度高于0mM的量递送，

从而产生目标转录RNA。

13.如段落12所述的方法，其中NTP包括腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鸟苷三磷酸(GTP)。

14.如段落12或13所述的方法，其中(a)的初始反应混合物包含1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

15.如段落12-14中任一项所述的方法，其中(a)的初始反应混合物包含2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

16.如段落12-15中任一项所述的方法，其中(a)的初始反应混合物中的每种NTP是以不同于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值的相等摩尔比存在。

17.如段落12-16中任一项所述的方法，其中(a)的初始反应混合物中的每种NTP是以针对每种NTP的等摩尔浓度存在。

18.如段落12-17中任一项所述的方法，其中(a)的初始反应混合物中的每种NTP是以1-10mM、1-6mM、2-6mM或3-6mM的浓度存在。

19.如段落12-18中任一项所述的方法，其中正在进行的IVT反应混合物中的每种NTP的浓度维持在其相应初始NTP浓度的5％至200％、5％-100％、5％-75％、20％-100％、20％-75％或25％-50％的范围内。

20.如段落12-19中任一项所述的方法，其中反应混合物维持在1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

21.如段落12-20中任一项所述的方法，其中反应混合物维持在2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

22.一种目标核糖核酸(RNA)的补料分批体外转录(IVT)方法，其包括：

(a)用包含编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶和核苷三磷酸(NTP)的初始反应混合物进行IVT反应，其中NTP包含2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]比率；和

(b)随时间向正在进行的IVT反应混合物递送包含NTP的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对每种NTP分别计算的消耗百分比值的摩尔比存在于原料混合物中，其中消耗百分比值特定于目标RNA，并且其中原料混合物是以维持2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]比率的量递送，

从而产生目标转录RNA。

23.如段落12-22中任一项所述的方法，其中NTP是化学修饰的NTP、天然存在的NTP或合成NTP。

24.如段落12-23中任一项所述的方法，其中随时间的推移使用批式进料将原料混合物递送至正在进行的IVT反应混合物中。

25.如段落24所述的方法，其中每10-250分钟，任选地每20-200分钟将原料混合物递送至正在进行的IVT反应混合物中。

26.如段落12-23中任一项所述的方法，其中随时间的推移使用连续进料将原料混合物递送至正在进行的IVT反应混合物中。

27.如段落26所述的方法，其中以如下连续流速将原料混合物递送至正在进行的IVT反应混合物中：

(i)2-8mL/min，任选为4-6mL/min；或

(ii)0.0030-0.007mL/min/mL初始体积，任选为0.0040-0.0060mL/min/mL初始体积。

28.如段落12-27中任一项所述的方法，其中(a)的初始反应混合物中的每种NTP是以相当于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值的摩尔比存在。

29.如段落12-28中任一项所述的方法，其中正在进行的IVT反应混合物中的总NTP浓度维持在高于0.5mM的下限，任选地维持在10mM至20mM。

30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中初始和/或正在进行的IVT反应混合物进一步包含RNA盖帽类似物。

31.如段落30所述的方法，其中RNA盖帽类似物是化学修饰的RNA盖帽类似物、天然存在的RNA盖帽类似物或合成RNA盖帽类似物。

32.如段落30或31所述的方法，其中RNA盖帽类似物是(i)三核苷酸RNA盖帽类似物，任选地选自包含盖帽1、盖帽2、盖帽3或盖帽4结构的三核苷酸盖帽类似物，或(ii)四核苷酸RNA盖帽类似物，任选地选自包含盖帽5、盖帽6、盖帽7或盖帽8结构的三核苷酸盖帽类似物。

33.如段落30-32中任一项所述的方法，其中初始和正在进行的IVT反应混合物包含1∶1至20∶1、1∶1至15∶1、1∶1至10∶1、1∶1至5∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[RNA盖帽类似物]∶[嘌呤]的比率。

34.如段落12-33中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的产量高于使用分批IVT反应转录的RNA的产量。

35.如段落34所述的方法，其中目标转录RNA的产量比使用分批IVT反应转录的RNA的产量高至少100％。

36.如段落12-35中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的产量高于5、10、15、20、25或30mg/mL初始反应体积。

37.如段落12-36中任一项所述的方法，其中初始和正在进行的IVT反应混合物进一步包含缓冲液和/或镁。

38.如段落37所述的方法，其中缓冲液是Tris-HCl，任选地其中缓冲液是20至60mMTris-HCl，任选地其中缓冲液是40mM Tris-HCl。

39.如段落30-3387中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的至少90％(任选地为至少95％)包含RNA盖帽类似物。

40.如段落30-39中任一项所述的方法，其中盖帽类似物与ATP的比率或盖帽类似物与GTP的比率大于0.6，并且目标转录RNA的至少90％包含盖帽类似物。

41.如段落39或40所述的方法，其中目标转录RNA的长度为至少2000个核苷酸。

42.如段落30-41中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的至少90％在IVT反应的第180分钟和/或第360分钟包含RNA盖帽类似物。

43.如段落12-42中任一项所述的方法，其中初始和/或正在进行的IVT反应混合物在IVT反应期间不补充RNA盖帽类似物。

44.如段落12-43中任一项所述的方法，其中初始反应混合物中的DNA浓度为0.025-0.075mg/mL，任选为0.05mg/mL。

45.如段落12-44中任一项所述的方法，其中DNA浓度在IVT反应期间维持在高于0.01mg/mL的浓度，任选地为0.01-0.05mg/mL。

46.如段落12-45中任一项所述的方法，其中IVT反应中目标转录RNA与DNA的摩尔比比非补料分批对照方法中转录RNA与DNA的摩尔比高至少2倍或至少3倍。

47.如段落23-46中任一项所述的方法，其中UTP是选自1-甲基假尿苷和1-乙基假尿苷的修饰的UTP。

48.如段落12-47中任一项所述的方法，其中目标转录RNA是信使RNA(mRNA)。

49.如段落12-48中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的长度大于100个核苷酸。

50.如段落12-49中任一项所述的方法，其中总IVT反应时间为150-1000分钟。

51.如段落12-50中任一项所述的方法，其中目标转录RNA的至少50％或至少70％在IVT反应的第420分钟包含polyA尾部。

52.如段落51所述的方法，其中polyA尾部是A₁₀₀polyA尾部。

53.如段落30-52中任一项所述的方法，其中初始反应混合物包含的RNA盖帽类似物浓度比存在于目标RNA的第一编码位置的NTP的浓度高至少10％或至少20％。

54.如段落53所述的方法，其中存在于目标RNA的第一编码位置的NTP是ATP或GTP。

55.如段落1-54中任一项所述的方法，其中RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。

56.如段落55所述的方法，其中T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶包含在C末端处的额外甘氨酸。

57.如段落55所述的方法，其中T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶包含G47A取代。

58.如段落55所述的方法，其中T7RNA聚合酶相对于野生型T7RNA聚合酶包含G47A取代和在C末端处的额外甘氨酸。

59.如段落30-58中任一项所述的方法，其中RNA盖帽类似物是二核苷酸盖帽、三核苷酸盖帽或四核苷酸盖帽。

60.如段落59所述的方法，其中RNA盖帽类似物包含三核苷酸序列GAG，任选地为GpppA₂′_OmepG。

61.如段落60所述的方法，其中RNA盖帽类似物包含四核苷酸序列GGAG。

62.如段落12-61中任一项所述的方法，其进一步包括分离目标转录RNA。

63.从如段落62所述的方法分离的目标RNA。

64.一种核糖核酸(RNA)，其通过如段落12-63中任一项所述的方法产生。

65.如段落63或64所述的RNA，其被配制在阳离子脂质纳米颗粒中，任选地其中阳离子脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离阳离子脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的甾醇和0.5-15％的PEG修饰的脂质。

实施例

通过以下实施例进一步说明本公开。提供这些实施例是为了帮助理解本公开，并且不应被解释为对公开的限制。

本公开的经验平衡补料分批体外转录(IVT)反应是部分基于以下各项：

核苷酸的经验平衡

●确定针对给定DNA的每种核苷酸的消耗百分比

●通过使用消耗百分比配制用于IVT反应和原料的核苷酸预混合物

确定进料计划和原料组分

●使进料计划适应反应速率随时间的变化

●进料确保盖帽类似物与最高嘌呤NTP浓度的比率≥1

●原料配方最大限度地提高产量和产品质量，同时最大限度地降低商品成本

实施例1.核苷酸经验平衡

在本实施例中，补料分批IVT反应使用四种核苷酸：CTP、GTP、UTP和ATP。我们已经证明，可以改变每种核苷酸的相对摩尔比以最大限度地利用反应物或改变RNA产物的属性。在本文中，我们提供了一种平台，该平台用于根据四种核苷酸的消耗率来平衡它们的比率以确保在整个补料分批IVT过程中维持每种核苷酸的浓度。

当获得编码新RNA产物的DNA时，随后进行以下步骤来计算消耗百分比：

(1)用已知初始浓度的CTP、GTP、UTP和ATP进行分批IVT反应，并在反应期间测量每种核苷酸的浓度。确保所有核苷酸在所有测量时间点保持＞0mM，否则弃用在该时间点收集的数据。对于图1A-1B中所示的数据，所有核苷酸的初始浓度为5mM，并且测量它们的浓度达最多30分钟。

(2)使用测量的浓度和收集时间来计算反应期间CTP、GTP、UTP和ATP消耗的速率。对于多个时间点，这可以是数据线性拟合的斜率(图1A)。

(3)将CTP、GTP、UTP和ATP的速率相加，以确定所有核苷酸的总消耗率(图1B)。

(4)将每一种核苷酸的速率除以所有(总)核苷酸的速率，以确定CTP、GTP、UTP和ATP的消耗百分比值。

相关值提供在表1中。

表1.消耗百分比的实验测定

消耗百分比值可用于配制分批IVT反应的反应混合物，或用于补料分批IVT反应的NTP预混合物和原料。例如，为了确保在分批反应中同时完全消耗所有核苷酸，NTP预混合物可以含有与消耗百分比值相当的NTP摩尔比。或者，在补料分批反应的情况下，可以另外优选配制NTP预混合物，使得当所有核苷酸的总和等于10mM或＞0mM的一些浓度(NTP维持在该浓度下)时，所有核苷酸是等浓度的。最后，可以优选在整个反应过程中保持核苷酸的特定比率，以产生所需的产物特征。使用消耗百分比值允许操作人员实现这些过程要求中的任一个。

按经验确定的消耗百分比值与在所需RNA序列中观察到的每个NTP的丰度％不同。此外，确定消耗百分比不需要构建体序列的先验知识。

如图2所示，超高效液相色谱法

可用于监测NTP和RNA盖帽类似物浓度。然后可以使用该信息来计算单个NTP浓度和/或总NTP浓度。提供以下条件作为实例：

柱：ACQUITY UPLC寡核苷酸BEH C18柱，

1.7μm，2.1mm X 150mm(零件号186005516)

柱温：40℃

流速：0.4mL/min

流动相A：100mM乙酸三乙铵(TEAA)

流动相B：100mM乙酸三乙铵(TEAA)，25％乙腈

示例性IVT预混合物和原料混合物配方基于图1A-1B中提供的数据如下表2和表3所示：

表2.IVT预混合物

表3.原料混合物

实施例2.通过消耗率进行NTP经验平衡

对编码两种构建体RNA#1和RNA#2的DNA进行初始核苷酸经验平衡反应。图3A和3B中描绘了显示每种DNA的单个NTP浓度的图表。如实施例1中所述，确定了以下消耗百分比(％)值：

表3.组成百分比(RNA#1和RNA#2)的实验测定

	CTP％	GTP％	UTP％	ATP％
					RNA#1	22.8％	24.2％	17.0％	35.9％
RNA#2	24.3％	26.9％	17.8％	31.1％

定制补料分批IVT反应中的NTP比率

CTP、GTP、UTP和ATP的消耗百分比值可用于控制初始IVT反应混合物中、在正在进行的反应期间或在IVT反应完成后的残余物中的NTP比率。在一个实例中，用于产生RNA#1的方法可能需要在反应结束时完全利用所有四种NTP试剂。在这种情况下，进行了RNA#1的分批IVT反应，其中设定相对核苷酸比率等于经验消耗百分比值。图4A中显示的图表示出了该反应期间的NTP浓度。所有四种核苷酸同时接近0mM的浓度，使得这些组分的利用率最大化。

其他情况可能要求该方法在补料分批或分批操作期间维持NTP的特定比率，以产生特定的产物特征或确保特定试剂的完全利用。例如，该方法可能要求[CTP]、[GTP]、[UTP]、[ATP]在维持补料分批IVT反应的范围内(例如当总[NTP]等于10mM时)是相等的。在这种情况下，使用按经验确定的消耗百分比值来计算核苷酸预混合物的调整组成以满足该方法要求(表4)。图4B中显示的图表示出了用编码RNA#1的DNA进行的分批IVT反应，其使用特定核苷酸预混合物以使所有NTP在10mM总NTP下是相等的(表4)。如图所示，所有四种核苷酸试剂同时达到2.5mM，或等于10mM的总NTP浓度。

表4.用于IVT反应期间的定制NTP浓度的NTP预混合物

三核苷酸(GAG)加帽效率测试

进行测试IVT以评估GAG∶NTP比率的影响，其中NTP是ATP或GTP。在这组实验中(图22)，大于0.6的GAG∶ATP或GAG∶GTP比率产生具有大于90％盖帽的mRNA。使用具有大于0.6的GAG∶ATP或GAG∶GTP比率的RNA盖帽类似物产生具有最佳盖帽含量的mRNA。因此，补料分批IVT旨在保持GAG∶ATP或GAG∶GTP的比率大于0.6。

实施例3.设置进料计划

补料分批IVT方法的一个重要方面是确定给定原料和IVT反应混合物的适当的添加时间安排，以将试剂保持在所需范围内。为此，使用经验平衡核苷酸预混合物(来自实施例1和2)和基于目标DNA的预测NTP消耗率的初始进料计划，用该DNA进行侦察补料分批IVT反应。如下所述，将根据该侦察补料分批IVT反应的结果和分析修改该初始进料计划。

在侦察补料分批IVT反应的整个过程中，针对每次进料在将原料混合物添加到IVT反应中之前和之后立即测定核苷酸的总浓度(图5A-B)。然后使用这些总浓度测量值和进料时间来计算每次反应进料之间的独特总核苷酸消耗率(图6A-B)。如图7A-C所示，绘制了核苷酸消耗率与[DNA]、[mRNA]或反应时间(在本实施例中使用[DNA])的关系图。用曲线拟合该关系图(示出的线性模型)提供了在整个补料分批IVT反应过程中的核苷酸消耗率的经验模型。通过将这些NTP消耗模型参数与一些额外参数(如下)相结合，确定了用于RNA#1的给定原料和IVT反应混合物的完整进料计划(见表5)。

●初始[DNA]

●最小核苷酸浓度

●初始核苷酸浓度

●原料核苷酸浓度

●最初进料体积分数(进料体积/初始反应体积)

●总反应时间或添加的总核苷酸

表5.针对RNA#1计算的原料添加时间

进料编号	经历的反应时间(分钟)
		1	48.5
2	80.5
		3	115.0
4	152.0
		5	192.5
6	236.5
		7	285.0

实施例4.反应建模

在完成核苷酸经验平衡实验(实施例1和2)并针对给定的DNA、原料和IVT反应混合物设置进料计划(实施例3)后，通过结合关于补料分批IVT反应的几个按经验确定的反应参数和用户选择的参数建立补料分批IVT反应模型：

按经验确定的反应参数

●CTP、GTP、UTP和ATP的消耗％(来自实施例1)

●NTP消耗曲线拟合参数(来自实施例3)

●初始加尾产物％(在实施例3中观察到的)

●加尾产物％对时间的速率(在实施例3中观察到的)

用户选择的反应参数

●用于初始IVT反应的核苷酸预混合物中CTP、GTP、UTP和ATP的比率

●用于原料的核苷酸预混合物中CTP、GTP、UTP和ATP的比率

●初始[DNA]或反应体积(如果用于NTP消耗曲线拟合)

●初始三核苷酸浓度

●最小核苷酸浓度

●初始核苷酸浓度

●原料核苷酸浓度

●最初进料体积分数(进料体积/初始反应体积)

●总反应时间或添加的总核苷酸

如图9-11所示，反应模型能够估算总核苷酸和单个核苷酸的浓度(图9)、RNA产物的产量(图10)、加尾RNA％(图11)。此外，该模型提供关于RNA产物中的预期加帽％(通过比较[嘌呤]与[三核苷酸])和任何DNA的最佳反应时间的指导。

实施例5.针对RNA#1和RNA#2的补料分批IVT方法测试

针对RNA#1和RNA#2进行经验平衡补料分批IVT反应。基于速率分析(图6A-B和图7A-C)为RNA#1和RNA#2设定进料计划。以下初始IVT条件用于每种构建体：

初始IVT反应配方：

●40mM Tris HCl，pH 8.0

●20mM总核苷酸(经验平衡至10mM NTP)●30mM乙酸镁

●RNA盖帽类似物(三核苷酸)等于1.2*[ATP]●0.04mg/mL RNA聚合酶

●0.02％Triton X-100(重量/体积)

●0.05mg/mL质粒

●5mM DTT

●1mM亚精胺

●1U/mL PPiase

实验细节：

●温度：37℃

●初始反应体积：500μL

●翻滚混合

原料配方：

●40mM Tris HCl，pH 8.0

●60mM总核苷酸(经验平衡至10mM NTP)

●60mM乙酸镁

●0.04mg/mL RNA聚合酶

●0.02％Triton X-100

●5mM DTT

●1mM亚精胺

●1U/mL PPiase

进料计划：

●恒定进料体积：71.4μL

●进料时间：

○RNA#1：60、85、115、150、185、220、260分钟(7次进料)

○RNA#2：60、100、140、180、220、270分钟(6次进料)

●总反应时间：360分钟(6小时)

●最终IVT反应体积：

○RNA#1(7次进料)：1000μL

○RNA#2(6次进料)：928μL

分析输出：

●RNA产物产量

●用于监测NTP和RNA盖帽类似物浓度的超高效液相色谱

●加尾RNA％

●加帽RNA％

如图11-16所示，在RNA#1和RNA#2的补料分批IVT反应的整个过程中评估核苷酸浓度、产量和产品质量。图11A-B和图12A-B分别示出了在RNA#1和RNA#2的补料分批IVT反应期间测量的总[NTP]和单个[NTP]。图13A和13B分别示出了RNA#1和RNA#2的总RNA和加尾RNA的浓度测量值。图14A-B示出了RNA#1和RNA#2的总RNA和加尾RNA的质量测量值对初始IVT反应体积。图15示出了RNA#1和RNA#2的加尾RNA产物％。图16A示出了RNA#1和RNA#2的加帽mRNA产物％，并且图16B示出了RNA#1的随时间变化的加帽RNA产物％。可以将实验结果与使用相同参数的IVT模型输出进行比较，以验证反应结果或改善模型。还可以记录构建体特异性参数并用于开发针对未来构建体的方法。

实施例6.针对RNA#3的具有两种流速的连续补料分批

在实施例3、4和5中，每个补料分批IVT反应使用批式进料进行，其中在反应期间的指定时间以恒定体积批式加料来添加原料混合物。该过程使得反应期间的核苷酸浓度随每次进料发生变化(图11A-B和图12A-B)。为了最大限度地减少这些变化，并减少对不同批式进料所需的额外制造控制的需求，将进料计划转换为连续进料形式。

连续补料分批IVT方法的一个实例如图17-22所示，其中针对编码RNA#3的DNA比较批式补料分批反应与连续补料分批反应。表6和7示出了用于测试RNA#3的批式和连续进料IVT反应模式的工艺参数。该方法的批式进料模式需要18个工艺参数，其中初始反应体积为1L，并且每次批式进料的体积为14.28mL。参见表6。相比之下，连续进料模式需要5个工艺参数。参见表7。连续进料计划包含5个进料参数：开始时间、流速1、从流速1到流速2的切换时间、流速2和停止时间(表7)。这两种流速用于适应在IVT反应期间发生的核苷酸消耗率的任何变化。

表6.用于RNA#3的批式进料计划的工艺参数

*所有体积标准化为1L反应

表7.用于RNA#3的连续进料计划的工艺参数

*所有体积标准化为1L反应

图17A-17B中的图表显示，在整个RNA#3的IVT反应过程中的总核苷酸浓度在连续补料分批反应中比在批式补料分批反应更加一致。图18A-18B和图19A-19B显示，连续和批式补料分批IVT反应的RNA产物的产量是相当的。

与批式补料分批反应相比，连续补料分批IVT反应的RNA#3的整体产品质量略有提高。图20A-20B中的图表显示，当使用连续补料分批时，RNA#3的加尾RNA产物的百分比相比于批式补料分批是相当的，但有所改善。图21A-21B中的图表显示，连续补料分批IVT反应中的加帽稍好。这一观察结果可以通过在整个连续补料分批反应过程中较低的平均A/GTP对三核苷酸比来解释。参见图22。

实施例7：使用四核苷酸盖帽类似物的补料分批IVT

在本实施例中，使用批式进料和四核苷酸盖帽类似物进行补料分批IVT反应以合成RNA。使用以按照目标RNA平衡的摩尔比存在的核苷酸(表8)、GGAG四核苷酸盖帽类似物、T7RNA聚合酶、焦磷酸酶、缓冲液和编码RNA#4的DNA产生初始IVT混合物。四核苷酸盖帽类似物与ATP的初始摩尔比为1.3∶1。原料预混合物由核苷酸、T7RNA聚合酶、焦磷酸酶和缓冲液组成。以30分钟的间隔分三次使用原料预混合物向反应进料，目标为最低8mM的NTP；并且反应进行两个小时。

使用相同的初始IVT混合物进行分批IVT反应作为对照实验。在反应开始后，不向对照分批反应补料。

表8.初始IVT混合物中的核苷酸浓度

如图23-25所示，评估补料分批IVT反应和对照分批反应的ATP浓度、总RNA产量和加帽百分比。补料分批反应提供具有高加帽效率的RNA(～90％RNA包含盖帽类似物)。令人惊讶的是，补料分批IVT反应的表现显著优于对照分批反应，其RNA产量高出约1.8倍(在补料分批反应中为～9mg/mL初始体积，而在对照分批反应中为～5mg/mL初始体积)。

Claims (65)

1.一种确定体外转录(IVT)反应的核苷三磷酸(NTP)消耗百分比(％)的方法，其包括：

(a)用包含已知初始NTP浓度、编码目标核糖核酸(RNA)的脱氧核糖核酸(DNA)和RNA聚合酶的反应混合物进行IVT反应；

(b)在一段时间内以离散时间间隔测量单个NTP浓度；和

(c)针对所述反应混合物中的每种NTP计算消耗百分比(％)值。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述NTP包括腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鸟苷三磷酸(GTP)。

3.如权利要求1所述的方法，其中(b)包括(i)将单个NTP消耗率除以总NTP消耗率。

4.如权利要求3所述的方法，其中通过在一段时间内以离散时间间隔测量单个NTP浓度来计算所述单个NTP消耗率；并且通过在一段时间内以离散时间间隔测量总NTP浓度来计算所述总NTP消耗率。

5.如权利要求4所述的方法，其中收集所述单个NTP浓度和总NTP浓度测量值，直到至少一种NTP的浓度降至阈值浓度以下。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述阈值浓度高于零(0)毫摩尔浓度(mM)，任选地其中所述阈值浓度为5mM至20mM，并且任选地其中所述阈值浓度在初始NTP浓度的5％-75％以内。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述已知初始NTP浓度包含[ATP]、[CTP]、[UTP]和[GTP]中每一个的等摩尔NTP浓度。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述已知初始NTP浓度包含1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述已知初始NTP浓度包含2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述NTP是化学修饰的NTP、天然存在的NTP或合成NTP。

11.如权利要求1所述的方法，其中在20至40分钟的时间间隔内进行所述IVT反应。

12.一种目标核糖核酸(RNA)的补料分批体外转录(IVT)方法，其包括：

(a)用包含编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶和核苷三磷酸(NTP)的初始反应混合物进行IVT反应；和

(b)随时间向正在进行的IVT反应混合物递送包含NTP的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对每种NTP分别计算的消耗百分比值的摩尔比存在于所述原料混合物中，其中所述消耗百分比值特定于所述目标RNA，并且其中所述原料混合物是以维持所述反应混合物中的总NTP浓度高于0mM的量递送，

从而产生目标转录RNA。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述NTP包括腺苷三磷酸(ATP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)和鸟苷三磷酸(GTP)。

14.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物包含1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

15.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物包含2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

16.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物中的每种NTP是以不同于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值的相等摩尔比存在。

17.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物中的每种NTP是以针对每种NTP的等摩尔浓度存在。

18.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物中的每种NTP是以1-10mM、1-6mM、2-6mM或3-6mM的浓度存在。

19.如权利要求12所述的方法，其中所述正在进行的IVT反应混合物中的每种NTP的浓度维持在其相应初始NTP浓度的5％至200％、5％-100％、5％-75％、20％-100％、20％-75％或25％-50％的范围内。

20.如权利要求12所述的方法，其中所述反应混合物维持在1∶1至4∶1，任选为1∶1至2∶1的[ATP]∶[UTP]比率；和/或1∶1至4∶1的[GTP]∶[CTP]比率。

21.如权利要求12所述的方法，其中所述反应混合物维持在2∶1∶1∶4的[ATP]∶[UTP]∶[CTP]∶[GTP]的比率。

22.一种目标核糖核酸(RNA)的补料分批体外转录(IVT)方法，其包括：

(a)用包含编码目标RNA的脱氧核糖核酸(DNA)、RNA聚合酶和核苷三磷酸(NTP)的初始反应混合物进行IVT反应，其中NTP包含2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]比率；和

(b)随时间向正在进行的IVT反应混合物递送包含NTP的原料混合物，其中每种NTP是以基于针对每种NTP分别计算的消耗百分比值的摩尔比存在于所述原料混合物中，其中所述消耗百分比值特定于所述目标RNA，并且其中所述原料混合物是以维持2∶1的[ATP]∶[UTP]比率和4∶1的[GTP]∶[CTP]比率的量递送，

从而产生目标转录RNA。

23.如权利要求12所述的方法，其中所述NTP是化学修饰的NTP、天然存在的NTP或合成NTP。

24.如权利要求12所述的方法，其中随时间的推移使用批式进料将所述原料混合物递送至所述正在进行的IVT反应混合物中。

25.如权利要求24所述的方法，其中每10-250分钟，任选地每20-200分钟将所述原料混合物递送至所述正在进行的IVT反应混合物中。

26.如权利要求12所述的方法，其中随时间的推移使用连续进料将所述原料混合物递送至所述正在进行的IVT反应混合物中。

27.如权利要求26所述的方法，其中以如下连续流速将所述原料混合物递送至所述正在进行的IVT反应混合物中：

(i)2-8mL/min，任选为4-6mL/min；或

(ii)0.0030-0.007mL/min/mL初始体积，任选为0.0040-0.0060mL/min/mL初始体积。

28.如权利要求12所述的方法，其中(a)的所述初始反应混合物中的每种NTP是以相当于针对每种NTP计算的消耗百分比(％)值的摩尔比存在。

29.如权利要求12所述的方法，其中所述正在进行的IVT反应混合物中的总NTP浓度维持在高于0.5mM的下限，任选地维持在10mM至20mM。

30.如权利要求12所述的方法，其中所述初始和/或正在进行的IVT反应混合物进一步包含RNA盖帽类似物。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述RNA盖帽类似物是化学修饰的RNA盖帽类似物、天然存在的RNA盖帽类似物或合成RNA盖帽类似物。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述RNA盖帽类似物是(i)三核苷酸RNA盖帽类似物，任选地选自包含盖帽1、盖帽2、盖帽3或盖帽4结构的三核苷酸盖帽类似物，或(ii)四核苷酸RNA盖帽类似物，任选地选自包含盖帽5、盖帽6、盖帽7或盖帽8结构的三核苷酸盖帽类似物。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述初始和正在进行的IVT反应混合物包含1∶1至20∶1、1∶1至15∶1、1∶1至10∶1、1∶1至5∶1、1∶1至3∶1或1∶1至2∶1的[RNA盖帽类似物]∶[嘌呤]的比率。

34.如权利要求12所述的方法，其中所述目标转录RNA的产量高于使用分批IVT反应转录的RNA的产量。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述目标转录RNA的产量比使用分批IVT反应转录的RNA的产量高至少100％。

36.如权利要求12所述的方法，其中所述目标转录RNA的产量高于5、10、15、20、25或30mg/mL初始反应体积。

37.如权利要求12所述的方法，其中所述初始和正在进行的IVT反应混合物进一步包含缓冲液和/或镁。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述缓冲液是Tris-HCl，任选地其中所述缓冲液是20至60mM Tris-HCl，任选地其中所述缓冲液是40mM Tris-HCl。

39.如权利要求30所述的方法，其中所述目标转录RNA的至少90％(任选地为至少95％)包含所述RNA盖帽类似物。

40.如权利要求30所述的方法，其中所述盖帽类似物与ATP的比率或所述盖帽类似物与GTP的比率大于0.6，并且所述目标转录RNA的至少90％包含盖帽类似物。

41.如权利要求39所述的方法，其中所述目标转录RNA的长度为至少2000个核苷酸。

42.如权利要求30所述的方法，其中所述目标转录RNA的至少90％在IVT反应的第180分钟和/或第360分钟包含所述RNA盖帽类似物。

43.如权利要求12所述的方法，其中所述初始和/或正在进行的IVT反应混合物在IVT反应期间不补充RNA盖帽类似物。

44.如权利要求12所述的方法，其中所述初始反应混合物中的DNA浓度为0.025-0.075mg/mL，任选为0.05mg/mL。

45.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA浓度在IVT反应期间维持在高于0.01mg/mL的浓度，任选地为0.01-0.05mg/mL。

46.如权利要求12所述的方法，其中所述IVT反应中目标转录RNA与DNA的摩尔比比非补料分批对照方法中转录RNA与DNA的摩尔比高至少2倍或至少3倍。

47.如权利要求23所述的方法，其中所述UTP是选自1-甲基假尿苷和1-乙基假尿苷的修饰的UTP。

48.如权利要求12所述的方法，其中所述目标转录RNA是信使RNA(mRNA)。

49.如权利要求12所述的方法，其中所述目标转录RNA的长度大于100个核苷酸。

50.如权利要求12所述的方法，其中总IVT反应时间为150-1000分钟。

51.如权利要求12所述的方法，其中所述目标转录RNA的至少50％或至少70％在IVT反应的第420分钟包含polyA尾部。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述polyA尾部是A₁₀₀polyA尾部。

53.如权利要求30所述的方法，其中所述初始反应混合物包含的RNA盖帽类似物浓度比存在于所述目标RNA的第一编码位置的NTP的浓度高至少10％或至少20％。

54.如权利要求53所述的方法，其中存在于所述目标RNA的第一编码位置的NTP是ATP或GTP。

55.如权利要求12所述的方法，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶相对于野生型T7 RNA聚合酶包含在C末端处的额外甘氨酸。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶相对于野生型T7 RNA聚合酶包含G47A取代。

58.如权利要求55所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶相对于野生型T7 RNA聚合酶包含G47A取代和在C末端处的额外甘氨酸。

59.如权利要求30所述的方法，其中所述RNA盖帽类似物是二核苷酸盖帽、三核苷酸盖帽或四核苷酸盖帽。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述RNA盖帽类似物包含三核苷酸序列GAG，任选地为

61.如权利要求60所述的方法，其中所述RNA盖帽类似物包含四核苷酸序列GGAG。

62.如权利要求12所述的方法，其进一步包括分离所述目标转录RNA。

63.从如权利要求62所述的方法分离的目标RNA。

64.一种核糖核酸(RNA)，其通过如权利要求12所述的方法产生。

65.如权利要求63所述的RNA，其被配制在阳离子脂质纳米颗粒中，任选地其中所述阳离子脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离阳离子脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的甾醇和0.5-15％的PEG修饰的脂质。

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