CN110465114B - 一种模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及纯化辅酶q10的方法 - Google Patents

一种模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及纯化辅酶q10的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于辅酶Q10提纯领域，公开了一种模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及纯化辅酶Q10的方法。所述模拟移动床连续层析色谱系统包括首尾依次连通的至少四根色谱柱，沿着色谱柱排列的方向上依次设置有进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口，这四个物料入口将模拟移动床连续层析色谱系统划分为进料区、洗脱区、解吸区和再生区且位置通过多孔分配阀切换以使得每根色谱柱依次且循环地切换至进料区、洗脱区、解吸区和再生区。采用本发明提供的模拟移动床连续层析色谱系统对辅酶Q10进行纯化，不仅有利于辅酶Q10纯度和收率的提高，而且杂质可以从色谱柱中解吸干净，保证了柱效稳定，提高了填料寿命，具有极高的适应性和稳定性。

Description

一种模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及纯化辅酶 Q10的方法
技术领域
本发明属于辅酶Q10提纯领域，具体涉及一种模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法。
背景技术
辅酶Q10(Coenzyme Q10，简写为CoQ10)又名泛醌，是一种类维生素物质，在动植物及微生物中广泛存在。辅酶Q10是生物自发合成的细胞代谢激活剂和抗氧化剂，它能作用于某些酶，使之发生三维结构的变化，从而影响其生理活动。过去的研究及临床试验证明，辅酶Q10具有增加机体免疫力、预防心脑血管硬化的作用，对改善高血压、充血性心衰竭、神经系统疾病以及肿瘤的治疗等都有帮助。当前，辅酶Q10作为一种珍贵的天然产物，被普遍用于生化药物、养生食品以及美容化妆品的生产中。
辅酶Q10的生产方法主要有化学合成法、动植物细胞培养法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法具有工艺稳定性高、易于大规模生产、操作简单以及产品生物活性高、易于吸收等优点，是目前辅酶Q10生产的研究热点。通过微生物发酵法制得的发酵液经离心、过滤、冻干、粉碎后得到菌渣，通过提取得到辅酶Q10粗提物，进一步纯化处理得到高纯度的辅酶Q10产品。现有的提取方法通常为先采用溶剂萃取法、皂化法、超临界流体萃取法进行粗提纯，之后结合硅胶柱色谱、重结晶等技术对辅酶Q10粗产物进行进一步纯化。然而，辅酶Q10粗提取物中主要含有侧链上异戊烯单元数不同的辅酶Q类同系物，分离难度较大。
模拟移动床色谱是当前最有工业化前景的制备色谱技术。现有的模拟移动床色谱通常仅包括进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口和萃余液出口这四个物料进出口，这四个物料进出口将所有色谱柱分成流速不同的四个区，分别承担不同的功能。它利用四个进出口物料的定时切换模拟洗脱剂与固定相的逆流移动，从而实现进出料的连续化。在萃取液出口连续收集含强吸附组分和洗脱剂的混合溶液，而在萃余液出口连续收集含弱吸附组分和洗脱剂的混合溶液。一方面，该操作允许连续进样，因而生产能力高；另一方面，由于洗脱剂循环使用，溶剂消耗少，可降低大规模制备的成本。为各区设计适合的流量，即可得到高纯度的目标组分。
例如，CN108017530A公开了一种从菌渣中连续分离辅酶Q10的方法，包括：(1)将辅酶Q10粗提物溶解在非极性有机溶剂中配成进料液；(2)将进料液和洗脱剂连续通入模拟移动床色谱系统中，从模拟移动床色谱系统的萃余口连续收集萃余液；(3)将步骤(2)所得萃余液减压浓缩后重新溶解，再经结晶、过滤、干燥后得到纯度大于98％的辅酶Q10精品。CN108084007A公开了一种模拟移动床色谱分离辅酶Q10和辅酶Q11的方法，包括：(1)将辅酶Q10和辅酶Q11的混合物溶解在有机溶剂中配成进料液；(2)将进料液和洗脱剂连续通入模拟移动床色谱系统中，从模拟移动床色谱系统的萃取口连续收集富含Q11的萃取液，从萃余口连续收集富含辅酶Q10的萃余液；(3)萃余液经后处理后得到辅酶Q10单体；萃取液经后处理后得到辅酶Q11单体。上述方法均是利用传统的模拟移动床的方法纯化辅酶Q10，这些传统的模拟移动床仅包括一个洗脱剂入口，从该入口引入的洗脱剂流经整个模拟移动床，即，整个模拟移动床中所采用的洗脱剂是固定的，并且传统的模拟移动床在运行时，出口流速、进口流速、切换时间、系统温度、物料浓度、洗脱剂极性、区数、各区柱数和流速、以及填料组成是固定不变的，这种模拟移动床主要适用于双组分辅酶Q10粗提物的分离。然而，工业上待分离提纯的辅酶Q10粗提物的组分较为复杂，除了辅酶Q10之外，其通常含有性质各异的多种杂质，当采用传统的模拟移动床对其进行分离提纯时，部分杂质在柱内用单梯度极性洗脱剂根本无法解吸干净，容易拖尾，影响柱效，所得辅酶Q10收率无法达到98％以上，并且也会降低填料寿命，不同批次上样液难以做到物料浓度固定，杂质含量难以统一，洗脱剂易挥发，极性存在偏差从而导致切换时间无法固定，工艺难以稳定运行，不适于大规模的推广应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服传统的模拟移动床适用于双组分辅酶Q10粗提物的分离，对多组分辅酶Q10粗提物分离时所得辅酶Q10收率较低、杂质无法解吸干净从而会降低填料寿命的缺陷，而提供一种新的模拟移动床连续层析色谱系统及其应用以及利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，采用该模拟移动床连续层析色谱系统无论是针对双组分辅酶Q10粗提物还是针对多组分辅酶Q10粗提物均能够实现良好的分离提纯，具有良好的普适性，不仅所得辅酶Q10的纯度和收率均非常高，而且杂质能够非常容易地从色谱柱上解吸下来，填料寿命长。
具体地，本发明提供了一种模拟移动床连续层析色谱系统，其中，所述模拟移动床连续层析色谱系统包括首尾依次连通的至少四根色谱柱，沿着色谱柱排列的方向上依次设置有进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口，这四个物料入口将所述模拟移动床连续层析色谱系统划分为进料区、洗脱区、解吸区和再生区，所述进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口的位置通过多孔分配阀切换以使得每根色谱柱依次且循环地切换至进料区、洗脱区、解吸区和再生区。
进一步的，所述色谱柱的总数量为4～32根，且所述进料区、洗脱区、解吸区和再生区各自独立地包括1～8根色谱柱。
进一步的，所述色谱柱中装填的填料选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、氧化铝和硅胶中的至少一种。
进一步的，所述模拟移动床连续层析色谱系统中料液与填料呈逆向流动。
本发明还提供了所述模拟移动床连续层析色谱系统在纯化辅酶Q10中的应用。
此外，本发明还提供了一种利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将辅酶Q10粗提物溶解在非极性有机溶剂中配成进料液；
(2)将所述进料液、1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂分别从上述模拟移动床连续层析色谱系统的进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口连续引入进料区、洗脱区、解吸区和再生区；处于进料区的色谱柱完成上样吸附后切换至洗脱区并采用1#洗脱剂进行洗脱，而处于进料区的未完成上样吸附的其余色谱柱继续进行进料；处于洗脱区的色谱柱收集完富含辅酶Q10的洗脱液后切换至解吸区并采用2#洗脱剂进行解吸，而处于洗脱区的未完成洗脱的其余色谱柱继续进行洗脱；处于解吸区的色谱柱完成解吸后切换至再生区并采用3#洗脱剂进行再生，而处于解吸区的未完成解吸的其余色谱柱继续进行解吸；处于再生区的色谱柱完成再生后切换至进料区并通入进料液进行上样吸附，而处于再生区的未完成再生的其余色谱柱继续进行再生，以此循环；
(3)将从所述洗脱区收集的富含辅酶Q10的洗脱液进行重结晶，得到辅酶Q10。
进一步的，所述非极性有机溶剂选自正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷和石油醚中的至少一种或3#洗脱剂。
进一步的，所述进料液中辅酶Q10固形物的浓度为50～400mg/mL。
进一步的，所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂各自独立地含有组分A和/或组分B，所述组分A选自石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷和甲基环己烷中的至少一种，所述组分B选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和碳原子数为1～4的一元醇中的至少一种。
进一步的，所述1#洗脱剂的溶剂极性指数为0.2～4，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞80％，优选＞90％；所述2#洗脱剂的溶剂极性指数≥4，含有组分B和任选的组分A，组分B的体积百分比＞20％，优选＞60％，最优选为100％；所述3#洗脱剂的溶剂极性指数≤0.2，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞90％，优选＞95％，最优选为100％。
进一步的，所述模拟移动床连续层析色谱系统的操作参数控制为：洗脱温度为0～60℃，进料液流速为1～1000L/h，洗脱剂流速为1～1000L/h，切换时间为0.5～2h。
进一步的，所述重结晶的方法为将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂重新溶解，之后依次进行结晶、过滤和干燥，得到辅酶Q10。
进一步的，所述重结晶的方法为将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂于40～75℃下重新溶解，之后搅拌降温结晶，搅拌转速控制在15～20r/min，降温速率控制在5～15℃/h，终温控制在0～25℃，待降温结晶完成之后离心过滤，干燥，得到辅酶Q10。
进一步的，所述有机溶剂与浓缩物的体积质量比为(2～15)L:1kg。
进一步的，所述有机溶剂选自丙酮、丁酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷和正辛烷中的至少一种。
本发明的有益效果是：
传统的模拟移动床色谱技术虽然采用了连续色谱技术，可以提高固定相的利用率，减少固定相的消耗，理论上能实现辅酶Q10的连续生产，使生产过程全自动化，降低劳动强度和生产成本，但其在运行时，出口流速、进口流速、切换时间、系统温度、物料浓度、洗脱剂极性、区数、各区柱数和流速、以及填料组成固定不变，主要适用于双组分的分离，工业上提纯辅酶Q10应用此工艺时，存在进料液组分复杂，部分杂质在柱内用单梯度极性洗脱剂无法解吸干净，容易拖尾，影响柱效，所得辅酶Q10纯度和收率较低，填料寿命较短，不同批次进料液难以做到物料浓度固定，杂质含量难以统一，洗脱剂易挥发，极性存在偏差从而导致切换时间无法固定，工艺难以稳定运行等问题，不适于大规模的推广应用。本发明在现有辅酶Q10的纯化方法基础上，对传统的模拟移动床色谱技术进行了改进，提供了一种模拟移动床连续层析色谱系统以及利用该模拟移动床连续层析色谱系统纯化辅酶Q10的方法，该模拟移动床连续层析色谱系统由多个色谱柱和一个多孔分配阀组成，整个模拟移动床色谱系统包括多个洗脱剂入口，通过多孔分配阀阀口的切换使得不同色谱柱进行角色转换，使色谱柱在一个工艺循环中依次完成吸附且采用相同或不同洗脱剂进行洗脱、解吸和再生的全部工艺过程，如此能够实现物料浓度可调，洗脱剂极性可变，从而使得杂质可以解吸干净，不仅保证了柱效稳定，提高了填料寿命，减少了溶剂用量，并且由此纯化得到的辅酶Q10的纯度和收率也能够得以大幅度提高。在本发明提供的模拟移动床连续层析系统中，层析分离的所有工艺步骤同时进行，各区连续工作，又彼此独立，实现了连续生产，使生产过程全自动化，降低了劳动强度和生产成本。此外，本发明提供的纯化工艺简单，具有更高的适应性和稳定性，适用于工业化大规模推广应用。
附图说明
图1为实施例1的模拟移动床连续层析色谱系统在一个周期内起始时刻T0时各区的使用状态图；
图2为图1的模拟移动床连续层析色谱系统在1/4个周期后(即T0+1/4T时)，多孔分配阀的阀门切换一次后各区的使用状态图。
具体实施方式
如图1和图2所示，本发明提供的模拟移动床连续层析色谱系统包括首尾依次连通的至少四根色谱柱，沿着色谱柱排列的方向上依次设置有进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口，这四个物料入口将所述模拟移动床连续层析色谱系统划分为进料区、洗脱区、解吸区和再生区，所述进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口的位置通过多孔分配阀切换以使得每根色谱柱依次且循环地切换至进料区、洗脱区、解吸区和再生区。其中，所述进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口分别位于不同的色谱柱上部。从进料液入口至1#洗脱剂入口之间的区域为进料区，从1#洗脱剂入口至2#洗脱剂入口之间的区域为洗脱区，从2#洗脱剂入口至3#洗脱剂入口之间的区域为解吸区，从3#洗脱剂入口至进料液入口之间的区域为再生区。所述色谱柱的总数量至少为4根，优选为4～32根。所述进料区、洗脱区、解吸区和再生区所含的色谱柱的数量可以相同，也可以不同，并优选各自独立地包括1～8根色谱柱。各区之间可以采用等度操作模式，也可以采用梯度操作模式。当使用时，预先设置各区流量、切换时间、切换次数和柱温等操作参数，连续泵入进料液和洗脱剂，待系统达到稳态后，在洗脱区连续收集富含辅酶Q10的洗脱液，贫含辅酶Q10的洗脱液接入未进料完成的色谱柱从而进入下一洗脱区，并且在解吸区连续收集富含杂质的组分，贫含杂质的组分进入下一解吸色谱柱，从而节约溶剂用量。
所述多孔分配阀切换一次可以同时调整进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂的位置，也可以选择性调整其中的一个、两个或三个入口的位置，具体应视情况而定。例如，当位于任意一个区域的一根或多根色谱柱已完成相应工作，而其他区域的色谱柱未完成相应工作时，可以切换一次阀门以使已完成工作的色谱柱先进入下一区域；当位于任意两个区域的一根或多根色谱柱已完成相应工作，而剩余两个区域的色谱柱未完成相应工作时，可以切换一次阀门以使已完成工作的色谱柱先进入下一区域；当位于任意三个区域的一根或多根色谱柱已完成相应工作，而剩余一个区域的色谱柱未完成相应工作时，可以切换一次阀门以使已完成工作的色谱柱先进入下一区域；当四个区域的一根或多根色谱柱均已完成相应工作时，可以切换一次阀门以使完成工作的色谱柱同时进入下一区域。
当工作时，进料液连续从进料液入口引入进料区，当进料(上样吸附)完毕后，多孔分配阀的阀门切换一次，1#洗脱剂入口切换至刚上样吸附完毕的色谱柱以使其进入洗脱区；当洗脱完毕后，多孔分配阀的阀门切换一次，2#洗脱剂入口切换至刚洗脱完毕的色谱柱以使其进入解吸区；当解吸完毕后，多孔分配阀的阀门切换一次，3#洗脱剂入口切换至刚解吸完毕的色谱柱以使其进入再生区；当再生完毕后，多孔分配阀的阀门切换一次，进料液入口切换至刚再生完毕的色谱柱以使其进入进料区，以此不断循环。例如，图1和图2为实施例1的模拟移动床连续层析色谱系统的使用状态图。其中，图1为一个周期内起始时刻(T0)各区状态图，从图1可以看出，该模拟移动床连续层析色谱系统总共包括首尾依次连通的6根色谱柱(依次命名为1号柱、2号柱、3号柱、4号柱、5号柱和6号柱)，从该时刻起至下一次阀门切换时，进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口分别位于1号柱、3号柱、4号柱和6号柱的上部，此时，1号柱和2号柱位于进料区，3号柱位于洗脱区，4号柱和5号柱位于解吸区，6号柱位于再生区，进料液、1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂分别从进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口连续引入以分别对不同区域的色谱柱进行上样、洗脱、解吸和再生。图2为1/4个周期后(即T0+1/4T时)，多孔分配阀的阀门切换一次后各区的使用状态图，从图2可以看出，经阀门切换之后，进料液入口切换至6号柱上部以对再生完毕的6号柱进行上样，1#洗脱剂入口切换至已上样完毕的2号柱以使2号柱进入洗脱区，2#洗脱剂入口切换至已洗脱完毕的3号柱以使3号柱进入解吸区，3#洗脱剂入口切换至已解吸完毕的5号柱以使5号柱进入再生区。
在本发明中，所述色谱柱中装填的填料可以选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、氧化铝和硅胶中的至少一种，这些填料富含羟基等极性基团，可与辅酶Q类同系物中的碳基形成氢键，根据氢键作用力大小不同，识别同系物之间的微小结构差异。
在本发明中，所述模拟移动床连续层析色谱系统中料液与填料呈逆向流动，即，料液的流动方向与物料入口的切换方向相反。进料区为上样区，洗脱区采用1#洗脱剂进行洗脱，同时收集富含辅酶Q10的洗脱液；解吸区采用2#洗脱剂进行解吸洗柱；再生区采用3#洗脱剂进行柱再生。
本发明还提供了所述模拟移动床连续层析色谱系统在纯化辅酶Q10中的应用。
本发明提供的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法包括以下步骤：
(1)将辅酶Q10粗提物溶解在非极性有机溶剂中配成进料液；
(2)将所述进料液、1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂分别从上述模拟移动床连续层析色谱系统的进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口连续引入进料区、洗脱区、解吸区和再生区；处于进料区的色谱柱完成上样吸附后切换至洗脱区并采用1#洗脱剂进行洗脱，而处于进料区的未完成上样吸附的其余色谱柱继续进行进料；处于洗脱区的色谱柱收集完富含辅酶Q10的洗脱液后切换至解吸区并采用2#洗脱剂进行解吸，而处于洗脱区的未完成洗脱的其余色谱柱继续进行洗脱；处于解吸区的色谱柱完成解吸后切换至再生区并采用3#洗脱剂进行再生，而处于解吸区的未完成解吸的其余色谱柱继续进行解吸；处于再生区的色谱柱完成再生后切换至进料区并通入进料液进行上样吸附，而处于再生区的未完成再生的其余色谱柱继续进行再生，以此循环；
(3)将从所述洗脱区收集的富含辅酶Q10的洗脱液进行重结晶，得到辅酶Q10。
在本发明中，所述辅酶Q10粗提物从微生物发酵所得的菌粉中提取，具体可参照公开号为CN101314782A、CN101619330A或CN105886562A的专利申请中所描述的方法培养菌种，将发酵液过滤、干燥、粉碎后得到菌粉；从菌粉中提取辅酶Q10粗提物的提取方法可以为渗漉提取法、有机溶剂浸提法、醇碱皂化法或超临界流体萃取法，具体可参照公开号为CN106146278A、CN101381747A、CN102391092A或CN104694613A的专利申请中所描述的方法进行提取。
在本发明中，所述非极性有机溶剂的具体实例包括但不限于：正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷和石油醚中的至少一种或3#洗脱剂。所述进料液中辅酶Q10固形物的浓度优选为50～400mg/mL，若进料浓度过低，则生产能力降低，工艺经济性降低；若进料浓度过高，则完全分离区显著缩小，设计操作条件的难度加大，分离难度增大。所述进料液的进料量折纯为单柱填料质量的10％～50％。
根据本发明的一种优选实施方式，在洗脱区中，富含辅酶Q10的洗脱液收集完毕后，贫含辅酶Q10的洗脱液接入未完成上样吸附的色谱柱；和/或，在解吸区中，富含杂质的组分收集完毕后，贫含杂质的组分进入下一解吸色谱柱，这样能够提高辅酶Q10的收率并节约溶剂用量。在本发明中，所述富含辅酶Q10的洗脱液中辅酶Q10的纯度较高，例如，可以为85％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上；所述贫含辅酶Q10的洗脱液中辅酶Q10的纯度较低，例如，可以为15％以下，优选为10％以下，更优选为5％以下；所述富含杂质的组分中杂质的含量较高，例如，可以为60％以上；所述贫含杂质的组分中杂质的含量较低，例如，可以为40％以下。
在本发明中，所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂可以各自独立地含有组分A和/或组分B，所述组分A选自石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷和甲基环己烷中的至少一种，所述组分B选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和碳原子数为1～4的一元醇中的至少一种。根据本发明的一种优选实施方式，所述1#洗脱剂的溶剂极性指数为0.2～4，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞80％，优选＞90％；所述2#洗脱剂的溶剂极性指数≥4，含有组分B和任选的组分A，组分B的体积百分比＞20％，优选＞60％，最优选为100％；所述3#洗脱剂的溶剂极性指数≤0.2，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞90％，优选＞95％，最优选为100％。当待提纯的辅酶Q10粗提物为两组分时，所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂可以相同；当待提纯的辅酶Q10粗提物为多组分(即含有各种杂质，特别是这些杂质的性质差异较大)时，所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂通常不同，且极性大小为3#洗脱剂＜1#洗脱剂＜2#洗脱剂，通过洗脱剂极性的调整使得辅酶Q10得以顺利分离并保证杂质能够从色谱柱中解吸干净，提高了辅酶Q10的纯度和收率，保证了柱效稳定，提高了填料使用寿命。此外，不同时刻所采用的1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂的种类可以相同，也可以不同。
在本发明中，所述模拟移动床连续层析色谱系统的操作参数控制为：洗脱温度优选为0～60℃，进料液流速优选为1～1000L/h，洗脱剂流速优选为1～1000L/h，切换时间优选为0.5～2h。其中，所述切换时间是指多孔阀门从某一状态切换至下一状态所经历的时间。
根据本发明的一种具体实施方式，所述重结晶的方法可以为将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂重新溶解，之后依次进行结晶、过滤和干燥，得到辅酶Q10。更具体地，将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂于40～75℃下重新溶解，之后搅拌降温结晶，搅拌转速控制在15～20r/min，降温速率控制在5～15℃/h，终温控制在0～25℃，待降温结晶完成之后离心过滤，干燥，得到辅酶Q10。其中，所述有机溶剂与浓缩物的体积质量比可以为(2～15)L:1kg。所述有机溶剂的具体实例包括但不限于：丙酮、丁酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷和正辛烷中的至少一种。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
将多组分的辅酶Q10粗提物(其中，杂质主要含有辅酶Q9、还原型辅酶Q9、5-脱甲氧基辅酶Q10、还原型辅酶Q10、辅酶Q11、还原型辅酶Q11)溶解于正己烷中，配制成辅酶Q10固形物浓度为80mg/mL的进料液，其中辅酶Q10的含量约为75.5％。如图1所示，模拟移动床连续层析色谱系统装有6根色谱柱，其中，进料区2根、洗脱区1根、解吸区2根和再生区1根，尺寸均为3.5cm×50cm；固定相均为硅胶(粒径45μm，孔径10nm)；洗脱剂为环己烷和乙酸乙酯的混合物，其中，1#洗脱剂中乙酸乙酯的体积百分比为8％，2#洗脱剂中乙酸乙酯的体积百分比为35％，3#洗脱剂中乙酸乙酯的体积百分比为1％；操作温度30℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速4L/h，进料液流速2L/h，切换时间1h。从洗脱区出口收集到富含辅酶Q10的高浓度洗脱液。分析表明，一个周期内所收集的高浓度洗脱液中辅酶Q10的纯度为98.3％。将该高浓度洗脱液浓缩成固体，在75℃搅拌条件下添加乙醇至刚好完全溶解，固液质量体积比为1kg:10L，搅拌转速为15r/min，将温度逐步降至20℃，降温速率5℃/h，冷却结晶3h后过滤，放入真空干燥箱中于30℃下干燥24h得辅酶Q10产品。采用液相色谱分析得辅酶Q10产品的纯度为99.6％，整个工艺的回收率为99.3％，杂质能够非常容易地从色谱柱上解吸下来，填料的寿命为600h。
实施例2
将两组分的辅酶Q10粗提物(其中，杂质为辅酶Q11)溶解于正己烷中，配制成辅酶Q10固形物浓度为120mg/mL的进料液，其中辅酶Q10的含量约为70.3％。模拟移动床装有12根色谱柱，其中，进料区4根、洗脱区2根、解吸区4根和再生区2根，尺寸均为3.5cm×50cm；固定相均为硅胶(粒径25μm，孔径20nm)；洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合物，其中，1#、2#、3#洗脱剂中的乙酸乙酯体积百分比均为10％；操作温度30℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速6L/h，进料液流速4L/h，切换时间0.5h。从洗脱区出口收集到富含辅酶Q10的高浓度洗脱液。分析表明，一个周期内所收集的高浓度洗脱液中辅酶Q10的纯度为97.5％。将该高浓度洗脱液浓缩成固体，在30℃搅拌条件下添加异丙醇至刚好完全溶解，固液质量体积比为1kg:12L，搅拌转速为15r/min，将温度逐步降至25℃，降温速率8℃/h，冷却结晶5h后过滤，放入真空干燥箱中于30℃下干燥24h得辅酶Q10产品。采用液相色谱分析得辅酶Q10产品的纯度为99.5％，整个工艺的回收率为99.5％，杂质能够非常容易地从色谱柱上解吸下来，填料的寿命为1000h。
实施例3
将多组分的辅酶Q10粗提物(其中，杂质主要含有辅酶Q9、还原型辅酶Q9、5-脱甲氧基辅酶Q10、还原型辅酶Q10、辅酶Q11、还原型辅酶Q11)溶解于正己烷中，配制成辅酶Q10固形物浓度为200mg/mL的进料液，其中辅酶Q10的含量约为65.3％。模拟移动床装有18根色谱柱，其中，进料区5根、洗脱区5根、解吸区4根和再生区4根，尺寸均为3.5cm×50cm；固定相均为氧化铝(粒径20μm，孔径22nm)；洗脱剂为正己烷和丙酮的混合物，其中，1#洗脱剂中丙酮的体积百分比为3％，2#洗脱剂中丙酮的体积百分比为20％，3#洗脱剂为纯正己烷；操作温度32℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速8L/h，进料液流速5L/h，切换时间0.8h。从洗脱区出口收集到富含辅酶Q10的高浓度洗脱液。分析表明，一个周期内所收集的高浓度洗脱液中辅酶Q10的纯度为98.1％。将该高浓度洗脱液浓缩成固体，在30℃搅拌条件下添加甲醇至刚好完全溶解，固液质量体积比为1kg:8L，搅拌转速为20r/min，将温度逐步降至15℃，降温速率10℃/h，冷却结晶5h后过滤，放入真空干燥箱中于30℃下干燥24h得辅酶Q10产品。采用液相色谱分析得辅酶Q10产品的纯度为99.6％，整个工艺的回收率为99.2％，杂质能够非常容易地从色谱柱上解吸下来，填料的寿命为580h。
实施例4
将两组分的辅酶Q10粗提物(其中，杂质为辅酶Q11)溶解于正己烷中，配制成辅酶Q10固形物浓度为300mg/mL的进料液，其中辅酶Q10的含量约为77.2％。模拟移动床装有24根色谱柱，其中，进料区6根、洗脱区6根、解吸区6根和再生区6根，尺寸均为3.5cm×50cm；固定相均为氧化铝(粒径50μm，孔径25nm)；洗脱剂为石油醚和丙酮的混合物，其中，1#、2#、3#洗脱剂中的丙酮体积百分比均为5％；操作温度35℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速10L/h，进料液流速6L/h，切换时间0.6h。从洗脱区出口收集到富含辅酶Q10的高浓度洗脱液。分析表明，一个周期内所收集的高浓度洗脱液中辅酶Q10的纯度为98.6％。将该高浓度洗脱液浓缩成固体，在30℃搅拌条件下添加正丙醇至刚好完全溶解，固液质量体积比为1kg:15L，搅拌转速为20r/min，将温度逐步降至10℃，降温速率15℃/h，冷却结晶5h后过滤，放入真空干燥箱中于30℃下干燥24h得辅酶Q10产品。采用液相色谱分析得辅酶Q10产品的纯度为99.7％，整个工艺的回收率为99.4％，杂质能够非常容易地从色谱柱上解吸下来，填料的寿命为1100h。
对比例1(采用CN108017530A实施例1中公开的传统模拟移动床色谱技术对多组分的辅酶Q10粗提物进行提纯)
将多组分的辅酶Q10粗提物(其中，杂质主要含有辅酶Q9、还原型辅酶Q9、5-脱甲氧基辅酶Q10、还原型辅酶Q10、辅酶Q11、还原型辅酶Q11)溶解于正己烷中，配制成辅酶Q10固形物浓度为80mg/mL的进料液，其中辅酶Q10的含量约为75.5％。采用CN108017530A的模拟移动床装置，并且采用CN108017530A实施例1中的色谱技术对上述料液进行处理，具体地：模拟移动床装有8根色谱柱，尺寸均为1cm×25cm；固定相均为硅胶(粒径45μm，孔径10nm)；洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯的混合物，其中乙酸乙酯的体积百分比为10％；操作温度30℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速16mL/min，进料液流速2mL/min，萃取液流速9.5mL/min，萃余液流速8.5mL/min，切换时间5min。连续切换32次后，系统达到平衡，从萃余液出口收集到富含辅酶Q10的萃余液。分析表明，萃余液中辅酶Q10的含量为95.3％。将洗脱液浓缩成固体，在75℃搅拌条件下添加乙醇至刚好完全溶解，固液质量体积比为1kg:10L，搅拌转速为15r/min，将温度逐步降至20℃，降温速率5℃/h，冷却结晶3h后过滤，放入真空干燥箱中于30℃下干燥24h得辅酶Q10产品。采用液相色谱分析得辅酶Q10产品的纯度为99.1％，整个工艺的回收率为95.5％，杂质在柱内无法解吸干净，容易拖尾，影响柱效，填料的寿命为120h。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (21)

1.一种用于纯化辅酶Q10的模拟移动床连续层析色谱系统，其特征在于，所述模拟移动床连续层析色谱系统包括首尾依次连通的至少四根色谱柱，沿着色谱柱排列的方向上依次设置有进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口，这四个物料入口将所述模拟移动床连续层析色谱系统划分为进料区、洗脱区、解吸区和再生区，所述进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口的位置通过多孔分配阀切换以使得每根色谱柱依次且循环地切换至进料区、洗脱区、解吸区和再生区；所述色谱柱中装填的填料选自极性大孔吸附树脂、离子交换树脂、氧化铝和硅胶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用于纯化辅酶Q10的模拟移动床连续层析色谱系统，其特征在于，所述色谱柱的总数量为4～32根，且所述进料区、洗脱区、解吸区和再生区各自独立地包括1～8根色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的用于纯化辅酶Q10的模拟移动床连续层析色谱系统，其特征在于，所述模拟移动床连续层析色谱系统中料液与填料呈逆向流动。
4.权利要求1～3中任意一项所述的模拟移动床连续层析色谱系统在纯化辅酶Q10中的应用。
5.一种利用权利要求1～3任意一项所述模拟移动床连续层析色谱系统纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将辅酶Q10粗提物溶解在非极性有机溶剂中配成进料液；
(2)将所述进料液、1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂分别从权利要求1～3中任意一项所述的模拟移动床连续层析色谱系统的进料液入口、1#洗脱剂入口、2#洗脱剂入口和3#洗脱剂入口连续引入进料区、洗脱区、解吸区和再生区；处于进料区的色谱柱完成上样吸附后切换至洗脱区并采用1#洗脱剂进行洗脱，而处于进料区的未完成上样吸附的其余色谱柱继续进行进料；处于洗脱区的色谱柱收集完富含辅酶Q10的洗脱液后切换至解吸区并采用2#洗脱剂进行解吸，而处于洗脱区的未完成洗脱的其余色谱柱继续进行洗脱；处于解吸区的色谱柱完成解吸后切换至再生区并采用3#洗脱剂进行再生，而处于解吸区的未完成解吸的其余色谱柱继续进行解吸；处于再生区的色谱柱完成再生后切换至进料区并通入进料液进行上样吸附，而处于再生区的未完成再生的其余色谱柱继续进行再生，以此循环；所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂的极性大小为3#洗脱剂＜1#洗脱剂＜2#洗脱剂；
(3)将从所述洗脱区收集的富含辅酶Q10的洗脱液进行重结晶，得到辅酶Q10。
6.根据权利要求5所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述非极性有机溶剂选自正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷和石油醚中的至少一种或3#洗脱剂。
7.根据权利要求5所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述进料液中辅酶Q10固形物的浓度为50～400mg/mL。
8.根据权利要5～7中任意一项所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述1#洗脱剂、2#洗脱剂和3#洗脱剂各自独立地含有组分A和/或组分B，所述组分A选自石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷、正辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷和甲基环己烷中的至少一种，所述组分B选自丙酮、丁酮、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和碳原子数为1～4的一元醇中的至少一种。
9.根据权利要8所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述1#洗脱剂的溶剂极性指数为0.2～4，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞80％。
10.根据权利要9所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述1#洗脱剂中组分A的体积百分比＞90％。
11.根据权利要8所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述2#洗脱剂的溶剂极性指数≥4，含有组分B和任选的组分A，组分B的体积百分比＞20％。
12.根据权利要11所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述2#洗脱剂中组分B的体积百分比＞60％。
13.根据权利要12所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述2#洗脱剂中组分B的体积百分比为100％。
14.根据权利要8所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述3#洗脱剂的溶剂极性指数≤0.2，含有组分A和任选的组分B，组分A的体积百分比＞90％。
15.根据权利要14所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述3#洗脱剂中组分A的体积百分比＞95％。
16.根据权利要15所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述3#洗脱剂中组分A的体积百分比为100％。
17.根据权利要求5～7中任意一项所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述模拟移动床连续层析色谱系统的操作参数控制为：洗脱温度为0～60℃，进料液流速为1～1000L/h，洗脱剂流速为1～1000L/h，切换时间为0.5～2h。
18.根据权利要求5～7中任意一项所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述重结晶的方法为将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂重新溶解，之后依次进行结晶、过滤和干燥，得到辅酶Q10。
19.根据权利要求18所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述重结晶的方法为将所述富含辅酶Q10的洗脱液经浓缩后用有机溶剂于40～75℃下重新溶解，之后搅拌降温结晶，搅拌转速控制在15～20r/min，降温速率控制在5～15℃/h，终温控制在0～25℃，待降温结晶完成之后离心过滤，干燥，得到辅酶Q10。
20.根据权利要求5～7中任意一项所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述有机溶剂与浓缩物的体积质量比为(2～15)L:1kg。
21.根据权利要求5～7中任意一项所述的利用模拟移动床连续层析色谱纯化辅酶Q10的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、丁酮、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、石油醚、乙醚、异丙醚、二异丙醚、乙基丁基醚、正己烷、正庚烷和正辛烷中的至少一种。
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