CN111733140B

CN111733140B - 一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用

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Publication number: CN111733140B
Application number: CN202010261672.3A
Authority: CN
Inventors: 丁一; 丁明星; 王卓乐; 朱红梅; 杨迪琦; 庄深; 李桥; 孙晋睿
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-04-04
Filing date: 2020-04-04
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-04-04
Also published as: CN111733140A

Abstract

本发明涉及一种抗犬基质金属蛋白酶13(MMP‑13)的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC NO:C2019290，其分类命名为抗犬MMP‑13杂交瘤细胞株8C7，其中抗犬MMP‑13的杂交瘤细胞株通过以下方法获得：(1)采用PET‑28a(+)表达载体在IPTG的诱导下表达免疫原，以该免疫原免疫BALB/c小鼠；(2)用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；(3)经筛选获得分泌抗犬MMP‑13单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明采用Ni‑NTA‑sefinose层析柱纯化得到了高纯度的犬MMP‑13抗原，保证后续阳性克隆的筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c雌性小鼠腹腔获取了大量单抗，该抗体具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，在检测MMP‑13的免疫印迹方法(western blot)和免疫荧光方法中的应用效果良好。

Description

一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域，具体涉及一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一种包含锌元素的钙离子依赖蛋白酶类，能够降解细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)中所包含的大部分成分。迄今为止发现20多种基质金属蛋白酶，根据其分子量大小及底物的不同可以将其分为胶原酶(collagenases)，明胶酶(gelatinases)、间质溶素 (stromelysins)，膜型基质金属蛋白酶(membrane-type MMP，MT-MMP) 和其他类型基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶家族包括5个共同的结构域：信号肽和前肽、催化结构域和血红素结合蛋白样C末端结构域，后者通过铰链区和催化结构域。MMPs活性依赖于锌离子(Zn²⁺)，其催化结构域有2个Zn²⁺结合区和1个钙离子(Ca²⁺)结合区，2个Zn²⁺结合区中分别为催化性结合区，位于MMPs酶活性中心内，通过保守序列HEXGHXXGXXH中氨基酸与Zn²⁺结合，参与MMPs催化过程；另一个为结构性结合区。翻译产物经信号肽引导质胞浆内质网。其中MMP 13 又称胶原酶3，它的水解底物为Ⅰ、Ⅱ型胶原。

研究报道，金属蛋白酶家族在维持软骨细胞外基质合成和降解动态平衡中发挥重要作用，基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinases,MMP-13)，可降解软骨组织中特有的Ⅱ型胶原蛋白，造成软骨细胞外基质降解异常。

骨软骨病(osteochondrosis，OC)是动物和人类生长软骨中最常见的一种疾病。在动物中，已有犬、猪、马、牛、鸡以及火鸡等报道这种疾病。OC被认为是造成猪“弱腿症”的重要原因，同时也是青年马和犬跛行的常见原因。

剥脱性骨软骨炎(osteochondritis dissecans)是在1888年由德国外科医生

提出的，用于描述与人类患者关节中碎片形成相关的疾病。该术语后来被改为剥脱性骨软骨病(osteochondrosis dissecans,OCD)，因为认识到炎症不是原发性病变的特征。在马中，同时诊断出OCD和滑膜炎时，仍称为剥脱性骨软骨炎。在人类中，也使用“剥脱性骨软骨炎”，青少年和成人的发病形式也得到了确认，与动物OCD发病最相似的是青少年OCD。

OCD是“骨软骨病”潜在的疾病过程的结果。骨软骨病是生长板软骨和/或骺生长软骨软骨内骨化过程发生局灶性紊乱的一种病理状态，以关节变形、运动性共济失调和跛行为特征。

软骨内成骨发生在生长软骨内，生长软骨是一种最终被犬骨软骨病发生直接原因是软骨细胞赖以生存的细胞外基质(糖胺聚糖和胶原蛋白)降解异常。因此，MMP-13是反映关节软骨降解的特殊标记，对早期骨软骨病的发生具有重要的临床诊断意义。

此外MMP-13在骨关节炎关节病理性变化的过程中起到重要的作用，同时在一些肿瘤疾病的转移过程中细胞基质的破坏也有MMP-13 的参与。因此对MMP-13变化的检测对骨关节炎和骨肿瘤疾病诊断有一定借鉴作用。

单克隆抗体指来自一个淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、针对同一抗原决定簇的抗体。单克隆抗体制备的基本的过程：给小鼠注射一种抗原，被免疫系统识别，从而诱导小鼠的淋巴细胞产生相应抗体；然后，在培养基中融合小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，产生杂交瘤细胞，经过筛选分离出单个杂交瘤细胞；扩增单个杂交瘤细胞，最后分离、纯化抗体。与常规的血清抗体的性质相比，单抗的纯度更高，特异性更好，因而在实验室诊断方面有更高的应用价值。从20世纪80年代至今，单抗研制一直是兽医界研究的一个热门课题，研制成功的单抗所针对的抗原来源和种类己覆盖了很多疾病的重要标志物和参与重要生理生化反应的标志性蛋白。

侯珏等人在《湖南医科大学学报》2003年(03期)第240-242页发表文章《人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用》，介绍了其获得兔抗人基质金属蛋白酶-1(MMP-1) 多克隆抗体，并将其初步应用于临床检测。方法:将人MMP-1融合蛋白经亲和层析法纯化，并将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗血清，经饱和硫酸铵纯化，获得初步纯化的兔抗人MMP-1多克隆抗体。采用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP-1的OD值。

胡晓慧在其博士毕业论文《基质金属蛋白酶-2的基础与临床研究》中记述了基质金属蛋白酶-2的单克隆抗体制备过程。其根据 GenBank中MMP-2cDNA序列设计引物，体外培养EA hy926内皮细胞，收集细胞后抽提总RNA，利用所合成引物经RT-PCR获得纤维连接蛋白样片段cDNA，与pET20b(+)表达载体重组后转化大肠杆菌 BL21(DE3)plus。挑选阳性克隆后，经IPTG诱导表达蛋白。蛋白经次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA agarose)柱纯化浓缩后，免疫Balb/c 小鼠，尾静脉加强后取脾细胞融合，ELISA法筛选阳性克隆，制备腹水。运用Western blot对抗体进行鉴定，并观察抗体与天然MMP-2 及纯品的反应情况,进行亚型鉴定和组织特异性鉴定，同时进行功能实验，包括增殖实验、侵袭实验以及体外血管新生实验。结果显示：原核表达MMP-2纤维连接蛋白样片段大小为21kd，表达量占菌体总蛋白25％，经Ni-NTA agarose柱纯化后获得了部分纯化的蛋白。以该蛋白作为抗原制备获得杂交瘤细胞株SZ-116和SZ-117两株杂交瘤细胞株，间接ELISA测定其效价为1×10⁵和2×10⁵。

游牧等人在《细胞与分子免疫学杂志》2012年(第28卷)11期 1177-1181页发表文章《抗基质金属蛋白酶-2单克隆抗体的制备、鉴定及其应用》，报道了制备和鉴定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)单克隆抗体(mAb)，检测其在人卵巢癌组织和裸鼠移植瘤中的表达。其方法:利用戊二醛法制备人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH，并免疫小鼠，采用标准杂交瘤技术，亚克隆筛选出单克隆细胞株，制备腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体，以ELISA、Western blot法对抗体进行鉴定。通过免疫组织化学法与商品化多抗进行对比，并联合CA125 将自制抗体应用于临床人卵巢癌组织和裸鼠移植瘤的检测，结果显示人工抗原MMP-2-BSA和MMP-2-KLH合成成功，获取3株稳定分泌抗 MMP-2的杂交瘤细胞株(3G10、4D12、1E8)，抗体亚型均为IgG1。其中3G10反应性最强，经间接ELISA法检测纯化后抗体的效价达1×10⁶。

赵平等人在其2006年的发明专利申请公布说明书中公布了《一种抗人基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其应用》，其发明涉及一种抗中国人种基质金属蛋白酶的单克隆抗体及其在检测MMP-9的ELISA试剂盒中的应用。该单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.1743，保藏日为 2006年6月27日。所述的该单抗在检测MMP-9的ELISA试剂盒中的应用，包括该单抗包被的96孔酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗MMP9 多克隆抗体双抗夹心检测样品中MMP9含量。

以上抗基质金属蛋白酶抗体主要针对其家族中MMP-1、MMP-2和 MMP-9，且其来源种属都是人源。目前，抗犬来源的MMP-13单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备和单克隆抗体的应用尚无报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗犬基质金属蛋白酶(MMP-13)的杂交瘤细胞株，该单克隆抗体可特异性与犬MMP-13结合，能准确有效检测犬MMP-13的变化。

本发明的目的之二在于提供一种抗犬MMP-13的杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种单克隆抗体及其在检测犬MMP- 13中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种基质金属蛋白酶检测技术，避免使用人用MMP-13试剂盒检测犬MMP-13而造成检测准确性不高的缺陷。

本发明的技术方案是：一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株，其分类命名为抗犬MMP-13杂交瘤细胞株8C7，并于2019年11 月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:C2019290。

本发明选择三月龄德国牧羊犬的膝关节软骨组织，提取RNA后用逆转录酶合成cDNA，再用高保真DNA聚合酶特异性扩增犬MMP-13基因片段，经基因测序验证后构建表达载体pET-28a(+)-MMP-13并在大肠杆菌表达和纯化，制备出经过质谱鉴定与其他物种MMM-13表位不同的犬源重组MMP-13抗原。本发明采用常规标准单克隆抗体制备技术，制备出数株犬MMP-13单克隆抗体。

本发明的的制备方法由以下方法获得：

(1)制备具有免疫原性和反应原性的MMP-13重组蛋白为免疫原

选取犬的MMP-13基因CDS区，设计相应的多对PCR引物，同时选取3月龄德国牧羊犬的膝关节软骨组织，提取RNA，反转录成 cDNA作为PCR模板，并使用多对设计的PCR引物进行PCR反应，获得了效率最佳的PCR引物对，收集纯化PCR产物目的片段，进行核酸序列测定，测序后确定DNA序列为MMP-13的CDS区，将PCR目的片段与pET-28a(+)载体进行连接，转化大肠杆菌，用0.06mmoL/L的 IPTG摇菌；离心收集菌体，用PBS重悬菌体进行压力破碎，收集破碎菌液，洗涤杂质；使用N-十二烷基肌氨酸钠溶解沉淀，采用透析复性的方法使蛋白重折叠；收集复性蛋白溶液过镍柱纯化获得MMP-13重组蛋白；

(2)免疫BALB/c小鼠

采用MMP-13抗原与完全弗氏佐剂混合，皮下注射8周龄BALB/c 雌性小鼠，之后每隔3周，采用MMP-13抗原溶于PBS，与弗氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射，5次增强免疫后，隔3周进行抗原冲击免疫，MMP-13抗原溶于PBS，腹腔注射，取脾细胞；

(3)用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合

将免疫小鼠的脾细胞与SP2骨髓瘤细胞同37℃预温的1mL 450g/L的PEG4000融合，融合后的细胞用RPMI-1640不完全培养液重悬后接种于加有小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞的96孔板内，在HAT 选择性培养液中培养，观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积 1/10以上时吸出上清供抗体检测；RPMI-1640不完全培养液：含体积分数为20％的小牛血清和体积分数为1％的选择培养基HAT；

(4)间接ELISA筛选阳性克隆

将纯化的MMP-13抗原溶液加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜包被，次日甩干孔内液体，加入150μL封闭液于室温封闭 2h，洗涤3次，加入细胞培养上清液孵育1h，甩干孔内液体，洗涤 3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗孵育45min，洗涤3次，加入 TMB作用12min；加入终止液，使用酶标仪进行OD值检测；

(5)阳性杂交瘤细胞克隆

使用间接ELISA法检测为阳性的融合细胞经过3次克隆，获得分泌抗MMP-13单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明提供一种适用于抗犬基质金属蛋白酶(MMP-13)的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为：CCTCC NO.C2019290保藏日为2019 年11月1日的杂交瘤细胞制得，其制备方法包括步骤如下：

(1)提前1周小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂，每只小鼠腹腔注射0.5～1.0×10⁷处于对数生长期的杂交瘤细胞。

(2)7～15d小鼠腹部逐渐涨大，此时采用16号针头通过腹部穿刺抽取腹水，每次可取4～5mL。抽取后5000rpm离心5min，吸取中间水相层。每10mL腹水加入150mg二氧化硅，摇动混匀孵育 2h，2000rpm离心20min，取上清。

(3)经过抗体亚型鉴定，编号为8C7的杂交瘤细胞株生产的抗体亚型为IgG1型。

本发明还提供了一种单克隆抗体在用于免疫印迹法检测MMP-13 的应用。包括步骤如下：

(1)采犬血液，37℃静置1h，12000rpm离心10min取血清。

(2)使用血清蛋白提取试剂盒提取血清总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

(3)调节到10mg/mL的总蛋白浓度后加入1/4比例的蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮样10min。

(4)配制10％分离胶和5％浓缩胶，每孔上样4μL进行SDS- PAGE电泳，切胶，转膜。

(5)脱脂奶粉封闭2h，4℃过夜孵育一抗(由本发明提供的抗犬MMP-13单克隆抗体配制)，洗膜3次，每次5min，孵育HRP标记的山羊抗小鼠二抗1h，洗膜3次，每次5min，加入化学发光底物进行化学发光成像。

本发明还提供了一种单克隆抗体在免疫荧光法检测犬MMP-13中的应用。

(1)用PBS浸洗培养有软骨细胞的培养板3次，每次3min；

(2)用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗培养板3次，每次3min；

(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

(4)PBS浸洗培养板3次，每次3min，倒掉PBS，在培养板中滴加5％BSA，室温封闭30min；

(5)倒掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗 (由本发明提供的抗犬MMP-13单克隆抗体配制)并放入湿盒，4℃孵育过夜；

(6)加荧光二抗(带有荧光标签的山羊抗小鼠二抗)：PBST浸洗培养板3次，每次3min，在暗室中滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20～37℃孵育1h，PBST浸洗培养板3次，每次3min；

(7)复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对细胞进行染核，PBST 5min重复4次洗去多余的DAPI；

(8)荧光显微镜下观察并采集图像。

本发明采用特异性的引物克隆犬的基质金属蛋白酶13(MMP-13) CDS基因片段，测序纯化后并连接pET28a(+)表达载体，IPTG诱导产生足量的MMP-13重组蛋白，质谱鉴定目的蛋白后，采用包涵体变性复性的方法取得蛋白重折叠的MMP-13重组蛋白，保证后续阳性克隆的筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c雌性小鼠腹腔获取了大量MMP-13单抗，该抗体是针对MMP-13的单一抗体，具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，在免疫印迹法(western blot)和免疫荧光法检测MMP-13 中有良好的效果。适用于各品种犬MMP-13含量变化的检测，在犬的骨软骨病诊断中具有重要作用，同时还为其他动物骨软骨病诊断及其他类型单抗的制备技术提供了一定的借鉴。

附图说明

图1为犬基质金属蛋白酶13(MMP-13)基因CDS区核酸序列。

图2为犬基质金属蛋白酶13(MMP-13)氨基酸序列。

图3为PCR核酸琼脂电泳凝胶成像，使用编号为pET28a-R/F的引物,分别在54℃、56℃、58℃、60℃和62℃进行温度梯度PCR，每个温度梯度下设置1μL、2μL、3μL三个模板浓度，在1500bp 左右的最亮条带即为目的条带。

图4为诱导表达重组犬基质金属蛋白酶13(MMP-13)SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，红色方框内即为目的蛋白。

图5为质谱鉴定表达的犬重组基质金属蛋白酶13(MMP-13)，质谱鉴定uniquepeptide数量为3。

图6为单克隆抗体纯化后SDS-PAGE染色显影，两个蓝色方框即代表纯化后抗体的重链和轻链。

图7为间接ELISA测定免疫小鼠血清效价，可见编号为A1、A2、A3 和B2的小鼠血清效价达到1×10⁵以上，冲击免疫后可以达到融合要求。

图8为免疫荧光结果图像，Hela细胞株作为阳性样本，可见本发明所提供的单克隆抗体对比PBS组有显著的荧光。

图9为免疫荧光结果图像，检测幼犬原代软骨细胞样本，可见本发明所提供的单克隆抗体对比PBS组有明显的荧光。

图10为免疫组织化学结果图，在犬股骨远端外侧髁软骨切片中软骨浅表层和中层软骨细胞胞浆中可见明显的阳性信号。

图11为免疫印迹(western blot)，图片第一排为本发明所提供的单克隆抗体与MMP-13的结合，第二排为血清内参transferrin蛋白，从第一列到第十列分别为第0、第1、地7、第30和第60d的sham 组和骨软骨病模型组。

具体实施方式

实施例1

犬重组基质金属蛋白酶(MMP-13)的获得。

本发明提供的作为抗原的基质金属蛋白酶，为采用基因工程技术从德国牧羊犬膝关节软骨组织中提取的RNA，经反转录和RT-PCR获得基质金属蛋白酶基因，然后克隆到质粒中，转化大肠杆菌表达后获得，其具体的克隆和纯化过程如下：

1)首先采用常规技术从德国牧羊犬膝关节软骨组织克隆基质金属蛋白酶基因并测序。反转录和RT-PCR的具体条件以及相应的引物序列为：

上游引物：GGAATTCATGAGTCACCACTGCAGGTC下划线标注为Eco R1位点

下游引物：GCCTCGAGTTAACACCACAACAGGGAGT，下划线标注为Xho 1位点

反转录后模板cDNA合成：取3μL总RNA加入1μL Random primer (0.1μg/μL)、10μL2×TS Reaction Mix、1μL RT/RI Enzyme Mix、1μL gDNA Remover、用DEPC水补至20μL混匀，42℃孵育 30min，85℃加热5秒失活RT/RI Enzyme与gDNA remover。

PCR反应条件step 1：94℃5min，step 2：94℃30sec，step 3： 60℃30sec，step 4：72℃1min，step 5：return to step 2 for 35 cycles，step 6：72℃10min，step 7：end.1.0％琼脂糖电泳鉴定。PCR所用酶为擎科生物公司的高保真DNA聚合酶。

克隆的基质金属蛋白酶基因其具有图1所示的核苷酸序列，图2 为图1序列所对应的氨基酸序列，该序列为犬类特有序列，和其他物种相比具有较高的独特性。

2)将步骤1)获得的犬基质金属蛋白酶(MMP-13)的序列1所示的基因克隆到pET28a(+)表达质粒，将pET28a(+)载体和RT-PCR产物分别用Eco R1和Xho 1双酶切后用T4连接酶连接，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃生长，待菌落长出后，挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的液体培养基中， 37℃下200rpm生长过夜；第二天，以1∶100接种于新鲜含氨卞青霉素的LB培养基中，37℃生长到OD 600＝0.6～0.9之间；按终浓度0.05mM加入1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，37℃， 200rpm，诱导3h；5000rpm，4℃离心10min，菌体反复冻融五次破碎；1000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀为包涵体，包涵体用含1％的Triton-X100洗涤一次，1000rpm，4℃离心10min；用pH 8.0、0.02M PBS(磷酸盐缓冲液)、6M盐酸胍缓冲液溶解包涵体，1000rpm，4℃离心10min；用pH8.0、0.02M PBS、8M的 N-十二烷基肌氨酸钠缓冲液平衡Ni金属亲和柱，已溶解的包涵体过柱，重组MMP-13蛋白被吸附，用含0.1M NaCl、pH 8.0、0.02M PBS、8M的N-十二烷基肌氨酸钠的缓冲液洗涤除去杂蛋白，用含0.5 M NaCl、pH 8.0、0.02M PBS、8M的N-十二烷基肌氨酸钠缓冲液洗脱，获得犬重组MMP-13蛋白，用适量pH 8.0、0.02M PBS、8M的 N-十二烷基肌氨酸钠缓冲液稀释至1.0mg/mL，-20℃冻存。

PCR结果如图3所示，PCR核酸琼脂电泳凝胶成像，使用引物pET28a- R/F,在54,56,58,60和62℃下进行温度梯度PCR，每个温度梯度设置 1μL、2μL、3μL三个模板浓度，1500bp左右的最亮条带即为目的条带。

抗原表达鉴定如图4所示，诱导表达犬重组MMP-13，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，红色方框内即为目的蛋白。抗体纯化结果如图5所示，质谱鉴定表达的犬重组MMP-13，质谱鉴定unique peptide数量为3，可以鉴定蛋白片段属于犬MMP-13蛋白。

实施例2

生产犬MMP-13单克隆抗体杂交瘤细胞株及犬MMP-13单克隆抗体的制备

1)免疫用抗原：实施例1步骤2)中获得的犬的MMP-13；

2)免疫程序：采用BALB/c小白鼠(购于华中农业大学动物实验中心) 作为免疫动物，首次免疫抗原剂量为100μg/只，经皮下多点注射，在间隔10～14d，加强免疫4次，取脾细胞；

3)细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞SP 2/0与脾细胞在聚乙二醇(分子量4000)的溶剂中进行细胞融合，在含HAT(H是次黄嘌呤 Hypoxanthine的简称，A是氨甲喋呤Aminopterin的简称，T是胸腺嘧啶核苷Thymidine的简称)培养液中作选择培养；

4)杂交瘤细胞克隆化：采用常规的有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；

所述的杂交瘤细胞株已于2019年11月1日保藏在，其保藏号为CCTCC NO:C2019290，其分类命名为抗犬MMP-13杂交瘤细胞株8C7；

5)杂交瘤细胞的保存：在液氮中保存；

6)单克隆抗体产生及提纯：在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹水，经常规方法提纯后分装待用；

所述的单克隆抗体纯化方法按天地人和公司提供的蛋白G亲和层析柱法纯化，具体如下：采用结合缓冲液按1∶5稀释腹水或抗血清，用2个柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A亲和层析柱，上样，用 5～6个柱体积的结合缓冲液洗柱，用5个柱体积的洗杂缓冲液洗柱，加入50μL的1M Tris进入1mL洗脱液，用1L PBS透析，2～ 8℃，48h，换液5次，收集抗体保存在-20℃。缓冲液配制：结合/ 洗杂缓冲液：0.15M NaCl，20mM Na₂HPO₄，pH 7.0。洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH 3.0。

实施例3

间接ELISA法确定抗原最适包被浓度。

1)抗原用包被缓冲液CBS(0.05mol碳酸盐缓冲液，pH 9.6)按1 μg/mL浓度，做连续1:2倍比稀释，每隔稀释度包被一行，100μL/ 孔加入酶标板中，覆膜封闭(防止水分挥发)4℃包被过夜。

2)次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，每孔加入150μL封闭液(含1％的BSA的包被缓冲液CBS)，室温2h以上。

用洗涤液PBST(含0.05％吐温-20的PBS，pH 7.4)分别从1:500开始做连续1:2倍稀释，加入100μL/孔,37℃孵育1h。

3)取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μL二抗工作液(用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记山羊抗小鼠IgG)，37℃孵育1h。

4)取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μL单组份TMB底物，室温孵育5～20min(根据颜色的改变速度确定合适的终止时间)。

5)每孔加入50μL终止液(0.5mol H₂SO₄)。

6)在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。

7)确定最适包被浓度。阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/ 其左孔OD值恰好为2倍并且OD值不低于1.2，且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。

8)以最适包被浓度将抗原按照以上方法包被到酶标板，后封闭将阴性血清依次倍比稀释，100μL加入到酶标板孔，然后依次加入HRP 标记山羊抗小鼠二抗、底物显色，读取OD值。

结果如图7所示，可见编号为A1、A2、A3和B2的小鼠OD值与阴性血清OD值比较显示，血清效价达到1x10⁵以上，冲击免疫后可以达到融合要求。

实施例4

免疫荧光实验检测本发明所提供的一种抗犬基质金属蛋白酶单克隆抗体与犬基质金属蛋白酶结合反应

(1)用PBS浸洗培养板3次，每次3min；

(3)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

(4)PBS浸洗培养板3次，每次3min，倒掉PBS，在培养板中滴加 5％BSA，室温封闭30min；

(5)倒掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量稀释好的实施例2制得的抗犬MMP-13单克隆抗体(1:1000倍稀释)，并放入湿盒4℃孵育过夜；

(6)加荧光二抗：PBST浸洗培养板3次，每次3min，在暗室中滴加稀释好的带FITC和CY3荧光标签的羊抗小鼠二抗，湿盒中20～37℃孵育1h，PBST浸洗培养板3次，每次3min；

(7)复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对细胞进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；

(8)荧光显微镜下观察并采集图像。

结果如图8所示，以Hela细胞株(MMP13表达阳性)作为阳性样本，二抗带有FITC绿色荧光，图片可见本发明所提供的抗犬MMP-13 单克隆抗体对比PBS组在细胞浆中有显著的代表阳性的绿色荧光。

结果如图9所示，检测幼犬原代软骨细胞，二抗带有CY3红色荧光，图片可见本发明所提供的抗犬MMP-13单克隆抗体对比PBS组在细胞浆中有较显著的代表阳性的红色荧光。

实施例5

免疫组织化学法验证本发明所提供的一种抗犬MMP-13单克隆抗体

切片，烤片60℃，1h；脱蜡及复水，依次二甲苯10min、100％乙醇5min、95％乙醇5min、90％乙醇5min、85％乙醇5min、 80％乙醇5min、75％乙醇5min、60％乙醇5min、50％乙醇5min、 30％乙醇5min、自来水1min和双氧水1min；1份30％H₂O₂加10 份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min。微波修复，将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力(98～100℃)加热至沸腾，冷却(约5～10min)，反复2次；将切片自然冷却至室温， PBS洗涤3次，每次5min；封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；滴加一抗为实施例2制得的抗犬MMP-13单克隆抗体(1:500稀释)，阴性对照使用鼠源抗组氨酸标签抗体代替PBS作为一抗，37℃， 1h；PBS洗涤3次，每次3min；滴加二抗，37℃，15-30min；PBS 洗涤3次，每次3min；滴加SABC，37℃，30min；PBS洗涤3次，每次5min；1mL蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间(约5min)；自来水冲洗干净，过蒸馏水；苏木素复染2min，自来水冲洗；依次脱水，即 30％乙醇3min、50％乙醇3min、70％乙醇3min、80％乙醇3min、 90％乙醇3min、95％乙醇3min、100％乙醇3min和二甲苯20min；树胶封片，镜检。

结果如图10所示，可在犬股骨远端外侧髁的软骨切片浅表层及中层细胞胞浆中观察到棕色阳性信号，且阴性对照使用鼠源抗组氨酸标签抗体代替PBS作为一抗，减少一抗非特异性染色的影响。该实验说明本发明制得的单抗与犬骨软骨中的基质金属蛋白酶具有较强的特异性反应。

实施例6

Western Blot免疫印迹实验检测本发明所提供的一种抗犬MMP-13单克隆抗体结合反应

取犬骨软骨病模型在第0、第1、第7、第30和第60天的血清和对照组血清进行10％SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到硝酸纤维素膜上。采用实施例2制得的抗犬MMP-13单克隆抗体为一抗，用酶标记兔抗鼠的lgG为二抗做免疫印迹实验，结果如图11所示，分别在第0、第1、第7、第30和第 60天的条带上52kD处显示MMP-13蛋白的特异性条带，在70kD处为血清的内参蛋白转铁蛋白transferrin，且展示了全骨软骨病模型不同时间点样品血清中MMP-13的变化。该实验说明本发明制得的单抗与犬基质金属蛋白酶具有较强的特异性反应。

上述实施例共同说明本发明制得的单抗能与基质金属蛋白酶发生特异性的结合反应，具有较高的特异性和足够的敏感度，本发明制备的单抗可用于犬类动物血液体样本中的MMP-13相对定量、犬软骨细胞的免疫荧光实验和病理组织切片的免疫组化鉴定，本发明制备的抗犬基质金属蛋白酶13单克隆抗体可以应用于犬骨软骨病的基础研究和早期临床诊断中，以便于提前采取防治措施，减慢或逆转疾病进程，降低经济损失，改善动物福利。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株及其制备方法和一种犬单克隆抗体及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 犬(Canis familiaris)

<400> 1

atgagtcacc actgcaggtc tataaaagta aaggtgcttg tctgggagag acagcaggct 60

ccaggcacaa ccaccaagat gctcccaggc atcctggctg ccttcctctg cttgagctgg 120

actcagtgct ggtccctgcc ccttcccagc gatggtgatg atgatctgtc tgaggaagac 180

ttccagcttg cagagcgcta cctgaaatcc tactactatc ccctgaatcc tgctggaatc 240

ctgaagaagt ctgcagcagg ctcagtggct gacaggcttc gagaaatgca gtccttcttc 300

ggcttagagg tcactggcaa acttgatgat aataccttgg acatcatgaa gaaaccaaga 360

tgtggggtcc ctgatgtggg cgagtacaat gttttccccc gaactctcaa gtggtccaaa 420

acgaacctaa cctacaggat tgtgaactat acccctgatc tgactcattc tgaagttgaa 480

aaggcattca aaaaagcttt caaagtttgg tcagatgtga cacctctgaa ttttaccaga 540

cttcatgacg gcactgcaga tatcatgatc tcttttggaa ctaaagagca tggggacttc 600

tatccatttg atggaccttc tggtcttctg gctcatgctt ttcctcctgg gccaaattat 660

ggaggagatg cccattttga tgatgatgaa acttggacaa gtagttccaa aggctacaac 720

ttgttccttg tcgctgccca tgagttcggc cactccttag gtcttgacca ctccaaggac 780

ccgggagcac tcatgtttcc catctacacc tacacgggca aaagccactt tatgcttccc 840

gatgatgatg tgcaagggat ccagtctctc tatggcccag gagatgaaga ccccaacccc 900

agacatccca aaacaccaga caaatgtgat ccctccttat cccttgatgc catcaccagc 960

ctccgaggag aaacaatgat ctttaaagac agattcttct ggcgattgca tcctcagcag 1020

gtggatgcgg agctgttttt aacaaaatcc ttttggccgg aacttcccaa ccgtatcgat 1080

gctgcatatg agcacccctc ccgcgacctt atcttcatct tcagaggcag aaaatattgg 1140

gctcttaatg gttatgacat tctggaaggt tatccccaaa aaatatctga actgggattt 1200

ccaaaagagg ttaagaagat aagtgcagct gttcactttg aggacacggg gaagacgctc 1260

ttcttctcgg gaaaccaggt ctggagctat gatgatacta accagatcat ggataaagac 1320

taccccaggc tgatagaaga ggacttccca gggattggtg ataaagtgga tgccgtctat 1380

gagaaaaacg gttatatcta ttttttcaat gggcccatcc agtttgagta taacatctgg 1440

agtaagcgga ttgtccgtgt catgccagca aactccctgt tgtggtgtta a 1491

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 犬(Canis familiaris)

<400> 2

Met Ser His His Cys Arg Ser Ile Lys Val Lys Val Leu Val Trp Glu

1 5 10 15

Arg Gln Gln Ala Pro Gly Thr Thr Thr Lys Met Leu Pro Gly Ile Leu

20 25 30

Ala Ala Phe Leu Cys Leu Ser Trp Thr Gln Cys Trp Ser Leu Pro Leu

35 40 45

Pro Ser Asp Gly Asp Asp Asp Leu Ser Glu Glu Asp Phe Gln Leu Ala

50 55 60

Glu Arg Tyr Leu Lys Ser Tyr Tyr Tyr Pro Leu Asn Pro Ala Gly Ile

65 70 75 80

Leu Lys Lys Ser Ala Ala Gly Ser Val Ala Asp Arg Leu Arg Glu Met

85 90 95

Gln Ser Phe Phe Gly Leu Glu Val Thr Gly Lys Leu Asp Asp Asn Thr

100 105 110

Leu Asp Ile Met Lys Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly Glu

115 120 125

Tyr Asn Val Phe Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Lys Thr Asn Leu Thr

130 135 140

Tyr Arg Ile Val Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Thr His Ser Glu Val Glu

145 150 155 160

Lys Ala Phe Lys Lys Ala Phe Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu

165 170 175

Asn Phe Thr Arg Leu His Asp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe

180 185 190

Gly Thr Lys Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Ser Gly

195 200 205

Leu Leu Ala His Ala Phe Pro Pro Gly Pro Asn Tyr Gly Gly Asp Ala

210 215 220

His Phe Asp Asp Asp Glu Thr Trp Thr Ser Ser Ser Lys Gly Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Phe Leu Val Ala Ala His Glu Phe Gly His Ser Leu Gly Leu Asp

245 250 255

His Ser Lys Asp Pro Gly Ala Leu Met Phe Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr

260 265 270

Gly Lys Ser His Phe Met Leu Pro Asp Asp Asp Val Gln Gly Ile Gln

275 280 285

Ser Leu Tyr Gly Pro Gly Asp Glu Asp Pro Asn Pro Arg His Pro Lys

290 295 300

Thr Pro Asp Lys Cys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Asp Ala Ile Thr Ser

305 310 315 320

Leu Arg Gly Glu Thr Met Ile Phe Lys Asp Arg Phe Phe Trp Arg Leu

325 330 335

His Pro Gln Gln Val Asp Ala Glu Leu Phe Leu Thr Lys Ser Phe Trp

340 345 350

Pro Glu Leu Pro Asn Arg Ile Asp Ala Ala Tyr Glu His Pro Ser Arg

355 360 365

Asp Leu Ile Phe Ile Phe Arg Gly Arg Lys Tyr Trp Ala Leu Asn Gly

370 375 380

Tyr Asp Ile Leu Glu Gly Tyr Pro Gln Lys Ile Ser Glu Leu Gly Phe

385 390 395 400

Pro Lys Glu Val Lys Lys Ile Ser Ala Ala Val His Phe Glu Asp Thr

405 410 415

Gly Lys Thr Leu Phe Phe Ser Gly Asn Gln Val Trp Ser Tyr Asp Asp

420 425 430

Thr Asn Gln Ile Met Asp Lys Asp Tyr Pro Arg Leu Ile Glu Glu Asp

435 440 445

Phe Pro Gly Ile Gly Asp Lys Val Asp Ala Val Tyr Glu Lys Asn Gly

450 455 460

Tyr Ile Tyr Phe Phe Asn Gly Pro Ile Gln Phe Glu Tyr Asn Ile Trp

465 470 475 480

Ser Lys Arg Ile Val Arg Val Met Pro Ala Asn Ser Leu Leu Trp Cys

485 490 495

Claims

1.一种抗犬基质金属蛋白酶的杂交瘤细胞株，其分类命名为抗犬MMP-13杂交瘤细胞株8C7，并于2019年 11月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:C2019290。

2.一种抗犬基质金属蛋白酶的单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株制得。