CN113308541A - c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用 - Google Patents

c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用 Download PDF

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崔慧情
陈晓钢
曹智铭
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Abstract

本发明公开了c‑Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用；本发明通过CHD1L启动子区结合蛋白生物信息分析及体内外实验，CHD1L高表达恶性肿瘤中存在c‑Myc/Chd1l正向调控回路，阻断此反馈回路可控制肿瘤细胞增殖及迁移。本发明通过Chd1l启动子荧光素酶基因检测等实验表明c‑Myc结合Chd1l启动子E‑box区段序列；构建诱导性Chd1l基因敲除系统、c‑Myc过表达载体，用免疫沉淀、流式细胞分选及多种分子生物学方法，在细胞水平证实了c‑Myc与Chd1l间存在正反馈调节回路，同时证明c‑Myc/Chd1l调控回路是促进肿瘤细胞恶性增殖及迁移表型的关键点，阻断此作用回路可有效控制肿瘤细胞恶性增殖。本发明为包括肝癌在内的各类恶性肿瘤药物治疗提供新方法。

Description

c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用。
背景技术
肿瘤耐药、术后复发及晚期转移是病患治疗失败、死亡的根本原因，目前仍无有效的防治办法。不同类别的肿瘤尽管发病机制不同，但殊途同归，后期的复发转移是所有恶性肿瘤病程进展的终点和必经过程，集中表现为肿瘤细胞在原位或转移部位的失控性增殖。肿瘤细胞的恶性增殖调控机制复杂，机体免疫力低下、病理微环境刺激等因素均可诱发肿瘤复发转移。
染色体解旋酶/ATP酶DNA结合蛋白1类似基因CHD1L位于染色体1q21 区，在多种实体瘤中均有异常高表达。TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)共享数据分析结果显示CHD1L在各类肿瘤如肺癌、乳腺癌、胆管上皮癌、膀胱癌、肝癌等多种实体瘤中均有异常扩增及表达，过表达CHD1L与肿瘤的分期、肿瘤侵袭转移及不良预后密切相关，是维持肿瘤恶性表型的关键分子(李师淼,花京文,黄长文.CHD1L在癌症中相关分子机制的研究进展[J].医学研究生学报, 2016,29(04):445-448.)。c-Myc基因是恶性肿瘤中发挥转录激活作用的明星分子，在大多数恶性肿瘤中均有异常表达，与DNA复制、维持及调节染色体及基因稳定性维持有关，可维持干细胞自我更新及多潜能状态、抑制干细胞分化，c-Myc 异常表达可促进肿瘤恶性表型，与肿瘤临床病理分期、分型、不良预后等密切相关(俞今晶,来纯云.c-Myc在肿瘤中的表达及功能[J].国际肿瘤学杂志,2017(4).)。然而，关于CHD1L和c-Myc两者间在肿瘤中的分子机制，及其调控细胞周期进展的精确机理目前还不十分清楚，也没有共同针对CHD1L和c-Myc的相关抗癌药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供c-Myc和 Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
鉴于CHD1L在恶性肿瘤中的异常高表达及其致癌作用，申请人对其表达调控机制进行深度解析，对开放数据库中chd1l启动子chip-sequence数据进行生物信息分析发现人胚胎干细胞(H1-hESC)、白血病细胞(K562，NB4)、乳腺癌细胞(MCF-7)及肝癌细胞(HepG2)中均发现c-MYC可与Chd1l启动子结合。c-Myc 发挥转录通过与靶基因E-BOX序列结合发挥转录调控作用，其基序为“CANNTG”，在TCGA数据库进行chd1l启动子上c-Myc结合位点预测分析，得到A(CACATG)，B(CACATG)，C(CAGATG)，D(CACCTG)，E(CAGTTG)五个预测结合位点。临床样本检测结果证明c-Myc/Chd1l在大多数恶性肿瘤中表达正相关，且表达水平于与临床不良预后显著相关，CHIP-sequencing及荧光素酶报告基因等实验表明c-Myc可与chd1l转录起始位点(TSS)上游-300bp到+600bp 区段A、B、E三个E-BOX序列靶向结合，c-Myc通过直接结合chd1l启动子激活其转录。进一步通过构建c-myc启动子荧光素酶报告基因载体，检测过表达或不过表达chd1l时报告基因载体荧光活性，结果显示chd1l可显著激活c-Mcy转录提高其荧光活性，表明c-Myc与chd1l间存双向调控回路。以肝癌细胞为工具证实过表达c-Myc/chd1l可促进肝癌细胞增殖及迁移等恶性表型，下调此作用回路中任一分子均可减缓细胞的增殖及迁移，但双分子同时消减则显著抑制细胞的增殖与迁移。因此，c-Myc/Chd1l可作为HCC等恶性肿瘤复发转移的一个预测指标，基于c-Myc/Chd1l正向调控阻断效应可作为肿瘤术后或放化疗后的辅助治疗方法。本发明为肝癌及其他类别恶性肿瘤药物治疗提供理想靶位及辅助治疗策略。本申请上述研究中采用的生物信息学分析方法、Chd1l启动子荧光素酶基因检测、构建诱导性Chd1l基因敲除系统、c-Myc过表达载体，免疫沉淀、流式细胞分选等分子生物学方法均为本领域常规的技术手段。
因此，本申请请求保护关于c-Myc及Chd1l的以下用途：
c-Myc及Chd1l作为治疗靶点在筛选或制备肿瘤药物中的应用。即将c-Myc 及Chd1l同时作为肿瘤药物的治疗靶点；在肿瘤细胞中，c-Myc与chd1l间存双向调控回路，阻断此反馈回路可控制肿瘤细胞增殖及迁移，同时阻断c-Myc及 Chd1l肿瘤细胞增殖及迁移能力显著下降。
c-Myc及Chd1l作为肿瘤复发转移生物标志物在制备肿瘤复发转移诊断产品中的应用。即c-Myc、Chd1l共表达作为一对预测肿瘤复发转移生物诊断标志物。
c-Myc及Chd1l表达抑制剂或c-Myc-Chd1l结合阻断剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述c-Myc-Chd1l结合阻断剂阻断位点为chd1l启动子转录起始位点上游-300bp到+600bp区段的三个E-BOX序列：CACATG、CACATGC、 CAGTTG。
进一步优选地，所述表达抑制剂、结合阻断剂为能抑制c-Myc及Chd1l表达或封闭c-Myc-Chd1l结合的抗体/配体，或能抑制c-Myc及Chd1l表达或封闭 c-Myc-Chd1l结合的多肽类物质，或能抑制c-Myc及Chd1l表达或阻断 c-Myc-Chd1l结合的小分子化合物，或能干扰/阻断c-Myc及Chd1l表达或 c-Myc-Chd1l结合的反义核苷酸中的一种或多种。
本发明还提供一种肿瘤治疗药物，含有抑制c-Myc及Chd1l表达的的siRNA 或shRNA。
优选地，所述siRNA或shRNA的序列为：
CHD1L siRNA：
Sence 5'-CCAAACUGCAGCUCACCAAdTdT-3'，
Antisence 5'-UUGGUGAGCUGCAGUUUGGdTdT-3'；
c-Myc siRNA：
Sence 5'-GCCGAUCACUCCGAAAUAAdTdT-3'，
Antisence 5'-UUAUUUCGGAGUGAUCGGCdTdT-3'。
本发明还提供一种肿瘤诊断产品，其特征在于，包含检测c-Myc及Chd1l 表达量的试剂。所述实际包括但不限于定量PCR引物，所有可用于检测c-Myc 及Chd1l表达量的试剂均应在本申请保护范围内。
优选地，所述试剂为检测c-Myc、Chd1l共表达状态的定量PCR引物，包括：
c-Myc正向序列：5'-GTCACACCCTTCTCCCTTCG-3'，
c-Myc反向序列：5'-GCCGCTCCACATACAGTCC-3'；
Chd1l正向序列：5'-GCTTCTTACTGCGGCTTCATACT-3'，
Chd1l反向序列：5'-TGCTCAAAACAGACAAGGGACA-3'。
进一步优选地，所述定量PCR检测采用20μL反应体系：SYBR Premix EX Taq 10μL，Rox Reference Dye I(50×)0.4μL，DNA模板1μL，混合引物(浓度 10μm)0.8μL，蒸馏水7.8μL。
进一步优选地，所述定量PCR检测反应条件为：95℃5min(预变性)，95℃10sec、60℃30sec(35个循环)，95℃15sec、60℃1min、95℃15sec(融解曲线)。
本发明还提供使用c-Myc/chd1l标准引物、借助定量PCR检测肿瘤组织中 c-Myc/chd1l表达的方法，通过定量PCR结果直接判断肿瘤的恶性程度及预后。定量PCR检测能够定量检测肿瘤组织中的c-Myc/chd1l表达量，操作简单，检测指标在肿瘤及正常组织中表现为有或无，定量定性精确，医院检验科技术成熟，容易推广。
进一步优选地，所述肿瘤包括但不仅限于原发性肝癌、肺癌、乳腺癌，所有存在c-Myc/Chd1l调控回路的肿瘤均应在本申请保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用，具体是 c-Myc/Chd1l调控回路在肿瘤治疗和诊断中的应用。本发明研究表明， c-Myc/Chd1l调控回路在维持细胞低分化状态、驱动肿瘤细胞恶性表型方面有叠加作用，c-Myc和Chd1l是恶性肿瘤预后诊断及治疗的理想靶点。通过实验表明下调c-Myc或Chd1l表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移，而同时阻断c-Myc及Chd1l 肿瘤细胞增殖及迁移能力显著下降。因此，c-Myc/Chd1l可共同作为HCC等恶性肿瘤复发转移的一个预测指标，基于c-Myc/Chd1l正向调控阻断效应可作为肿瘤术后或放化疗后的辅助治疗方法。同时针对c-Myc和Chd1l，相较于现有单一针对c-Myc或Chd1l作为靶点，具有更好的治疗效果。
附图说明
图1为chd1l启动子区c-Myc潜在结合位点预测分析。A：ENCODE数据库 chd1l转录起始位点结合蛋白数据分析；B：chd1l启动子区c-Myc潜在结合位点预测分析；C：RT-qPCR检测肝癌配对样本中Chd1l表达(***P＜0.001)；D： RT-qPCR检测肝癌配对样本中c-myc表达(***P＜0.001)；E：肝癌配对样本 Chd1l与c-Myc表达相关性分析(r＝0.6753，****P<0.0001)。
图2为c-Myc对chd1l启动子的靶向结合及转录活化作用。A：c-Myc对野生型chd1l启动子的活化效果；B：c-Myc对chd1l启动子突变体的影响；C： CHIP-sequencing检测c-Myc靶向chd1l启动子位点；D：c-Myc与chd1l启动子上游结合位点示意图。
图3为c-Myc/Chd1l的双向调控作用。A：荧光素酶报告实验检测chd1l对c-myc启动子的转录激活作用；B：c-Myc上调chd1l表达；C：western blot检测 chd1l与c-Myc间的调控效果；D：chd1l调控c-Myc表达；E：诱导性敲除chd1l 后过表达c-Myc后CHD1L表达水平。
图4为乳腺癌、肺癌细胞中c-Myc/Chd1l相互作用效应检测。A-D表示乳腺癌231、T47-D细胞及肺癌A549、PC-9细胞系中chd1l及c-Myc表达定量PCR 检测。
图5为细胞功能学实验。A，B：transwell实验；C，D：划痕实验；E，F：细胞增殖实验。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 chd1l启动子区存在c-Myc潜在结合位点
为解析肿瘤细胞中chd1l表达的调控机制，基于ENCODE数据库中已上传的 chd1l启动子chip-sequence实验数据，进行生物信息学分析寻找直接靶向chd1l 启动子的转录因子，结果显示在胚胎干细胞(H1-hESC)，白血病细胞(K562， NB4)，乳腺癌细胞(MCF-7)，肝癌细胞(HepG2)中均发现MYC与Chd1l启动子结合(图1A)。已有研究表明c-Myc发挥转录因子促转录作用是通过与靶基因E-BOX序列结合，其基序为“CANNTG”，我们在TCGA数据库进行chd1l启动子上c-Myc结合位点预测，得到A(CACATG)，B(CACATG)，C(CAGATG)， D(CACCTG)，E(CAGTTG)五个预测结合位点(图1B)。为了明确c-Myc与chd1l 表达的临床病理学关系，我们收集肝癌手术患者癌与癌旁组织配对样本进行 qPCR检测分析，结果显示相较于癌旁组织，癌组织中c-myc与chd1l均高表达 (图1C-D)，肝癌配对样本相关性统计学分析显示c-my与chd1l表达正相关 (r＝0.6753，p<0.0001)(图1E)。
其中，qPCR检测具体方法包括如下步骤：
A：细胞总RNA的提取
(1)处理细胞后，用0.25％的胰酶消化、计数，取约1×106个细胞加入 1mLTrizol充分混匀，室温静置10min待细胞裂解，可放入-80℃冰箱保存后续处理也可继续进行如下处理；
(2)上述Trizol裂解液中每管加入200μL氯仿，旋涡震荡15sec，放于冰上静置5min，4℃、12000rpm离心15min；
(3)准备好每个样品一个1.5mLEP管，标记好，小心从每管中吸取上清液至另一新的EP管中，上清液中加入等体积预冷的异丙醇，充分震荡混匀15sec 后，冰上静置10min；
(4)4℃、12000rpm离心10min，弃上清；
(5)加入750μL 4℃预冷的75％乙醇，剧烈震荡，充分洗涤沉淀及离心管壁， 4℃、7500rpm离心5min，弃上清；
(6)4℃、12000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥10min；
(7)加入20μL DEPC水至完全溶解，NANODROP 2000测定OD值和RNA 浓度。
B：细胞总RNA浓度测定
1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解，Nanodrop 2000检测RNA的浓度及纯度，纯度以OD260/OD280控制在1.8～2.0之间可继续逆转录，调整RNA浓度至1000ng/μL以内。根据RNA浓度计算出样本RNA调至1μg的体积。
C：qRT-PCR步骤
(1)采用一步法逆转录合成cDNA：
反应体系(20μL)：5X PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I1μL，Oligo dT Primer 1μL，Random 6mers primer 1μL，样本RNA 1μg，蒸馏水配平至20μL。
反应条件：heat to 110℃，37℃15min，85℃5sec，4℃30min。
(2)qRT-PCR检测采用20μL反应体系：SYBR Premix EX Taq 10μL，Rox ReferenceDye I(50×)0.4μL，DNA模板1μL；混合引物(浓度10μm)0.8 μL，蒸馏水7.8μL。
其中，检测引物如下：
c-Myc正向序列：5'-GTCACACCCTTCTCCCTTCG-3'，
c-Myc反向序列：5'-GCCGCTCCACATACAGTCC-3'；
Chd1l正向序列：5'-GCTTCTTACTGCGGCTTCATACT-3'；
Chd1l反向序列：5'-TGCTCAAAACAGACAAGGGACA-3'
反应条件为：95℃5min(预变性)，95℃10sec、60℃30sec(35个循环)， 95℃15sec、60℃1min、95℃15sec(融解曲线)。
以18s为内参，肝癌细胞Chd1l，c-Myc，为目标基因，每个样品设3个平行对照，将对照组目标基因的表达量设定为1，各目的基因的相对表达量采用 2-△△Ct法计算获得，计算公式如下：
Figure RE-GDA0003187368510000071
实施例2 c-Myc靶向结合chd1l启动子转录起始位点上游-300bp到+600bp区段
利用荧光素酶报告基因实验验证c-Myc可结合chd1l启动子E-BOX区段。首先构建A+B位点，E位点的野生型和突变型荧光素酶载体、chd1l启动子全长野生型荧光素酶载体，将其瞬时转入PLC-8024细胞，转入荧光素酶载体同时转入或不转入过表达c-myc质粒，检测c-Myc对chd1l启动子活性的影响，结果显示相较于对照组，过表达c-myc时，A+B和E位点野生型载体及启动子全长载体荧光素酶活性显著升高(图2A)，突变型载体荧光素酶活性无明显变化(图 2B)。chd1l转录起始位点(TSS)上游-300bp到+600bp区段有三个c-Myc结合 E-BOX序列，分别位于A，B，E区段(图2C，2D)。
实施例3 c-Myc/Chd1l间存在正反馈调控作用，c-Myc对chd1l的转录调控有赖于与Chd1l启动子的结合
为明确chd1l与c-myc表达的关系，我们在宫颈癌HeLa细胞与肝癌 PLC-8024细胞中瞬转c-myc过表达质粒，与对照组相比，高表达c-Myc后CHD1L 表达显著上调(图3A，B)，提示c-myc确可靶向转录激活chd1l。进一步构建了c-Myc过表达肝癌细胞株、Dox(阿霉素)诱导的chd1l-iKO HeLa细胞株，进一步验证二者关系。结果显示CHD1L表达量随着c-Myc表达而增加(c-Myc上调chd1l表达)，诱导性敲除chd1l后，c-Myc表达量也随之下调(即chd1l上调 c-Myc表达)；诱导性敲除chd1l后过表达c-Myc并不能回复CHD1L表达水平(图 3C-E)，表明c-Myc对chd1l的转录调控有赖于与Chd1l启动子的结合，即c-myc 需靶向Chd1l方能发挥其调控作用。
实施例4肺癌、乳腺癌细胞中同样存在c-Myc/Chd1l正调控回路效应
为了证实c-Myc/chd1l调控回路在恶性肿瘤细胞中的广泛表达特性，我们选用乳腺癌231、T47-D细胞及肺癌A549、PC-9细胞系进行了双向验证，结果显示敲低各细胞系中chd1l表达后c-Myc表达随之降低(图4A，4C)；而敲低c-myc 表达同样伴随chd1l的表达下降(图4B，4D)。表明c-myc与chd1l间的正向调控效应存在于各类肿瘤细胞中。
实施例5 c-Myc/Chd1l调控回路促进肝癌细胞恶性表型(增殖、迁移)，双向阻断回路可显著抑制肝癌细胞恶性表型
为确证c-Myc/Chd1l调控回路对肿瘤细胞生物学表型的影响，我们进行了细胞功能学实验。transwell实验结果显示Dox(-)对照组细胞中，chd1l及c-Myc 呈基础表达时，肝癌8024细胞迁移能力明显高Dox(+)诱导敲除chd1l组；Dox (+)诱导敲除chd1l后瞬时转染c-Myc表达载体，细胞迁移能力仅有少许回调，与Dox(-)对照组相比差异有显著性(P<0.05)；Dox(+)诱导敲除chd1l同时用siRNA干扰c-Myc，细胞迁移能力显著下降(图5A，B)。划痕实验结果与 transwell实验结果趋势相同(图5C，D)。MTS实验显示分别敲减chd1l及c-Myc，肿瘤细胞增殖减慢，同时阻断chd1l及c-Myc双分子，细胞增殖速率下降明显，与其余各组相比差异有显著性(**P<0.05)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体，但不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出的若干变形和改良属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学
<120> c-Myc和Chd1l在肿瘤治疗和诊断中的应用
<141> 2021-03-29
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 1
ccaaacugca gcucaccaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 2
uuggugagcu gcaguuugg 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 3
gccgaucacu ccgaaauaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 4
uuauuucgga gugaucggc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 5
gtcacaccct tctcccttcg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 6
gccgctccac atacagtcc 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 7
gcttcttact gcggcttcat act 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequences )
<400> 8
tgctcaaaac agacaaggga ca 22

Claims (10)

1.c-Myc及Chd1l作为治疗靶点在筛选或制备肿瘤药物中的应用。
2.c-Myc及Chd1l作为肿瘤复发转移生物标志物在制备肿瘤复发转移诊断产品中的应用。
3.c-Myc及Chd1l表达抑制剂或c-Myc-Chd1l结合阻断剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
4.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述c-Myc-Chd1l结合阻断剂阻断位点为chd1l启动子转录起始位点上游-300bp到+600bp区段的三个E-BOX序列：CACATG、CACATGC、CAGTTG。
5.根据权利3或4所述应用，其特征在于，所述表达抑制剂、结合阻断剂为能抑制c-Myc及Chd1l表达或封闭c-Myc-Chd1l结合的抗体/配体，或能抑制c-Myc及Chd1l表达或封闭c-Myc-Chd1l结合的多肽类物质，或能抑制c-Myc及Chd1l表达或阻断c-Myc-Chd1l结合的小分子化合物，或能干扰/阻断c-Myc及Chd1l表达或c-Myc-Chd1l结合的反义核苷酸中的一种或多种。
6.一种肿瘤治疗药物，其特征在于，含有抑制c-Myc及Chd1l表达的siRNA或shRNA。
7.根据权利要求6所述的的药物，其特征在于，所述siRNA或shRNA的序列为：CHD1LsiRNA：
Sence 5'-CCAAACUGCAGCUCACCAAdTdT-3'，
Antisence 5'-UUGGUGAGCUGCAGUUUGGdTdT-3'；
c-Myc siRNA：
Sence 5'-GCCGAUCACUCCGAAAUAAdTdT-3'，
Antisence 5'-UUAUUUCGGAGUGAUCGGCdTdT-3'。
8.一种肿瘤诊断产品，其特征在于，包含检测c-Myc及Chd1l表达量的试剂。
9.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述试剂为检测c-Myc、共表达状态的定量PCR引物，其引物序列为：
c-Myc正向序列：5'-GTCACACCCTTCTCCCTTCG-3'，
c-Myc反向序列：5'-GCCGCTCCACATACAGTCC-3'；
Chd1l正向序列：5'-GCTTCTTACTGCGGCTTCATACT-3'；
Chd1l反向序列：5'-TGCTCAAAACAGACAAGGGACA-3'。
10.根据权利要求1-5任一所述应用，其特征在于，所述肿瘤为原发性肝癌、肺癌、乳腺癌。
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