CN111485032B - 一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的snp引物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的SNP引物组合。本发明所提供的SNP引物组合由2个引物组组成；每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点；各个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示。该SNP引物组合可在黄瓜的种子或幼苗期进行早期鉴定，加快雌性系材料的筛选，并为黄瓜雌性系选育提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的SNP引物组合。
背景技术
黄瓜是我国重要的瓜类作物之一，占全国蔬菜栽培面积的6.2％。目前全国申请登记的黄瓜品种已达1607个，且93％以上为一代杂交种。黄瓜雌性系是只有雌花而无或少雄花的品系，在黄瓜杂交种配置和选育方面具有得天独厚的优势，可显著提高制种纯度并降低制种成本。但我国黄瓜种质资源大多缺乏雌性基因，国内现有的黄瓜雌性系材料多为从国外引进的欧洲加工型黄瓜，属于果实表面光滑少刺类型，不能直接用于华北密刺型黄瓜育种。因此，找到并利用与黄瓜雌性基因紧密连锁的分子标记，是加快我国黄瓜雌性系材料选育的一条有效途径。目前，随着黄瓜雌性基因的遗传定位研究，已开发了多个与黄瓜雌性基因相关的分子标记(王鹤冰，向华丰，张生，熊艳，张洪成(2015).中国黄瓜雌性系研究进展，中国农学通报，31(10)：92-96)，但这些分子标记未利用基因组变异组分析，且与黄瓜雌性基因的遗传距离较远，鉴定材料较少，无法大规模、高通量的鉴定黄瓜雌性系。
第三代分子标记SNP，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。随着高通量测序技术的发展和测序成本的不断降低，完成全基因组重测序的黄瓜材料越来越多；基于分析黄瓜变异组信息，可以挖掘更加稳定高效的SNP位点。采用等位基因竞争性特异PCR法，开发其特异性引物，可获得样本在SNP位点的基因型，目前已开始应用到黄瓜分子标记辅助育种。
发明内容
本发明的目的是鉴定黄瓜雌性系。
本发明首先保护SNP位点组合，可包括位于黄瓜基因组上的SNP12位点和/或SNP16位点；所述SNP12位点为6号染色体上的第24249840位核苷酸；所述SNP16位点为6号染色体上的第24254904位核苷酸。
所述SNP位点组合具体可由所述SNP12位点和所述SNP16位点组成。
本发明还保护SNP引物组合，可包括用于扩增所述SNP12位点的引物组1和/或用于扩增所述SNP16位点的引物组2。
所述SNP引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO：1所示的正向引物1F1、SEQ IDNO：2所示的正向引物1F2和SEQ ID NO：3所示的反向引物1R组成。所述引物组2可由SEQ IDNO：4所示的正向引物2F1、SEQ ID NO：5所示的正向引物2F2和SEQ ID NO：6所示的反向引物2R组成。
所述SNP引物组合中，所述引物组1可由SEQ ID NO：1自5’末端起第22至49位所示的正向引物1F1、SEQ ID NO：2自5’末端起第22至49位所示的正向引物1F2和SEQ ID NO：3所示的反向引物1R组成。所述引物组2可由SEQ ID NO：4自5’末端起第22至49位所示的正向引物2F1、SEQ ID NO：5自5’末端起第22至46位所示的正向引物2F2和SEQ ID NO：6所示的反向引物2R组成。
上述任一所述引物组中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。
上述任一所述SNP引物组合具体可由所述引物组1和所述引物组2组成。
上文中，SEQ ID NO：1自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即FAM荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。SEQ ID NO：2自5′末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即HEX荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。
本发明还保护上述任一所述SNP位点组合或上述任一所述SNP引物组合的应用，可为x1)或x2)：
x1)制备用于鉴定黄瓜雌性系的试剂盒；
x2)鉴定黄瓜雌性系。
含有上述任一所述SNP引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。
所述试剂盒在鉴定黄瓜雌性系中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种鉴定待测黄瓜是否为或疑似为雌性系的方法，可包括如下步骤：检测待测黄瓜基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测黄瓜基于SNP12位点的基因型为AA纯合型和/或基于SNP16位点的基因型为AA纯合型，则待测黄瓜为或疑似为雌性系；如果待测黄瓜基于SNP12位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP16位点的基因型为GG纯合型，则待测黄瓜为或疑似为普通系。
上述方法中，所述检测待测黄瓜基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型的方法可如下：
(a1)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(a2)完成步骤(a1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型。
上述方法中，所述检测待测黄瓜基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型的方法可如下：
(b1)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述SNP引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(b2)取步骤(b1)得到的PCR扩增产物，测序；
(b3)根据步骤(b2)得到的测序结果，获得待测黄瓜基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型。
上述任一所述的方法中，“分别采用上述任一所述SNP引物组合中的引物组进行PCR扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touchdown程序，每循环降低0.6℃)1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
需要说明的是，检测基于所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型，如果基因型为杂合型或缺失，则不可用于结果判定。
上述任一所述待测黄瓜可为1181迷你黄瓜分离后代、50011迷你黄瓜分离后代、50036华南型黄瓜分离后代、50038华南型黄瓜分离后代、50039华南型黄瓜分离后代、G31迷你黄瓜分离后代、G32迷你黄瓜分离后代、I11迷你黄瓜分离后代、G54H561欧亚杂交后代纯化的、G54H562欧亚杂交后代纯化的、G54H56JY364欧亚杂交后代纯化的、06W1欧亚杂交后代纯化的、MNK1欧洲迷你黄瓜后代、MNK2欧洲迷你黄瓜后代、MNK3欧洲迷你黄瓜后代、MNK4欧洲迷你黄瓜后代、MNK5欧洲迷你黄瓜后代、MNK6欧洲迷你黄瓜后代、MNK7欧洲迷你黄瓜后代、N29欧洲迷你黄瓜后代、MLXX1华南型黄瓜后代、MLXX2华南型黄瓜后代、7WK1华南型黄瓜后代、7WK2华南型黄瓜后代、7WK3华南型黄瓜后代、7WK4华南型黄瓜后代、7WK5华南型黄瓜后代、7WK6华南型黄瓜后代、7WK7华南型黄瓜后代、SXLQ华南型黄瓜后代、7WK8华南型黄瓜后代、7WK9华南型黄瓜后代、XWX3华南类型黄瓜后代、QXMN1欧洲迷你黄瓜后代、QXMN2欧洲迷你黄瓜后代、2XWX2华南型黄瓜后代、6XWX华南型黄瓜后代、HY51华南型黄瓜后代、XWX5华南类型黄瓜后代、HY54华南型黄瓜后代、HY55华南型黄瓜后代、HY56华南型黄瓜后代、HY57华南型黄瓜后代、HY58华南型黄瓜后代、HY59华南型黄瓜后代、HY510华南型黄瓜后代、HY511华南型黄瓜后代、HY512华南型黄瓜后代、HY513华南型黄瓜后代、HY514华南型黄瓜后代、HY515华南型黄瓜后代、HY518华南型黄瓜后代、HY519华南型黄瓜后代、HY521华南型黄瓜后代、HY522华南型黄瓜后代、HY523华南型黄瓜后代、HY524华南型黄瓜后代、HY525华南型黄瓜后代、HY526华南型黄瓜后代、HY527华南型黄瓜后代、HY529华南型黄瓜后代、HY530华南型黄瓜后代、HY531华南型黄瓜后代、HK61华南型黄瓜后代、HK62华南型黄瓜后代、HK63华南型黄瓜后代、HK64华南型黄瓜后代、HK7华南型黄瓜后代、TZ6华南类型黄瓜后代、HY528华南型黄瓜后代、50031华南型黄瓜分离后代、50032华南型黄瓜分离后代、50035华南型黄瓜分离后代、DNLL1华南型黄瓜分离后代、DNLL2华南型黄瓜分离后代、DNLL5华南型黄瓜分离后代、G54H56JY363欧亚杂交后代纯化的、244856G1欧亚杂交后代纯化的、LY11华南型黄瓜后代、LY12华南型黄瓜后代、DZ1华南型黄瓜后代、DZ2华南型黄瓜后代、GMQJ华南型黄瓜后代、2XWX1华南型黄瓜后代、7XWX华南型黄瓜后代、HY4华南型黄瓜后代、JP日本类型黄瓜分离纯化、50033华南型黄瓜分离后代、CM-5欧洲、CM-71欧洲、CM-72欧洲、DNLL4华南型黄瓜分离后代、244856G2欧亚杂交后代纯化的、10-31华北密刺品种分离纯化的、XW1华北型黄瓜后代、FS13华北型黄瓜分离纯化、FS14华北型黄瓜分离纯化、FS15华北型黄瓜分离纯化、FS16华北型黄瓜分离纯化、FS17华北型黄瓜分离纯化、FS112华北型黄瓜分离纯化、K31华北型黄瓜分离纯化、LDXX2华北型黄瓜分离纯化、LDXX3华北型黄瓜分离纯化、LDXX4华北型黄瓜分离纯化、LDXX5华北型黄瓜分离纯化、LY41华北型黄瓜分离纯化、LY43华北型黄瓜分离纯化、LY31华南类型、LY32华南类型、LY33华南类型、LY34华南类型、LY35华南类型、LY36华南类型、LY37华南类型、YNLS1华北型黄瓜后代、YNLS2华北型黄瓜后代、YNLS4华北型黄瓜后代、JYCQL1华北型黄瓜后代、JYCQL2华北型黄瓜后代、JYCQL3华北型黄瓜后代、JYCQL4华北型黄瓜后代、JYXM1华北型黄瓜后代、JYXM2华北型黄瓜后代、JYXM3华北型黄瓜后代、JYXM4华北型黄瓜后代、CHHML1华北型黄瓜后代、CHHML2华北型黄瓜后代、1181华北型黄瓜后代、1182华北型黄瓜后代、1183华北型黄瓜后代、55B欧亚杂交后代纯化、LY44华北型黄瓜分离纯化、LY44华北型黄瓜分离纯化、FS11华北型黄瓜分离纯化、FS13华北型黄瓜分离纯化、FS14华北型黄瓜分离纯化、FS15华北型黄瓜分离纯化、FS16华北型黄瓜分离纯化、FS17华北型黄瓜分离纯化、FS18华北型黄瓜分离纯化、FS18华北型黄瓜分离纯化、FS19华北型黄瓜分离纯化、FS19华北型黄瓜分离纯化、LDXX1华北型黄瓜分离纯化、LDXX1华北型黄瓜分离纯化、FS110华北型黄瓜分离纯化、FS110华北型黄瓜分离纯化、FS111华北型黄瓜分离纯化、FS111华北型黄瓜分离纯化、FS112华北型黄瓜分离纯化、JS4华北型黄瓜分离纯化、JS4华北型黄瓜分离纯化、K31华北型黄瓜分离纯化、K32华北型黄瓜分离纯化、N20华北型黄瓜分离纯化、FS13华北型黄瓜分离纯化、LDXX2华北型黄瓜分离纯化、FS14华北型黄瓜分离纯化、LDXX3华北型黄瓜分离纯化、LDXX4华北型黄瓜分离纯化、LDXX5华北型黄瓜分离纯化、LY41华北型黄瓜分离纯化、LY42华北型黄瓜分离纯化、LY42华北型黄瓜分离纯化、LY43华北型黄瓜分离纯化、68210温室密刺品种分离纯化的、MY1华南类型、MY2华南类型、248华南类型、68213温室密刺品种分离纯化的、68214温室密刺品种分离纯化的、68215温室密刺品种分离纯化的、W351华北密刺品种分离纯化的、W352华北密刺品种分离纯化的、W353华北密刺品种分离纯化的、W354华北密刺品种分离纯化的、6822温室密刺品种分离纯化的、W355华北密刺品种分离纯化的、W356华北密刺品种分离纯化的、W357华北密刺品种分离纯化的、W358华北密刺品种分离纯化的、W359华北密刺品种分离纯化的、W3510华北密刺品种分离纯化的、W3511华北密刺品种分离纯化的、W3512华北密刺品种分离纯化的、W3513华北密刺品种分离纯化的、W3514华北密刺品种分离纯化的、6823温室密刺品种分离纯化的、W3515华北密刺品种分离纯化的、W3516华北密刺品种分离纯化的、W3517华北密刺品种分离纯化的、W3518华北密刺品种分离纯化的、Q81华北密刺品种分离纯化的、Q82华北密刺品种分离纯化的、Q83华北密刺品种分离纯化的、Q84华北密刺品种分离纯化的、Q86华北密刺品种分离纯化的、6824温室密刺品种分离纯化的、Q87华北密刺品种分离纯化的、Q88华北密刺品种分离纯化的、Q89华北密刺品种分离纯化的、Q8910华北密刺品种分离纯化的、Q8911华北密刺品种分离纯化的、Q8912华北密刺品种分离纯化的、Q8913华北密刺品种分离纯化的、Q8914华北密刺品种分离纯化的、Q8915华北密刺品种分离纯化的、6825温室密刺品种分离纯化的、10-32华北密刺品种分离纯化的、6826温室密刺品种分离纯化的、06W2欧亚杂交后代纯化的、06W3欧亚杂交后代纯化的、06W4欧亚杂交后代纯化的、06W5欧亚杂交后代纯化的、06W6欧亚杂交后代纯化的、06W7欧亚杂交后代纯化的、6827温室密刺品种分离纯化的、06W8欧亚杂交后代纯化的、N261华北密刺品种后代、N262华北密刺品种后代、N263华北密刺品种后代、6828温室密刺品种分离纯化的、305-11华北密刺品种后代、36-31华北密刺品种后代、36-32华北密刺品种后代、36-9华北密刺品种后代、36-131华北密刺品种后代、36-132华北密刺品种后代、XLV31华南类型、TC1006华南型黄瓜后代、XW2华北型黄瓜后代、XW3华北型黄瓜后代、XW4华北型黄瓜后代、CYZH1华北型黄瓜后代、CYZH2华北型黄瓜后代、CY1061华北型黄瓜后代、CY1062华北型黄瓜后代、CY1063华北型黄瓜后代、CY1064华北型黄瓜后代、ZQG2华南型黄瓜后代、CY1065华北型黄瓜后代、CY1066华北型黄瓜后代、CY1067华北型黄瓜后代、CY1068华北型黄瓜后代、CY1069华北型黄瓜后代、CYXSJ华北型黄瓜后代、CY3353华北型黄瓜后代、MS368华北型黄瓜后代、BY华北型黄瓜后代、SCBY华北型黄瓜后代、N181华北型黄瓜后代、N182华北型黄瓜后代、N183华北型黄瓜后代、N184华北型黄瓜后代、N185华北型黄瓜后代、SHQ9711华南型黄瓜后代、N186华北型黄瓜后代、N187华北型黄瓜后代、XX1华北型黄瓜后代、XX2华北型黄瓜后代、SX3031华北型黄瓜后代、SX3032华北型黄瓜后代、XX3华北型黄瓜后代、SX3151华北型黄瓜后代、SX3152华北型黄瓜后代、SHQ9712华南型黄瓜后代、JWJM2华南型黄瓜后代、JW6151华北型黄瓜后代、JW6152华北型黄瓜后代、JW6153华北型黄瓜后代、JW6154华北型黄瓜后代、JW6155华北型黄瓜后代、JW6156华北型黄瓜后代、JW6157华北型黄瓜后代、ZY3061华北型黄瓜后代、SHQ9713华南型黄瓜后代、ZY3062华北型黄瓜后代、ZY3063华北型黄瓜后代、ZY3064华北型黄瓜后代、XL华北型黄瓜后代、HG1311华北型黄瓜后代、LH1华北型黄瓜后代、LH51华北型黄瓜后代、LH52华北型黄瓜后代、LH53华北型黄瓜后代、LH54华北型黄瓜后代、XY6华北型黄瓜后代、LH55华北型黄瓜后代、LH56华北型黄瓜后代、LH57华北型黄瓜后代、LH59华北型黄瓜后代、LH81华北型黄瓜后代、LH82华北型黄瓜后代、LH83华北型黄瓜后代、LH84华北型黄瓜后代、HG1日本华南型黄瓜后代、LH85华北型黄瓜后代、LH10华北型黄瓜后代、LH11华北型黄瓜后代、LH121华北型黄瓜后代、LH122华北型黄瓜后代、LH123华北型黄瓜后代、HG2日本华南型黄瓜后代、QD206华北露地型黄瓜后代、Y11华南型黄瓜后代、Y12华南型黄瓜后代、Y13华南型黄瓜后代、JY6华北型黄瓜后代、BQ2231华北型黄瓜后代、BQ2232华北型黄瓜后代、CQDF华北型黄瓜后代、YNLS华北型黄瓜后代、LY1华南型黄瓜后代、LY2华南型黄瓜后代、ZHLG华北型黄瓜后代、LYLJ1华北型黄瓜后代、LYLJ2华北型黄瓜后代、LH1华北型黄瓜后代、LH2华北型黄瓜后代、JYCQL1华北型黄瓜后代、JYCQL2华北型黄瓜后代、JYCQL3华北型黄瓜后代、JYCQL4华北型黄瓜后代、JYCQL5华北型黄瓜后代、JYCQL6华北型黄瓜后代、JYCQL7华北型黄瓜后代、JYCQL8华北型黄瓜后代、TC1001华南型黄瓜后代、TC1002华南型黄瓜后代、华北密刺品种后代、TW1华北密刺品种后代、TW3华北密刺品种后代、TW4华北密刺品种后代、TW6华北密刺品种后代、TW7华北密刺品种后代、TW8华北密刺品种后代、382华北密刺品种后代、TW10华北密刺品种后代、TW11华北密刺品种后代、TW13华北密刺品种后代、TW14华北密刺品种后代、TW15华北密刺品种后代、HG122华北密刺品种后代、DF3华北密刺品种后代、JP日本类型黄瓜分离纯化、TZ51华南类型黄瓜后代、TZ52华南类型黄瓜后代、YNLS3华北型黄瓜后代、JWJM1华南型黄瓜后代、LH58华北型黄瓜后代、LH510华北型黄瓜后代、LH13华北型黄瓜后代或LH3华北型黄瓜后代。即实施例中表3编号为C12、D110、D111、N6、D114、N75、C1的黄瓜品系以外的所有黄瓜品系。
本发明提供的SNP引物组合可在黄瓜的种子或幼苗期进行早期鉴定，加快雌性系材料的筛选，并为黄瓜雌性系选育提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为15个SNP位点与20份重测序材料雌性系表型的关联分析结果。
图2为96个供试黄瓜品系采用引物组1的SNP分型结果。
图3为96个供试黄瓜品系采用引物组2的SNP分型结果。
图4为12个待测黄瓜品系采用引物组1的SNP分型结果。
图5为12个待测黄瓜品系采用引物组2的SNP分型结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于鉴定黄瓜雌性系的SNP引物组合的获得
一、15个SNP位点的发现
本发明基于20份黄瓜代表资源的重测序数据，获得15个SNP位点。这20份黄瓜资源包含10份全雌性黄瓜和10份普通黄瓜，基本包括了加工型、欧洲水果型、华北型、华南型和西双版纳型等黄瓜主要的生态类型，尽可能多地体现了种质代表性。具体的，SNP位点的筛选标准如下：在第6号染色体ACC合酶基因(Csa6G496450)附近30kb区间内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、MAF>0.3且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SNP)的SNP位点。
15个SNP位点的基本信息详见表1(华北型黄瓜9930属于普通系，黄瓜Gy14为全雌性系)。其中SNP位点在染色体上的位置是基于华北型黄瓜9930参考基因组序列比对确定的，所述华北型黄瓜9930参考基因组序列的版本号为V2(下载地址为：http://cucurbitgenomics.org/organism/2)。
表1.15个SNP位点的基本信息
二、用于鉴定黄瓜雌性系的SNP引物组合的获得
1、基于步骤一发现的15个SNP位点，本发明的发明人利用20份重测序黄瓜的SNP位点的基因型和全雌性表型进行关联分析。根据关联分析结果，获得2个与全雌性性状具有较高连锁度的SNP位点，分别为SNP12和SNP16。
关联分析结果见图1。
2、完成步骤1后，本发明的发明人基于SNP12和SNP16开发了用于鉴定黄瓜雌性系的SNP引物组合。
SNP引物组合由2个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。2个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。
表2.用于鉴定黄瓜雌性系的SNP引物组合
注：单下划线为FAM荧光标签序列，双下划线为HEX荧光标签序列。
实施例2、实施例1开发的SNP引物组合的有效性检验
本实施例中的361个供试黄瓜品系的基本信息见表3中第1至4列。361个供试黄瓜品系均为常见的优良品系。根据表型，93个供试黄瓜品系为雌性系，268个供试黄瓜品系为普通系。
表3
注：NA表示基因型为缺失。
1、供试黄瓜品系的基因组DNA的获得
采用CTAB法分别提取361个供试黄瓜品系的叶片(混取10粒种子的真叶)的基因组DNA，得到供试黄瓜品系的基因组DNA。
供试黄瓜品系的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试黄瓜品系的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。
2、分别以361个供试黄瓜品系的基因组DNA为模板，分别采用2个引物组进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
3、完成步骤2后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断361个供试黄瓜品系基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试黄瓜品系基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试黄瓜品系基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜品系基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试黄瓜品系基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜品系基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试黄瓜品系基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
引物组1的部分结果见图2。统计结果见表3中第5列。
引物组2的部分结果见图3。统计结果见表3中第6列。
结果表明，2个引物组在361个供试黄瓜品系中基本可以得到很好的分型效果，且分型结果高度一致。
4、两个引物对鉴定361个供试黄瓜品系是否为雌性系的效率评价
(1)统计361个供试黄瓜品系基于SNP12的基因型。
结果表明，基于SNP12基因型为AA纯合型的供试黄瓜品系为97个，判定为雌性系；其中93个品系表型为雌性系，4个品系表型为普通系，一致性为95.88％(93/97×100％＝95.88％)。基于SNP12基因型为TT纯合型的供试黄瓜品系为261个，判定为普通系；261个品系表型均为普通系，一致性为100％(261/261×100％＝100％)。
(2)统计361个供试黄瓜品系基于SNP16的基因型。
结果表明，基于SNP16基因型为AA纯合型的供试黄瓜品系为92个，判定为雌性系；其中87个品系表型为雌性系，5个品系表型为普通系，一致性为94.57％(87/92×100％＝94.57％)。基于SNP16基因型为GG纯合型的供试黄瓜品系为258个，判定为普通系；258个品系表型均为普通系，一致性为100％(258/258×100％＝100％)。
(3)基于SNP12基因型为AA纯合型且基于SNP16基因型为AA纯合型的供试黄瓜品系为91个；其中87个品系表型为雌性系，4个品系表型为普通系，一致性为95.60％(87/91×100％＝95.60％)。基于SNP12基因型为TT纯合型且基于SNP16基因型为GG纯合型的供试黄瓜品系为253个，253个品系表型均为普通系，一致性为100％(253/253×100％＝100％)。
由此可见，实施例1开发的SNP引物组合可以鉴定黄瓜雌性系。
实施例3、采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测黄瓜品系是否为雌性系
待测黄瓜品系为待测黄瓜品系1至待测黄瓜品系12。
1、采用实施例1开发的SNP引物组合检测待测黄瓜品系是否为雌性系
(1)待测黄瓜品系的基因组DNA的获得
种植待测黄瓜品系的种子，得到幼苗；取待测黄瓜品系的叶片或根，采用CTAB法分别提取基因组DNA，获得待测黄瓜品系的基因组DNA。
(2)以待测黄瓜品系的基因组DNA为模板，分别采用引物组1和引物对2进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度比为2:2:5。
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
(3)完成步骤(2)后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色，进行如下判断：如果供试黄瓜品系基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试黄瓜品系基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试黄瓜品系基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供试黄瓜品系基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型。
12个待测黄瓜品系采用引物组1的SNP分型结果见图4。
12个待测黄瓜品系采用引物组2的SNP分型结果见图5。
统计结果见表4中第2-3列。基于SNP12基因型为TT纯合型的供试黄瓜品系和/或基于SNP16基因型为GG纯合型的供试黄瓜品系判定为普通系。基于SNP12基因型为AA纯合型的供试黄瓜品系和/或基于SNP16基因型为AA纯合型的供试黄瓜品系判定为雌性系。
表4.12个待测黄瓜品系的雌性系鉴定
| 待测黄瓜品系 | 基于SNP12的基因型 | 基于SNP16的基因型 | 是否为雌性系表型 |
| 待测黄瓜品系1 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系2 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系3 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系4 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系5 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系6 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
| 待测黄瓜品系7 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
| 待测黄瓜品系8 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
| 待测黄瓜品系9 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
| 待测黄瓜品系10 | TT纯合型 | GG纯合型 | 否 |
| 待测黄瓜品系11 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
| 待测黄瓜品系12 | AA纯合型 | AA纯合型 | 是 |
2、根据表型，判断待测黄瓜品系是否为雌性系。
统计结果见表3中第4列。
结果表明，实施例1开发的SNP引物组合鉴定黄瓜雌性系的结果和表型鉴定结果完全一致。由此可见，基于实施例1开发的SNP引物组合可以鉴定待测黄瓜品系是否为雌性系。
<110>北京市农林科学院
<120>一种鉴定黄瓜雌性系的方法及其使用的SNP引物组合
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgattgtgac cactaataat cgcatttaa 49
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tgattgtgac cactaataat cgcatttat 49
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgtttttgt tcattagttg attgacaatt gagatt 36
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tattaaagct cctctatatc tatgcctta 49
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat taaagctcct ctatatctat gccttg 46
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
cttgtgttga agtgtcgtgg cttca 25
Claims (9)
1.SNP引物组合，由用于扩增SNP12位点的引物组1和用于扩增SNP16位点的引物组2组成；所述SNP12位点和所述SNP16位点为黄瓜基因组上的SNP位点；
所述SNP12位点为6号染色体上的第24249840位核苷酸；
所述SNP16位点为6号染色体上的第24254904位核苷酸；
其中SNP位点在染色体上的位置是基于华北型黄瓜9930参考基因组序列比对确定的；所述华北型黄瓜9930参考基因组序列的版本号为V2。
2.如权利要求1所述的SNP引物组合，其特征在于：
所述引物组1由SEQ ID NO：1所示的正向引物1F1、SEQ ID NO：2所示的正向引物1F2和SEQ ID NO：3所示的反向引物1R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO：4所示的正向引物2F1、SEQ ID NO：5所示的正向引物2F2和SEQ ID NO：6所示的反向引物2R组成。
3.如权利要求1所述的SNP引物组合，其特征在于：
所述引物组1由SEQ ID NO：1自5’末端起第22至49位所示的正向引物1F1、SEQ ID NO：2自5’末端起第22至49位所示的正向引物1F2和SEQ ID NO：3所示的反向引物1R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO：4自5’末端起第22至49位所示的正向引物2F1、SEQ ID NO：5自5’末端起第22至46位所示的正向引物2F2和SEQ ID NO：6所示的反向引物2R组成。
4.权利要求1至3任一所述SNP引物组合的应用，为x1）或x2）：
x1）制备用于鉴定黄瓜雌性系的试剂盒；
x2）鉴定黄瓜雌性系。
5.含有权利要求1至3任一所述SNP引物组合的试剂盒。
6.权利要求5所述试剂盒在鉴定黄瓜雌性系中的应用。
7.一种鉴定待测黄瓜是否为或疑似为雌性系的方法，包括如下步骤：检测待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型，然后进行如下判断：如果待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型为AA纯合型和/或基于权利要求1中所述SNP16位点的基因型为AA纯合型，则待测黄瓜为或疑似为雌性系；如果待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型为TT纯合型和/或基于权利要求1中所述SNP16位点的基因型为GG纯合型，则待测黄瓜为或疑似为普通系。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型的方法如下：
（a1）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述SNP引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（a2）完成步骤（a1）后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型的方法如下：
（b1）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，分别采用权利要求3所述SNP引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（b2）取步骤（b1）得到的PCR扩增产物，测序；
（b3）根据步骤（b2）得到的测序结果，获得待测黄瓜基于权利要求1中所述SNP12位点的基因型和/或所述SNP16位点的基因型。
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