CN113533177B - 一种高速操作和检测活细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于双光梳和光镊技术领域的一种高速操作和检测活细胞的方法。该方法包括以下步骤，步骤1：获取单腔模式复用双光梳；步骤2：利用光子灯笼进行空间模式分离并获得携带轨道角动量的涡旋光束；步骤3：操作微小粒子或活细胞；利用步骤2得到的涡旋光束捕获直径在10‑50μm范围的微小粒子或活细胞，再移动、旋转被捕获的微小粒子或活细胞；步骤4：测量双光梳光谱。本发明所提方法的光谱测量速度快，可实现毫秒量级的细胞检测速度；细胞吸收谱测量信噪比高，双光梳相干性好，并且可通过多次平均进一步提升信噪比；双光梳光谱覆盖范围宽，同一台仪器可实现多细胞的识别与筛选，为多种不同场景的应用提供有力的工具。

Description

一种高速操作和检测活细胞的方法
技术领域
本发明涉及双光梳和光镊技术领域，尤其涉及一种高速操作和检测活细胞的方法。
背景技术
光镊技术作为一种利用强聚焦光场产生梯度力捕获粒子的工具，能够对活体细胞物质进行单分子结构和功能检测，对人类探索生命的本质具有重要作用。
将激光光镊与共焦拉曼光谱技术相结合的激光光镊拉曼光谱技术能够在生理条件下捕获、操控和测量在悬浮状态下的单个活细胞，对其进行生物学分析研究，能够提供精细的分子结构和物质成分指纹信息，实现生物分子水平上的高分辨率快速无标记检测分析。尽管激光光镊拉曼光谱技术有诸多的优势，却也存在许多自身不足：一是，文献[1]J.W.Chan,“Recent advances in laser tweezers Raman spectroscopy(LTRS)forlabel-free analysis of single cells,”Journal of Biophotonics 6,36-48(2013).中，由于生物分子拉曼散射信号极其微弱，成像提取时间为1-10s每像素甚至更长，因此对于单个活细胞一般需要10min，大大限制了将拉曼散射应用于活细胞在体成像与监控活细胞生长变化的研究；二是，拉曼光谱作为一种非线性光谱技术，一般需要提高激光强度来提高拉曼信号的强度，这也会不可避免地对生物分子活性造成影响。
文献[2]S.Feng,Z.Li,G.Chen,D.Lin,S.Huang,Z.Huang,Y.Li,J.Lin,R.Chen,andH.Zeng,“Ultrasound-mediated method for rapid delivery of nano-particles intocells for intracellular surface-enhanced Raman spectroscopy and cancer cellscreening,”Nanotechnology 26,065101(2015).提到表面增强拉曼散射技术能够在一定程度上有效提升拉曼信号强度，但该技术一般需要将待测样品与设计的微纳结构距离足够近，并不适用于活细胞检测。最后，无法对细胞无旋转操控，分子的旋转操控为人们认识DAN折叠和超螺旋结构提供了一种新的方法，“快速”、“旋转”已成为DNA分子研究的主旋律。因此，寻找更高效的分子识别手段并与光镊结合一直是学术界的研究热点。
除了拉曼光谱以外，也可对细胞中不同分子的振动吸收谱线进行线性吸收光谱的直接测量。这样，用较弱的输入光来获取分子振动谱，可以有效地降低激光信号对样品的影响，更有利于活细胞检测。
文献[3]N.Picque and T.W.Hansch,“Frequency comb spectroscopy,”NaturePhotonics 13,146-157(2019).和文献[4]I.Coddington,N.Newbury,and W.Swann,“Dual-comb spectroscopy,”Optica 3,414-426(2016).中应用光学频率梳(Optical frequencycombs)与双光梳光谱(Dual-comb spectroscopy,DCS)技术相结合便可以对分子振动吸收谱进行精确测量。其中，双光梳光谱技术作为一种新兴的光谱测量技术，可以由紧凑的结构(无需传统光谱仪中的可动机械部件)和单探测器完成宽光谱测量，并可以提供比传统光谱测量手段表现出更高的频谱光谱分辨率、灵敏度及采样率。因此，该技术已经在诸如文献[5]G.B.Rieker,F.R.Giorgetta,W.C.Swann,J.Kofler,A.M.Zolot,L.C.Sinclair,E.Baumann,C.Cromer,G.Petron,and C.Sweeney,“Frequency-comb-based remotesensing of greenhouse gases over kilometer air paths,”Optica 1,290-298(2014).中HCN、氰化甲烷/空气混合气体等气体吸收谱测量，文献[6]B.Lomsadze andS.T.Cundiff,“Frequency combs enable rapid and high-resolutionmultidimensional coherent spectroscopy,”Science 357,1389-1391(2017).中温室气体排放监控，文献[7]B.Lomsadze,B.C.Smith,and S.T.Cundiff,“Tri-combspectroscopy,”Nature Photonics 12,676-680(2018).中非线性光谱成像等领域，都得到了重要应用。单腔产生的双光梳可以在激光器自由运转不需要复杂电路系统进行频率稳定的前提下，仍然可以保证两套光频梳之间的高相干性，大大简化了系统的复杂性，具有独一无二的优势。
因此，根据激光光镊与双光梳光谱技术实现双光梳光镊光谱仪的研发，不仅具有常规激光光镊系统对细胞进行捕获和操控的功能，还可以对细胞吸收光谱进行快速检测，集多种功能于一体。对双光梳光场进行空间调制，获得携带轨道角动量的涡旋光束，进行细胞捕获与操控，以及多外差干涉获取细胞光谱信息。涡旋光镊可实现粒子的捕获、移动和旋转操控，有利于快速观测生命体中的化学反应，如：DNA-蛋白质复杂的动态反应、基因组交易、转录因子转运、分子马达化学能-机械能转化等。深入研究双光梳光镊系统及关键技术，可以实现多种活细胞的高速检测。
发明内容
本发明的目的是提出一种高速操作和检测活细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取单腔模式复用双光梳；在多模锁模激光器中，利用模间色散实现LP01和LP11两个空间模式的并行锁模，获得稳定的、高相干的双光梳；
步骤2：利用光子灯笼进行空间模式分离并获得携带轨道角动量的涡旋光束；将步骤1中LP01和LP11模式分离纯度达到95％以上，空间光调制器将其中一路光频梳转换为拓扑荷为+1、纯度超过99％的涡旋光束；
步骤3：操作微小粒子或活细胞；利用步骤2得到的涡旋光束经高数值孔径的显微物镜聚焦到三维平台上捕获直径在10-50μm范围的微小粒子或活细胞，再通过控制三维平台和改变激光参数来移动、旋转被捕获的微小粒子或活细胞；
步骤4：测量双光梳光谱；由双光梳光镊系统，将步骤3中涡旋光束携带颗粒的吸收谱特征信息，与另外一路未经过微小粒子或活细胞的基模高斯光束汇合，并用同一个光电探测器接收探测；探测器对双光梳的时域信号进行探测得到干涉图样，并对时域信号进行快速傅里叶变换，得到射频谱信息；按照射频与光频的对应关系，将射频频域的信号还原到光学频率上，得到微小粒子或活细胞的吸收谱信息。
所述步骤1中多模锁模激光器为环形结构，由增益多模光纤、无源多模光纤和非线性偏振旋转锁模所需的波片以及偏振分束器组成；泵浦光由多模980nm连续激光器提供，通过耦合器耦合至激光腔内；增益多模光纤为双包层的掺铒光纤，利用空间光隔离器来确保激光的单向运转；双光梳的中心波长为1560nm，重频为50MHz，重频差为7kHz。
所述步骤2中的光子灯笼是将多根单模光纤嵌入低折射率毛细管中进行熔融拉锥，在锥区尖端形成波导结构，在拉锥末端与少模光纤连接。
所述步骤4测量双光梳光谱中单光谱的检测速度达到143μs，平均50ms后吸收谱信噪比达到30dB以上。
本发明的有益效果在于：
本发明所提方法的光谱测量速度快，可实现毫秒量级的细胞检测速度；细胞吸收谱测量信噪比高，双光梳相干性好，并且可通过多次平均进一步提升信噪比；双光梳光谱覆盖范围宽，同一台仪器可实现多细胞的识别与筛选，为多种不同场景的应用提供有力的工具；另外，仪器结构简单紧凑、成本低廉，不需要昂贵笨重的拉曼光谱仪，仅仅一个普通的探测器即可实现双光梳光谱的测量，并可实现粒子的捕获、移动和旋转操控。
附图说明
图1为本发明技术方案总框架图；
图2为双光梳光镊系统结构图；
图3为光子灯笼示意图；
图4为模式分离及转换方案图；
图5为双光梳光谱测量基本原理示意图；
图6为双光梳光镊系统原理图。
具体实施方式
本发明提出一种高速操作和检测活细胞的方法，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
双光梳光谱技术相较于自发拉曼光谱技术具有更快的测量速度、更高的信噪比、更简单紧凑的实验光路以及更低廉的成本，因此双光梳光谱技术与光镊技术的综合应用将能更大程度地发挥光镊在各个科学领域的重要作用。
本发明的技术方案框架如图1所示，包括单腔模式复用双光梳的获取、双光梳模式分离及转换、光镊粒子操控、双光梳光谱测量、活细胞快速操控及光谱测量五个部分。分离的一路光梳用于光谱测量的参考光路，转换的一路光梳用于粒子操控并携带粒子吸收谱信息，两路合并测量其吸收谱信息，最后对活细胞进行快速操控和检测。
双光梳光镊系统结构如图2所示，分为以下四个部分：双光梳光源的产生、双光梳模式分离及转换、光镊粒子/活细胞操纵、和双光梳光谱测量粒子吸收谱信息。
(1)获取模式复用光纤激光器产生中心波长为1560nm，重频为50MHz，重频差为7kHz的高相干双光梳光源。
在多模锁模激光器中，利用模间色散可以实现两个空间模式的并行锁模，获得稳定的、高相干的双光梳。以光纤激光器中锁模脉冲的产生为例进行仿真。该环形光纤激光器主要包括以下器件：增益多模光纤、无源多模光纤、可饱和吸收体和输出耦合器。简单起见，我们只考虑多模光纤中的基模LP01和第二个模式LP11，忽略更高阶的空间模式。
通过设计合适的腔参数为单腔双光梳重频差的可调范围提供参考。例如，当选择Nufern MM-EYDF-10/125-XPH为掺铒增益光纤，Nufern MM-GDF-12/130-M为合束器无源匹配光纤，长飞两模阶跃型光纤为多模光纤。假定不同模式在增益光纤和无源匹配光纤中的差分群时延可以忽略，而主要考虑其在两模阶跃型光纤中的走离。固定增益光纤、无源匹配光纤和两模阶跃型光纤的长度分别为1.5m、1m和1m。通过计算可知，激发LP01、LP11两个模式可以实现7kHz的重频差。
如图6中基于多模光纤的锁模光纤激光器部分，激光器为环形结构，由增益多模光纤、多模无源光纤和非线性偏振旋转(Nonlinear Polarization Rotation,NPR)锁模所需的波片以及偏振分束器组成。泵浦光由多模980nm连续激光器提供，通过耦合器耦合至激光腔内。增益光纤为双包层的掺铒光纤，空间光隔离器确保激光的单向运转。四分之一波片、二分之一波片以及偏振分束器组合形成等效可饱和吸收体协助锁模，并耦合输出激光。由于腔内所有光纤均为多模光纤，因此可同时激发出不同空间模式的光，并在腔内稳定传输形成锁模脉冲。通过恰当地调节各类光纤长度、优化光纤熔接点、旋转波片到适当位置等方法产生空间模式复用的双光梳。
(2)利用光子灯笼将LP01和LP11模式分离纯度达到95％以上，空间光调制器将其中一路光频梳转换为拓扑荷为+1、纯度超过99％的涡旋光束。
如图6所示，为简单起见，假定该激光器实现了多模光纤中两个最低阶模式(LP01和LP11模式)的锁模，这两个模式的锁模脉冲具有略微不同的重复频率。为了方便后续的粒子捕获及操控，仅需一束具有螺旋相位波前的涡旋光束即可。因此，首先利用光子灯笼将这两个模式进行完全分离，再对LP11模式的锁模脉冲进行模式转换获得携带轨道角动量的涡旋光束。其中，未进行操作的LP01模式的锁模脉冲进行后续的双光梳光谱测量。模式转换器由空间光调制器构成，通过扭曲向列液晶的双折射效应，当不同位置的光通过液晶层后，会产生不同的光程差，从而实现相位的调制，获得具有连续螺旋状相位的涡旋光束。
双光梳光镊系统原理具体如下：
泵浦光依次经过泵浦光-信号光合束器、增益多模光纤、无源多模光纤、第一多模准直器、第一1/4波片、1/2波片进入偏振分束器后分为A、B两路，其中A路依次经过隔离器、第二1/4波片、第二多模准直器、无源多模光纤后返回泵浦光-信号光合束器；B路经过光子灯笼后再分为基模高斯模式LP01光束和一阶高阶模式LP11光束。基模高斯模式LP01光束的一路依次经过第一透镜、第一反射镜、分束器、探测器、低通滤波器，再经快速傅里叶变换后到达纳米颗粒/活细胞；基模高斯模式LP01光束经分束器后的另一路再经双色分束镜后分为B1、B2两路，其中B1路经第一物镜到达纳米颗粒/活细胞，B2路进入电荷耦合器件。一阶高阶模式LP11光束依次经过第二透镜、第二反射镜、空间光调制器后形成涡旋光束，涡旋光束再经过第三反射镜、第四反射镜、第五反射镜、第二物镜后到达纳米颗粒/活细胞；其中在第三反射镜、第四反射镜和第五反射镜附近设置白光光源。
光子灯笼的原理图如图3所示，将多根单模光纤嵌入低折射率毛细管中进行熔融拉锥，在锥区尖端形成类似少模光纤的波导结构。光子灯笼的拉锥末端同少模光纤相连接，实现多个高阶模式向基模的转换，达到模式解复用的效果。
如图4所示，光子灯笼将两个不同模式的光频梳分离，分离后的模式均为单模光纤中的基模，将基模高斯光束转换为携带轨道角动量的高阶涡旋光束可通过空间光调制器实现。
激光腔产生基模高斯模式LP01和一阶高阶模式LP11两种模式的光束，两种模式的光束通过光子灯笼后进行分离，其中基模高斯模式LP01光束经过第一准直器后再经过反射镜反射后进入电荷耦合器件；一阶高阶模式LP11光束经过第二准直器后再经过空间光调制器后形成涡旋光束进入电荷耦合器件。
大部分空间光调制器都是由折射率受施加电场调控的液晶薄膜组成，将薄膜分成多个像素阵列并分别进行独立控制，可获得相位随空间位置变化的反射光。很多商用的空间光调制器的能量转换效率均超过50％，而且多种修正算法亦可提升光束的质量，因此其已广泛应用于轨道角动量的实验中。
(3)涡旋光束捕获直径在10-50μm范围的微小颗粒/活细胞，并实现定向移动和旋转。
对于被光镊捕获的微小粒子，通常按照微粒的尺寸与入射光波长的关系将微粒划分为三种类别：微粒尺寸远大于光波长(一般为大于光波长的五倍)的米氏粒子，微粒尺寸远小于光波长的瑞利粒子(一般小于波长的二十分之一)，以及尺寸在二者中间的第三类粒子。对于这三种类型的微粒，计算其在光场中的受力的模型也不一样，瑞利粒子的尺寸远小于入射光波长，因此近似认为在每一瞬时瑞利粒子所处的光场区域的场分布都保持不变，即可以将瑞利粒子看作是一个位于粒子球心的小的电偶极子，它所处的区域场分布就是电偶极子这一点的场分布进行计算。米氏粒子的尺寸要远大于入射光波长，研究米氏粒子在光场中的受力时，通常都采用几何光学的原理来分析。当微粒尺寸处于瑞利粒子和米氏粒子中间时，称其为第三类粒子或者中间粒子，对这类粒子通常计算的方法是将光场中光的散射看作是电磁散射，用麦克斯韦方程解出其散射场。
图6的粒子操控环节，通过空间光调制器产生的涡旋光束经高数值孔径的显微物镜聚焦到三维平台上对微小粒子或活细胞进行捕获，白光光源和CCD用于微小粒子/活细胞成像以方便对其操控。如果被捕获的微小粒子或活细胞直径在几微米到几十微米大小，则激光光镊捕获它时，其会受到梯度力和散射力，合力方向沿激光光束传播方向竖直向上。再通过控制三维平台和改变激光参数来移动、旋转被捕获的微小粒子或活细胞。值得注意的是，飞秒激光脉冲是非连续输出的，微小粒子或活细胞在相邻两个脉冲间隔内做布朗运动。但相邻脉冲仅间隔20ns(50MHz重频)，当下一个脉冲作用到微小粒子或活细胞上时，仍然会使微小粒子或活细胞再次回到原来的位置。
(4)测量双光梳光谱，双光梳单光谱检测速度达到143μs，平均350次(50ms)后吸收谱信噪比达到30dB以上。
通过微小粒子或活细胞的涡旋光束携带有颗粒的吸收谱特征信息，将其与另外一路未经过微小粒子或活细胞的基模高斯光束汇合并用同一个光电探测器接收探测。探测器对双光梳的时域信号进行探测得到干涉图样，并对其进行快速傅里叶变换，得到射频谱信息。按照射频与光频的对应关系，将射频频域的信号还原到光学频率上，得到微小粒子或活细胞的吸收谱信息。不同类型粒子或活细胞的吸收谱信息不同，依照该原理即可进行微小粒子或活细胞的分类筛选。
双光梳光谱测量技术基本原理图如图5所示。两个具有不同重复频率(fr和fr+Δfr)的光频梳一起经过待测样品，由于样品分子键的振动会吸收特定波长的光子，因此经过待测样品的双光梳携带有该样品分子的吸收谱信息。通过外差干涉后获得梳齿间隔为Δfr的射频信号同样包含该信息，其中每一根射频梳齿均与特定的光频梳梳齿相对应。因此，通过计算出该射频信号携带的信息即可获得样品吸收谱信息。
在系统结构上，采用双光梳对样品吸收谱进行测量已经是一项非常成熟的检测手段。在采样时间上，参考相关研究者的一系列工作和已报道的相关实验参数，例如：(1)文献[8]S.Mehravar,R.Norwood,N.Peyghambarian,and K.Kieu,"Real-time dual-combspectroscopy with a free-running bidirectionally mode-locked fiber laser,"Applied Physics Letters 108,231104(2016).利用单腔双向锁模光纤激光器实现了重频差78.2Hz的双光梳，对100幅图1.3s采样时间的干涉图进行平均，得到了24.4dB的信噪比，并进行了空气中水蒸气的吸收谱测量；(2)文献[9]R.Liao,Y.Song,W.Liu,H.Shi,L.Chai,and M.Hu,"Dual-comb spectroscopy with a single free-running thulium-dopedfiber laser,"Optics Express 26,11046-11054(2018).利用单腔双波长锁模光纤激光器实现了重频差3.2kHz的双光梳，采用1s采样时间，并对测得的时域信号进行傅里叶变换，得到40dB的信噪比，并对水蒸气吸收谱进行了测量。因此，可使用单腔模式复用双光梳方案实现重频差7kHz左右的双光梳，采样时间50ms获得高信噪比的气体吸收谱数据。
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种高速操作和检测活细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取单腔模式复用双光梳；在多模锁模激光器中，利用模间色散实现LP01和LP11两个空间模式的并行锁模，获得稳定的、高相干的双光梳；
步骤2：利用光子灯笼进行空间模式分离并获得携带轨道角动量的涡旋光束；将步骤1中LP01和LP11模式分离纯度达到95％以上，空间光调制器将其中一路光频梳转换为拓扑荷为+1、纯度超过99％的涡旋光束；
步骤3：操作微小粒子或活细胞；利用步骤2得到的涡旋光束经高数值孔径的显微物镜聚焦到三维平台上捕获直径在10-50μm范围的微小粒子或活细胞，再通过控制三维平台和改变激光参数来移动、旋转被捕获的微小粒子或活细胞；
步骤4：测量双光梳光谱；由双光梳光镊系统，将步骤3中涡旋光束携带颗粒的吸收谱特征信息，与另外一路未经过微小粒子或活细胞的基模高斯光束汇合，并用同一个光电探测器接收探测；探测器对双光梳的时域信号进行探测得到干涉图样，并对时域信号进行快速傅里叶变换，得到射频谱信息；按照射频与光频的对应关系，将射频频域的信号还原到光学频率上，得到微小粒子或活细胞的吸收谱信息。
2.根据权利要求1所述的高速操作和检测活细胞的方法，其特征在于，所述步骤1中多模锁模激光器为环形结构，由增益多模光纤、无源多模光纤和非线性偏振旋转锁模所需的波片以及偏振分束器组成；泵浦光由多模980nm连续激光器提供，通过耦合器耦合至激光腔内；增益多模光纤为双包层的掺铒光纤，利用空间光隔离器来确保激光的单向运转；双光梳的中心波长为1560nm，重频为50MHz，重频差为7kHz。
3.根据权利要求1所述的高速操作和检测活细胞的方法，其特征在于，所述步骤2中的光子灯笼是将多根单模光纤嵌入低折射率毛细管中进行熔融拉锥，在锥区尖端形成波导结构，在拉锥末端与少模光纤连接。
4.根据权利要求1所述的高速操作和检测活细胞的方法，其特征在于，所述步骤4测量双光梳光谱中单光谱的检测速度达到143μs，平均50ms后吸收谱信噪比达到30dB以上。
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