CN110628737A - 一个调控黄瓜矮化性状相关基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个调控黄瓜矮化性状的相关基因及其编码蛋白，该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，CsDHCR7基因编码7‑脱氢胆固醇还原酶，属于ERG4/ERG24家族，与BR合成前体‑‑甾醇的合成有关；该蛋白的编码序列如序列表SEQ ID NO：1所示的碱基序列，该碱基在第2375位的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代，突变碱基位于第六个内含子剪切位点处，导致终止密码子提前，蛋白短截。该蛋白结构功能紊乱，导致甾醇合成过程异常，使植株表现矮化，节间缩短，叶色深绿且叶片皱缩，无侧枝分生，雌花不育等突变性状。该基因及其蛋白的发现，可以为黄瓜株型的遗传改良及BR复杂的合成网络的机制研究提供研究基础。

Description

一个调控黄瓜矮化性状相关基因及其应用

技术领域

发明涉及基因工程和分子生物学，属于分子遗传育种领域，具体涉及到一种调控黄瓜矮化性状相关蛋白编码基因的应用。

技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.2n＝2x＝14)属葫芦科甜瓜属典型的一年生蔓生草本植物，是世界上主要的蔬菜作物之一。随着分子生物学和基因组学的飞速发展，通过基因工程技术对作物进行遗传改良已成为提高作物产量的有效途径。突变体材料是研究基因功能最直接有效的手段之一。在用EMS构建的黄瓜突变体库中，发现一个可稳定遗传的单基因控制的矮化突变体。突变体表现为株型紧凑，下胚轴及节间长度缩短，株高显著降低，同时伴随着叶片皱缩叶色深绿，雌花不育等表型。株型是影响作物栽培方式及光合效率的关键因素，研究株型调控基因对于解析植物的形态建成、提高作物产量至关重要。葫芦科物种株型相关性状的遗传研究还处在初级阶段，株型主要研究集中在改良蔬菜作物株高上，目前在甜瓜，西瓜，南瓜等作物种均有矮生基因的生理遗传分析以及定位克隆等方面的研究。黄瓜中目前也已经报道了与4类株型相关基因，分别为控制有限生长的基因de(Hutchins，1940)，矮化基因cp(Li et al.，2011)，侧枝抑制基因CLS(Yuan et al.，2010)以及控制下胚轴的基因SH1(Bo et al.，2016)，然而现有的这几种株型基因的遗传分析和定位研究远未能达到黄瓜理想株型选育的要求，因此，挖掘、鉴定控制黄瓜株型的新基因，开展定位克隆和相关机理方面的研究，实现对黄瓜株型相关性状的定向改良，具有十分重要的理论和实践作用。随着新一代测序技术的发展，利用改进的MutMap法对矮化突变体和野生型F₂代群体进行混池测序，结合EMS诱变原则(G →A，C→T)以及ΔSNP指数≥0.9，功能注释，获得了一个SNP，SNP7G18016936，位于基因Csa7G447780.1的第6个外显子与第6个内含子的剪切位点发生了G到A的突变，引起编码蛋白保守结构域的氨基酸序列发生改变，最终确定调控黄瓜矮化突变体的基因为 Csa7G447780，命名为CsDHCR7。

株高是株型的重要组成部分，对于植株管理及产量具有重要的作用。大量报道表明株高受到体内遗传机制和体外环境的双重调节。植物激素如生长素(IAA)、赤霉素(GA)参与植株整个生长发育过程，或独立或相互作用对植株起调控作用。油菜素类固醇(BR)作为一种新兴的植物激素，也能调节植物生长发育的许多不同方面，如刺激细胞伸长和分裂，参与维管组织的分化，植物性器官发育和应激反应等多种方面。近来，有许多涉及BR生物合成和信号传到中存在缺陷的突变体材料表现出异常的表型，如矮化，育性降低，维管系统发育异常等。有证据表明7-脱氢胆固醇还原酶是通过影响24-亚甲基胆甾醇合成进而影响BR的合成从而引起BR合成缺陷从而导致矮化表型的出现。

该基因编码7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)又称甾醇Δ⁷还原酶(S7R)，属于ERG4/ERG24 家族。DHCR7参与24-亚甲基胆甾醇的合成，是油菜素甾醇的合成前体油菜烷醇合成途径的重要成分。甾醇是植物合成BR的前体，经过BR特异性途径进行修饰，以产生最终产物BL 及其同源物。已有研究表明DHCR7功能丧失，会导致儿童患Smith-Lemli-Opitz综合征，表现为智力发育迟缓及多种器官发育畸形(Smith et al.，1964)，拟南芥相应蛋白甾醇Δ7还原酶 (S7R)的功能缺失型突变体表现出株高变矮，节间变短，叶片变圆且叶色深绿，花絮数量增加等表型(Choe et al.，2010)。而本研究中突变体也涉及株型矮化及多种器官发育异常等现象。这对我们进一步对黄瓜进行株型改良提供重要的理论依据。

发明内容

(一)技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种调控黄瓜矮化性状相关蛋白及其编码基因的应用。7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)，属于ERG4/ERG24家族，在蛋白短截的情况下，突变体造成BR合成前体甾醇合成异常，表现出植株矮化，叶片皱缩，无侧枝分生，雌花不育等表型。可以为黄瓜株型改良和BR复杂合成网络的深入研究创造条件。

(二)技术方案

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：定位到一个黄瓜矮化性状相关蛋白，命名为CsDHCR7，来源于黄瓜，CsDHCR7是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中经过剪切位点氨基酸序列的的替换导致氨基酸序列短截且与黄瓜矮化突变相关的由a)衍生的蛋白质。

氨基酸序列由435个氨基酸残基组成，属于ERG4/ERG24家族，调控甾醇的合成，进而影响BR的合成，突变体表现出植株矮化，叶片深绿，雌花不育无侧枝发育等表型。上述b)中的CsDHCR7可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的CsDHCR7的编码基因可以通过将序列表中SEQ ID NO：1所示的CDS序列中进行一个碱基对的非同义突变。

编码所述CsDHCR7的基因也属于本发明的保护范围。

CsDHCR7基因具体可分为1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的CDS序列：

2)在严格条件下可与序列表SEQ ID NO：1限定的DNA序列杂交且编码上述于黄瓜矮化性状相关蛋白的DNA分子。

3)与1)的基因由90％以上的同源性，且编码上述与黄瓜矮化性相关蛋白的DNA分子。

序列由1308个碱基组成，自5`端第1-3位为起始密码子，编码具有序列表中SEQ IDNO：2 所示的氨基酸残基序列的蛋白，该氨基酸蛋白为7-脱氢胆固醇还原酶，具有12个外显子和 11个内含子。碱基序列第2375位由原本的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代，突变碱基位于第六个内含子剪切位点处，导致终止密码子提前，蛋白短截。

含有CsDHCR7基因的重组载体，转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

(三)有益效果

本发明的优点在于改进的Mutmap的方法定位调控黄瓜矮化突变体的基因，发现一种调控黄瓜株高相关蛋白及其编码基因，该蛋白的氨基酸序列如序列表2所示，属于ERG4/ERG24 家族，与甾醇的合成有关；该单边编码基因序列表如SEQ ID NO：1所示的碱基序列，该基因序列在2375位鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代，由于处于剪切位点处。导致编码蛋白短截，该蛋白结构功能紊乱，导致甾醇合成过程异常，表现植株矮化，节间缩短，叶色深绿且叶片皱缩，无侧枝分生，雌花不育等。该基因及其蛋白的发现，可以为黄瓜株型改良及BR复杂的合成网络的机制研究提供基础。

附图说明

黄瓜矮化突变体与野生型表型对比图。图1为矮化突变体苗期田间表型图，表现典型的矮化，叶片皱缩且叶色深绿。图2为子叶期突变体与野生型表型比对，图中突变体下胚轴变短。图3为雄花比对图，突变体的雄花比野生型变小。图4为初花期黄瓜矮化突变体和野生型表型比对图。图2-4中左边为野生型，右边为突变体。

具体实施方式

以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1突变体的表型及遗传分析

从诱变的长春密刺突变体库中筛选到一个黄瓜矮化突变体。该突变体发育初期就表现出矮化，节间缩短，叶色深绿且叶片皱缩，雌花不育等表型。

以突变体scp-3为父本，与野生型长春密刺杂交，获得子一代F₁植株，所有后代均具有野生型表型。由于纯合的突变体植物是雌性不育，因此统计来自突变体和野生型之间杂交的F₂代的野生型植物或和突变型植物，在含有107株植物的F2群体中，有82可表现出野生型表型，25棵表现出矮化表型，分离比符合孟德尔遗传3∶1(χ²＝0.078＜χ² _0.05.1＝3.84)，表明该体是由单个隐性基因调控的，命名该基因为CsDHCR7。

实施例2 CsDHCR7基因的定位

1利用改进的Mutmap进行基因预测

按常规方法-CTAB法提取亲本，F₁及全部F₂分离群体的叶片总DNA。利用群体分离法(BSA)从F₂分离群体中分别随机选取矮化突变单株和野生型单株个体各22株，建立矮化池(D)和野生池(W)的基因池。采用Illumine HiSEQ 2500测序平台对双亲及两混池进行全基因组重测序。去除低质量测序reads后，利用BWA和SAMtools软件将测序数据比对黄瓜参考基因组(‘Chinese Long’参考基因组v2)进行SNP指数计算。使用1Mb大小的窗口进行滑窗分析，每次步移100Kb，以窗口为横坐标，SNP-index为纵坐标，可以得到SNP-index 在基因组上的分布曲线。并对所有染色体的SNP-index进行绘图，同时画出两个极端池在同一染色体同一窗口的ΔSNP-index绝对值在染色体上的分布，ΔSNP-index绝对值越大，表示与性状连锁的可能性也越大，同时作出置信区间为90％的阈值线，超过阈值线视为差异显著，认为是候选区域。结合SNP-index曲线与卡方分布的结果，得到潜在的候选SNP位点，结合 EMS诱变G→A，C→T偏好性，筛选出位于基因外显子或者剪切位点处，发生非同义突变得位点，得到该SNP(7G18016936)，是一个发生在剪切位点处的非同义突变，原本的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代，导致终止密码子提前出现，该蛋白编码异常，从而确定了导致突变的候选基因CsDHCR7。

2基因共分离验证

利用遗传学方法进一步缩小目的基因的范围，具体方法为：利用步骤1中筛选出来的SNP 位点设计SNP标记，结合重组单株验证连锁关系。如果上述基因是候选基因，就应该表现为共分离。具体方法如下：结合步骤1基础，在7号染色体上开发了一些标记，筛选多态性引物，利用矮化突变体与另一野生型品种hazerd杂交构建的F₂群体，筛选重组单株，缩短物理距离，后利用该基因两端的重组单株验证该基因与CsDHCR7的共分离情况。结果该基因确实与CsDHCR7基因共分离。

实施例3 CsDHCR7基因克隆和鉴定

CsDHCR7基因突变位于Csa7G447780的第六个内含子的剪切位点处，碱基G突变为A。为了验证测序的结果，对Cucurbit Genomics Database中编号为Csa7G447780基因的cDNA进行测序，证实编码区cDNA由鸟嘌呤突变为腺嘌呤(A)，导致编码蛋白异常，这与预测结果相符，证实该基因的突变导致产生矮化突变体，命名该基因为CsDHCR7。

CsDHCR7基因全长cDNA的获得：

黄瓜长春密刺和矮化突变体总RNA提取采取TRIzol方法，采用TaKaRa公司的反转录试剂盒PrimerScriptTM RT reagent Kit合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用引物Csa7G447780-F(ATGGCGGAAGGATCCAACACTGTA)和引物Csa7G447780-R(TTAGTATATTCCAGGTATGATTTTG)采用TaKaRa公司的高保真酶GXL DNAPolymerase进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积26ul，其中含有：

用双蒸水补足26ul体积。

反应程序如下：95℃，预变性5分钟，然后95℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸90秒，进行35个循环的扩增；最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物用OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒按产品说明书进行纯化，然后纯化的产物用rTaq酶进行加A反应，反应条件如下：

反应体积10ul，其中含有

反应程序：72℃连接10分钟。

将加A后的产物与pMD19-T载体在16℃下连接4小时，构建重组载体pMD19-CsDHCR7。 42℃热击70秒将重组载体pMD19-CsDHCR7转化大肠杆菌DH5α(TaKaRa)，转化物在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑取单克隆，提取质粒，送交测序。测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，将该片段命名为CsDHCR7基因，CsDHCR7基因全长1308bp，其编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：2中序列所示。

实施例4 CsDHCR7基因的表达分析

采取长春密刺和矮化突变体中不同植物组织子叶、根、茎、叶、雄花、子房采用同例3 方法进行RNA提取和第一链cDNA的合成。根据黄瓜CsDHCR7基因的CDS序列设计引物 D-q-F：(AATGGACATAGCGCATGATAGA)和D-q-R(TGTCTGTCACAATCGTAGTTGA)。同时以黄瓜内参基因Actin的表达量进行对照处理，引物为Actin-F (TCGTGCTGGATTCTGGTG)和Actin-R(GGCAGTGGTGGTGAACAT)。采用SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，中国)依照说明书进行实验。反应程序为首先94℃10分钟，然后对94℃5秒和65℃30秒进行40个循环的扩增。每个样品进行3次生物学重复和3次技术重复。结果表明，突变体中各组织中的该基因的表达量均显著低于野生型相应组织中的表达。突变体中该基因的下调表达与以上结果一致，证实了该基因与矮化表型密切相关。

参考文献：

BO K，WANG H，PAN Y，et al.2016.SHORT HYPOCOTYL 1 Encodes a SMARCA3-likeChromatin Remodeling Factor Regulating Elongation.Plant Physiology[J]，172.

CHOE S，.，TANAKA A，.，NOGUCHI T，.，et al.2010.Lesions in the steroldelta reductase gene of Arabidopsis cause dwarfism due to a block inbrassinosteroid biosynthesis.Plant Journal[J]，21：431-443.

HUTCHINS A E 1940.Inheritance in the cucumber.Journal of AgriculturalResearch[J].

LI Y，YANG L，PATHAK M，et al.2011.Fine genetic mapping of cp：arecessive gene for compact(dwarf)plant architecture in cucumber，Cucumissativus L. Tag.theoretical&Applied Genetics.theoretische Und AngewandteGenetik[J]，123：973.

YUAN L H，PAN J S，WANG G，et al.2010.The Cucumber Lateral SuppressorGene(CLS)Is Functionally Associated with Axillary Meristem Initiation.PlantMolecular Biology Reporter[J]，28：421-429.

Claims (5)

1.一种黄瓜矮化相关基因调控蛋白，其特征为如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中经过剪切位点氨基酸序列的替换导致氨基酸序列短截且与黄瓜矮化突变相关的由a)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的一种黄瓜矮化相关蛋白的基因，其特征为所述基因是如下1)或2)或3)的基因；

1)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子：

2)在严格条件下可与序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸系列杂交且编码矮化相关蛋白的DNA分子；

3)与1)的基因由90％以上的同源性，且编码上述矮化相关蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述的基因的转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求2所述的黄瓜矮化相关性状蛋白的编码基因在改变黄瓜株高中的应用。