CN110382439A - 多级样品回收系统 - Google Patents

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Execella Biosciences Inc
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Abstract

提供了多级样品回收系统，其包含自动化2级和3级样品回收系统。此类系统实现从高通量筛选系统(包含利用大规模微毛细管阵列的系统)中快速筛选并回收样品，所述样品包含基于活细胞的样品。在具体筛选系统中，每个微毛细管包括含有变体蛋白质、固定化靶分子和报告元件的溶液。固定化靶分子可以包含任何所关心的分子，包含蛋白质、核酸、碳水化合物和其它生物分子。通过测量来自所述报告元件的信号来评估变体蛋白质与分子靶标的缔合。可以使用本文公开的多级系统鉴别和回收在测定中被鉴别为含有所关心的变体蛋白质的微毛细管的内容物。

Description

多级样品回收系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月30日提交的美国临时申请第62/441,128号的权益，所述美国临时申请的全部内容明确地通过引用整体并入本文。
背景技术
生物样品的分析，包含蛋白质、核酸、碳水化合物和其它重要的生物分子的鉴别、表征以及重新工程化，已经大大获益于样品数的增加和样品大小的减小。例如，如DNA微阵列等二维生物材料微阵列已经实现了对涉及用于处理样品和检测结果的多重方法的高通量筛选方法的开发。
以上方法已经在一些情况下获益于其与用于使用荧光或其它对应的特异性且敏感的标记方法鉴别所关心的样品的光学感测技术的组合。
虽然这种技术提供有关特定样品的分析的信息，例如溶液中存在特定生物分子和潜在地所述生物分子的量或者特定核酸或多肽的序列，但是在不使所关心的样品失活或未以其它方式损坏所关心的样品的情况下，所述技术不能实现对通过测定鉴别的生物样品的回收。
因此，需要继续开发具有高通量能力的改进的微量筛选和分析方法和系统，并且尤其是实现对在筛选和分析中鉴别的样品的回收的方法和系统。
发明内容
本公开通过在一方面提供多级样品回收系统来解决这些或其它需要，所述多级样品回收系统包括：
筛选阵列级，其中所述筛选阵列级相对于显微镜物镜在两个维度上是可控的并且被配置成与筛选阵列可逆关联；以及
第一回收阵列级，其中所述第一回收阵列级相对于所述显微镜物镜在至少一个维度上是可控的并且被配置成与回收阵列可逆关联；
其中所述筛选阵列级和所述第一回收阵列级是能彼此独立控制的。
在一些实施例中，本公开的多级样品回收系统进一步包括与所述筛选阵列级可逆关联的筛选阵列和与所述第一回收阵列级可逆关联的回收阵列。
在一些实施例中，所述系统进一步包括提取束发生器，所述提取束发生器通过所述筛选阵列级中的孔光学地耦合到所述筛选阵列中的微型样品容器。
在一些实施例中，所述系统进一步包括第二回收阵列级。
附图说明
图1A-1C示意性地展示了示例性微毛细管筛选测定的步骤。每个图中的左侧图示是从单个微毛细管的侧面观看的横截面视图。每个图中的右侧图示是微毛细管阵列的一小部分的仰视图。每种情况下的阴影旨在展示如荧光等电磁信号。
图2A-C示出了微毛细管阵列的一小部分的仰视图，所述仰视图展示了针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选，其中使用明视场(图2A)、LiveGreen(图2B)或荧光抗小鼠第二抗体(图2C)对细胞进行成像。
图3示出了含有A431靶细胞和杂交瘤细胞的微毛细管在4小时的孵育过程中的图像。
图4A和图4B示出了微毛细管阵列的一小部分的图像，所述图像针对哺乳动物细胞突出显示了表达和非表达酵母细胞，其中使用明视场(图4A)或荧光抗体(图4B)对细胞进行成像。
图5A-5G展示了永生化人类细胞在微毛细管阵列中在6天的过程中的生长。
图6A-6E是被设计成实施本公开的筛选方法的显微镜系统的不同视图。
图7A展示了示例性筛选阵列级。图7B展示了示例性回收阵列级。
图8示出了在如本发明的样品回收系统所促进的从筛选阵列回收三种所关心的样品期间的筛选阵列和回收阵列相对于彼此的示例性定位。
具体实施方式
最近已在用于高通量分析和蛋白质工程的方法中，例如在被称为“微毛细管单细胞分析和激光提取”或“μSCALE”的方法中，将微毛细管阵列与大量生物样品一起使用。参见Chen等人(2016),《自然-化学生物学(Nature Chem.Biol.)》12:76–81；DOI：10.1038/NCHEMBIO.1978。此方法依赖于微毛细管阵列内的单个细胞的空间隔离，并且因此实现微毛细管阵列的每个微毛细管内的单独样品的重复成像、细胞生长和蛋白质表达。因此，所述技术实现对微毛细管阵列内的数百万个样品的大规模并行、定量的生物化学和生物物理测量，例如，在对从酵母、细菌或其它分布在整个阵列中的合适的细胞中表达的数百万个蛋白质变体的分析中。有利地，所述方法已允许多重样品的同时性时间分辨动力学分析，以及基于靶向表型特征对那些细胞进行分选。
用于生物变体群的定量生物化学和生物物理分析的μSCALE方法和设备的发展已在美国专利申请公开第2016/0244749 A1号中进行了报道，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。然而，根据μSCALE方法提取期望微毛细管的内容物需要在每个样品中包含辐射吸收材料并且将来自脉冲激光器的电磁辐射引入到此材料中，因此增加了提取方法的复杂性。另外，筛选微腔阵列中的生物变体的早期方法依赖于向阵列化样品中添加微粒以部分或完全地抑制电磁辐射透射进出样品从而最小化从缺乏期望结合活性的微腔发射的信号。参见美国专利申请公开第U.S.2014/0011690 A1号。在本公开的一些方面，所述筛选方法不依赖于这些另外的样品组分或操纵，因此简化并提高了筛选技术的效率。在均提交于2016年12月12日的美国专利申请第62/433,210号和第15/376,588号中已描述了所述筛选方法，所述美国专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
在这些方法中的具体应用中，并且如将在本文中更详细地公开的，靶分子可以固定在如颗粒(例如，磁性颗粒)、细胞或微毛细管壁的表面等表面上。然后，可以通过若干方法，包含利用可检测抗体的方法和测量靶细胞内产生的可检测信号的方法，来测量在这些方法中变体蛋白质与靶分子之间的相互作用。应理解，可以在高通量筛选中使用这种方法来发现结合到靶分子，例如细胞或其它表面上的靶分子的蛋白质变体。
筛选方法
因此，在一些方面，本公开提供了筛选变体蛋白质群的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包括多个微毛细管的微毛细管阵列，每个微毛细管包括变体蛋白质、固定化靶分子和报告元件，其中所述变体蛋白质以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合；以及
测量来自至少一个报告元件的指示至少一个变体蛋白质与至少一个固定化靶分子的缔合的信号以鉴别至少一个所关心的微毛细管。
在这些方法中，微毛细管阵列优选地包括多个纵向熔融毛细管，例如熔融石英毛细管，但是也可以在阵列中使用任何其它合适的材料。参见例如，PCT国际专利公开第WO2012/007537号和第WO2014/008056号，所述PCT国际专利公开的公开内容通过引用整体并入本文。可以例如通过捆扎数百万个或数十亿个二氧化硅毛细管并且通过热过程将它们熔融在一起来制造这种阵列，但是也可以采用其它合适的制造方法。熔融过程可以包括例如以下步骤：i)对在张力下拉延成单包层纤维的毛细管单拉延玻璃进行加热；ii)由单拉延玻璃、通过捆扎、加热和拉延来产生毛细管多拉延单毛细管；iii)由多拉延单毛细管、通过另外的捆扎、加热和拉延来产生毛细管多-多拉延多毛细管；iv)由多-多拉延多毛细管、通过在压块中进行堆叠来产生拉延玻璃的块组合件；v)由块组件、通过热量和压力进行处理来形成块压块；以及vi)通过以精确的长度(例如，1mm)切割块压块来形成块成型块。
在一些实施例中，制造方法进一步包括切割石英毛细管，从而形成密度非常高的玻璃微毛细管阵列。在一些实施例中，微毛细管阵列可以被切割成大约1毫米高，但是设想了甚至更短的微毛细管阵列，包含10μm高或甚至更短的阵列。在一些实施例中，设想了甚至更短的微毛细管阵列，包含1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的阵列。
在一些实施例中，设想了甚至更长的微毛细管阵列，包括10mm或甚至更长的阵列。在一些实施例中，阵列的高度为200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。
这种过程形成适合于在本发明方法中使用密度非常高的微毛细管阵列。在示例性阵列中，每个微毛细管的直径为约5μm并且其开放空间(即，表示每个微毛细管的内腔)为约66％。在一些阵列中，阵列的处于开放状态的比例的范围介于约50％与约90％之间，例如约60到75％，如由滨松(Hamamatsu)提供的开放区域为约67％的微毛细管阵列。在一个特定实例中，具有直径为5μm的微毛细管和开放空间为约66％的10×10cm阵列具有总计约3.3亿个微毛细管。
在各个实施例中，阵列中的每个微毛细管的内径范围介于约1μm与500μm之间。在一些阵列中，每个微毛细管的内径范围介于约1μm与300μm之间；任选地介于约1μm与100μm之间；进一步任选地介于约1μm与75μm之间；仍进一步任选地介于约1μm与50μm之间；并且仍进一步任选地介于约5μm与50μm之间。
在一些微毛细管阵列中，阵列的开放区域(OA)占开放区域的90％，使得当孔径在1μm与500μm之间变化时，每厘米阵列的微毛细管的数量在约460与1100多万之间变化。在一些微毛细管阵列中，阵列的开放区域占开放区域的67％，使得当孔径在1μm与500μm之间变化时，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约340与800,000多之间变化。在一些实施例中，孔径为1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、250μm、350μm或500μm。在一些实施例中，孔径介于5μm与500μm之间。在一些实施例中，孔径介于10μm与450μm之间。在一些实施例中，孔径介于50μm与500μm之间。在一些实施例中，孔径介于100μm与500μm之间。在一些实施例中，孔径介于250μm与500μm之间。在一些实施例中，孔径介于350μm与500μm之间。在一些实施例中，孔径介于100μm与450μm之间。在一些实施例中，孔径介于250μm与450μm之间。
在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量为约400；500；1000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；20,000；50,000；100,000；200,000；300,000；400,000；500,000；600、000；700,000；或800,000。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约500与800,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约1000与700,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约2000与600,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约10,000与800,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约10,000与700,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约50,000与800,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约50,000与700,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约100,000与700,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约100,000与600,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约100,000与500,000之间变化。在一些实施例中，每平方厘米阵列的微毛细管的数量在约500,000与800,000之间变化。
在一个特定的实施例中，可以通过结合数十亿个石英毛细管并且然后通过热过程将它们熔融在一起来制造微毛细管阵列。在这之后，切出切片(0.5mm或以上)以形成纵横比非常高的玻璃微毛细管阵列。阵列也可商购自如滨松光子学株式会社(HamamatsuPhotonics K.K.)(日本)；盈创公司(Incom,Inc.)(马萨诸塞州)；光子技术公司(PhotonisTechnologies,S.A.S.)(法国)等。在一些实施例中，阵列的微毛细管在一端处用附接到阵列的固相基底封闭。
本发明的筛选方法的微毛细管阵列可以在所述阵列内包括任何数量的微毛细管。在一些实施例中，微毛细管阵列包括至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个、至少10,000,000个或甚至更多个微毛细管。优选地根据要筛选的变体蛋白质文库的大小选择阵列内的微毛细管的数量。
如上所描述的，在本发明的筛选方法中使用的微毛细管阵列中的每个毛细管包括变体蛋白质、固定化靶分子和报告元件，其中所述变体蛋白质是经受所述筛选方法的变体蛋白质群中的一个变体蛋白质。变体蛋白质群可以是任何可以适当地分布在微毛细管阵列内的蛋白质群。理想地，变体蛋白质群分布在微毛细管阵列中，使得每个微毛细管包括少量的不同变体蛋白质，优选地每个微毛细管仅包含单个不同的变体蛋白质。重要的是，组合固定化靶分子选择变体蛋白质群，使得群中的蛋白质中的至少一些蛋白质可以以特定的亲和力与固定化靶分子缔合，使得可通过测量来自报告元件的信号来检测所述缔合。在一些实施例中，本发明的微毛细管筛选方法允许向微毛细管添加组分的数分钟内发生变体蛋白质与靶分子之间的筛选反应和/或相互作用(包含结合相互作用)。在一些实施例中，变体蛋白质与靶分子之间的反应和/或相互作用在约1分钟到约10分钟内发生和/或可在所述时间内检测。在一些实施例中，变体蛋白质与靶分子之间的反应和/或相互作用在约1小时到约6小时内发生和/或可在所述时间内检测。在一些实施例中，变体蛋白质与靶分子之间的反应和/或相互作用在使得微毛细管内的细胞是活的且健康的一段时间内发生和/或可在所述时间内检测。在一些实施例中，变体蛋白质与靶分子之间的反应和/或相互作用在使得微毛细管内的细胞是活的一段时间内发生和/或可在所述时间内检测。在一些实施例中，细胞可以在从微毛细管和/或微腔移除后生长。在一些实施例中，细胞在从微毛细管和/或微腔中移除后是活的。在一些实施例中，变体蛋白质与靶分子之间的反应和/或相互作用发生在微毛细管内。
如本文所使用的，术语“蛋白质”既指全长蛋白质或多肽序列又指其片段。这种片段可以包含保留如例如结合活性等功能活性的片段。术语“蛋白质”和“多肽”在整个公开中可互换地使用并且包含通过肽键共价连接的氨基酸链，其中多肽中的每个氨基酸可以称为“氨基酸残基”。对术语“蛋白质”或“多肽”的使用不应被视为限于任何特定长度的多肽，例如，任何特定数量的氨基酸残基。主题蛋白质可以包含具有如翻译后修饰等非肽修饰(包含糖基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化等)的蛋白质或者如烷基化、乙酰化、酯化、聚乙二醇化等其它化学修饰。另外的修饰，如在多肽序列内包含非天然氨基酸或在氨基酸残基之间包含非肽键，也应被视为处于术语“蛋白质”或“多肽”的定义范围内。
变体蛋白质群优选地为具有微小变化的蛋白质群，例如每个蛋白质具有略微不同的氨基酸序列的蛋白质群。因此，筛选测定可以鉴别具有期望特性的变体蛋白质序列。因为筛选可以在微观尺度下以如此大的数量执行，所以可以在相对短的时间内测定大量的变体蛋白质。在一些实施例中，筛选过程在4小时到6小时内发生。在一些实施例中，筛选过程在4小时、5小时或6小时内发生。在一些实施例中，筛选过程需要介于每微毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)1-3秒之间。在一些实施例中，筛选过程需要约每微毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)1秒。在一些实施例中，筛选过程需要约每微毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)2秒。在一些实施例中，筛选过程需要约每微毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)3秒。
在一些实施例中，所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包括来自所述变体蛋白质群的0到5个不同的变体蛋白质。在具体实施例中，所述微毛细管阵列中的每个微毛细管包括来自所述变体蛋白质群的0到4个、0到3个、0到2个或者甚至0到1个不同的变体蛋白质。应当理解，变体蛋白质群中的不同变体蛋白质的分子结构不同，无论差异在于其氨基酸序列还是蛋白质的其它某种化学修饰。
应理解，每个微毛细管将通常包括同一变体蛋白质的许多多个拷贝，这取决于特定的变体蛋白质的来源和表达水平(参见下文)。在一些实施例中，每个微毛细管将包括特定变体蛋白质的数千个、数万个、数十万个、数百万个、数十亿个或甚至更多个分子，这取决于变体蛋白质如何递送到微毛细管或在微毛细管内如何表达。
通常使用在生物表达系统中，例如在体外(即，无细胞)表达系统或者在体内或细胞表达系统中的基因文库产生变体蛋白质群。示例性细胞表达系统包含例如动物系统(例如，哺乳动物系统)；真菌系统(例如，酵母系统)；细菌系统；昆虫系统或植物系统。在具体实施例中，表达系统是哺乳动物系统或酵母系统。表达系统，无论是细胞表达系统还是无细胞表达系统，通常包括编码变体蛋白质群的遗传物质文库。细胞表达系统提供的优点在于，具有期望表型的细胞，例如表达如能够以高亲和力与固定化靶分子缔合的变体蛋白质等特定所关心的变体蛋白质的细胞，可以生长并繁殖，从而促进并简化对由细胞表达的所关心的蛋白质的鉴别和表征。
编码大变体蛋白质群的基因文库在生物工程学领域中是公知的。这种文库通常用于依赖定向进化过程的系统中以鉴别具有如与靶分子的高亲和力结合、稳定性、高表达或特定光谱(例如，荧光性)或酶活性等有利特性的蛋白质。所述文库通常包含与来自宿主表达系统的序列的基因融合，例如指导亚细胞定位的蛋白质片段，其中靶片段将表达的变体融合蛋白质群定向到细胞或病毒颗粒的特定位置以实现变体蛋白质群的活性筛选。可以使用如本领域中熟知的常规生物工程技术产生大量变体蛋白质(例如，106个变体、108个变体、1010个变体、1012个变体或甚至更多个变体)。这种文库可以包含本文所描述的任何变体蛋白质，包含抗体、抗体片段、单链可变片段或天然蛋白质配体。
因此，在一些实施例中，变体蛋白质是可溶性蛋白质，例如由细胞表达系统分泌的可溶性蛋白质。示例性可溶性变体蛋白质包含抗体和抗体片段；如二硫键合的肽支架等替代性蛋白质支架；细胞表面受体蛋白质的细胞外结构域；如例如G蛋白偶联受体配体等受体配体；其它肽激素、凝集素等。有利地，在本发明的方法中针对结合活性而筛选的变体蛋白质不需要共价连接到表达它们的细胞或病毒以在筛选测定后鉴别所述变体蛋白质，因为具有期望结合活性的变体蛋白质以及表达所述变体蛋白质的细胞在整个测定中保持共同定位于同一微毛细管内。分离期望微毛细管的内容物，然后增殖负责表达期望变体蛋白质的细胞或病毒克隆，由此实现对所述蛋白质的鉴别和表征。与通过将蛋白质融合到细胞或病毒颗粒的表面上的分子而显示所关心的变体蛋白质的筛选测定不同，在本发明的筛选方法中鉴别的变体蛋白质在鉴别所述变体蛋白质后不需要以任何方式对其作出改变。因此，在筛选中观察到的变体蛋白质的活性更可能表示那些蛋白质在其后续应用中的实际活性。
然而，在其它实施例中，可能期望变体蛋白质是膜缔合蛋白质，例如与表达系统中的细胞或病毒颗粒的表面保持缔合的蛋白质。在变体蛋白质和其靶分子介导生物组织内的两个细胞之间的相互作用时，细胞缔合的变体蛋白质的筛选可能是令人期望的。在针对与如例如G蛋白偶联受体或离子通道等传统上“无成药性的(non-druggable)”蛋白质靶标的相互作用进行的筛选时，筛选细胞缔合的变体蛋白质的能力也可能是令人期望的。
除了变体蛋白质之外，本发明的筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还包括固定化靶分子。固定化靶分子充当筛选测定的变体蛋白质的潜在结合伙伴。与每个微毛细管理想地包含略微不同的序列的变体蛋白质的变体蛋白质群不同，固定化靶分子理想地在阵列的每个微毛细管中具有同一种分子结构。
在一些实施例中，靶分子是靶蛋白质或多肽、靶核酸、靶碳水化合物、靶脂质或这些靶分子中的两种或更多种靶分子的组合。例如，在一些实施例中，靶分子可以是经过脂质修饰的或经过糖基化的蛋白质。在一些实施例中，靶分子固定在表面上。在更具体的实施例中，靶分子固定在如靶细胞等细胞的表面、珠粒的表面、微毛细管壁的表面或其它合适的表面上。在其它更具体的实施例中，靶分子是天然蛋白质，例如固定在细胞的表面上的天然蛋白质。在仍其它更具体的实施例中，靶分子固定在被配置成通过重力沉降而沉降在微毛细管中的表面上。
如先前所提到的，在本公开的方法中，变体蛋白质在微毛细管内以特定亲和力与固定化靶分子缔合。重要的是，对于所关心的变体蛋白质，这种亲和力应该足够强，以便可以通过来自报告元件的信号测量所述缔合。通常通过如本领域的普通技术人员所熟知的解离常数(Kd)评估结合亲和力，其中解离常数越低，亲和力越高。在一些实施例中，所关心的变体蛋白质与固定化靶分子之间的缔合显示出的解离常数处于毫摩尔到微摩尔的范围内。在具体实施例中，缔合显示出的解离常数为微摩尔到高纳摩尔(即，10-6M到10-8M)。在更具体的实施例中，缔合显示出的解离常数为较低纳摩尔到高皮摩尔(即，10-8M到10-10M)。在甚至更具体的实施例中，缔合显示出的解离常数处于皮摩尔范围内(即，10-10M到10-12M)或甚至更低。在一些实施例中，第一细胞表达并分泌变体蛋白质或多肽，并且第二细胞包括靶标，使得第一细胞结合到第二细胞。在一些实施例中，第二细胞表达靶标。在一些实施例中，第二用靶标标记。在一些实施例中，第一细胞在微毛细管中结合到第二细胞。在一些实施例中，第一细胞在微毛细管和/或微腔中结合到第二细胞。
在一些实施例中，靶分子是靶蛋白质或多肽、靶核酸、靶碳水化合物、靶脂质或这些靶分子中的两种或更多种靶分子的组合。例如，在一些实施例中，靶分子可以是经过脂质修饰的或经过糖基化的蛋白质。在一些实施例中，靶分子固定在表面上。在更具体的实施例中，靶分子固定在如靶细胞等细胞的表面、珠粒的表面、微毛细管壁的表面或其它合适的表面上。在其它更具体的实施例中，靶分子是天然蛋白质，例如固定在细胞的表面上的天然蛋白质。在仍其它更具体的实施例中，靶分子固定在被配置成通过重力沉降而沉降在微毛细管中的表面上。在一些实施例中，使用一个、两个、三个或四个或更多个靶分子，以鉴别结合到一个、两个、三个或四个或更多个靶分子的变体。在一些实施例中，靶分子单独地包含在单独的不同微毛细管中。在一些实施例中，靶分子单独地包含在单个阵列内的单独的不同微毛细管中。在一些实施例中，靶分子单独地包含在一个或多个阵列内的单独的不同微毛细管中。在一些实施例中，靶分子一起包含在单个微毛细管中。在一些实施例中，靶分子一起包含在单个阵列内的单个微毛细管中。在一些实施例中，变体结合到的一个、两个、三个或四个或更多个靶分子是原始靶分子的衍生物或变体，包含化学修饰、二次翻译后修饰或序列同一性变体(包含例如与原始核酸或氨基酸靶序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的变体)。
除了变体蛋白质和固定化靶分子之外，本发明的筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管还包括报告元件。重要的是，报告元件提供指示变体蛋白质与固定化靶分子的缔合的可测量信号并且因此用于鉴别包含所关心的变体蛋白质的微毛细管。
在一些实施例中，报告元件是能够结合到变体蛋白质群中的每个变体蛋白质的经过标记的抗体或其它分子。更具体的，报告元件是经过荧光标记的抗体或其它结合分子。
在一些实施例中，经过标记的抗体是经过标记的第一抗体或经过标记的第二抗体。出于本公开的目的，第一抗体通常被视为直接结合到所关心的抗原的抗体，而第二抗体通常被视为出于标记第一抗体的目的而结合到第一抗体上的恒定区的抗体。因此，第二抗体经常用荧光团或其它可检测标签标记或者用能够产生可检测信号的酶标记。它们通常对来自不同物种的第一抗体具有特异性。例如，如本领域的普通技术人员所理解的，可以使用山羊或其它动物物种来产生针对小鼠、鸡、兔的第二抗体或者除了来自该动物物种的抗体之外的几乎任何第一抗体。在具体实施例中，经过标记的抗体是荧光抗体或酶联抗体。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于AlexaFluor 3、AlexaFluor 5、AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 500、AlexaFluor 514、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700和AlexaFluor 750(分子探针AlexaFluor(Molecular ProbesAlexaFluor)染料，可购自生命技术公司(Life Technologies,Inc.)(美国))。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于Cy染料，包含Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7(可购自通用电气生命科学(GE Life Sciences)或Lumiprobes)。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 750和DyLight 800(可购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)(美国))。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于FluoProbes390、FluoProbes 488、FluoProbes 532、FluoProbes 547H、FluoProbes 594、FluoProbes647H、FluoProbes 682、FluoProbes 752和FluoProbes 782、AMCA、DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸)；7-羟基-4-甲基香豆素-3；7-羟基香豆素-3；MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸)；7-甲氧基香豆素-3；AMF(4'-(氨甲基)荧光素)；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-FAM(6-羧基荧光素)；5(6)-FAM尸胺；5-FAM尸胺；5(6)-FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC(FITC异构体I；荧光素-5-异硫氰酸酯)；5-FITC尸胺；荧光素-5-马来酰亚胺；5-IAF(5-碘乙酰氨基荧光素)；6-JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)；5-CR 110(5-羧基罗丹明110)；6-CR 110(6-羧基罗丹明110)；5-CR6G(5-羧基罗丹明6G)；6-CR6G(6-羧基罗丹明6G)；5(6)-羧基罗丹明6G尸胺；5(6)-羧基罗丹明6G乙二胺；5-ROX(5-羧基-X-罗丹明)；6-ROX(6-羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；5-TAMRA尸胺；6-TAMRA尸胺；5-TAMRA乙二胺；6-TAMRA乙二胺；5-TMR C6马来酰亚胺；6-TMR C6马来酰亚胺；TR C2马来酰亚胺；TR尸胺；5-TRITC；G异构体(四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯)；6-TRITC；R异构体(四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯)；丹酰尸胺(5-二甲基氨基萘-l-(N-(5-氨基戊基))磺酰胺)；EDANS C2马来酰亚胺；荧光胺；NBD；和吡咯亚甲基和其衍生物。在一些实施例中，使用的报告元件可以是用AlexaFluor 633标记的驴抗山羊IgG第二抗体。
在一些方法实施例中，例如在图1A-1C中展示的筛选方法中，变体蛋白质介导报告元件与靶分子(在此实例中为靶细胞的表面上的靶分子)的缔合。如图1B所示，其中变体蛋白质(此处命名为“所分泌的蛋白质”)对其在靶细胞上的靶分子具有足够的亲和力，以便变体蛋白质在微毛细管溶液的条件下与靶细胞缔合。报告元件(此处命名为“荧光检测抗体”)结合到变体蛋白质，理想地在不影响变体蛋白质对靶分子的亲和力的表位处，如图1C所示。
如本领域的普通技术人员将理解的，当本发明的筛选方法中使用如荧光抗体等可溶性报告元件时，由在微毛细管内的溶液中保持游离(即，未结合到变体蛋白质或结合到未结合到靶分子的变体蛋白质)的任何过量报告元件发射出的信号不应如此高以至于淹没通过变体蛋白质与靶分子缔合的报告元件的信号(参见例如，图1C中展示的未缔合的荧光检测抗体)。然而，可以通过限制微毛细管溶液内的经过标记的抗体或其它报告元件的浓度使这种背景信号最小化。另外，在使用荧光显微镜测量来自筛选方法的信号的情况下，将显微镜配置成对包围式曝光靶分子的位置的相对窄的景深(例如，当靶细胞通过重力沉降作用沉淀在那里时的微毛细管的底部)进行成像可以使来自未与靶分子缔合的报告元件的背景信号最小化。
在其它实施例中，报告元件是产生与结合事件，如例如变体蛋白质与固定化靶分子(例如受体或细胞的表面上的其它靶分子)的缔合相关的可检测信号的细胞内报告元件。在这些实施例中，报告元件可以包括整个细胞途径，如例如细胞内信号传导途径。这种途径应该包含或者被设计成包含可检测信号作为所述途径的下游读数。相比于，可检测信号结合到靶细胞的外表面的图1A-1C中所示的测定，这些实施例中的可检测信号将通常在靶细胞内部产生。
已经开发了在高通量筛选测定中，尤其是在药物发现筛选中使用的许多细胞内信号传导途径，并且可以使所述细胞内信号传导途径适用于在本发明的测定中使用。参见例如，Michelini等人(2010),《分析和生物分析化学(Anal.Bioanal.Chem.)》398:227-38。具体地，与细胞的表面上的靶分子的结合事件导致产生可测量信号，尤其是荧光信号的任何细胞测定可以用作本发明的测定中的报告元件。优选地，可以将细胞工程化成在其表面上表达所关心的靶分子，使得特定变体蛋白质与靶分子的结合以及随后的细胞内信号传导途径的激活导致从报告元件产生可检测信号，从而实现使微毛细管的鉴别为阳性命中(positive hit)。绿色荧光蛋白(GFP)或各种变体荧光蛋白中的任何一种变体荧光蛋白的表达在这种细胞测定中通常用作读数并且可以充当本发明的方法中的报告元件端点。报告元件还可以包含RFP(红色荧光蛋白)和YFP(黄色荧光蛋白)以及其变体。可替代地，信号传导读数可以通过荧光素酶或产生生物发光信号的其它相关酶提供，如本领域的普通技术人员所熟知的，。参见例如，Kelkar等人(2012),《药理学新见(Curr.Opin.Pharmacol.)》12:592-600。来自细菌系统和植物系统的其它公知的酶报告基因包含β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)等，其可适用于在本发明的筛选测定中与合适的成色底物(colorogenic substrate)一起使用。使用萤火虫荧光素酶和GFP的转录报告基因已被广泛用于研究转录因子的功能和调节。所述转录报告基因同样可以适用于在本发明的筛选测定中使用。示例性细胞内信号传导系统可以商购获得，例如来自凯杰公司(Qiagen)的CignalTM报告基因测定试剂盒(参见例如，www.sabiosciences.com/reporterassays.php)，所述试剂盒可与荧光素酶或GFP读数一起获得。可以适当地重新设计这种系统以在本发明的筛选方法中使用。
应理解，变体蛋白质表达系统，尤其是表达系统是细胞表达系统的变体蛋白质表达系统，可以在变体蛋白质的表达之前和/或在将测定混合物递送到微毛细管的阵列中之前与固定化靶分子和报告元件(或如负责产生固定化靶分子和/或报告元件的细胞组分等合适的组分)组合。与现有技术的微毛细管筛选系统相比，这种方法有利地允许组分之间的相互作用的定时的灵活性和控制，其中筛选测定的所有组分通常以静态形式混合并装入微毛细管中。相比而言，本发明的方法通过允许细胞组分的生长、遗传组分的表达或二者而使结合测定的组分中的一些或所有组分能够在微毛细管内原位产生。
还应理解的是，微毛细管内的筛选测定的每种组分的浓度，包含变体蛋白质的浓度、固定化靶分子的浓度以及报告元件的浓度，可以在测定中根据需要进行调节以获得最佳结果。具体地，可能期望调节变体蛋白质和/或固定化靶分子的浓度以在这些组分之间的实现期望缔合水平。缔合水平还将取决于这些组分之间的特定亲和力，其中在给定组分浓度的情况下，较高的亲和力导致较高缔合水平，并且在给定浓度的情况下，较低的亲和力导致较低缔合水平。同样可以调节报告元件的浓度以实现最佳的信号输出水平，如本领域的普通技术人员将理解的。在一些实施例中，所采用的报告元件包含第二抗体，包含可商购的抗体。在一些实施例中，稀释范围是1:200-1:2000。在一些实施例中，稀释范围是1:300-1:2000。在一些实施例中，稀释范围是1:300-1:1500。在一些实施例中，稀释范围是1:400-1:1500。在一些实施例中，稀释范围是1:500-1:1500。在一些实施例中，稀释范围是1:200-1:1000。在一些实施例中，稀释范围是1:500-1:1000。在一些实施例中，稀释范围是1:1000-1:2000。在一些实施例中，稀释范围是1:1500-1:2000。在一些实施例中，稀释为1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500或1:2000。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于AlexaFluor 3、AlexaFluor 5、AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 500、AlexaFluor 514、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700和AlexaFluor 750(分子探针AlexaFluor(Molecular Probes AlexaFluor)染料，可购自生命技术公司(Life Technologies,Inc.)(美国))。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于Cy染料，包含Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7(可购自通用电气生命科学(GE LifeSciences)或Lumiprobes)。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 550、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 650、DyLight 680、DyLight 750和DyLight 800(可购自赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)(美国))。在一些实施例中，荧光团可以包含但不限于FluoProbes 390、FluoProbes 488、FluoProbes 532、FluoProbes 547H、FluoProbes 594、FluoProbes 647H、FluoProbes 682、FluoProbes 752和FluoProbes 782、AMCA、DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸)；7-羟基-4-甲基香豆素-3；7-羟基香豆素-3；MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸)；7-甲氧基香豆素-3；AMF(4'-(氨甲基)荧光素)；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素)；6-FAM(6-羧基荧光素)；5(6)-FAM尸胺；5-FAM尸胺；5(6)-FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC(FITC异构体I；荧光素-5-异硫氰酸酯)；5-FITC尸胺；荧光素-5-马来酰亚胺；5-IAF(5-碘乙酰氨基荧光素)；6-JOE(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)；5-CR 110(5-羧基罗丹明110)；6-CR 110(6-羧基罗丹明110)；5-CR6G(5-羧基罗丹明6G)；6-CR6G(6-羧基罗丹明6G)；5(6)-羧基罗丹明6G尸胺；5(6)-羧基罗丹明6G乙二胺；5-ROX(5-羧基-X-罗丹明)；6-ROX(6-羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；5-TAMRA尸胺；6-TAMRA尸胺；5-TAMRA乙二胺；6-TAMRA乙二胺；5-TMR C6马来酰亚胺；6-TMR C6马来酰亚胺；TR C2马来酰亚胺；TR尸胺；5-TRITC；G异构体(四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯)；6-TRITC；R异构体(四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯)；丹酰尸胺(5-二甲基氨基萘-l-(N-(5-氨基戊基))磺酰胺)；EDANS C2马来酰亚胺；荧光胺；NBD；和吡咯亚甲基和其衍生物。在一些实施例中，使用的报告元件可以是用AlexaFluor633标记的驴抗山羊IgG第二抗体。
在一些实施例中，本发明的筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管进一步包括用于提高细胞表达系统的活力的一种或多种试剂。具体地，包含一种或多种药剂以防止在例如通过激光脉冲(参见下文)分离所关心的微毛细管的内容物的步骤期间产生细胞损坏。在优选的实施例中，试剂是甲基纤维素(例如，以0.001到10wt％)；葡聚糖(例如，以0.5到10wt％)；普朗尼克F-68(例如，以0.01到10wt％)；聚乙二醇(“PEG”)(例如，以0.01到10wt％)；聚乙烯醇(“PVA”)(例如，以0.01到10wt％)等。可替代地或另外，本发明的筛选方法的微毛细管阵列中的每个微毛细管可以进一步包括生长添加剂，如例如，50％条件生长培养基、25％标准生长培养基或25％血清。在一些实施例中，将条件生长介质调节24小时。在一些实施例中，添加的试剂是胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、胰岛素样生长因子或这些试剂的组合或以上列举试剂中的任何试剂。
本公开的筛选方法优选地包含以下另外的步骤：测量来自至少一个报告元件的指示至少一个变体蛋白质与至少一个固定化靶分子的缔合的信号以鉴别至少一个所关心的微毛细管。在一些实施例中，所测量的信号是荧光信号、吸光度信号、明视场信号、暗视场信号、相衬信号等。因此，测量步骤可以由适当的检测器装置，例如能够检测电磁辐射或任何其它合适信号的装置执行。在具体实施例中，测量步骤由显微镜，例如荧光显微镜或者被配置成检测上文提及的信号的任何其它显微镜执行。
应理解，在优选实施例中，本发明的筛选方法中使用的微毛细管不包括能够抑制电磁辐射的透射的微粒。换句话说，微毛细管优选地对入射在微毛细管阵列上的电磁辐射，尤其是沿微毛细管的纵轴入射在微毛细管阵列上的电磁辐射，完全透明。在其它优选实施例中，本发明的筛选方法的微毛细管不包括磁性微粒或珠粒。在仍其它优选实施例中，本发明的筛选方法的微毛细管不包括能够抑制电磁辐射的透射的微粒、磁性微粒或磁珠。
在其它优选实施例中，在本发明的筛选方法中使用的微毛细管不包括电磁辐射吸收材料。然而，应理解，出于本发明的此方面的目的，报告元件的在筛选方法中负责产生可测量信号的组分，例如荧光抗体上的荧光团，不应被视为电磁辐射吸收材料。
在一些实施例中，本发明的筛选方法进一步包括分离所关心的微毛细管的内容物的步骤。在具体实施例中，通过用激光器对所关心的微毛细管施以脉冲来分离所关心的微毛细管的内容物。在一些实施例中，激光器是二极管激光器。在一些实施例中，激光器是纳秒脉冲激光器。在一些实施例中，激光器是皮秒脉冲激光器。更具体地，激光器可以是二极管激光器或二极管泵浦Q开关Nd:YLF激光器。在一些实施例中，激光器可以指向微毛细管壁与微毛细管中含有的样品之间的水-玻璃界面。在不旨在受理论束缚的情况下，据信，在此界面处激发UV激光器可以破坏通常将样品保持在微毛细管中的弯月面/水表面张力，从而允许样品通过重力的作用从阵列落下。在其它实施例中，通过激光触发的蒸汽力膨胀来分离所关心的微毛细管的内容物。在一些实施例中，通过破坏微毛细管本身的玻璃来分离微毛细管的内容物。
用于筛选和样品回收的系统
根据本发明的另一个方面，提供了用于筛选变体蛋白质群的系统，所述系统包括：
包括多个微毛细管的阵列，每个微毛细管包括变体蛋白质、固定化靶分子和报告元件，其中所述变体蛋白质以特定亲和力与所述固定化靶分子缔合。以上详细描述了这些筛选装置的部件。
在一些实施例中，所述筛选系统进一步包括光源和检测器。在一些实施例中，光源是尼康Intensilight照明器(Nikon Intensilight Illuminator)。在一些实施例中，光检测器是如电荷耦合装置(CCD)或互补型金属氧化物半导体(CMOS)成像传感器等成像相机。在一些实施例中，光检测器是滨松ORCA-Flash4.0 CMOS相机。根据筛选系统中使用的特定报告元件选择光源和检测器。例如，在报告元件产生荧光信号的情况下，光源提供适当波长的激发光以激发荧光探针。同样，检测器被选择成对荧光探针发射的光的波长敏感。光源和检测器可以是例如如荧光显微镜等显微镜的部件，或者它们可以是单独的装置，如本领域的普通技术人员将理解的。优选地，荧光显微镜是倒置荧光显微镜。
在图6A-6E的图示中展示了用于根据本发明的方法筛选变体蛋白质群并且从筛选中回收所关心的样品的示例性显微镜。图6A示出了从显微镜上方观看的透视图，展示了筛选阵列级12、回收阵列14、回收阵列固持器16、第一回收阵列级18和第二回收阵列级20。图6B示出了装置的前视图。图6C示出了从右侧观看的视图。图6D中提供了装置右侧的放大视图，其详细展示了此系统中的筛选阵列级、回收阵列级与回收阵列之间的关系。图6E提供了此特定多级样品回收系统的各种部件的分解图。
在一些方面，本公开因此提供了多级样品回收系统，其包括：
筛选阵列级，其中所述筛选阵列级相对于显微镜物镜在两个维度上是可控的并且被配置成与筛选阵列可逆关联；以及
第一回收阵列级，其中所述第一回收阵列级相对于所述显微镜物镜在至少一个维度上是可控的并且被配置成与回收阵列可逆关联；
其中所述筛选阵列级和所述第一回收阵列级是能彼此独立控制的。在一些实施例中，筛选阵列级和第一回收级在物理上彼此分离。在一些实施例中，在两个维度上可控的筛选阵列级相对于显微镜物镜在水平维度和/或竖直维度上是可控的。在一些实施例中，在至少一个维度上可控的第一回收阵列级相对于显微镜物镜在水平维度和/或竖直维度上是可控的。在一些实施例中，在至少一个维度上可控的第一回收阵列级相对于显微镜物镜在水平维度上是可控的。在一些实施例中，在至少一个维度上可控的第一回收阵列级相对于显微镜物镜在竖直维度上是可控的。在一些实施例中，筛选阵列级可以定位成在竖直维度上更靠近第一回收级。在一些实施例中，筛选阵列级可以定位成在竖直维度上更远离回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度和竖直维度二者上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级收集并且进入第一回收级。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级，并且通过筛选阵列级和/或第一回收级的移动和/或重新定位来促进此移动。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级，并且通过筛选阵列级的移动和/或重新定位来促进此移动。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级，并且通过第一回收级的移动和/或重新定位来促进此移动。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级收集并且进入第一回收级，并且通过筛选阵列级和/或第一回收级的移动和/或重新定位来促进此收集。
在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级收集并且进入第一回收级，并且通过筛选阵列级的移动和/或重新定位来促进此收集。在一些实施例中，在样品回收过程期间，样品从筛选阵列级收集并且进入第一回收级，并且通过第一回收级的移动和/或重新定位来促进此收集。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度和/或竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度和/或竖直维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，激光器处于固定位置。在一些实施例中，激光器相对于显微镜物镜处于固定位置。在一些实施例中，激光在穿过第一回收级之前穿过筛选阵列级。在一些实施例中，激光在穿过第一回收级之前穿过筛选阵列级，从而使样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级。在一些实施例中，激光首先穿过(例如，激活并激发)筛选阵列级，从而使样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级。在一些实施例中，通过激光使样品从筛选阵列级移动并且进入第一回收级。在一些实施例中，激光穿过筛选阵列级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)并且进入第一回收级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)。在一些实施例中，激光穿过筛选阵列级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)并且进入第一回收级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)，从而使样品从筛选阵列级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)移动并且进入第一回收级中的一个毛细管(即，腔、微毛细管、微腔、孔和/或微孔)。在一些实施例中，激光器相保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在水平维度和/或竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级和第一回收级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在水平维度和/或竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位筛选阵列级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在水平维度和/或竖直维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在水平维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，在激光器保持处于固定位置(即，不会相对于显微镜物镜移动)时，可以在样品回收过程期间在竖直维度上移动和/或重新定位第一回收级。在一些实施例中，所述两个级之间的竖直距离为约20mm。在一些实施例中，筛选级与回收级之间的竖直距离为约20mm。在一些实施例中，在定位于(例如，凹入)筛选级中的筛选阵列与定位于(例如，凹入)回收级中的回收载玻片之间存在间隙。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的回收载玻片之间的间隙为约1mm、约2mm或约3mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的回收载玻片之间的间隙为约1mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的回收载玻片之间的间隙为约2mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的回收载玻片之间的间隙为约3mm。在一些实施例中，将回收载玻片称为第一回收阵列。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的第一回收阵列之间的间隙为约1mm、约2mm或约3mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的第一回收阵列之间的间隙为约1mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的第一回收阵列之间的间隙为约2mm。在一些实施例中，凹入和/或定位于筛选级中的筛选阵列与凹入和/或定位于回收级中的第一回收阵列之间的间隙为约3mm。在一些实施例中，筛选阵列级和回收级被定位成使得显微镜物镜可以对筛选阵列和回收载玻片二者进行成像。在一些实施例中，筛选阵列级和第一回收阵列级被定位成使得显微镜物镜可以对筛选阵列和第一回收阵列二者进行成像。在一些实施例中，并且筛选阵列处于物镜的工作距离内。在一些实施例中，并且第一回收阵列处于物镜的工作距离内。在一些实施例中，筛选阵列和第一回收阵列处于物镜的工作距离内。在一些实施例中，筛选阵列级处于物镜的工作距离内。在一些实施例中，第一回收阵列级处于物镜的工作距离内。在一些实施例中，筛选阵列级和第一回收阵列级处于物镜的工作距离内。工作距离通常是显微镜物镜能够进行成像的距离(即，物镜的工作距离是物镜的前透镜与样品之间的间隙或距离)。在一些实施例中，显微镜物镜的工作距离为约1mm到约30mm。在一些实施例中，显微镜物镜的工作距离为约5mm到约25mm。在一些实施例中，显微镜物镜的工作距离为约10mm到约25mm。在一些实施例中，显微镜物镜的工作距离为约10mm到约20mm。在一些实施例中，与本发明的方法一起采用的显微镜的行进距离为约1mm到约30mm。在一些实施例中，与本发明的方法一起采用的显微镜的行进距离为约5mm到约25mm。行进距离通常是显微镜的Z轴可以行进的距离。在一些实施例中，与本发明的方法一起采用的显微镜的行进距离为约10mm到约25mm。在一些实施例中，与本发明的方法一起采用的显微镜的行进距离为约10mm到约20mm。在一些实施例中，回收阵列是第一回收阵列。在一些实施例中，回收阵列是第二回收阵列。在一些实施例中，微毛细管阵列处于工作距离内。在一些实施例中，微毛细管阵列处于投影镜或物镜的工作距离内，使得可以聚焦于微毛细管阵列。在一些实施例中，显微镜系统有能力聚焦于微毛细管阵列和回收阵列和/或回收载玻片二者。在一些实施例中，筛选阵列和回收阵列和/或回收载玻片二者均处于物镜的行进距离内。在一些实施例中，筛选阵列处于物镜的行进距离内。在一些实施例中，回收阵列和/或回收载玻片处于物镜的行进距离内。在一些实施例中，筛选阵列和回收阵列和/或回收载玻片二者均处于物镜的行进距离内，使得可以聚焦于筛选阵列和回收阵列和/或回收载玻片。参见作为示例性实施例的随本文提供的附图，包含图6A-6E，如在下一段以及整个申请中所讨论的。
如上所提提及的，在图6A-6E中提供了示例性样品回收系统的各个视图。具体地，图6E展示了筛选阵列级12、回收阵列14、回收阵列固持器16、第一回收阵列级18、第二回收阵列级20和显微镜物镜22的相对定位。分别从在图6B-6D中示出为“激光束路径”和“成像路径”的三个角度展示了提取束(在此情况下是激光束)和筛选阵列图像的光学路径。筛选阵列级优选地被配置成容纳微型样品容器的阵列，具体地在允许光束透射穿过相关阵列的孔内。图7A中更详细的示出了这种级。图7B中展示了示例性回收阵列级。至少一个回收阵列级优选地连接到回收阵列固持器，例如如图6E所示，以促进回收阵列与回收阵列级的可逆关联。可逆关联是指回收阵列能够在样品回收过程之前、期间或之后与回收阵列级(例如，第一回收级)关联和解除关联的能力。在一些实施例中，可逆表明可以将回收阵列放置在系统中和/或从系统中移除，在一些情况下多于一次。在一些实施例中，回收阵列通过弹簧张力、重力、磁力、摩擦力、螺钉/紧固件和/或维可牢(Velcro)与回收阵列级可逆关联。
在优选实施例中，多级样品回收系统进一步包括与筛选阵列级可逆关联的筛选阵列。可逆关联是指筛选阵列能够在样品回收过程之前、期间或之后与筛选阵列级关联和解除关联的能力。在一些实施例中，可逆表明可以将筛选阵列放置在系统中和/或从系统中移除，在一些情况下多于一次。在一些实施例中，筛选阵列通过弹簧张力、重力、磁力、摩擦力、螺钉/紧固件和/或维可牢(Velcro)与筛选阵列级可逆关联。如以上更详细描述的，这种筛选阵列通常包括多个微型样品容器，优选地多个微毛细管，但是如本领域普通技术人员将理解的，在本发明的系统中可以适当地使用其它筛选阵列。
在其它优选实施例中，本发明的多级样品回收系统进一步包括与第一回收阵列级可逆关联的回收阵列。更具体地，回收阵列包括一个或多个回收容器。在一些实施例中，例如如图6A和6E的回收阵列14中所示的这种回收容器可以被配置成防止细胞损伤和/或促进细胞生长。例如，回收阵列内的每个回收容器可以包括用于防止细胞损伤的一种或多种试剂。在一些实施例中，试剂是甲基纤维素(例如，以0.001到10wt％)；葡聚糖(例如，以0.5到10wt％)；普朗尼克F-68(例如，以0.01到10wt％)；聚乙二醇(“PEG”)(例如，以0.01到10wt％)；聚乙烯醇(“PVA”)(例如，以0.01到10wt％)等。可替代地或另外，每个回收容器可以包括生长添加剂，如例如，50％条件生长培养基、25％标准生长培养基、25％血清或另一种合适的生长添加剂。还参见均提交于2016年12月12日的美国专利申请第62/433,210号和第15/376,588号。在一些实施例中，将条件生长介质调节24小时。在一些实施例中，添加的试剂是胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、胰岛素样生长因子或这些试剂的组合或以上列举试剂中的任何试剂。细胞培养领域的普通技术人员充分理解用于促进细胞生长的回收容器的配置。
在一些实施例中，回收容器可以被配置成进行如聚合酶链式反应或反转录聚合酶链式反应等扩增反应，或者如DNA测序反应等测序反应。分析领域的普通技术人员充分理解用于鉴别或表征使用本发明的样品回收系统从筛选阵列中回收的样品的扩增反应、测序反应或任何其它这种分析反应的回收容器的配置。
在优选实施例中，多级样品回收系统包括与筛选阵列级可逆关联的筛选阵列和与第一回收阵列级可逆关联的回收阵列两者。更具体地，筛选阵列包括多个微型样品容器，并且回收阵列包括多个回收容器。
如先前所提到的，本发明的多级样品回收系统通常包括用于鉴别筛选阵列内的所关心的样品的光源和光检测器。在一些情况下，例如在监测生物发光信号的情况下，可能不需要单独的光源，并且系统可以仅包括光检测器。在任一种情况下，光检测器通常被配置成通过筛选阵列级中的孔将筛选阵列光学地耦合到检测器来监测从筛选阵列中的样品发射的光学信号。如上所描述的，观察来自筛选阵列的样品容器内的报告元件的光学信号实现对保持所关心的样品的具体样品容器的鉴别，并且然后可以通过来自提取束发生器的脉冲回收那些样品容器的内容物。光检测器，例如如电荷耦合装置(CCD)或互补型金属氧化物半导体(CMOS)成像传感器等成像相机，理想地能够在单个视场内对来自筛选阵列的大量样品容器进行成像。在一些实施例中，光检测器是电荷耦合装置(CCD)。在一些实施例中，光检测器是互补型金属氧化物半导体(CMOS)成像传感器。在一些实施例中，光检测器是光电二极管。在报告元件中使用荧光标记的情况下，通常针对成像检测器在电磁波谱的可见范围中的灵敏度对其进行选择。来自筛选阵列的荧光发射通常通过显微镜物镜、经由系统的成像路径引导到光检测器。如本领域普通技术人员将理解的，如例如尼康Eclipse系列倒置显微镜等商业显微镜可以适当地适用于本发明的系统。
在一些实施例中，多级样品回收系统进一步包括提取束发生器，所述提取束发生器通过筛选阵列级中的孔光学地耦合到筛选阵列内的一个微型样品容器。更具体地，所述提取束可以是激光束，例如由二极管激光器、如二极管泵浦Q开关Nd:YLF激光器等二极管泵浦Q开关激光器或另一种适当的激光装置发射的射束。在一些实施例中，激光器是二极管激光器。在一些实施例中，激光器是纳秒脉冲激光器。在一些实施例中，激光器是皮秒脉冲激光器。在系统包括微毛细管阵列的情况下，提取束可以指向微毛细管壁与微毛细管中含有的样品之间的水-玻璃界面。先前已经描述了使用激光器分离通过微毛细管阵列内的荧光成像鉴别的具体微毛细管的内容物。参见例如，Chen等人(2016),《自然-化学生物学(Nature Chem.Biol.)》12:76–81；DOI：10.1038/NCHEMBIO.1978和美国专利申请公开第2016/0244749A1号。
在优选实施例中，提取束从目标微型样品容器下方引导。然而，还应理解，如果需要，则提取束可以可替代地从目标微型样品容器上方引导。
在具体实施例中，所述统进一步包括第二回收阵列级。在更具体的实施例中，第二回收阵列级被定位成与第一回收阵列级正交。根据这些实施例，样品可以从筛选阵列自动地回收到具有以有序网格布置的回收容器的回收阵列中，特别是具有x行和y列的网格，其中x和y可以独立地为3、10、30、100或甚至更多。
在一些实施例中，筛选阵列级和一个或多个回收阵列级可由一个或多个电动机控制，如本领域的普通技术人员将理解的。
在一些实施例中，本发明的系统的筛选阵列和回收阵列被配置成使得至少一个微型样品容器和至少一个回收容器定位在显微镜物镜的工作距离内。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约0.1mm到约40mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约1mm到约40mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约2mm到约30mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约1.5mm到约30mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约2.5mm到约30mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约2mm到约25mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约3mm到约30mm。在一些实施例中，工作距离(包含竖直距离)为约3mm到约25mm。更具体地，工作距离为约2.5mm到约25mm。在这些实施例中，系统允许对所关心的微型样品容器和关联回收容器的内容物进行同时成像。在更具体的实施例中，显微镜物镜的工作距离为约4mm到约10mm或者甚至约6mm到约8mm，例如，约7.4mm。在一些实施例中，回收阵列是第一回收阵列。在一些实施例中，回收阵列是第二回收阵列。
如先前所提到的，在优选实施例中，本发明的多级样品回收系统的筛选阵列包括多个微毛细管。更具体地，筛选阵列包括至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个、至少10,000,000个或甚至更多个微毛细管。在一些实施例中，阵列包括至少100,000个、至少200,000个、至少300,000个、至少400,000个、至少500,000个、至少600,000个、至少700,000个、至少800,000个、至少1,000,000个、至少1,500,000个、至少2,000,000个、至少2,500,000个或至少3,000,000个或更多个微毛细管。
如先前同样所提到的，在优选实施例中，本发明的多级样品回收系统的回收阵列包括包括一个或多个回收容器。因此，在这种系统中，回收阵列可以包括至少1个回收容器、至少3个回收容器、至少10个回收容器、至少30个回收容器或、至少100个回收容器或甚至更多个回收容器。
在优选实施例中，本发明的系统的回收阵列定位于筛选阵列的下方。在一些实施例中，回收阵列和筛选阵列相隔至少25mm、至少30mm、至少35mm、至少40mm、至少45mm或至少50mm或更多。在一些实施例中，回收阵列和筛选阵列相隔至少30mm、至少35mm或至少40mm。在一些实施例中，回收阵列和筛选阵列相隔至少35mm或至少40mm。在一些实施例中，回收阵列和筛选阵列相隔至少35mm。在一些实施例中，回收阵列处于筛选阵列下方至少25mm、至少30mm、至少35mm、至少40mm、至少45mm或至少50mm处。在一些实施例中，回收阵列处于筛选阵列下方至少30mm、至少35mm或至少40mm处。在一些实施例中，回收阵列处于筛选阵列下方至少35mm或至少40mm处。在一些实施例中，回收阵列处于筛选阵列下方至少35mm处。
对相关领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本发明或其任何实施例的范围的情况下，可以对本文描述的方法和应用作出其它合适的修改和调整。在现在已经详细描述了本发明的情况下，通过参考以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例仅出于说明的目的包含在本文中并且不旨在限制本发明。
实例
实例1.筛选所分泌的EGFR结合蛋白质
图1A-图1C展示了用于能够与作为固定化靶分子(在这种情况下是固定化靶蛋白质)的细胞表面蛋白质(例如，表皮生长因子受体(“EGFR”))缔合的可溶性蛋白质的示例性筛选方法。图1A(左图)示出了靶细胞，所述靶细胞在其表面上表达EGFR。还示出了表达变体蛋白质群的“文库表达细胞”，以及微毛细管溶液中的多个“荧光检测抗体”。在右图中展示了微毛细管阵列的仰视图。
根据此筛选测定的每个微毛细管的组分：
1.分泌所关心的变体蛋白质的细胞(“文库表达细胞”)。所关心的变体蛋白质优选地是变体蛋白质群，即蛋白质文库的成员。
2.靶蛋白质固定在“靶细胞”的表面上。在此实例中，靶蛋白质是天然的细胞表面受体(即，EGFR)。然而，可替代地，可以将靶蛋白质固定在另一个表面上，如珠粒表面或微毛细管本身的表面上。
3.报告元件
a.在此实例中，报告元件对应于对所分泌的蛋白质具有特异性的经过荧光标记的抗体(即，“荧光检测抗体”)。抗体特异性地定位于所分泌的蛋白质上的表位，但理想地不干扰所分泌的蛋白质结合到靶细胞上的靶蛋白质。
b.可替代地，报告元件可以是表达靶蛋白质的细胞内的信号传导途径。如果所分泌的变体蛋白质结合细胞表面上的靶蛋白质并且激活靶细胞内的信号传导途径，则结合相互作用将在细胞内产生荧光信号(未示出)。
4.反应缓冲液：
a.可以是文库表达细胞或靶细胞的培养基。
b.可以是哺乳动物成像溶液。
方法说明
步骤1：将所有组分添加到微毛细管中(参见图1A)。
步骤2：由进入微毛细管的文库表达细胞表达特定的“所分泌的蛋白质”。如所示出的，能够结合到靶蛋白质的所分泌的蛋白质变体定位于靶细胞表面(参见1B)。
步骤3：在具体微毛细管中观察到与所结合的所分泌的蛋白质变体缔合的荧光检测抗体与靶细胞的缔合(参见图1C)。
详细描述和样品数据：
为了演示此方法，创建了表达被设计成结合到人类癌细胞上的EGFR的蛋白质的酵母载体文库。在此文库中，一些酵母变体能够表达蛋白质，而其它变体不能表达蛋白质。将酵母细胞、癌细胞和针对所表达的蛋白质的荧光抗体添加到微毛细管中。18小时后，对微毛细管阵列进行成像。在下面的实例3中提供了筛选的进一步细节和结果。
实例2.针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选
一般背景
当前用于筛选蛋白质或其它靶分子之间的结合相互作用的方法通常依赖于使用“展示”方法，例如，噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示或病毒展示。在展示方法中，编码蛋白质变体的基因文库在细胞或噬菌体的表面表达。将蛋白质变体与靶分子的可溶版本一起孵育以鉴别能够结合到靶标的蛋白质变体。可以通过淘选或者通过荧光激活细胞(“FACS”)分选来筛选文库。这种测定具有两种主要的限制：1)工程化蛋白质通常拴系到展示平台；以及2)通常有利的是存在靶分子的可溶形式。因此，可能难以开发针对结合到多个靶分子的变体蛋白质，尤其是如G蛋白偶联受体和其它这种受体等膜蛋白，的可靠测定。
针对哺乳动物细胞的杂交瘤筛选
为了鉴别特异性地结合到靶分子的抗体变体，将杂交瘤(其分泌抗体变体)添加到表达高水平的EGFR的癌症细胞系中作为靶分子。然后添加对所分泌的抗体具有特异性的经过标记的抗体。
材料：
细胞：
小鼠杂交瘤
A431靶细胞(表达高水平的EGFR的人癌症细胞系)
检测抗体：
用Alexa488(荧光团)标记的抗小鼠第二抗体
用于细胞培养的培养基：
DMEM-10％胎牛血清
DMEM-10％马血清
细胞系生长和制备.将小鼠杂交瘤细胞在完全培养基(具有10％马血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))中培养。用PBSA洗涤杂交瘤细胞两次并且使其悬浮在600个细胞/微升的完全培养基中。将A431细胞在完全培养基(具有10％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)中培养。用PBSA洗涤A431细胞两次并且用LiveGreen荧光信号染色。然后，将A431细胞悬浮在含有杂交瘤的最终浓度为1800个细胞/微升的完全培养基中。
测定设置.混合两种细胞类型之后，将检测抗体加入到反应混合物中：1:100稀释的第二(抗小鼠Alexa488)。然后，将此反应混合物装入乙醇灭菌的经过电晕处理的微毛细管阵列(直径40μm、厚度1mm)中。将1％重量/体积琼脂糖的2mm板放置于阵列上以帮助防止蒸发。每一小时后，在荧光和明视场显微镜下对样品进行成像。
样品数据：
图2A-2C示出了微毛细管阵列的一小部分的图像，所述图像示出了所有细胞(图2A，明视场信号)、A431靶细胞(图2B，LiveGreen信号)或用荧光抗小鼠第二抗体标记的细胞(图2C，Ab-a555信号)。含有表达对EGFR具有特异性的抗体的杂交瘤细胞的微毛细管在每个图像中用两个箭头表示。
图3示出了含有A431靶细胞和杂交瘤细胞的微毛细管在4小时的孵育过程中的图像，其中在测定的时间过程期间，随着对EGFR具有特异性的小鼠抗体产生，针对A431靶细胞的抗体结合信号增加(中间栏)。A431靶细胞的LiveGreen染色在同一时间段内下降(右栏)。
实例3.针对哺乳动物细胞的酵母文库筛选
为了确定最好的分泌酵母质粒载体，创建了表达被设计成结合到癌细胞表面上的EGFR的支架蛋白质的酵母载体文库。此文库含有具有支架蛋白质的各种可溶性表达水平的酵母细胞。使用所描述的测定，筛选变体表达文库以回收具有期望支架蛋白质的高表达的质粒载体。在此实验中，所分泌的支架具有可以用经过荧光标记的抗体标记的c-Myc标签。
材料：
细胞：
支架蛋白质的酵母分泌文库
A431细胞(表达高水平的EGFR的人癌症细胞系)
检测抗体：
鸡抗-c-Myc
用Alexa488标记的抗-鸡第二抗体
用于细胞培养的培养基：
DMEM-10％FBS
SD-CAA基本酵母培养基
反应缓冲液：
SD-CAA基本酵母培养基
方法：
细胞系生长和制备.在SD-CAA基本酵母培养基(20g右旋糖；6.7g Difco酵母氮碱基；5g Bacto酪蛋白氨基酸；5.4g Na2HPO4；8.56g NaH2PO4·H2O；溶于去离子化的H2O中，到体积为1升)中生长酵母文库。生长后，用PBSA(磷酸盐缓冲盐水+1mg/ml BSA)洗涤酵母细胞两次并且将其悬浮于最终浓度为2,400个细胞/微升的SD-CAA中。
将A431细胞在完全培养基(具有10％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)中培养。用PBSA洗涤A431细胞两次并且将其悬浮于含有酵母细胞的最终浓度为600个细胞/微升的SD-CAA中。
测定设置.混合两种细胞类型之后，将两种抗体加入到反应混合物中：1:250稀释的未经标记的第一抗体(鸡抗-c-Myc)和1:200稀释的经过标记的第二抗体(抗-鸡Alexa488)。然后，将此反应混合物装入乙醇灭菌的经过电晕处理的微毛细管阵列(直径40μm、厚度1mm)中。将1％重量/体积琼脂糖的2mm板放置于阵列上以帮助防止蒸发。生长18小时后，在荧光和明视场显微镜下对样品进行成像。
微毛细管阵列提取.使用Triton UV激光提取期望毛细管的内容物。激光器运行18±2毫秒(n＝5次测量)，从而递送频率为2.5kHz的、总能量为约100μJ的脉冲串。将微毛细管内容物提取到玻璃盖玻片上，然后将所述玻璃盖玻片置于酵母生长培养基(液体培养基或琼脂板)中以增殖所提取的细胞。
样品数据
图4A和4B示出了使用明视场成像(图4A)和荧光成像(图4B)鉴别具有表达和非表达细胞的微毛细管的微毛细管阵列的一小部分的图像。
实例4.培养的人类细胞在微毛细管阵列中的生长
图5A-5G显示了K562细胞(人永生化骨髓性白血病细胞系)在微毛细管的阵列内、在生长培养基中在6天的过程中的生长。每24小时拍摄阵列的同一部分的明视场图像。图5A：第0天；图5B：第1天；图5C：第2天；图5D：第3天；图5E：第4天；图5F：第5天；和图5G：第6天。每个图像中示出了40μm的比例尺。
实例5.针对哺乳动物报告细胞的杂交瘤筛选
为了鉴别激活特异性信号传导途径的抗体变体，将分泌不同抗体变体的杂交瘤加入到具有报告细胞的微毛细管阵列中。例如，报告细胞可以来自凯杰公司(参见http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCS-013L.html)。
如果蛋白质变体结合报告细胞并且激活信号传导途径，则报告细胞表达荧光蛋白。在含有令人期望的蛋白质变体的微毛细管中观察活化细胞的信号荧光并且将所述信号荧光用于分离那些微毛细管的内容物。
实例6.自动细胞回收系统(ACRS)
本实例描述了已经用于使用以上描述的筛选方法从大型微毛细管阵列中回收所关心的样品的多级样品回收系统。自动细胞回收系统(“ACRS”)是由处于两层中的3个级(1个x-y和2个线性级)构成的配置，所述级一起工作以实现从微毛细管阵列中回收样品。顶部X-Y级固持微毛细管阵列并且四处移动阵列，使得可以由显微镜物镜对整个阵列进行成像。底部的两个线性级移动捕获表面(例如，18孔载玻片)，使得可以将所关心的微毛细管的内容物回收到分离的回收容器(例如，18孔载玻片的新孔)中。整个配置装配到显微镜物镜的工作距离(7.4mm)内，这实现对微毛细管阵列和回收阵列的成像，而无需从显微镜中移除任何部件。
详细描述
如以上所指出的，ACRS由如图7A所示的X-Y级和至少一个如图7B所示的X/Y级组成。所述级与尼康Ti-E机动显微镜等介接。X-Y级固持如微毛细管阵列等筛选阵列，并且一个或多个X/Y级被配置成固持如18孔载玻片等样品回收阵列。
来自关联显微镜的光行进穿过两个级层以可视化筛选阵列中的每个样品的内容物，例如，固持在筛选阵列级上的微毛细管阵列中的每个微毛细管。因为筛选阵列级与回收阵列级之间极为接近，所以物镜还能够对与例如18孔载玻片等回收阵列关联的容器进行成像。
这些级彼此独立地工作以相对于显微镜物镜将期望微型样品容器(例如，微毛细管阵列内的微毛细管)和期望捕获表面(例如，回收阵列内的回收容器)定位在期望位置处。例如，如图8所示，如果发现筛选阵列10含有三个所关心的样品容器，例如，图示中标记为1、2和3的三个样品容器，则移动筛选阵列级以将第一样品容器定位成与提取束的光路处于一条直线上，并且同样独立地移动回收阵列级以将回收阵列14的第一回收容器定位成与光路处于一条直线上，如图8的左上图所示。
在已经将第一所关心的样品转移到第一回收容器中之后，在X和Y方向上移动筛选阵列级以将第二所关心的样品定位成与提取束处于一条直线上，并且独立地移动回收阵列级以将第二回收容器定位成与射束处于一条直线上，如图8的右上图所示。在已经将第二所关心的样品转移到第二回收容器中之后，根据需要，通过在X和Y方向上移动筛选阵列级来重复所述过程以将第三所关心的样品定位成与提取束处于一条直线上。独立地移动回收级以将第三回收容器定位成与射束处于一条直线上，如图8的底部图所示，并且通过提取束将样品转移到第三回收容器中。
在此实例中，因为第一、第二和第三回收容器定位在一条直线上，所以系统中将只需要单个回收阵列级。如果用户想要使用所示回收阵列中的另外两行回收容器，则可以手动移动回收阵列级，例如，以使第二行回收容器与提取束对齐。然而，优选地，系统进一步包括被定位成与第一回收阵列级正交的第二回收阵列级，例如如图6A-6E的系统中所示出的，其中第二线性级在与第一回收阵列级的方向正交的方向上自动地移动回收阵列，并且因此实现将另外的所关心的样品回收到回收阵列的后续行中。
虽然已提供了具体实例，但是以上描述是说明性而非限制性的。前述实施例中的所述特征中的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中的任何其它实施例的一个或多个特征组合。此外，在阅读了本说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，如对本领域技术人员而言是明显的。本文描述的具体实施例和实例仅通过举例的方式提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求有权获得的等效物的全部范围的限制。
提供以上阐述的实例以向本领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人视为其发明的范围。对用于实施本发明的以上描述的模式进行的对于本领域的技术人员来说是显而易见的修改旨在处于以下权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。
使用所有标题和章节命名仅仅是出于清楚和参考的目的并且不应被视为以任何方式进行限制。例如，本领域的技术人员将认识到根据本文所描述的本发明的精神和范围适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文中所引用的全部参考文献，包含所有专利、专利出版物以及其它出版的参考文献通过引用整体并入本文并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地或单独地被指示出于所有目的通过引用整体并入。

Claims (24)

1.一种多级样品回收系统，其包括：
筛选阵列级，其中所述筛选阵列级相对于显微镜物镜在两个维度上是可控的并且被配置成与筛选阵列可逆关联；以及
第一回收阵列级，其中所述第一回收阵列级相对于所述显微镜物镜在至少一个维度上是可控的并且被配置成与回收阵列可逆关联；
其中所述筛选阵列级和所述第一回收阵列级是能彼此独立控制的。
2.根据权利要求1所述的多级样品回收系统，其进一步包括提取束发生器，其中提取束通过所述筛选阵列级中的孔光学地耦合。
3.根据权利要求2或权利要求3所述的多级样品回收系统，其中所述提取束是激光束。
4.根据权利要求2到3中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述提取束从所述筛选阵列级下方引导。
5.根据权利要求2到4中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述提取束从所述筛选阵列级上方引导。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的多级样品回收系统，其进一步包括与所述筛选阵列级可逆关联的筛选阵列。
7.根据权利要求6所述的多级样品回收系统，其中所述筛选阵列包括多个微型样品容器。
8.根据权利要求6所述的多级样品回收系统，其进一步包括与所述第一回收阵列级可逆关联的回收阵列。
9.根据权利要求8所述的多级样品回收系统，其中所述回收阵列包括多个回收容器。
10.根据权利要求8所述的多级样品回收系统，其中所述筛选阵列包括多个微型样品容器，并且所述回收阵列包括多个回收容器，并且其中所述筛选阵列和所述回收阵列被配置成将至少一个微型样品容器和至少一个回收容器定位在所述显微镜物镜的工作距离内。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述显微镜物镜的所述工作距离为2.5mm到25mm。
12.根据权利要求1到8中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述筛选阵列包括多个微毛细管。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述筛选阵列包括至少100,000个、至少300,000个、至少1,000,000个、至少3,000,000个或至少10,000,000个微毛细管。
14.根据权利要求1到12中任一项所述的多级样品回收系统，其中所述回收阵列包括回收容器。
15.根据权利要求14所述的多级样品回收系统，其中所述回收阵列包括至少一个回收容器、至少3个回收容器、至少10个回收容器、至少30个回收容器或至少100个回收容器。
16.根据权利要求14所述的多级样品回收系统，其中所述回收容器被配置成防止细胞损伤或促进细胞生长。
17.根据权利要求14所述的多级样品回收系统，其中所述回收容器被配置成进行扩增反应。
18.根据权利要求17所述的多级样品回收系统，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应。
19.根据权利要求17所述的多级样品回收系统，其中所述扩增反应是逆转录聚合酶链式反应。
20.根据权利要求14所述的多级样品回收系统，其中所述回收容器被配置成进行测序反应。
21.根据权利要求12所述的多级样品回收系统，其中所述回收阵列定位于所述筛选阵列下方。
22.根据权利要求1所述的多级样品回收系统，其中所述筛选阵列级和所述第一回收阵列级能由电动机控制。
23.根据权利要求1所述的多级样品回收系统，其进一步包括第二回收阵列级。
24.根据权利要求23所述的多级样品回收系统，其中所述第二回收阵列级被定位成与所述第一回收阵列级正交。
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