CN110408706B - 一种评估鼻咽癌复发的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种评估鼻咽癌复发的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评估鼻咽癌复发的生物标志物，该生物标志物选自NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的至少一种。本发明还公开了所述生物标志物在制备和筛选评估鼻咽癌复发试剂中的用途。本申请首次发现，与初治鼻咽癌样本相比，所述生物标志物在复发鼻咽癌样本中为特异性高频突变基因，检测所述生物标志物的突变频率可评估鼻咽癌的复发风险，提示所述生物标志物可作为鼻咽癌复发的预测分子标志。本发明为鼻咽癌的复发评估提供了新的特异性分子标志物，具有广阔的应用前景。

Description

一种评估鼻咽癌复发的生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种评估鼻咽癌复发的生物标志物及其应用。
背景技术
鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，占头颈部恶性肿瘤的78.08％，占上呼吸道癌肿的92.99％。世界卫生组织调查报道，全球有80％的鼻咽癌患者在中国，且以中国的南方较高，包括广东、广西和湖南等地。鼻咽癌病理大多为低分化鳞癌，恶性度高，发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶部，早期症状不明显因而难以早期发现，误诊误治率较高，可达12.2％。由于鼻咽癌起病隐匿，具有强烈的转移倾向，约75％的患者首诊时就己到达晚期，发生局部淋巴结和/或远处转移。以放疗为主的综合治疗对早期鼻咽癌非常有效，但是仍然有30％～40％的患者由于转移和复发，未能获得长期生存。治疗后复发或转移则预后极差，成为鼻咽癌治疗失败、生存率下降的主要原因。因此，开发用于预测鼻咽癌复发的特异性分子标志物是降低鼻咽癌复发转移、提高病人生存率，降低死亡率的关键。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种评估鼻咽癌复发的生物标志物，其具有特异性好、准确率高等优点，可用于预测鼻咽癌的复发风险。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种评估鼻咽癌复发的生物标志物，所述生物标志物选自NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的至少一种。
本申请发明人首次发现，鼻咽癌复发患者样本中所述生物标志物的突变频率明显高于初治鼻咽癌患者，检测所述生物标志物的突变频率可评估鼻咽癌的复发风险，因此所述生物标志物可作为评估鼻咽癌复发的特异性标志物。
本发明所述生物标志物选自NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的至少一种，其中，选择NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的任何一个基因都能实现鼻咽癌的复发评估。随着组成所述生物标志物的特异性高频突变基因数量增多，鼻咽癌复发评估准确率相应提高，甚至可达100％。
本发明还提供了所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物在筛选鼻咽癌复发检测试剂中的用途。
所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物可用于筛选鼻咽癌复发检测试剂。
本发明还提供了所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物在制备鼻咽癌复发检测试剂中的用途。
所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物可用于制备鼻咽癌复发检测试剂。
本发明还提供了检测所述生物标志物突变频率的试剂在制备用于检测鼻咽癌复发的试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂包括可以对所述生物标志物进行测序的试剂和通过PCR方法检测所述生物标志物突变频率的试剂。
本发明还提供了一种检测鼻咽癌复发的试剂盒，所述试剂盒包含检测所述生物标志物突变频率的试剂和DNA提取试剂。
本发明还提供了一种评估鼻咽癌复发的生物标志物，所述生物标志物为NOTCH1蛋白和/或NCKAP5L蛋白。
本申请发明人首次发现，鼻咽癌复发患者样本中所述NOTCH1蛋白的表达水平显著高于初治鼻咽癌患者，NCKAP5L蛋白的表达水平显著低于初治鼻咽癌患者，检测所述生物标志物的突变频率可评估鼻咽癌的复发风险，因此所述生物标志物可作为评估鼻咽癌复发的特异性标志物。
本发明还提供了所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物在筛选鼻咽癌复发检测试剂中的用途。
所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物可用于筛选鼻咽癌复发检测试剂。
本发明还提供了所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物在制备鼻咽癌复发检测试剂中的用途。
所述的评估鼻咽癌复发的生物标志物可用于制备鼻咽癌复发检测试剂。
本发明还提供了检测所述生物标志物表达水平的试剂在制备用于检测鼻咽癌复发的试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂为可以和所述生物标志物特异性结合的抗体。
本发明还提供了一种检测鼻咽癌复发的试剂盒，所述试剂盒包含检测所述生物标志物表达水平的试剂、辣根过氧化物酶标记的第二抗体和3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)。
优选地，所述试剂为可以和所述生物标志物特异性结合的抗体。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明为鼻咽癌复发评估提供了新的特异性生物标志物，检测所述生物标志物可评估鼻咽癌的复发风险，具有特异性好、准确性高等优点，临床应用前景广阔。
附图说明
图1为复发鼻咽癌样本特异性高频突变基因检测结果。
图2为复发鼻咽癌样本特异性高频突变基因的蛋白表达水平检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1测序法检测复发鼻咽癌样本特异性的高频突变基因
1.样本和数据的收集
所有的样本均是在2012年6月1日至2016年5月1日于中山大学肿瘤医院收集并经病理确诊为鼻咽癌(WHO I,II,III型)。该研究获得中山大学伦理委员会的批准。初治鼻咽癌样本为确诊前未接受化疗或放疗等任何治疗。复发鼻咽癌为距离上一次根治放疗后至少6个月局部又出现新的病灶。使用组织切片及苏木精-曙红染色估计样本的肿瘤纯度，仅有肿瘤纯度不低于30％的高质量样本才能进行后续的测序分析。一共收集了55例复发和44例初治的新鲜组织样本，进行测序分析。
前期研究报道的初治鼻咽癌外显子测序数据经由美国国家生物技术信息序列读取档案中心www.ncbi.nlm.nih.gov/sra(登记号.SRA288429和SRA291304)和欧洲核酸档案中心(登记号PRJEB12830)下载。这些文件包含由zheng等人报道的50例初治鼻咽癌患者43及由Li等人报道的69例初治鼻咽癌患者的外显子测序数据41。
2.基因组DNA的准备和全基因组、全外显子组测序
使用DNeasy血和组织试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据产品的说明书提取基因组DNA。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA是否存在降解和污染。使用
Figure BDA0002185103280000041
DNA试剂盒和
Figure BDA0002185103280000042
2.0荧光光度计检测DNA的浓度。
对于全基因组测序(WGS)，每个样本需要0.8ug基因组DNA(其分子量高，>20Kb单band)用于DNA文库的构建。使用TruSeq Nano DNA HT Sample Prep Kit(Illumina,USA)进行文库构建，并对每个样本添加指数代码。简而言之，通过Covaris超声系统将基因组DNA样品片段化至～350bp的大小。然后，将DNA片段进行末端抛光，加A尾，并与全长接头连接以用于Illumina测序，然后进一步行PCR扩增。在纯化PCR产物(AMPure XP系统)后，通过Agilent2100生物分析仪分析文库的大小分布，并通过实时PCR(3nmol/L)进行定量。根据制造商的说明，使用HiSeq X PE Cluster Kit v2.5(Illumina)在cBot Cluster GenerationSystem上进行索引编码样本的聚类。在聚类完成后，在Illumina HiSeq X平台上对DNA文库进行测序，并产生150bp的配对末端读段。
对于全外显子组测序(WES)，通过Covaris技术对43个复发鼻咽癌和27个初治鼻咽癌患者的肿瘤和匹配外周血的合格基因组DNA行片段化，得到180-280bp的文库片段，然后将衔接子连接到两端。然后，提取的DNA通过连接介导的PCR(LM-PCR)行扩增，纯化，并与Agilent SureSelect Human Exome V6杂交用于富集，然后洗去未杂交的片段。将未捕获和捕获的LM-PCR产物进行实时PCR以估计富集的量级。然后将每个捕获的文库加载到Illumina HiSeq X平台上，我们独立地对每个捕获的文库进行高通量测序，以确保每个样品满足所需的平均次覆盖率。
3.测序数据质量控制
从HiSeq平台获得的原始荧光图像文件通过碱基调用转换为短读段(原始数据)，并以FASTQ格式记录，其包含序列信息和相应的测序质量信息。在排除含有衔接子污染和低质量/不可识别核苷酸的读段后，将清洁数据用于下游生物信息学分析。同时，计算总读段，测序错误率，平均质量>20且平均质量>30的读段百分比和GC含量分布。
4.读段比对和体细胞基因组突变检测
通过Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将有效测序数据比对到人参考基因组(UCSC hg19)，以获得以BAM格式存储的原始比对结果。然后，使用SAMtools和Picard(http://broadinstitute.github.io/picard/)对BAM文件进行排序并执行重复标记以生成用于计算序列覆盖和深度的最终BAM文件。
使用MuTec软件和Strelka软件对成对的肿瘤正常样品中鉴定体细胞单核苷酸变异(SNV)和小片段插入和缺失(InDel)。随后，使用ANNOVAR注释VCF(变体调用格式)文件。
使用Control-FREEC软件鉴定体细胞拷贝数变异(CNV)，同时，使用GISTIC算法推断反复扩增或缺失的基因组区域。基于影响每个基因的扩增或缺失的频率和幅度，计算基因组和基因编码区的G分数。显著的CNV区域被定义为具有G分数>0.1的扩增或缺失，对应于来自置换衍生的空分布的p值阈值0.05。
对于基于软剪切读段的体细胞结构变异(SV)的检测，使用CREST软件，以在核苷酸分辨率的水平上直接比对结构变异。仅选择具有跨越断点的至少三个支持限幅读段的断点对用于进一步分析。
5.聚合酶链式反应(PCR)和sanger测序
为了验证从WGS和WES测序数据中鉴定的体细胞SNV和InDel，我们使用PCR来扩增跨越具有特异性引物的突变位点的基因组DNA。然后，将PCR产物直接测序或克隆到TA载体中。对至少50个TA载体克隆进行测序，因为较低变异等位基因频率(VAF)的突变难以通过直接Sanger测序检测出来。
6.鉴定显著突变的基因
使用MuSiC软件鉴定显著突变的基因。MuSiC软件是基于观察到的基因中的沉默突变和周围区域的非编码突变，估计每个基因-患者-类别组合的背景突变率(BMR)。通过三次测试确定显著水平(p值)，然后计算错误发现率(FDR，q值)。显著突变的基因(SMG)定义为至少两个肿瘤样品中出现突变，并且FDR小于0.2。
7.突变特征分析
从WGS和WES数据中提取外显子区域中的所有体细胞点突变，并将其分类为96个突变的三核苷酸(突变碱基加上其序列背景)。然后，通过Wellcome Trust Sanger Institute突变特征框架提供的非负矩阵分解(NMF)对基础突变特征进行破译。利用具有NMF模块的基因模式平台获得几个特征，然后将其与先前在癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库中定义的特征进行聚类。
8.突变克隆的评估
据现有的研究报道，通过整合肿瘤纯度，VAF和拷贝数变异来确定该突变的癌细胞比例(CCF)。将分段的拷贝数数据连同突变谱纳入ABSOLUTE程序以评估每种突变的CCF，同时考虑肿瘤纯度，读段深度覆盖度和VAF60。根据前期研究推荐，所有ABSOLUTE解决方案均由3位研究人员审核，其解决方案基于多数投票。如果其CCF的95％置信区间大于或等于1，则将该突变定义为主克隆。
9.统计分析
使用χ2检验，校正χ2检验或Fisher精确检验比较分类变量，并使用Mann-Whitney U检验比较连续变量。所有分析均使用Stata 10.0版进行，双尾P值小于0.05被认为具有统计学意义。
10.结果
至少在两个肿瘤样品中发生突变，同时，使用MuSiC软件，其在复发鼻咽癌(rNPC)或初治鼻咽癌(pNPC)病例中的错误发现率(FDR)小于0.2，被鉴定为高频突变基因(SMG)。结果如图1所示，9个基因在rNPC中被鉴定为高频突变，在这9个高频突变基因中，4个基因在rNPC和pNPC中均为高频突变，包括TP53基因，NF-κB通路基因TRAF3，CYLD和NFKBIA，而NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因仅在rNPC中为高频突变，因此，检测鼻咽癌患者样本中上述仅在rNPC中为高频突变基因的突变频率，可用于评估鼻咽癌的复发风险。
实施例2免疫组化检测复发鼻咽癌样本特异性高频突变基因的蛋白表达水平
1.免疫组化检测方法
对石蜡切片进行免疫组化染色，使用了如下抗体：NOTCH1(Bioss，bs1335R)，RPL22(Biorbyt，orb128654)，NAPA(Abnova，PAB1686)，FAM135B(Bioss，bs-9063R)和NCKAP5L(Invitrogen，PA5-59404)。首先，将组织载玻片在60℃烘箱中烘烤2小时，随后每次用二甲苯脱石蜡两次，每次10分钟，并通过梯度乙醇再水合。柠檬酸盐缓冲液(pH9.0)中的高压预处理用于NOTCH1、RPL22和NAPA染色的抗原修复，而柠檬酸盐缓冲液(pH8.0)中的高压预处理用于FAM135B和NCKAP5L染色的抗原修复。使用H2O2(0.3％)来阻断内源性过氧化物酶活性30分钟。然后将样品用PBST洗涤并在4℃下使用NOTCH1(1：200稀释)、RPL22(1：200稀释)、NAPA(稀释1：200)、FAM135B(稀释1:50)和NCKAP5L(1：100稀释)的一抗孵育过夜。接下来，将载玻片与生物素化的抗山羊抗体在室温下孵育30分钟，然后与缀合有辣根过氧化物酶的第二抗体在37℃下孵育30分钟。然后将载玻片用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)染色并用苏木精复染。
2.免疫组化评分
通过两个评分评估NOTCH1、RPL22、NAPA、FAM135B和NCKAP5L的染色结果：第一个评分是表达强度，从阴性到强阳性的表达强度分别为0＝阴性，1＝弱阳性表达，2＝中度阳性表达，3＝强阳性表达；第二个评分是表达面积，表达面积比例范围为0％至100％(0＝0-5％，1＝6-25％，2＝26-50％，3＝51-75％，4＝76-100％)。最终总分等于每位患者的强度分数和其相应面积分数的乘积结果。
所有染色结果均由两名病理学家独立评估，他们对患者的临床病例特征不知情。如果同一病例的评估结果在这两位病理学家之间差异很大，则由另一位监督病理学家重新评估病例。
3.结果
我们行免疫组织化学(IHC)染色以检查这些rNPC特异的高频突变基因在148个rNPC样品和122个pNPC样品中的表达。结果如图2所示，所有这些特异高频突变基因在rNPC和pNPC样品中均是有表达的，与pNPC样品相比，rNPC样品中NOTCH1蛋白的表达量显著升高，NCKAP5L蛋白的表达量显著下降，其他rNPC特异的高频突变基因在rNPC和pNPC样品之间均存在相似的表达水平，提示NOTCH1和NCKAP5L蛋白可作为评估鼻咽癌复发的特异性生物标志物。
实施例3
本发明所述生物标志物选自NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的至少一种，其中，选择NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因中的任何一个基因都能实现鼻咽癌的复发评估，选择其中两个或两个以上基因作为评估标志物时，评估准确性相应升高。
为了研究选择不同生物标志物对评估结果准确性的影响，设计实验组1～5，每个实验组选择不同数量的高频突变基因作为生物标志物。利用测序法检测复发鼻咽癌样本中NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因的突变频率，然后以各实验组中的高频突变基因作为生物标志物来评估复发情况，结果如表1所示：
表1不同生物标志物对鼻咽癌复发的评估结果
Figure BDA0002185103280000091
由上述结果可知，只用1种复发鼻咽癌高频突变基因作为生物标志物即能实现鼻咽癌复发评估，其准确率为85％以上；当选择2种高频突变基因组成所述生物标志物时，评估准确率达到90％以上；当选择3种及3种以上高频突变基因组成所述生物标志物时，评估准确率达到95％以上，甚至可达100％(4种和5种高频突变基因组成生物标志物)。随着组成所述生物标志物的特异性高频突变基因数量增多，鼻咽癌复发评估准确率提高。其他1种、2种、3种和4种高频突变基因组合作为生物标志物来评估鼻咽癌复发的准确率与本实施例类似，具体数据省略。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (1)

1.检测生物标志物突变频率的试剂在制备用于检测鼻咽癌复发的试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标志物选自以下生物标志物中的任意一种：(1)NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因和FAM135B基因；(2)NOTCH1基因、NAPA基因、RPL22基因、FAM135B基因和NCKAP5L基因。
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