CN111875606B - 一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物，采用虚拟筛选和药效团的方式筛选而来，通过虚拟对接设计与化合物的合成相互佐证验证的结果，也使的本申请提供的化合物具有非常高的活性的同时，具有较高的相对于PI3K的选择性，以及具有更好的生物耐受性和成药前景。进一步的，本发明还提供了上述化合物的制备方法和应用。

Description

一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

由于我国肝炎病毒(HBV[乙肝病毒]或HCV[丙肝病毒])感染率高，肝癌(HCC)已成为我国最致命的疾病之一。更糟糕的是，大多数首次被诊断为肝癌的患者往往已处于疾病的晚期，这时已经不适合进行手术或肝移植，因而化疗和放疗成为了肝癌晚期病人为数不多的选择。近年来，由于肝癌化疗的多药耐药，分子靶向药物仍然是肝癌患者一线或二线治疗的唯一选择。然而，采用分子靶向治疗晚期肝癌也面临着许多挑战：(1)患者对分子靶向药物的敏感性存在个体差异，只有少数患者对分子靶向药物敏感；(2)患者在治疗过程中容易产生对分子靶向药物的耐药性；(3)分子靶向治疗需要大剂量的药物(如每天800毫克索拉非尼)，不仅给患者带来巨大的经济负担，而且严重影响患者的健康状况。因此，研究和提高肝癌患者对分子靶向治疗的敏感性，在保持抗肿瘤疗效的同时降低药物剂量具有重要意义。

众所周知，雷帕霉素的哺乳动物靶蛋白(mTOR)是癌细胞的关键调节因子，其对营养物质、细胞应激或激素变化的反应，调节重要的物理过程以对微环境的变化作出反应。mTOR的异常激活与人类癌症的发生有关，而抑制剂mTOR的活性可能有较好的抗肿瘤效果。近年来，许多mTOR抑制剂已经被鉴定和开发。然而，有一种现象引起了人们的注意的是，迄今为止几乎所有的选择性mTOR抑制剂用于抗肿瘤的开发都暂停在了临床二期。这主要是因为人们以前对mTOR抑制剂的发展方向是将其发展为独立的肿瘤抑制剂。但是越来越多的研究表明，由于人体内存在很多代偿通路，单独应用选择性mTOR抑制肿瘤(特别是肝部肿瘤)效果有限。mTOR抑制剂的另一个发展方向是mTOR/PI3K双重抑制剂，这类抑制剂虽然抗肿瘤效果优于选择性mTOR抑制剂。但是由于同时抑制了两个重要通路mTOR和PI3K，很容易导致较大的副作用，因此该类抑制剂的发展也较为缓慢。

近年来，多种研究表明mTOR的表达与晚期癌症患者不良预后相关，使用mTOR抑制剂可以缓解人癌细胞的耐药性。这些新发现给了我们极大的启迪，这说明将mTOR抑制剂作为肿瘤增敏剂用于抗肿瘤治疗是一个有前景的策略。

专利CN108794478A公开了一系列新型嘌呤类衍生物用于抗肿瘤药物领域以及PI3K/Akt/mTOR通路信号失常导致的相关疾病。这类化合物选择嘌呤结构为母环，并在嘌呤的2位引入吗啉环结构，9位引入4-甲基四氢吡喃环结构，增加了化合物与mTOR的结合能力。但是，这些化合物均为PI3K与mTOR的双重抑制剂，从而其对较多的生物信号通路都有影响，最终也导致该类化合物的治疗副反应较大，现有报道的双重抑制剂也证明了上述缺点。因此，开发具有高效的选择性mTOR抑制剂成为更多人关注的焦点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是寻找并开发具有选择性抑制mTOR的新型化合物，用于治疗和预防各种与mTOR信号异常相关的疾病。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物，其结构为通式I的化合物，或者其异构体、可药用的盐或水合物；

其中：

X选自CH₂、O或NH；

R₁为C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆酯基、C₁-C₆醛基、C₁-C₆酮基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳香杂环或取代或未取代的芳香环，其中所述取代的杂环烷基、取代的芳香杂环或取代的芳香环为被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自下列的取代基取代：C₁-C₆羟基烷基、C₁-C₆氨基烷基、C₁-C₆硝基烷基、C₁-C₆卤素烷基、C₁-C₆氰基烷基。

在一个优选的实施方案中，X为O；R₁为C₁-C₆烷基；

在一个优选的实施方案中，X为NH；R₁为取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳香杂环、取代或未取代的芳香环，其中所述取代的杂环烷基、取代的芳香杂环、取代的芳香环为被1个或2个独立地选自下列的取代基取代：C₁-C₆羟基烷基、C₁-C₆氨基烷基、C₁-C₆硝基烷基、C₁-C₆卤素烷基、C₁-C₆氰基烷基。

本发明特别优选的通式I化合物或其可药用的盐或水合物优选下面的化合物：

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(吡啶-4-基)尿素(01)；

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-苯基脲(02)；

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(4-(羟甲基)苯基)尿素(03)；

叔丁基(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)氨基酸酯(04)；

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(4-(溴乙基)苯基)尿素(05)。

另一方面，本发明提供了制备上述通式I化合物或其可药用盐或水合物的方法，其包括以下反应方程式所代表的步骤：

其中：步骤(a)中溶剂为甲苯或二氯甲烷，在30-70℃下反应；步骤(b)中溶剂为无水乙醇，在30℃下反应；步骤(c)中加入氢氧化钾、纯净水和无水乙醇，在室温下反应；步骤(d)中采用四(三苯基膦)钯和碳酸钾作为催化剂，加入纯净水和1,4-二氧六环，在80℃下反应。

再一方面，本发明提供了上述化合物、其可药用盐、其水合物或者药物组合物在制备抗癌药物、免疫抑制剂、mTOR抑制剂、抑制PI3K-Akt-mTOR通路信号的药物、抑制T淋巴细胞增殖的药物、抗菌药物、抗病毒药物、促进肿瘤细胞凋亡的药物、使细胞周期停滞在G1期的药物、防止器官排斥反应的药物、降低动脉栓塞的药物、抗衰老药物、抗阿尔茨海默病药物、抗炎药物、放射增敏剂或抗菌药物中的用途；其中优选的，本发明提供的化合物作为放射增敏剂，在与分子靶向药物联合使用治疗癌症中的用途。

其中，本发明提供的化合物对多种肿瘤细胞具有明显的抑制活性，这些肿瘤细胞包括但不限于：人高转移性肝癌细胞(MHCC97-H细胞)、人肺癌细胞系(A549细胞)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人白血病细胞(K562)、子宫颈癌细胞(Hela)、卵巢癌细胞(SKOV3)、胃腺癌细胞(AGS)、前列腺细胞(PC-3)。因此，本发明提供了上述化合物、其可药用盐、其水合物或者本发明的药物组合物在制备治疗肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、子宫颈癌、卵巢癌、胃腺癌、前列腺药物中的用途。

此外，本发明提供的化合物其可药用的盐用于生产可抑制哺乳动物体内PI3K/Akt/mTOR信号的药物的用途。

此外，本发明提供的化合物为ATP类似物，可作用于各种激酶(kinase)类靶点，作为激酶抑制剂使用，用于治疗激酶失调相关疾病和病症中的用途。

此外，本发明还提供了一种药物组合物，它包含上述通式I的化合物或其可药用的盐、异构体、水合物以及至少一种可药用的载体。

需要说明的是，本发明提供的化合物为采用虚拟筛选和药效团的方式筛选而来。首先，第一侧链上的1,3-二氧戊环具有较大的空间体积，而且其能够提供两个氢键受体，从而能够与mTOR的结合空腔中的氨基酸VAL2240形成重要的氢键连接。最重要的是，其与母环之间间隔两个碳的距离，刚好能够令该侧链足够长进而与mTOR的结合空腔形成重要的氢键连接，但却不能进入PI3K的结合空腔中，从而明显的提高其对PI3K的选择性。其次，第二侧链的吗啉环能够与mTOR的结合空腔中的氨基酸SER2165形成稳定的氢键连接，由于PI3Kα、β、γ、δ在相应位置不存在类似的氨基酸残基，所以化合物与SER2165相互作用是化合物对mTOR具有选择性的重要原因。再次，第三侧链的脲结构(或氨基酸酯结构)与mTOR的结合空腔中重要的氨基酸ASP2244形成氢键，脲结构末端的侧链与化合物的药代动力学性质及其相对于PI3K的选择性密切相关。上述结构特点是发明人通过虚拟对接设计与化合物的合成相互佐证验证的结果，也使的本申请提供的化合物具有非常高的活性的同时，具有较高的相对于PI3K的选择性，以及具有更好的生物耐受性和成药前景。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请一实施例提供的化合物04的蛋白质印迹实验检测结果；

图2为本申请一实施例提供的化合物04在裸鼠模型中对于MHCC97-H细胞皮下生长的抗肿瘤作用；其中图2(A)为肿瘤图片；图2(B)为肿瘤体积；图2(C)肿瘤体积抑制率；图2(D)为肿瘤重量；图2(E)为肿瘤重量抑制率，其中*P<0.05；

图3为本申请一实施例提供的化合物04与索拉非尼联合使用时在裸鼠模型中对于MHCC97-H细胞皮下生长的抗肿瘤作用；其中图3(A)为肿瘤图片；图3(B)为肿瘤体积；图3(C)肿瘤体积抑制率；图3(D)为肿瘤重量；图3(E)为肿瘤重量抑制率，其中*P<0.05；

图4为本申请一实施例提供的化合物04与mTOR蛋白的虚拟对接图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

叔丁基(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)氨基酸酯(04)的制备：

根据下列反应式进行

试剂和条件：(a)甲苯，70℃；(b)无水乙醇，30℃；(c)氢氧化钾，纯净水，无水乙醇，室温；(d)四(三苯基膦)钯，碳酸钾，纯净水，1,4-二氧六环，80℃。

具体合成步骤如下：

反应a：叔丁基(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸酯(中间体A2)的制备

向100ml反应器中，投入4-氨基苯硼酸频哪醇酯(1.00g，0.0046mol)，甲苯(50ml)，二碳酸二叔丁酯(2g，0.0092mol)，投料完毕后，在70℃下反应12h。反应完成后，将反应液减压浓缩，柱层析得叔丁基(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氨基甲酸酯(0.59g，收率40％)。

反应b：4-(2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(中间体A4)的制备

向500ml反应器中，投入2，6-二氯嘌呤(5.00g，0.0265mol)，无水乙醇(100ml)，然后缓慢滴加吗啉(3.69g，0.042mol)。投料完毕后，在30℃下反应3h。过滤，滤饼用(3×30ml)乙醇洗涤。收集滤饼，在40℃下真空干燥30分钟，得4-(2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(6.37g，97％)。

反应c：4-(9-(2-(1,3-二氧杂戊-2-基)乙基)-2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(中间体A5)的制备

将2-(2-溴乙基)-1，3-二氧戊烷(3.77g，0.0208mol)溶于20ml无水乙醇中备用。向250ml反应器中，投入KOH(2.34g，0.042mol)，纯化水(100ml)，搅拌至完全溶解。加入4-(2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(5g，0.0208mol)搅拌30min，加入2-(2-溴乙基)-1，3-二氧戊烷和乙醇混合物，室温反应12小时。反完成后，反应液在40℃下减压浓缩20min。浓缩液加入乙醇(3×30ml)进行萃取、分液。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并用Na₂SO₄干燥。减压蒸馏得4-(9-(2-(1,3-二氧杂戊-2-基)乙基)-2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(5.3g，75％)。

反应d：叔丁基(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)氨基酸酯(化合物04)的制备

向100ml反应器中，投入4-(9-(2-(1,3-二氧杂戊-2-基)乙基)-2-氯-9H-嘌呤-6-基)吗啉(0.4g，0.00118mol)，1，4-二氧六环(10ml)，再加入1-(叔丁基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)脲(250mg，0.00078mol)、Pd(PPh₃)₄(0.027g，0.0000236mol)、K₂CO₃(0.33g，0.00236mol)、H₂O(2ml)。投料完毕后，在N₂保护下，将反应加热至80℃，反应4h完毕。反应完成后，反应液减压浓缩，柱层析得叔丁基(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)氨基酸酯(125mg，32％)。白色粉末，m.p.:135.9–136.8℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.53(s,2H),8.33–8.25(m,4H),8.17(s,2H),7.68–7.50(m,19H),4.91(t,J＝4.4Hz,2H),4.31(dd,J＝15.4,8.2Hz,12H),3.98–3.84(m,4H),3.77(ddt,J＝9.0,5.7,3.5Hz,12H),2.25(td,J＝7.2,4.4Hz,4H),1.50(s,18H).¹³CNMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.11,153.41,153.11,152.25,141.52,140.87,132.68,132.49,131.99,131.89,129.26,129.14,128.69,118.45,117.94,102.06,79.66,66.73,64.85,38.97,33.48,28.59.MS(ESI)m/z:497.23[M+H]⁺.

实施例2：

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(4-(溴甲基)苯基)尿素(05)的制备：

根据下列反应式进行：

试剂和条件：(a)二氯甲烷；室温；(b)无水乙醇，30℃；(c)氢氧化钾，纯净水，无水乙醇，室温；(d)四(三苯基膦)钯，碳酸钾，纯净水，1,4-二氧六环，80℃。

具体合成步骤如下：

反应a：1-(4-(溴甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)脲(中间体A7)的制备

向100ml反应器中，投入4-氨基苯硼酸频哪醇酯(1.00g，0.0046mol)，二氯甲烷(50ml)，1-(溴甲基)-4-苯基异氰酸酯(1.95g，0.0092mol)，投料完毕后，在室温下反应24h。反应完成后，将反应液减压浓缩，柱层析得1-(4-(溴甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)脲(1.75g，收率88％)。

反应b-d实验步骤同实施例1中内容。最终得到白色粉末，m.p.:248.9–249.5℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.94(s,1H),8.86(s,1H),8.37–8.29(m,2H),8.18(s,1H),7.61–7.52(m,2H),7.46(s,3H),4.91(t,J＝4.4Hz,1H),4.37–4.29(m,2H),3.98–3.86(m,2H),3.90–3.72(m,6H),3.32(s,3H),2.26(td,J＝7.1,4.3Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.10,153.42,152.68,152.27,141.52,140.90,139.48,132.41,131.99,128.89,120.65,118.46,118.07,113.78,102.06,66.73,64.86,38.98,33.47.MS(ESI)m/z:608.89[M+H]⁺.

实施例3：1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(4-(羟甲基)苯基)尿素(03)的制备

参照实施例2的合成方法进行合成，得化合物03。m.p.:225.3–225.6℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.76(s,1H),8.66(s,1H),8.08–8.00(m,2H),7.93–7.85(m,2H),7.79(s,1H),7.73–7.65(m,2H),7.30(dt,J＝8.3,1.0Hz,2H),4.91(t,J＝4.8Hz,1H),4.57–4.46(m,3H),4.42–4.33(m,2H),3.88–3.79(m,2H),3.81–3.70(m,6H),3.74–3.55(m,4H),2.19(td,J＝7.2,4.8Hz,2H).MS(ESI)m/z:546.35[M+H]⁺.

实施例4：1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(吡啶-4-基)尿素(01)的制备

参照实施例2的合成方法进行合成，得化合物01。m.p.:197.8–198.2℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.87(s,1H),8.63(s,1H),8.33(d,J＝8.3Hz,2H),8.24–8.16(m,2H),7.97(d,J＝8.2Hz,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,2H),7.33(dd,J＝8.2,4.6Hz,1H),5.42(s,1H)4.36(t,J＝6.3Hz,2H),4.31(s,4H),3.78(t,J＝4.5Hz,4H),3.31(s,1H),2.77(t,J＝6.0Hz,2H),2.48(s,1H).MS(ESI)m/z:517.35[M+H]⁺.

实施例5：1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-苯基脲(02)的制备

参照实施例2的合成方法进行合成，得化合物02。m.p.:203.2–204.5℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.97(s,1H),8.79(s,1H),8.61(s,1H),8.30(d,J＝8.3Hz,2H),8.22–8.14(m,2H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.28(s,1H),5.40(s,1H)4.36(t,J＝6.3Hz,2H),4.27(s,4H),3.62(t,J＝4.6Hz,4H),3.29(s,2H),2.71(t,J＝6.0Hz,2H),2.31(s,1H).MS(ESI)m/z:516.42[M+H]⁺.

化合物的选择性研究

采用蛋白质印迹(Western Blot)实验检测P70S6K1、AKT或ERK的磷酸化水平，明确mTOR抑制剂体外作用的分子机制。小分子抑制剂如PI3K/AKT抑制剂(LY294002)、MAPK抑制剂(GSK2118436)或Jak/STAT抑制剂(CP690550)从Selleck公司(Houston,TX,USA)购买。开始实验，首先培养MHCC97-H细胞。对细胞给予化合物处理后，收集体外实验中给药后的MHCC97-H细胞。将细胞样品在冰浴中裂解5-10分钟后，收集蛋白质。将组织蛋白质样品中加入SDS上样缓冲液，进行15分钟的沸水浴。样品在4℃下12000转离心15分钟，收集上清液，即为制备的细胞蛋白样品。对蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，使用转膜仪进行转膜，15V恒压转膜，将蛋白样品从凝胶中转印到PVDF膜上。使用5％BSA对PVDF膜进行封闭，37℃封闭2小时。封闭后的PVDF膜孵育一抗，37℃封闭2小时。用TBST清洗三次后，再孵育二抗，37℃封闭2小时。将PVDF膜用TBST洗三次。用相应抗体：兔抗人phospho-p70S6K抗体,p70S6K抗体,phospho-AKT抗体,AKT抗体,phospho-ERK抗体,ERK抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)检测P70S6K1、AKT、ERK或β-action的表达水平，以及P70S6K1、AKT或ERK的磷酸化水平。最后，再使用X光胶片压片、显影，对胶片进行扫描，并用Image J软件(National Institutes of Health[NIH],Bethesda,Maryland,USA)进行分析。

化合物04为酶抑制活性的最好的化合物。如附图1所示，用化合物04处理后可以显著降低mTOR下游信号分子P70S6K1的磷酸化(Thr389位点的磷酸化)。在化合物04、LY294002和GSK2118436的给药浓度分别为0.3μmol/L、1μmol/L和1μmol/L时进行测定。在这些浓度下，这些化合物对mTOR通路几乎达到了最大的抑制作用。

本申请中，Western Blot实验被用于判定化合物04是否选择性作用于mTOR。该实验中，P70S6K1为mTOR的下游效应子，ERK(Extracellular-signal-regulated kinase)为MAPK的下游效应子^]。

首先，排除化合物04对上游PI3K/AKT信号通路的影响。挑选PI3K抑制剂LY294002作对照物。Western blot实验(图1)证明，LY294002可显著抑制AKT的磷酸化并降低P70S6K1的磷酸化；而化合物04对AKT的磷酸化基本无影响，仅仅只能抑制P70S6K1的磷酸化。这说明化合物04不能作用于mTOR上游的PI3K和AKT。由于信号通路间的相互影响，ERK-MAPK信号通路也可以调节mTOR的活性。因此，第二步，还需要考察化合物04是否对ERK-MAPK通路有抑制作用。MAPK抑制剂GSK2118436作为对照物，表现出对ERK磷酸化的显著抑制作用，但是化合物04不能抑制ERK的磷酸化。这说明化合物04并不是通过抑制MAPK通路来达到抑制mTOR的目的。最后，JAK/STAT通路抑制剂CP690550(1μmol/L)被作为阴性对照(不影响AKT、ERK或P70S6K1的磷酸化)参与这个实验。结果不出所料，CP690550被证明对mTOR无明显影响。综述上述反应，我们可排除化合物04是mTOR上游抑制剂的可能性，证明了化合物04对mTOR作用的特异性。

化合物对mTOR酶抑制活性测试：

化合物的mTOR酶抑制活性用赛默飞公司的

 ultra time-resolvedfluorescence resonance energy transfer(TR-FRET)测试(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，按赛默飞公司提供的说明书进行操作，选择已经报道的化合物BEZ235为阳性对照化合物。操作时，首先将mTOR酶(0.1μg/mL,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、ATP(3μM)、GFP-4EBP1 Peptide(0.4μM)以及测试化合物溶于酶缓冲液(50mM HEPES pH 7.5,1mM EGTA,3mMMnCl₂,10mM MgCl₂,2mM DTT and 0.01％Tween-20)。该反应在384孔板(Corning,New York,NY,USA)中，常温反应一小时。然后加EDTA至10mM停止反应。接下来向每个孔中加入Tb-antiphospho-4EBP1(Thr37/46)抗体(PerkinElmer,Fremont,CA,USA)使最终浓度达到2nM，将反应液在室温下混合30分钟。荧光强度用Spectramax 190酶标仪测量(MolecularDevices,Valley,CA,USA)上的TR-FRET模式进行测试(激发波长320nm，散射波长665nm)。所有化合物活性测试两次，结果用IC₅₀表达(抑制50％细胞时候的浓度)，取两次测试结果的平均值。酶抑制活性测试结果见表1。

化合物对PI3K酶抑制活性测试：

用ADP-Glo kinase assay方法测试化合物的PI3Kα酶抑制活性(PI3Kα酶购自Promega公司)。

试验试剂准备：将10μl(1μg,promega,#V1691)PI3K酶溶于310μl 2.5x酶反应缓冲液(Promega,#V1691)，得到320μl 2.5x酶反应溶液。50μl PIP2:3PS底物被溶于100μl 10x脂质缓冲液，加水至400μl，获得2.5x PIP2:3PS脂质底物工作溶液。25μl超纯ATP(10mM)被溶于975μl水，获得250μM ATP水溶液。

试验开始，将测试化合物溶于DMSO配制成10μM的待测液，取1μl加入384孔板。然后向化合物中加入4μl 2.5x PIP2:3PS脂质底物工作溶液。然后，再向其中加入4μl 2.5x酶工作溶液。其中，无酶对照组只加入4μl 1x酶反应缓冲液，DMSO组只加入DMSO。向反应液中加入1μl 250μM ATP后酶反应正式开始，在摇床上混合板子60秒，然后在23℃孵育1小时。孵育完毕后，向其中加入10μl ADP-Glo^TM试剂(Promega,#V1691)用以终止酶反应，并且消耗未反应的ATP。40分钟后，加入20μL酶检测试剂(Promega,#V1691)，振摇一分钟，孵育40分钟，然后用酶标仪读取荧光值。根据每孔的化学发光检测值，计算化合物的抑制率。抑制率计算公式为：(max-sample RLU)/(max-min)×100％；max：DMSO对照；min:无酶对照；sample RLU：样品发光值。所有化合物活性测试两次，结果用IC₅₀表达(抑制50％细胞时候的浓度)，取两次测试结果的平均值。酶抑制活性测试结果见表1。

表1化合物的mTOR酶抑制活性和选择性

其中对照化合物选自专利CN108794478A中公开的活性最优化合物。以上mTOR酶抑制活性实验结果(表1)说明本发明中所述化合物具有较好的对mTOR酶的抑制活性。与对照化合物相比，其保留对mTOR酶的抑制活性的同时，能够尽量小的影响PI3K酶的活性，从而在后续成药过程中，能够明显降低药物副作用，提高其耐受性。

肿瘤细胞抑制实验

实验材料：DMEM高糖细胞培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司，磷酸生理盐水缓冲液(PBS)购自Gibco公司，Cell

细胞活力检测试剂购自Promega公司，胰酶以及二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。肝癌细胞(HepG2细胞)、人肺癌细胞系(A549细胞)、人乳腺癌细胞(MCF7)、人白血病细胞(K562)、子宫颈癌细胞(Hela)、卵巢癌细胞(SKOV3)、胃腺癌细胞(AGS)、前列腺细胞(PC-3)均购自ATCC公司。其中对照化合物选自专利CN108794478A中的实施例2的化合物。

实验方法：

以每孔5000个细胞的数量接种白壁底透96孔板(Costar)，37℃5％CO₂条件下培养24h。利用DMSO将待测化合物溶解至100mM，作为化合物母液。

利用含有2％FBS的DMEM培养液稀释化合物，浓度梯度为3，浓度范围为100μM～3nM。将各稀释度化合物加入培养好的96孔板细胞中，每孔100μl。37℃CO₂条件下培养72h，弃去上清液后，进行细胞活力检测实验。

将Cell 

的反应缓冲液以及底物进行等比混合后，加入96孔板中，每孔100μl。水平震荡4min以诱导细胞裂解。室温平衡15min，以稳定反应信号。利用化学发光检测仪检测96孔板中每孔的化学发光单位。

根据每孔的化学发光检测值，计算每个化合物各稀释度的抑制率，利用Origin8.0软件对每个化合物的不同梯度进行S型曲线拟合，计算IC₅₀值。结果见表2。

表2实施例化合物对多种肿瘤细胞的体外增值抑制能力

体外抗肿瘤实验实验的结果证明，化合物01-05除了对A549细胞活性较弱以外，对多个肿瘤细胞系如：MCF7，K562，SKOV3，MDA231，AGS，PC-3的抑制活性均较好。

肿瘤细胞抑制实验

本申请所用的抗肿瘤药物如索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、安罗替尼或阿帕替尼从selleck公司购买。细胞使用高侵袭性HCC细胞系(MHCC97-H)模拟晚期HCC，该实验中所涉及的细胞和动物实验已经本单位伦理委员会批准。

将MHCC97-H细胞以每孔5000个的数量接种于白壁底透96孔板(Corning,NY,USA).该细胞系在DMEM(Invitrogen,USA)中与10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在37℃和5％CO₂条件下培养24小时。受试化合物用DMSO溶解，用DMEM稀释，最终达到DMSO浓度为1‰。用指定浓度(10.0μmol/L、3.0μmol/L、1.0μmol/L、0.3μmol/L、0.1μmol/L、0.03μmol/L、0.01或0.003μmol/L)的分子靶向药物处理MHCC97-H细胞12h，然后用MTT法(Amresco,Washington,USA)测试细胞的存活。用O.D.490nm波长检测吸光度，分子靶向剂对MHCC97-H细胞的抑制率计算方法为：(对照组的O.D.490nm-给药组的O.D.490nm)/(对照组的O.D.490nm)×100％。通过抑制率计算MHCC97-H细胞上分子靶向药物的IC₅₀值。

实验结果

为了考察化合物04在体外对MHCC97-H细胞的增敏效果，需要首先确定一个合适的给药浓度。在该浓度下，化合物04不能直接抑制MHCC97-H细胞的生长，但是可以基本抑制细胞中mTOR酶的活性(phosphorylation of P70S6K1)。实验数据(表3)显示，在0.03μmol/L(30nmol/L)的浓度下，化合物04可显著抑制mTOR的活性(抑制率71.69％)，而对MHC97H细胞无明显的细胞毒性作用(抑制率8.43％)。因此，在接下来的实验中，采用30nmol/L的给药浓度进行细胞增敏实验。

表3化合物04细胞实验中的抑制率

在30nmol/L剂量下，化合物04分别与5种分子靶向药物联合给药，以不加化合物04作为对照组，获得的IC₅₀值见表4。该实验显示，化合物04的处理明显增强了多种分子靶向药物索拉非尼、瑞戈非尼、乐伐替尼、阿帕替尼、安罗替尼对MHCC97-H细胞的抑制作用，从而降低了五种分子靶向药物的IC₅₀值.

表4化合物04对分子靶向药物作用于MHCC97-H细胞IC₅₀值的影响

动物实验——裸鼠异种移植肿瘤模型

实验材料与方法

使用裸鼠模型测试候选化合物的体内生物活性。动物实验根据1986年英国《动物(科学程序)法》及其相关指南进行。为了形成肿瘤组织，首先培养了MHCC97-H细胞，将单细胞悬液(1×10⁶个细胞/每只小鼠)注射到4-6周的成年裸鼠的皮下位置。注射后4～5天，进行口服给药，每2天给药一次。据Xie等人和Wang等人所述的方法，在动物实验中将药物溶于少量DMSO，使用PEG(聚乙二醇)和吐温80制备为口服液。治疗30天后(约给药15次)收集肿瘤组织。计算肿瘤体积为(肿瘤长度)×(肿瘤宽度)×(肿瘤宽度)/2，采用精密天平法称量肿瘤重量。肿瘤重量或肿瘤体积反映了药物对MHCC97-H细胞皮下生长的抑制能力。

实验结果

在进行联合用药以前，首先需要确定适宜的给药浓度。如图2和表5所示，将不同浓度的化合物04用于小鼠皮下肿瘤模型，结果显示1mg/kg剂量的化合物04可显著抑制mTOR的激活(62.14％)，但对MHCC97-H细胞的皮下生长几乎无影响(对肿瘤体积抑制率12.72％，对肿瘤重量抑制率14.99％)。因此，体内实验时化合物04的体内实验浓度被定为1mg/kg。

表5化合物04在皮下肿瘤模型中的抑制率

在下述体内实验中，如表6所示，1mg/kg剂量的化合物04分别与五种分子靶向药物联用，起到了显著的抑制皮下肿瘤生长的效果。对照组单独使用索拉非尼。该实验表明，多种分子靶向药物联合化合物04的治疗效果均优于单独使用分子靶向药物。以索拉非尼为例(图3)，在各个浓度下，索拉非尼和化合物04联合使用比单独使用索拉非尼具有更好的抗肿瘤效果。从图3中可以看出，0.5mg/kg索拉非尼与化合物04联用，可以到达与2mg/kg索拉非尼单独使用近似的效果。该实验显示，在裸鼠皮下肿瘤模型中，化合物04可以显著增强分子靶向药物的抗肝细胞癌效果。

表6化合物04对分子靶向药物抑制MHCC97-H细胞能力的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物，其特征在于，其选自如下化合物：

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(吡啶-4-基)尿素；

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-苯基脲；

1-(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)-3-(4-(羟甲基)苯基)尿素；

或者，叔丁基(4-(9-(2-(1,3-二氧戊环-2-基)乙基)-6-吗啉基-9H-嘌呤-2-基)苯基)氨基酸酯。

2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于：其包括以下反应方程式所代表的步骤：

其中：步骤(a)中溶剂为甲苯或二氯甲烷，在30-70℃下反应；步骤(b)中溶剂为无水乙醇，在30℃下反应；步骤(c)中加入氢氧化钾、纯净水和无水乙醇，在室温下反应；步骤(d)中采用四(三苯基膦)钯和碳酸钾作为催化剂，加入纯净水和1,4-二氧六环，在80℃下反应。

3.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的化合物以及至少一种可药用的载体。

4.一种如权利要求1所述的化合物或如权利要求3所述的药物组合物在制备mTOR抑制剂、抑制PI3K-Akt-mTOR通路信号的药物中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的化合物或药物组合物在制备抗癌药物中的应用，所述抗癌是指作为放射增敏剂，与分子靶向药物联合使用治疗癌症。

6.权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的化合物或药物组合物在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的应用，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、子宫颈癌、卵巢癌、胃腺癌、前列腺癌中的一种。

7.权利要求4所述的用途，其特征在于，用于生产可抑制哺乳动物体内PI3K/Akt/mTOR信号的药物。

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