CN110366597B - 用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及由全血、富含红细胞的血液样品、或红细胞成分生成血液蛋白图谱的方法。该方法涉及比较与蛋白酶抑制剂孵育之前和之后的蛋白水平，或是比较存在和不存在蛋白酶抑制剂的孵育之后的蛋白水平。所述蛋白图谱用于监测和诊断对象的疾病或障碍，包括结肠直肠癌和先兆子痫。

Description

用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析
相关申请的交叉引用
本申请要求(1)2016年12月20日提交的题为“用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析(Blood Profiling with Protease Inhibitors)”的第62/436,875号美国临时申请、(2)2017年4月6日提交的题为“用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析(Blood Profiling withProtease Inhibitors)”的第62/482,582号美国临时申请和(3)2017年6月22日提交的题为“用蛋白酶抑制剂进行血液图谱分析(Blood Profiling with Protease Inhibitors)”的第62/523,489号美国临时申请的优先权的权益。上述相关申请的全部内容通过引用并入本文。
另外，将以下每个申请通过引用整体并入本文：(1)2015年10月7日提交的题为“血液制备和图谱分析(Blood Preparation and Profiling)”的第2015904075号澳大利亚申请；(2)2016年10月6日提交的题为“血液制备和图谱分析(Blood Preparation andProfiling)”的第PCT/AU2016/000341号国际申请号，和(3)2015年12月22日提交的题为“使用红细胞的治疗方法(Therapeutic Methods Using Erythrocytes)”的第2015905309号澳大利亚申请。此外，本公开中提及的其他参考文献或出版物也通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及血液学领域。本公开涉及血液中的蛋白图谱分析，以及由富含红细胞的血液样品和/或红细胞成分产生和/或生成血液蛋白图谱，包括细胞因子和/或趋化因子图谱的方法。
背景技术
血液的蛋白图谱分析用于各种目的。例如，外周血单核细胞(PBMC)和血清/血浆中的指示性蛋白的图谱分析通常用于疾病诊断。另外，通过提供监测对治疗的响应性和缓解或消退的指征的方式，监测血液中的蛋白图谱可以有助于指导更有效的治疗干预。
在血液中发现的生物标志物如细胞因子、趋化因子和生长因子可以提供对炎症、免疫应答和修复的了解。例如，使用血液中的促炎和/或抗炎细胞因子和趋化因子水平的检测和定量来测量免疫状态。这些细胞因子和趋化因子可用于诊断某些疾病状态，确定发展疾病的倾向，和/或预测预后结果。然而，确定用作各种疾病的生物标志物的蛋白可能是耗时且劳动密集的。
通常，可以使用分离的血清/血浆和/或PBMC进行血液中各种蛋白的检测和定量。红血球/红细胞(RBC)是血液中丰富的细胞成分，通常占其体积的40％至50％，在进行血液蛋白分析之前通常被去除和丢弃，因为它们尤其被认为使目前的血液处理和分析方法复杂化。还认为RBC不会对血液的总蛋白图谱提供显著贡献。此外，依赖于含量较少的血液成分如血浆/血清和PBMC来分析血液蛋白可能例如增加血液蛋白图谱的不准确性并限制在各种情况下检测蛋白和/或蛋白水平差异的能力。在蛋白图谱分析和来自血液样品的蛋白的其他评价中使用RBC是有优势的，这些优势迄今为止尚未被本领域普通技术人员完全认识到。
本公开旨在解决本文公开的这些和其他问题。本公开还旨在克服和/或改善现有技术的至少一个缺点，这将从本文的讨论中变得显而易见。本公开还旨在指出使用RBC的一个或多个优点。
发明概述
本公开旨在解决血液蛋白图谱的一些上述问题，令人惊讶地发现RBC是高水平的许多不同蛋白(例如，细胞因子、趋化因子和/或生长因子)的来源。此外，本发明人已经发现其中向红细胞样品中添加蛋白酶抑制剂调节来自患有疾病或障碍的对象的样品中的各种蛋白的水平，但是没有类似地调节来自未患有该疾病或障碍的对象的红细胞样品中的那些蛋白的水平。因此，本发明人通过评价已经与各种蛋白酶抑制剂接触的RBC中的蛋白的存在、水平或水平变化，建立了用于由全血、富集的红细胞样品和/或红细胞成分产生蛋白图谱的新的和有用的实验室技术。这种新的和有用的实验室技术是对现有技术的改进，其通过提高检测蛋白和/或区分患有疾病或障碍的对象和健康个体的能力由血液产生蛋白图谱和/或检测疾病或障碍。本公开尤其提供了使用蛋白酶抑制剂由全血、富含红细胞的样品、富含红细胞的部分和/或红细胞成分产生蛋白图谱的改进的方法、试剂盒和/或系统，从而提供一种或多种优点，包括但不限于降低蛋白检测中的不准确性和提高相关血液样品中的蛋白检测和差异表达。
本文公开了本公开的某些非限制性实施方案。
某些实施方案涉及用于产生蛋白图谱的方法，所述方法包括：获得血液样品；获得来自所述血液样品的红细胞成分；测量来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量来自与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；和确定在与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后，来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化，其中所述产生的蛋白图谱包含在所述红细胞成分与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后具有水平变化的一种或多种蛋白。
某些实施方案涉及产生蛋白图谱的方法，所述方法包括：获得血液样品或来自血液样品的红细胞成分；获得来自所述血液样品或所述红细胞成分的第一和第二部分；使来自所述血液样品或所述红细胞成分的第二部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量来自所述血液样品或所述红细胞成分的第一和第二部分的一种或多种蛋白的水平，其中所述第一部分未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；和确定来自所述血液样品或所述红细胞成分的所述第一部分和所述血液样品或所述红细胞成分的所述第二部分的一种或多种蛋白的水平变化，其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种蛋白，来自所述血液样品或所述红细胞成分的所述第一部分和所述血液样品或所述红细胞成分的所述第二部分的所述一种或多种蛋白的水平发生变化。在一些实施方案中，获得血液样品和红细胞成分二者。
某些实施方案涉及产生蛋白图谱的方法，所述方法包括：获得来自未患有疾病或障碍的对象的血液样品；获得来自所述血液样品的红细胞成分；测量来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量来自与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；和确定在与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后，来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化，其中所述产生的蛋白图谱包括在与一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化。
某些实施方案涉及产生疾病蛋白图谱的方法，所述方法包括：从患有疾病或障碍的对象获得根据其他实施方案中的一种或多种产生的第一蛋白图谱；从未患有疾病或障碍的对象获得根据其他实施方案中的一种或多种产生的第二蛋白图谱，其中从与获得第一蛋白图谱的红细胞成分相同的红细胞成分获得所述第二蛋白图谱；和比较来自患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化与来自未患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化之间的差异，其中所述产生的疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其中来自患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化与来自未患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化之间存在差异。
在一些实施方案中，所述红细胞成分从全血或分离的红细胞获得。在其他实施方案中，所述红细胞成分是红细胞或红细胞膜。在其他实施方案中，测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白或十种或更多种蛋白的水平。在某些实施方案中，测量三种或更多种蛋白的水平。在某些其他实施方案中，使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂、两种或更多种蛋白酶抑制剂、三种或更多种蛋白酶抑制剂、四种或更多种蛋白酶抑制剂、五种或更多种蛋白酶抑制剂、六种或更多种蛋白酶抑制剂、七种或更多种蛋白酶抑制剂、八种或更多种蛋白酶抑制剂、九种或更多种蛋白酶抑制剂或十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使所述红细胞成分与包含至少两种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物接触。在某些实施方案中，使所述红细胞成分与蛋白酶抑制剂混合物A8127s接触。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和氨基肽酶抑制剂。在其他实施方案中，通过统计分析确定所述一种或多种蛋白的水平变化，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白的水平变化是0倍至5倍的倍数变化。在再其他实施方案中，通过统计分析确定来自所述患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化和来自所述未患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化之间的差异，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。在又其他实施方案中，来自所述患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化和来自所述未患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化之间的差异是水平变化升高或水平变化降低。在某些其他实施方案中，所述对象是人或非人动物。在一些实施方案中，使用一种或多种抗体测量所述一种或多种蛋白的水平。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分、糖蛋白、炎性蛋白和酶。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白选自表1中列出的蛋白或表2中列出的蛋白。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是先兆子痫。在某些实施方案中，所述疾病蛋白图谱是先兆子痫蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra和HGF的蛋白。在其他实施方案中，所述疾病或障碍是结肠直肠癌。在再其他实施方案中，所述疾病蛋白图谱是癌症蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF和IL-12p40的蛋白。
某些实施方案涉及监测对象的疾病或障碍的方法，所述方法包括：在第一时间点从患有疾病或障碍的对象获得第一血液样品，并且在第二时间点获得第二血液样品；针对第一血液样品和第二血液样品中的疾病或障碍测量来自据其他实施方案中的一种或多种产生的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平；和确定第一血液样品和第二血液样品中的至少一种蛋白的水平变化之间的差异，其中所述第一血液样品和第二血液样品中的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明疾病或障碍的变化。
某些实施方案涉及监测对象中的治疗效果的方法，所述方法包括：在第一时间点从所述对象获得根据其他实施方案中的一种或多种产生的第一蛋白图谱，并且在第二时间点获得根据其他实施方案中的一种或多种产生的第二蛋白图谱；和将来自所述第一蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自所述第二蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，其中来自所述第一蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化和来自所述第二蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明治疗效果。在某些实施方案中，所述第一时间点在治疗之前，所述第二时间点在治疗之后。在一些实施方案中，所述第一时间点在治疗之前，所述第二时间点在治疗期间。在其他实施方案中，所述第一时间点和所述第二时间点在治疗期间。在再其他实施方案中，所述第一时间点在治疗期间，所述第二时间点在治疗之后。在其他实施方案中，述第一时间点和所述第二时间点在治疗之后。在又其他实施方案中，所述对象已经接受了相同的治疗。在其他实施方案中，所述对象已经接受了不同的治疗。在某些实施方案中，所述血液样品是小体积血液样品。在其他实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次和每天五次或更多次。在再其他实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次和每周七次或更多次。在某些实施方案中，每天监测所述对象。在一些实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次。
某些实施方案涉及诊断疾病或障碍的方法，包括：获得至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的疾病蛋白图谱；获得来自对象的血液样品；获得来自所述血液样品的红细胞成分；使所述红细胞成分的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量来自所述红细胞成分的第一部分中的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白的水平；确定所述红细胞成分的第一部分中的至少一种蛋白和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白之间的水平变化；和将所述红细胞成分的第一部分和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白之间的水平变化与疾病蛋白图谱中的至少一种蛋白的水平变化进行比较，其中与疾病蛋白图谱中的至少一种蛋白的水平变化相比，所述红细胞成分的第一部分和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白的相同或相似的水平变化表明所述对象患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及诊断对象的疾病或障碍的方法，所述方法包括：获得至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的对象的蛋白图谱；和将来自所述至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自根据其他实施方案中的一种或多种产生的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，其中与来自疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化相同或相似的来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化表明所述对象患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及诊断对象的疾病或障碍的方法，所述方法包括：获得对象的至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱；获得未患有疾病或障碍的对象的至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱；和将来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自未患有疾病或障碍的对象的至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，其中来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自未患有疾病或障碍的对象的至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明所述对象患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及用于产生血液样品的蛋白图谱的试剂盒，所述试剂盒包含：至少一种获得红细胞成分的试剂；一种或多种蛋白酶抑制剂；和至少一种测量来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平的试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种获得来自对象的血液样品的试剂。在其他实施方案中，测量一种或多种蛋白的水平的试剂是一种或多种抗体。在再其他实施方案中，检测一种或多种蛋白的测量水平的试剂是酶联免疫吸附分析(ELISA)装置。在其他实施方案中，一种或多种蛋白酶抑制剂包含蛋白酶抑制剂混合物。在又其他实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物是A8127s。
某些实施方案涉及产生蛋白图谱的方法，所述方法包括：获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；使所述富含红细胞的样品与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；和检测富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在，其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种在富含红细胞的样品中检测到的蛋白。
某些实施方案涉及产生蛋白图谱的方法，所述方法包括：获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；分离富含红细胞的样品中的红细胞和血浆；使所述红细胞与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量红细胞中的一种或多种蛋白的水平和血浆中的一种或多种蛋白的水平；和计算蛋白比，其包括红细胞中的一种或多种蛋白的水平与血浆中的一种或多种蛋白的水平之比，其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其具有至少2:1的蛋白比。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白具有选自至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1和至少20:1的蛋白比。
某些实施方案涉及产生蛋白图谱的方法，包括：获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；在包含一种或多种蛋白酶抑制剂的介质中孵育富含红细胞的样品中的红细胞；和检测介质中的一种或多种蛋白，其中所述产生的蛋白图谱包含在介质中检测到的一种或多种蛋白。
在某些实施方案中，所述方法还包括测量在富含红细胞的样品或介质中检测到的一种或多种蛋白的水平。在一些实施方案中，检测两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白、或十种或更多种蛋白、十一种或更多种蛋白、十二种或更多种蛋白、十三种或更多种蛋白、十四种或更多种蛋白或十五种或更多种蛋白的存在，或测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白、或十种或更多种蛋白、十一种或更多种蛋白、十二种或更多种蛋白、十三种或更多种蛋白、十四种或更多种蛋白或十五种或更多种蛋白的水平。在一些实施方案中，检测三种或更多种蛋白的存在，或测量三种或更多种蛋白的水平。在其他实施方案中，使所述富含红细胞的样品与两种或更多种蛋白酶抑制剂、三种或更多种蛋白酶抑制剂、四种或更多种蛋白酶抑制剂、五种或更多种蛋白酶抑制剂、六种或更多种蛋白酶抑制剂、七种或更多种蛋白酶抑制剂、八种或更多种蛋白酶抑制剂、九种或更多种蛋白酶抑制剂或十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使所述富含红细胞的样品与三种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使所述富含红细胞的样品与三种或更多种蛋白酶抑制剂接触，并且检测两种或更多种蛋白的存在或测量两种或更多种蛋白的水平。在再其他实施方案中，使所述富含红细胞的样品与两种或更多种蛋白酶抑制剂接触，并且其中检测三种或更多种蛋白的存在或测量三种或更多种蛋白的水平。在某些实施方案中，所述一种或多种蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
在其他实施方案中，所述对象是人或非人动物。在再其他实施方案中，使用一种或多种抗体检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平。在某些其他实施方案中，所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分和酶。在其他实施方案中，所述一种或多种蛋白选自表1中列出的蛋白或表2中列出的蛋白。在一些实施方案中，通过选自以下的一种或多种方法对所述血液样品进行白细胞去除：流式细胞术、磁珠分离、离心、纤维素柱和葡聚糖沉降。在一些实施方案中，通过葡聚糖沉降对所述红细胞进行白细胞去除。
某些实施方案涉及监测对象的疾病或障碍的方法，包括：在第一时间点和第二时间点从对象获得至少一种根据本文公开的其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱；和将第一时间点的对象的至少一种蛋白图谱与第二时间点的对象的至少一种蛋白图谱进行比较，其中与第二时间点的对象的至少一种蛋白图谱相比，第一时间点的对象的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平的差异表明疾病或障碍的变化。
某些实施方案涉及监测对象的治疗的方法，包括：在治疗之前和在治疗之后从对象获得至少一种根据其他实施方案中的一种或多种产生的蛋白图谱；和将在治疗之前的对象的至少一种蛋白图谱与在治疗之后的对象的至少一种蛋白图谱进行比较，其中与在治疗之后的对象的至少一种蛋白图谱相比，在治疗之前的对象的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平的差异表明对对象的治疗效果。在一些实施方案中，将未接受治疗的对象的至少一种蛋白图谱与接受治疗后的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。在一些实施方案中，将基本上未接受或几乎没有接受治疗的对象的至少一种蛋白图谱与接受治疗后的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。在一些实施方案中，将在治疗之后的一个时间点的对象的至少一种蛋白图谱与在治疗之后的不同时间点的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。在其他实施方案中，所述对象已经接受了相同的治疗。在其他实施方案中，所述对象已经接受了基本上相同的治疗或相似的治疗。在再其他实施方案中，所述对象已经接受了不同的治疗。在一些实施方案中，所述血液样品是小体积血液样品。在一些实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次和每天五次或更多次。在其他实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次和每周七次或更多次。在某些实施方案中，每天监测所述对象。在其他实施方案中，监测所述对象多次，所述次数选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次。
某些实施方案涉及产生疾病蛋白图谱的方法，包括：获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；使所述富含红细胞的样品的第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量所述富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和将富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，其中所述产生的疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，所述蛋白与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，在富含红细胞的样品的第一部分中具有不同的水平。在一些实施方案中，通过统计分析确定与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平的差异，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。在一些实施方案中，测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白或十种或更多种蛋白的水平。在某些实施方案中，测量三种或更多种蛋白的水平。在一些实施方案中，所述疾病或障碍是先兆子痫。在其他实施方案中，所述疾病蛋白图谱是先兆子痫蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra和HGF的蛋白。在再其他实施方案中，所述疾病或障碍是癌症。在其他实施方案中，所述疾病蛋白图谱是包含选自一种或多种以下蛋白的癌症蛋白图谱：IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTE、IL-7、IP-10、PDGF和IL-12p40。
某些实施方案涉及用于诊断疾病或障碍的方法，包括：获得来自对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；使所述富含红细胞的样品的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和将所述富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，其中与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平的差异表明所述对象患有疾病或障碍。在一些实施方案中，一种或多种蛋白的水平无差异表明对象未患有所述疾病或障碍。
某些实施方案涉及确定对象是否患有疾病或障碍的方法，包括：获得来自对象的血液样品；对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；使富含红细胞的样品的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；测量富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和将富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，其中与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平无差异表明对象未患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：获得根据本文提供的方法产生的来自所述对象的至少一种蛋白图谱；和将所述至少一种蛋白图谱与至少一种疾病蛋白图谱进行比较，其中至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平与至少一种疾病蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平类似表明对象患有所述疾病或障碍。在一些实施方案中，获得的所述至少一种疾病蛋白图谱是根据本文提供的方法中的一种或多种产生的。
某些实施方案涉及诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：获得根据本文提供的方法产生的来自对象的至少一种蛋白图谱；获得来自未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象的至少一种蛋白图谱；和将从所述对象获得的所述至少一种蛋白图谱与从未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象获得的至少一种蛋白图谱进行比较，其中与从未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象获得的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平相比，从所述对象获得的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白存在或水平的差异表明所述对象患有疾病或障碍。
某些实施方案涉及用于产生血液样品的蛋白图谱的试剂盒，所述试剂盒包含：至少一种对血液样品进行白细胞去除并产生富含红细胞的样品的试剂；一种或多种蛋白酶抑制剂；和至少一种检测富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在或测量富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的水平的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种获得来自对象的血液样品的试剂。在其他实施方案中，检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平的所述试剂是一种或多种抗体。在再其他实施方案中，检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平的所述试剂是酶联免疫吸附分析(ELISA)装置。
除了在发明内容中讨论的实施方案之外，在说明书、附图和权利要求中公开了其他实施方案。概述并不意味着涵盖各个和每个实施方案；本公开内容考虑了组合或变化。
附图简要说明
仅通过举例的方式，参考附图描述了本公开的实施方案。
图1A-1TT是显示小体积全血中的各种蛋白的水平的一系列图表。
图2A-2AA是显示通过扎手指(FT)或静脉穿刺(V)从由健康对象获得的全血样品中分离的红细胞中的各种蛋白的水平的一系列图表。
图3A-3G是显示与氯化锂接触的红细胞中的各种蛋白的水平的一系列图表。
图4A-4VV是显示从健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者分离的红细胞中的各种蛋白的水平差异的一系列图表。
图5A-5C是显示从肿瘤患者分离的红细胞中的各种蛋白的水平与血浆中的各种蛋白的水平之比的图表。
图6A-6RR是显示来自从健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者分离的红细胞的各种蛋白的水平的一系列图表。
图7A–7Z是显示蛋白酶抑制剂(PI)对从RBC释放的蛋白浓度(黑色柱)和孵育后细胞中剩余的蛋白浓度(灰色柱)的影响的一系列图表。
图8A-8ZZ是显示蛋白酶抑制剂(PI)对来自从健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者分离的红细胞的蛋白浓度的影响的一系列图表。
图9A-9FF是显示蛋白酶抑制剂(PI)对来自从健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者分离的红细胞的蛋白浓度的影响的一系列图表。
图10A-10D是显示蛋白酶抑制剂(PI)对从来自健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者的红细胞释放的细胞因子的累积数据的影响的一系列图表。
图11A-11D是显示在蛋白酶抑制剂(PI)存在或不存在的情况下，从来自健康个体、健康妊娠妇女、患有先兆子痫的妊娠妇女和肿瘤患者的红细胞释放的细胞因子的累积数据的差异的一系列图表。
图12A-12VV是显示单个蛋白酶抑制剂对从来自健康个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图13A-13VV是显示蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图14A-14AA是显示蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图15A-15AA是显示单个蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物对从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图16A-16AA是显示蛋白酶抑制剂混合物对从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图17A-17AA是显示与从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的细胞因子相比，单个蛋白酶抑制剂对从来自健康个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图18A-18AA是显示与从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的细胞因子相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的细胞因子的倍数变化的影响的一系列图表。
图19A-19VV是显示与从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞膜释放的细胞因子相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的倍数变化的影响的一系列图表。
图20A-20LL是显示单个蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的其他蛋白的影响的一系列图表。
图21A-21LL是显示与从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图22A-22VV是显示与患有淋巴瘤的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的全血裂解物获得的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图23A-23VV是显示与患有淋巴瘤的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的分离的红细胞获得的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图24A-24VV是显示与患有骨关节炎的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图25A-25VV是显示与患有先兆子痫的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图26A-26VV是显示与患有先兆子痫合并宫内生长受限的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图27A-27VV是显示与患有溃疡性结肠炎的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图28A-28VV是显示与患有十二指肠溃疡的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的细胞因子的影响的一系列图表。
图29A-29LL是显示与患有淋巴瘤的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的其他蛋白的影响的一系列图表。
图30A-30NN是显示与患有骨关节炎的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的其他蛋白的影响的一系列图表。
图31A-31NN是显示与患有溃疡性结肠炎的个体相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的其他蛋白的影响的一系列图表。
图32-45是显示单个蛋白酶抑制剂对从来自患有结肠直肠癌的健康个体的红细胞释放的蛋白的影响的一系列图表。
图46-59是显示与从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞膜释放的蛋白相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的蛋白浓度的影响的一系列图表。
图60-73是显示与从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的蛋白相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞释放的蛋白的倍数变化的影响的一系列图表。
图74-87是显示与从来自患有结肠直肠癌的健康个体的红细胞膜释放的蛋白相比，蛋白酶抑制剂混合物对从来自健康个体的红细胞膜释放的蛋白的倍数变化的影响的一系列图表。
具体实施方式
定义
如在本申请中所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“细胞裂解物”包括多种细胞裂解物。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”是指“包括(including)”。词语“包括(comprising)”的变体，例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”，具有相应变化的含义。因此，例如，“包括”步骤‘A’和‘B’的方法可以仅由步骤‘A’和‘B’组成，或者可以包括一个或多个另外的步骤(例如，步骤‘A’、‘B’和‘C’)。
包括在详述中使用的主题标题是为了便于参考或读者，并且不应该用于限制在整个公开内容或权利要求中存在的主题。主题标题不应用于解释权利要求的范围或权利要求限制。
如本文所使用的，术语“对象”包括具有经济、社会或研究重要性的动物，包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿类动物物种。因此，“对象”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。
如本文所使用的，术语“抗体”和“多种抗体”包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，IgA(包括IgA1和IgA2)，IgD，IgE或IgM，和IgY，完整抗体，包括单链完整抗体，和其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗体可以来自动物来源。抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可以单独包含可变区(多个可变区)，或者与以下全部或部分组合：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。还包括可变区(多个可变区)和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的组合。抗体可以是单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的以及特异性结合生物分子的人单克隆和多克隆抗体。
如本文所使用的，术语“蛋白”是指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物。
如本文所使用的，术语“蛋白酶(protease)”、“肽酶”或“蛋白酶(proteinase)”是指通过水解破坏、裂解或蛋白水解蛋白的肽键(多个肽键)的酶。蛋白酶可以包括对特定蛋白底物(例如，特定蛋白)具有特异性和/或特异性切割特定蛋白底物(例如，特定蛋白)的那些，对一种类型的蛋白底物具有特异性的那些(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶)，或对多于一种类型的蛋白底物具有特异性的那些(例如，半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶)。蛋白酶还可以包括对蛋白底物具有非特异性或非特异性切割蛋白底物的那些(例如，胃蛋白酶、蛋白酶K、弹性蛋白酶、外切蛋白酶、内切蛋白酶等)。
如本文所使用的，术语“蛋白酶抑制剂”是指阻断或降低蛋白酶的催化(例如蛋白水解)活性的物质(例如蛋白或化学物质)。蛋白酶抑制剂可以阻断蛋白酶切割给定蛋白的肽键的能力，通常通过阻断蛋白酶的活性位点并防止其接近底物。借助非限制性实例，蛋白酶抑制剂可以包括非特异性蛋白酶抑制剂(例如，EDTA)，特异性蛋白酶抑制剂(包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和氨基肽酶抑制剂)，或双特异性、多特异性或泛特异性蛋白酶抑制剂(包括丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂)。
如本文所使用的，术语“蛋白图谱”是指样品中存在的蛋白(多种蛋白)和/或蛋白片段(多种蛋白片段)。样品可以包含或不包含细胞。如果样品包含细胞，则蛋白或蛋白片段可以存在于细胞内和/或部分或完全存在于细胞表面。虽然不要求，但蛋白图谱还可以提供样品中的蛋白(多种蛋白)和/或蛋白片段(多种蛋白片段)的定量信息。
如本文所使用的，术语“血液样品”是指包含至少部分血液和/或血液成分的样品。血液样品可以直接从一个或多个对象或从一个或多个对象的预先存在的收集的血液中获得。血液样品可以通过多种方法从人类对象获得，例如，身体部位(例如，手臂、腿、耳朵)的静脉穿刺(例如，蝶形针和真空采血管，直针和真空采血管，蝶形针和注射器)或通过针刺(例如，扎手指、扎足跟或扎耳朵)。血液样品可以通过多种方法从非人类哺乳动物对象获得，例如，身体部位(例如，尾巴、手臂、腿(例如，大腿)、鼻子、面部、耳朵、胸部、颈部/喉部、舌头、心脏)的静脉穿刺(例如，针和注射器)或通过针刺(例如，扎手指、扎足跟、扎耳朵或扎尾巴)。血液样品可以通过许多方法从其他非人动物(例如，鸡或鸟)获得，例如，身体部位(例如，翅膀、喉部或心脏)的静脉穿刺(例如，针和注射器)。
如本文所使用的，术语“血细胞”或“血液样品中存在的细胞”是指样品中的细胞，包括红细胞和白细胞，但不包括或基本上不包括血小板。
如本文所使用的，术语“富含红细胞的样品”、“红细胞样品”或“富含RBC的部分”是指样品或样品的成分，其中RBC的比例与富集前的血液样品中的RBC的比例相比增加。可以例如通过从样品中去除不是RBC的细胞类型(多种细胞类型)(例如，去除白细胞(白细胞去除)和/或去除血小板)，和/或通过从样品中的其他细胞类型(多种细胞类型)移出RBC以提供单独的样品，使RBC的比例增加。富含红细胞的样品也可包含培养基、血浆/血清、上清液和/或细胞洗液。富含RBC的部分可包含总血细胞数的多于99.5％、多于99.6％、多于99.7％、多于99.75％、多于99.8％、多于99.85％、多于99.9％、多于99.5％、约100％的红细胞或100％的红细胞。
如本文所使用的，术语“红细胞成分”是指整个/完整的红细胞和红细胞的组成部分或元素。例如，在某些实施方案中，红细胞成分是红细胞。在其他实施方案中，红细胞成分是红细胞膜。红细胞可以例如从全血或富含红细胞的样品中获得。红细胞膜可以从全血、富含红细胞的样品和/或分离的红细胞中获得和/或产生。
如本文所使用的，术语“快速冷冻”是指通常在快速时间段内(例如，在几毫秒、1-2秒、1-5秒、1-10秒、1-15秒、1-20秒、10-20秒、10-30秒、30-60秒、小于1分钟、小于2分钟的时间段内)将血细胞(例如，RBC)和/或血浆/血清冷冻至低于其冰点的温度。
如本文所使用的，“白细胞去除”是指例如通过从血液样品或血液样品成分中去除白细胞，或者供选择地通过从血液样品或血液样品成分中移出其他血液成分(多种成分)以提供单独的白细胞去除的样品，降低血液样品或血液样品成分中的白细胞的比例。在一些实施方案中，白细胞去除包括血小板去除。
如本文所使用的，“血小板去除”是指例如通过从血液样品或血液样品成分中去除血小板，或者供选择地通过从血液样品或血液样品成分中移出其他血液成分(多种成分)以提供单独的血小板去除的样品，降低血液样品或血液样品成分中血小板的比例。
如本文所使用的，“细胞上清液”应理解为意指细胞培养基，其中细胞群在给定温度或给定温度范围内孵育或培养给定时间段，例如，大于：30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或120小时。
如本文所使用的，“细胞洗液”应理解为意指用于冲洗细胞群的液体，并且不同于如上定义的细胞上清液，因为细胞洗液通常不用作细胞培养基。因此，用于产生“细胞洗液”的流体可以与细胞群混合小于：30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4,分钟、3分钟、2分钟、1分钟或30秒的时间段。
如本文所使用的，“介质(media)”或“介质(medium)”是指具有维持血液样品内的细胞、从血液样品中分离的细胞、或从血液样品中分离的细胞产生的细胞成分的活力的能力的组合物。介质可以刺激细胞生长和增殖或使细胞维持在特定和/或现有的生长状态。介质的非限制性实例包括等渗盐溶液、平衡盐溶液、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank氏平衡盐溶液(HBSS)、Earles氏平衡盐溶液(EBSS)、Roswell Park纪念研究所培养基(RPMI)、极限必需培养基(MEM)、改良极限必需培养基(IMEM)、Eagle氏极限必需培养基(EMEM)、Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)和Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)。
如本文所使用的，术语“小体积”是指一毫升或更少的血液体积。小体积可以是1μL至100μL、100μL至200μL、200μL至300μL、300μL至400μL、400μL至500μL、500μL至600μL、600μL至700μL、700μL至800μL、800μL至900μL和900μL至1000μL。在一些实施方案中，小体积是50μL至100μL、100μL至150μL、150μL至200μL、200μL至250μL、250μL至300μL、300μL至350μL、350μL至400μL、400μL至450μL、450μL至500μL、500μL至550μL、550μL至600μL、600μL至650μL、650μL至700μL、700μL至750μL、750μL至800μL、800μL至850μL、850μL至900μL、900μL至950μL、950μL至1000μL。在一些实施方案中，小体积是1μL至10μL、10μL至20μL、、20μL至30μL、30μL至40μL、40μL至50μL、50μL至60μL、60μL至70μL、70μL至80μL、80μL至90μL,或90μL至100μL。在其他实施方案中，小体积是0.1μL至0.5μL、0.5μL至1μL、1μL至5μL、5μL至10μL、10μL至15μL、15μL至20μL、20μL至25μL、25μL至30μL、30μL至35μL、35μL至40μL、40μL至45μL、45μL至50μL、50μL至55μL、55μL至60μL、60μL至65μL、65μL至70μL、70μL至75μL、75μL至80μL、80μL至85μL、85μL至90μL、90μL至95μL或95μL至100μL。在一些实施方案中，小体积是5μL至10μL、5μL至15μL、5μL至20μL、5μL至25μL、5μL至30μL、5μL至35μL、5μL至40μL、5μL至45μL、5μL至50μL、5μL至55μL、5μL至60μL、5μL至65μL、5μL至70μL、5μL至75μL、5μL至80μL、5μL至85μL、5μL至90μL、5μL至95μL或5μL至100μL。在其他实施方案中，小体积是0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、27μL、28μL、29μL、30μL、31μL、32μL、33μL、34μL、35μL、36μL、37μL、38μL、39μL、40μL、41μL、42μL、43μL、44μL、45μL、46μL、47μL、48μL、49μL或50μL。
如本文所使用的，术语“可检测水平”或“检测水平”是指组合物或药剂指示和/或表示样品(例如，血液样品)中期望的分子(如蛋白)的存在的能力。例如，在富含红细胞的样品中，由于可用于检测的蛋白的增加，蛋白的可检测水平可能提高。这种提高可能是由于一种或多种原因，例如，通过破坏阻止和/或减少蛋白检测的蛋白-分子相互作用(例如，蛋白-蛋白、蛋白-膜、蛋白-核酸)。
如本文所使用的，术语蛋白(多种蛋白)的“水平变化(change in level)”或“所述水平变化(change in the level)”是指本领域普通技术人员不视为相同、基本相同、相似或基本相似的蛋白水平的蛋白(多种蛋白)的可检测水平的升高或降低。因此，技术人员将通过例如观察(例如，色谱法)、统计检验的结果(例如，Student T检验、ANOVA检验，混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和或Spermans秩相关)或测量的蛋白水平的相关倍数变化的计算(例如，统计上显著的倍数变化(例如，大于0倍的变化、大于0.5倍的变化、大于1倍的变化或大于1.5倍的变化))来确定蛋白的可检测水平的升高或降低是统计学上显著的。
如本文所使用的，术语蛋白(多种蛋白)水平的“无变化”或“无差异”是指蛋白(多种蛋白)水平无升高或降低(例如，蛋白水平相同)或本领域普通技术人员认为该蛋白水平相同或基本相似的蛋白(多种蛋白)水平的足够小的升高或降低。因此，技术人员将通过例如观察(例如，色谱法)、统计检验的结果(例如，Student T检验、ANOVA检验，混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和或Spermans秩相关)或测量的蛋白水平的相关倍数变化的计算(例如，统计上显著的倍数变化(例如，小于0.5倍的变化、小于1倍的变化或小于1.5倍的变化))来确定蛋白(多种蛋白)的可检测水平的升高或降低不是统计学上显著的。
如本文所使用的，“水平的不同变化”或“水平变化之间的差异”是指一种样品或一个对象中一种或多种蛋白的水平变化与另一种样品或另一个对象中的一种或多种蛋白的水平变化不相同、基本不相同、不相似、或基本不相似(例如，患有疾病或障碍的对象与未患有所述疾病或障碍的对象相比)。例如，一种或多种蛋白的水平变化的差异可以包括：与另一个对象中相同蛋白水平的降低相比，一个对象中蛋白水平的增加；与另一个对象相比，一个对象中一种或多种蛋白水平变化的幅度更大或更小(例如，一个对象中蛋白水平的升高或降低大于或小于不同对象中蛋白水平的升高或降低)；或者，与另一个对象的水平无变化相比，一个对象的水平变化(例如，与另一个对象的蛋白水平无显著升高或降低相比，一个对象中蛋白水平的升高或降低)。水平变化的差异可以通过数据可视化(例如，图表或图形)或分析方法来确定，包括统计分析(例如，Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和或Spermans秩相关)。
如本文所使用的，从RBC“释放”的蛋白是指通过主动或非主动机制(i)从RBC的细胞内区域或内部移动到RBC的表面和/或细胞外或外部区域(例如，血浆、血清和/或介质)，或(ii)从RBC的细胞外或外部区域(从例如血浆、血清和/或介质)移动到RBC的表面和/或细胞外区域或外部。在一些实施方案中，蛋白可以通过细胞表面-蛋白结合相互作用(例如，受体、共价连接、非共价连接和/或粘附)结合到RBC的表面。在其他实施方案中，表面结合的蛋白可以释放回RBC的细胞外或外部区域(例如，释放到血浆、血清和/或介质中)。
如本文所使用的，“治疗”是指可以用于预防、管理、减轻或改善疾病、障碍或病症的一种或多种疗法、方案、方法和/或药剂，包括预防、减轻或改善疾病、障碍或病症的一种或多种症状和/或与其相关的症状。在某些实施方案中，术语“治疗”和“多种治疗”是指可用于预防、管理、减轻和/或改善疾病、障碍或病症的生物疗法、支持疗法和/或其他疗法。
如本文所使用的，短语“基本相似”或“基本相同”表示两个数值之间的相似度足够高，使得本领域技术人员将认为两个值之间的差异(例如，蛋白浓度/水平或水平变化(例如，倍数变化))在由该值衡量的生物学特征的情况下几乎没有或没有生物学和/或统计学意义。例如，两个值之间的差异可以小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％。
如本文所使用的，术语“试剂盒”是指具有可用于实施本文所述的实施方案中的一个或多个的成分的递送系统。借助非限制性实例，试剂盒可以包括以下方式：收集血液、抑制蛋白酶、提高蛋白检测、防止凝固、稳定血液、获得红细胞成分、富集RBC、去除/分离非RBC血液成分、快速冷冻血液或其成分(多种成分)、裂解细胞、洗涤细胞、培养细胞、检测细胞内和/或细胞外的特定靶蛋白或其组合。在一些实施方案中，试剂盒可包含以下一种或多种：用于从对象获得血液样品的装置(多种装置)(例如，注射器、针、蝶形针、管、持针器、血液采集装置、转移装置、真空采血管、hemaPENTM)；用于从对象获得干燥血液样品的装置(多种装置)(例如，滤纸、卡片、HemaSpotTM)；用于从液体血液样品获得红细胞部分、白细胞部分和/或血小板部分的装置(多种装置)(例如，抗体涂覆的磁珠)；蛋白酶抑制剂；阳离子盐；抗凝血剂；蛋白酶抑制剂；蛋白变性剂；等等。这样的递送系统可以包括允许将反应试剂(例如在适宜的容器中的标记物、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行分析的书面指导等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可包括一个或多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳，例如盒子。术语“试剂盒”包括分段和组合试剂盒。
如本文所使用的，术语“分段试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的递送系统，所述容器包含总试剂盒成分的子部分。容器可以一起或分开地递送到预期的接收者。包含两个或更多个包含总试剂盒成分的子部分的单独容器的递送系统包括在术语“分段试剂盒”的含义内。
如本文所使用的，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳每种所需成分的单个盒子中)含有反应分析的成分的递送系统。
本文中对现有技术文献的任何描述，或本文中来自或基于那些文献的陈述，并不是承认文献或得到的陈述是相关领域的公知常识的一部分。
详述
目前使用的对血液中蛋白水平进行图谱分析的技术通常使分析限制于血清/血浆和/或PBMC。因为RBC被认为干扰血液处理和/或血液蛋白测量，所以它们通常在生成蛋白图谱之前在血液处理过程中被去除和丢弃。
本发明人已经出乎意料地发现RBC提供蛋白标志物的重要来源，以及使富含红细胞的样品与蛋白酶抑制剂接触调节患有疾病或障碍的对象中的蛋白标志物的可检测水平，同时使来自未患有疾病或障碍的对象的红细胞样品中的蛋白水平保持不变或对其进行差异调节。因此，已经确定了当前技术的缺陷，因为先前未认识到RBC提供本文所述的各种蛋白标志物的来源，因此，从蛋白图谱分析中排除RBC提供了不充分和/或不准确的评估。(还参见2015年10月7日提交的题为“血液制备和图谱分析(Blood Preparation andProfiling)”的第AU2015904075号澳大利亚申请号和2016年10月6日提交的题为“血液制备和图谱分析(Blood Preparation and Profiling)”的第PCT/AU2016/000341号国际申请)。此外，目前的技术不适合于基于响应血液样品中蛋白酶抑制剂的存在的红细胞蛋白标志物的非特异性和/或特异性水平变化，在患有疾病或障碍的对象与未患有疾病或障碍的对象之间进行简单和/或快速描绘。本公开弥补了血液蛋白图谱分析缺陷，提供了用于由血液生成蛋白图谱的新的和有用的实验室技术，其结合了与蛋白酶抑制剂接触的RBC的分析，以调节患有疾病或障碍的对象中的蛋白水平/检测。本文提供的新的和有用的实验室技术具有诊断、预后和/或治疗应用。
以下描述足够详细地表达了本公开的示例性实施方案，以使得本领域普通技术人员能够实践本发明。所描述的各种实施方案的特征或限制不一定限制本公开的其他实施方案或本公开的整体。因此，以下详细描述不限制由权利要求限定的本公开的范围。
红细胞(RBC)中的蛋白图谱分析
本公开提供了使用蛋白酶抑制剂由血液样品、富含红细胞的样品、红细胞成分和/或包含RBC的血液样品成分生成蛋白图谱的方法。在一些实施方案中，RBC的数量占血液样品或血液样品成分中存在的血细胞总数的多于0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.75％、99.9％或99.95％。
血液样品
在所提供的方法中，从对象获得的血液样品如本文所定义(参见，例如“血液样品”)，并且可以从对象或现有的收集的血液(例如，先前从一个或多个对象获得的血液和/或储存的血液)获得。可以使用本领域普通技术人员可获得的示例性手段从对象获得血液样品(参见例如，世界卫生组织，“血液、血液成分和血浆衍生物的收集、处理和质量控制的要求(Requirements for the collection,processing and quality control of blood,blood components and plasma derivatives)”，世界卫生组织技术报告系列，第840号，1994年，附件2)。借助非限制性实例，可以使用静脉采血、毛细血管采血、动脉采血或其组合从对象获得血液样品。
在某些实施方案中，从对象或现有的收集的血液获得小体积血液样品。可以通过各种方法从对象获得小体积，包括例如通过针刺(例如，扎手指、扎足跟、扎耳朵或扎尾巴)。在一些实施方案中，通过扎手指、扎足跟、扎耳朵或干血点(来自例如人)获得小体积血液样品。在其他实施方案中，通过扎尾巴(来自例如小鼠或大鼠)获得小体积血液样品。在其他实施方案中，通过扎手指获得小体积血液样品。在其他实施方案中，通过扎足跟(来自例如婴儿)获得小体积血液样品。在再其他实施方案中，通过扎耳朵获得小体积血液样品。在进一步的实施方案中，通过扎尾巴获得小体积血液样品。
在一些实施方案中，小体积如本文所定义(参见例如“小体积”)。在其他实施方案中，小体积为1μL至10μL、5μL至100μL或5μL至50μL。在其他实施方案中，小体积为5μL至20μL或5μL至10μL。在再其他实施方案中，小体积为5μL。在其他实施方案中，小体积为1μL。
与较大体积的血液样品相比，获得小体积血液样品允许更频繁地对例如对象采样，因为采集小体积血液样品减少了对对象的伤害(例如，疼痛、失血、血液水平恢复慢)。例如，使用典型的现有方法，不能实现从小动物(例如，大鼠，小鼠)频繁进行血液采样，因为全面的血液分析需要如此多的血液以至于必须处死动物。类似地，为了防止失血造成伤害，通常可能只能通过针刺(例如扎足跟)对婴儿安全地采样。在本文提供的某些实施方案中，获得小体积血液样品。在某些实施方案中，获得小体积血液样品，其频率为每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次或每天五次或更多次。在其他实施方案中，每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次或每周七次或更多次获得小体积血液样品。在其他实施方案中，每天获得小体积血液样品。在再其他实施方案中，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次获得小体积血液样品。在某些实施方案中，每月一次获得小体积血液样品。
富集的红细胞样品或部分
在一些实施方案中，所述方法涉及由富含红细胞的样品、富含红细胞的部分或红细胞产生或生成蛋白图谱，以及确定富含红细胞的样品、富含红细胞的部分或红细胞中的一种或多种蛋白的水平。通过例如白细胞去除和/或血小板去除由血液样品产生富含红细胞的样品和富含红细胞的部分。另外地或供选择地，可以从样品中去除RBC以产生富含红细胞的样品或富含红细胞的部分。
用于白细胞去除和血小板去除的各种方法是可获得的(参见，例如Wenz,B.,“Clinical Benefits of Leukodepleted Blood Products”第5-16页,1995,SpringerBerlin Heidelberg中的“Methods for leukodepletion”；Novotny V.和Brand,A.,“Modern Transfusion Medicine”,第117-121页,1995,CRC Press,Inc.中的“Leukocyte-Poor Blood and Platelet Transfusions”；White和Jennings,“Platelet Protocols:Research and Clinical Laboratory Procedures”,1999,Academic Press)。用于白细胞去除的适合技术的非限制性实例包括流式细胞术、葡聚糖沉降、ficol/percol密度梯度离心等。
本公开还提供了通过产生富含红细胞的样品并检测富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在或测量富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的水平来提高血液样品中的一种或多种蛋白的检测或测量的灵敏度的方法。在某些实施方案中，血液与葡聚糖的比例为1:1至2:1、1:1至3:1、1:1至4:1、1:1至5:1、1:1至6:1、1:1至7:1、1:1至8:1、1:1至9:1或1:1至10:1。在其他实施方案中，血液与葡聚糖的比例为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在再其他实施方案中，血液与葡聚糖的比例为2:1。在进一步的实施方案中，血液与葡聚糖的比例为4:1。
借助非限制性实例，富含红细胞的样品或富含红细胞的部分可以通过对血液样品中存在的白细胞数的多于90％、92.5％、95％、97.5％、99％、99.5％、99.75％或99.9％进行白细胞去除而生成。在该条件下的“白细胞去除”可以通过直接从血液样品中去除白细胞，和/或通过从样品中移出RBC以提供单独的白细胞去除(富含RBC)的部分来实现。在一些实施方案中，白细胞去除包括血小板去除。
另外地或供选择地，富含红细胞的样品或富含红细胞的部分可以通过对血液样品中存在的血小板数的多于90％、92.5％、95％、97.5％、99％、99.5％、99.75％或99.9％进行血小板去除而生成。在该条件下的“血小板去除”可以通过直接从血液样品中去除血小板，和/或通过从样品中移出RBC以提供单独的血小板去除(富含RBC)的部分来实现。
在一些实施方案中，富含红细胞的样品或富含红细胞的部分可以包含多于99.75％、多于99.8％、多于99.9％、多于99.95％、约100％或100％的红细胞(作为富含RBC的部分内存在的血细胞的总数的组成部分)。
可以使用本领域普通技术人员可获得的方法评估给定富集样品或富含红细胞的部分中RBC的百分比，包括例如流式细胞术、荧光显微术、其他基于抗体的技术等。
红细胞膜
在某些实施方案中，本文提供的方法涉及由红细胞膜和/或红细胞血影产生或生成蛋白图谱。红细胞膜是指其中胞浆蛋白中的一些(例如，大于：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)已被去除的RBC。例如，可以通过裂解、洗涤和离心分离的和全血中存在的红细胞来去除胞浆蛋白。可以通过多种方法裂解红细胞以获得红细胞膜，包括例如低渗溶血(hypotonic hemolysis)(参见例如，Bramley TA,Coleman R,Finean JB.Chemical,enzymological and permeability properties of humanerythrocyte ghosts prepared by hypotonic lysis in media of differentosmolarities.Biochimica et Biophysica Acta–Biomembranes,241(3)1971)、冻融循环等。冻融循环可以重复适当的次数(例如，至少两次、至少三次、至少四次或至少五次)，以达到与红细胞相关的胞浆材料的期望水平(例如，95％不含胞浆蛋白)。因为可以通过离心(例如，在16,000g下)裂解的红细胞获得红细胞膜，所以可以从包含红细胞的样品中分离膜，即使红细胞是小的或最小的样品成分。
小体积富含红细胞的样品
本公开还提供了由小体积的富含红细胞的血液样品产生蛋白图谱的方法。可以通过本领域可获得并且本领域普通技术人员认为适合的方法从富含红细胞的血液样品获得小体积，用于富含红细胞的样品中的蛋白检测或蛋白测量的后续方法(参见例如以下的蛋白图谱分析)。小体积是如本文所定义的体积(参见例如“小体积”)。借助非限制性示例，在其他实施方案中，小体积可以是0.1μL至0.5μL、0.5μL至1μL、1μL至5μL、5μL至10μL、5μL至20μL、5μL至30μL、5μL至40μL、5μL至50μL、5μL至60μL、5μL至70μL、5μL至80μL、5μL至90μL或5μL至100μL。在一些实施方案中，小体积为5μL至100μL。在其他实施方案中，小体积为5μL至50μL或5μL至20μL。在再其他实施方案中，小体积为5μL至10μL。在某些实施方案中，小体积为5μL。
包含RBC的全血
其他实施方案涉及分析包含RBC的全血样品。在这些实施方案中，分析全血样品的蛋白图谱，而不或基本上不改变样品中血细胞类型的相对比例，并且不分离血浆/血清。
可以使用本领域普通技术人员可获得的示例性手段获得全血样品(参见例如，世界卫生组织，“血液、血液成分和血浆衍生物的收集、处理和质量控制的要求(Requirementsfor the collection,processing and quality control of blood,blood componentsand plasma derivatives)”，世界卫生组织技术报告系列，第840号，1994年，附件2)。方法也在本说明书的实施例中给出。
借助非限制性实例，可以使用静脉采血、毛细血管采血、动脉采血或其组合获得全血样品。
在一些实施方案中，涉及全血分析的本公开的方法可以使用干血点(DBS)采样进行。DBS采样的非限制性优点包括以下中的一个或多个：样品稳定、最小的体积要求(例如，每个点30-100μL)、易于收集样品(例如，扎手指、扎脚趾或扎足跟)和运输。获得的用于本公开的DBS样品可以例如在冷藏和/或环境温度下保持数月至数年的稳定性。
适用于DBS的方法对于本领域普通技术人员来说是可获得的(参见例如，McDade等人；Demography 2007,44:899–925；De Jesus等人.Clin Chem2009,55:1；158–164；Sharma等人.Drug Testing and Analysis,2014,6(5),399–414)。
简言之，并且仅借助非限制性实例，可以使用合适的器械(例如，无菌手术刀片或一次性刺血针)从感兴趣的对象(例如，扎手指、扎足跟或扎脚趾)获得全血并且点在例如膜或纸(例如，滤纸卡)上。对于定量分析，可以应用测量体积的血液。然后可以使血液在例如室温和/或氮气流和/或受控湿度下干燥。干燥时间通常至少部分取决于样品体积。DBS膜或纸可以在环境温度下储存或冷藏，并且可以适当地包装以避免潮湿。然后可以在合适的时间提取DBS用于分析(例如，使用提取溶剂或类似物)。
另外的血液隔室的分析
除了富集的RBC样品、RBC部分或包含RBC的全血样品的蛋白图谱分析之外，本公开的方法还可以包括进行一个或多个另外的血液隔室的蛋白图谱分析。
例如，蛋白图谱分析可以针对选自以下的一个或多个另外的血液隔室进行：血浆、血清、血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)及其组合。
可以使用可用的技术制备用于分析的另外的血液隔室(多个血液隔室)。例如，可以通过流式细胞术、磁珠分离、离心等分离细胞成分。血浆/血清分离技术也可在本领域中获得。许多标准文本和协议可用于并广泛用于这些目的，并且借助非限制性示例参考：世界卫生组织，“血液、血液成分和血浆衍生物的收集、处理和质量控制的要求(Requirementsfor the collection,processing and quality control of blood,blood componentsand plasma derivatives)”，世界卫生组织技术报告系列，第840号，1994年，附件2；Wenz,B.,“Clinical Benefits of Leukodepleted Blood Products”第5-16页,1995,SpringerBerlin Heidelberg中的“Methods for leukodepletion”；Novotny V.和Brand,A.,“Modern Transfusion Medicine”,第117-121页,1995,CRC Press,Inc.中的“Leukocyte-Poor Blood and Platelet Transfusions”；White和Jennings,“Platelet Protocols:Research and Clinical Laboratory Procedures”,1999,Academic Press。
裂解物分析
在一些实施方案中，本公开的方法包括由细胞裂解物生成蛋白图谱。
仅借助非限制性实例，可以处理根据本公开的方法中的一种或多种制备的富集的RBC样品或RBC部分，以提供其中一种或多种蛋白的水平被确定的裂解物。裂解物还可以由选自以下的一个或多个其他血液隔室产生：全血、血浆、血清、血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)及其组合。
另外地或供选择地，可以处理不是RBC或包含最少量的RBC(例如，少于：10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％RBC)的血液的其他细胞成分以提供其中一种或多种蛋白的水平被确定的裂解物。
用于本公开的方法的细胞裂解物可以使用合适的方法产生，包括例如液体均质化、机械破碎、冻/融循环、高频声波、手动研磨、化学透化、酶促透化、使用链球菌溶血素透化等。
在一些实施方案中，通过一次、两次、三次、四次、五次或多于五次冻/融循环制备细胞裂解物。该技术提供了以下潜在益处：提供在冰点稳定血液样品或其成分(多种成分)并在裂解和分析蛋白含量之前允许储存的手段。通常，快速冷冻可以在以下或低于以下的温度下进行：-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90℃、-100℃、-120℃、-140℃、-160℃、-180℃、-190℃、-195℃或-196℃。在再其他实施方案中，快速冷冻在低于以下的温度下进行：-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90、-100℃、-120℃、-104℃、-160℃、-180℃、-190℃、-200℃。在再其他实施方案中，快速冷冻在低于以下的温度下进行：-190℃、-191℃、-192℃、-193℃、-194℃、-195℃、-196℃、-197℃、-198℃或-199℃。全血样品、富含RBC的样品、富含RBC的部分和/或其他不同的细胞成分可以快速冷冻以稳定细胞。这可以减少或防止例如来自RBC和/或处理过程中存在的其他细胞类型的蛋白的汇集和/或释放。
细胞洗液和上清液的分析
在一些实施方案中，本公开的方法包括由细胞洗液和/或细胞上清液生成蛋白图谱。
细胞洗液和/或细胞上清液可以由包含RBC的血液样品或血液样品成分产生。在一些实施方案中，RBC的数量占血液样品或血液样品成分中存在的血细胞总数的多于：0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.75％、99.9％或99.95％。
在一些实施方案中，细胞洗液可以通过洗涤富含RBC的细胞和/或通过单独洗涤一个或多个选自以下的细胞血液隔室产生：全血、血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)或其组合。
在一些实施方案中，细胞上清液可以通过孵育或培养富含RBC的细胞和/或单独孵育或培养一个或多个选自以下的细胞血液隔室产生：血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)或其组合。然后可以将细胞上清液与细胞分离并分析孵育或培养的细胞释放的蛋白(细胞内和/或来自细胞表面)。任选地，可以洗涤去除上清液后剩余的细胞并用于生成蛋白图谱。可以将细胞洗液与细胞上清液组合以生成蛋白图谱，或者供选择地可以分别由细胞洗液和细胞上清液生成单个蛋白图谱。如果需要，这将允许比较两个单独的图谱。
通过如上培养细胞一段时间并在不同时间点收集一系列上清液，可以产生一系列细胞上清液。可以分析上清液的蛋白含量以提供多个时间点的蛋白图谱分析。任选地，孵育或培养条件(例如，介质含量、温度等)可以在上清液采样的时间点之间变化。任选地，可以洗涤在一个或多个时间点去除上清液后剩余的细胞并用于生成蛋白图谱。细胞洗液可以与给定时间点(例如，相同时间点)的细胞上清液组合以生成蛋白图谱。供选择地，可以由单一细胞洗液和单一细胞上清液生成单个蛋白图谱。供选择地，可以合并来自多个时间点的细胞洗液并分析以生成蛋白图谱。同样地，可以合并来自多个时间点的细胞上清液并分析以生成蛋白图谱。
用于孵育或培养富含RBC的细胞和/或单独孵育或培养其他细胞血液隔室(多个细胞血液隔室)的合适的示例性方案和/或介质对于本领域普通技术人员是可获得的(参见例如，Koller,Palsson,Masters,(编)“Human Cell Culture:Vol IV.PrimaryHematopoietic cells”,2006,Springer Science and Business Media；Mirty andHughes(编)2001,“Human Cell Culture Protocols,第三版”,2011,Humana Press)。方法也在本说明书的实施例中给出。
细胞洗液可以使用适合的介质进行，例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)、等渗盐溶液、生长介质、培养基或其组合。
在本公开的方法中用作细胞洗液、细胞培养基或细胞孵育介质的合适介质的非限制性实例包括等渗盐溶液、平衡盐溶液、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank氏平衡盐溶液(HBSS)、Earles氏平衡盐溶液(EBSS)、Roswell Park纪念研究所培养基(RPMI)、极限必需培养基(MEM)、改良极限必需培养基(IMEM)、Eagle氏极限必需培养基(EMEM)、Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)和Iscove氏改良Dulbecco氏培养基(IMDM)或其组合。在一些实施方案中，所述介质为PBS或HBSS，以使RBC维持在非生长或增殖状态。在其他实施方案中，所述介质为RPMI，以刺激RBC的生长或增殖。
血液稳定剂和抗凝血剂
不受特定机制特征的限制，假设RBC可能具有汇集和释放不同蛋白(例如，细胞因子和趋化因子)的能力，并且RBC的蛋白释放(或者供选择地汇集)的程度被认为受到血液采集和处理过程中产生的各种因素的影响。
在一些实施方案中，某些实施方案中使用的血液样品或其成分可以与血液稳定剂混合。具有稳定RBC的能力的药剂是有用的，以便于减少或防止在处理过程中来自RBC的蛋白的汇集和/或释放。
血细胞稳定剂可以在从对象采集血液样品时和/或在血液样品或其成分(多种成分)的后续处理期间与血液样品混合。借助非限制性实例，血液稳定剂可在从对象获得血液样品的1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、7.5小时或10小时内与血液样品或其成分混合。
合适的血液稳定剂的非限制性实例包括蛋白酶抑制剂、抗凝血剂、RNA稳定剂(例如RNALater-Thermo Fisher Scientific)、蛋白变性剂或其组合。在某些实施方案中，血液稳定剂不是蛋白酶抑制剂。
在示例性实施方案中，血液稳定剂是抗凝血剂。在从对象收集血液样品时(例如，收集血液样品的器皿或容器可以包含抗凝血剂)和/或在血液样品或其成分(多种成分)的后续处理过程中，可以将抗凝血剂与抗凝血剂混合。
适合的抗凝血剂的非限制性实例包括肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA二钠盐、EDTA四钠盐、EDTA二钾盐、EDTA二铵盐、亚乙基双(氧亚乙基次氨基)四乙酸(EGTA)、EDTA三钠盐、EDTA三钾盐、乙二醇-O,O-双(2-氨基乙基)-N,N,N,N-四乙酸、N-(2-羟基乙基)乙二胺-N,N,N-三乙酸三钠盐、柠檬酸盐、酸-柠檬酸盐-葡萄糖、柠檬酸氢二铵、酒石酸二铵、华法林、N-(2-双(羧甲基)氨基乙基)-N-(2-羟基乙基)甘氨酸盐二水合物、柠檬酸、柠檬酸单钠盐、柠檬酸二钠盐、柠檬酸酸三钠盐、柠檬酸单钾盐、柠檬酸三钾盐、蛋白C/蛋白S、次氨基三乙酸、酒石酸钾钠、D-酒石酸氢钾、L-酒石酸单钠盐、L-酒石酸二钠盐、L-酒石酸二钾盐、链激酶、硫酸鱼精蛋白、三(羧甲基)胺、抗凝血酶III、苯丙香豆素、水蛭素、醋硝香豆素、香豆定(Coumadin)、糖胺聚糖(glycosaminoglymays)、布洛芬、乙酰水杨酸酸、吲哚美辛、前列腺素、磺吡酮、尿激酶、水蛭肽(hirulog)、组织纤溶酶原激活物、香豆素或其组合。
例如，当除了富含RBC的级分的分析之外，还需要白细胞(白血细胞)、血小板和/或血浆中的一种或多种的蛋白图谱分析时，使用抗凝血剂可能是有益的。如果需要对血液的全细胞成分(即扣除血浆成分的混合的血细胞群)进行蛋白图谱分析，则使用抗凝血剂也可以是有益的。
在其他实施方案中，当例如对RBC、富集的RBC或全血样品进行蛋白图谱分析时，本公开的方法中使用的血液样品可以不与抗凝血剂混合。在这种情况下，可以将其他没有抗凝血活性或仅具有标称量的抗凝血活性的稳定剂与血液样品或其成分混合。
在其他实施方案中，可以通过冷冻(例如，快速冷冻)或通过干燥(例如，干血点)来稳定本公开的方法中使用的血液样品或其成分。
蛋白酶抑制剂的用途
在某些实施方案中，所述方法包括使全血样品、富含红细胞的样品或红细胞成分(例如，红细胞或红细胞膜)与调节样品或成分中的一种或多种蛋白的水平的一种或多种蛋白酶抑制剂接触。通过例如在包含一种或多种蛋白酶抑制剂的介质(例如，PBS、HBSS、EBSS、RPMI、MEM、IMEM、EMEM、DMEM、IMDM)中孵育富含红细胞的样品或红细胞成分，可以使富含红细胞的样品或红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触。血液样品或成分可以从患有疾病或障碍的对象和/或未患有疾病或障碍的对象(例如，健康对象)获得。例如，血液样品或成分可以与一种或多种蛋白酶抑制剂接触，所述蛋白酶抑制剂与来自未患有疾病或障碍的对象的血液样品或成分中的一种或多种蛋白的水平调节相比，差异调节来自患有疾病或障碍的对象的样品或成分中的一种或多种蛋白的水平。
许多蛋白酶抑制剂可以单独或与用于本领域普通技术人员确定的方法中的适合的蛋白酶抑制剂组合用于本文提供的方法。例如，通过确定单个蛋白酶抑制剂对来自红细胞成分的蛋白(多种蛋白)水平的影响(例如，升高或降低的幅度，或者没有显著的升高或降低)，本领域技术人员可以基于蛋白水平的期望调节选择使用特定的蛋白酶抑制剂。适用于该方法的蛋白酶抑制剂可以包括抑制来自各种蛋白酶家族的蛋白酶的那些，包括在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和氨基肽酶抑制剂。蛋白酶抑制剂可以特异性抑制特定蛋白酶或特定蛋白酶家族，或非特异性抑制一般/常见蛋白水解机制(例如EDTA)。蛋白酶抑制剂还可包括抑制来自多于一个蛋白酶家族的蛋白酶的那些，例如，抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者的蛋白酶抑制剂(例如，亮抑酶肽(leupeptin)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、鳞状细胞癌抗原-1(SCCA-1))。蛋白酶抑制剂可包括内源性(例如内源性蛋白)或合成的(例如化学合成的)蛋白酶抑制剂。
适用于所提供方法的丝氨酸蛋白酶抑制剂可以包括例如，α-1-抗胰凝乳蛋白酶、C1抑制剂(C1INH)、α-1-抗胰蛋白酶，抗凝血酶III、α-1-抗纤溶酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、胰腺胰蛋白酶抑制剂、SCCA-1、抑制丝氨酸蛋白酶活性的SERPIN超家族的其他成员、抑肽酶(aprotinin)、糜蛋白酶抑素(chymostatin)、亮抑酶肽、抗痛素二盐酸盐(antipain dihydrochloride)、PMSF(Thermo Fisher Scientific)、二异丙基氟磷酸盐(DSF)、E-64(N-(N-L-3-反式-羰基)-L-亮氨酰)-胍丁胺)、SC(Roche/Sigma-Aldrich)、TLCK(CAS 131918-97-3)、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶A和G)抑制剂、胰蛋白酶抑制剂等。
适用于本文提供的方法的半胱氨酸(巯基)蛋白酶抑制剂可以包括例如，半胱天冬酶抑制剂、钙蛋白酶抑制剂(例如，钙蛋白酶抑制剂I、钙蛋白酶抑制剂II、钙蛋白酶抑制蛋白)、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、F、H、K、S、L、O、S、V、X和W)(例如，木瓜蛋白酶)抑制剂(例如，半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，stefins、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、激肽原)、色氨酸蛋白酶抑制剂(thyropin)、丝氨酸蛋白酶抑制剂、E-64(N-(N-L-3-反式-羰基)-L-亮氨酰)-胍丁胺))、SCCA-1、糜蛋白酶抑素、抗痛素二盐酸盐、N-乙基马来酰亚胺、亮抑酶肽、α2-巨球蛋白、PMSF等。
适用于本文提供的方法的金属蛋白酶(metalloprotease)(金属蛋白酶(metalloproteinase))抑制剂可以包括例如，乌苯美司(bestatin)、膦酰二肽(phosphoramidon)、α2-巨球蛋白、金属蛋白酶的组织抑制剂(例如，TIMP1-TIMP4)、EDTA、2,2’-联吡啶乙二胺四乙酸二钠盐脱水物、1,10-菲咯啉一水合物、膦酰二肽二钠盐和其他合成抑制剂(例如基于异羟肟酸、基于硫醇、基于嘧啶、基于羟基丙酮(hydroxyprone)、基于磷和基于四环素的抑制剂)和金属内肽酶抑制剂(例如，膦酰二肽、SCH39370)等。
适用于本文提供的方法的天冬氨酸/天冬氨酰蛋白酶抑制剂可以包括例如，α2-巨球蛋白、胃酶抑素(pepstatin)、胃酶抑素A、组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶D和E)抑制剂等。
适用于本文提供的方法的氨基肽酶抑制剂可以包括例如，盐酸乌苯美司、放线酰胺素、奥代美宁A、阿司匹汀(aspstatin)、氨肽酶抑制剂盐酸盐、奥代美宁B、厄比内酯A、盐酸表抑氨肽酶肽、氨基肽酶N抑制剂、乌苯美司甲酯、l-谷氨酸γ-(7-酰氨基-4-甲基香豆素)、CHR 2797、卡托普利、烟曲霉素、HFI 142、SC 57461A等。
蛋白酶抑制剂混合物(PIC)也适用于本文提供的方法。在某些实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物是A8127s，其包含抗痛素二盐酸盐、乌苯美司、E-64、亮抑酶肽、胃酶抑素、膦酰二肽、pefabloc SC、EDTA-Na2和抑肽酶。在其他实施方案中，PIC，如蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)、蛋白酶抑制剂混合物散剂(Sigma Aldrich，目录号SRE0055)、SIGMAFAST蛋白酶抑制剂片剂(Sigma Aldrich，目录号S8820)、蛋白酶抑制剂混合物(SigmaAldrich，目录号P8340)、无动物成分蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich，目录号13786)、Halt蛋白酶和磷酸盐抑制剂混合物(Thermo Fisher)、Abcam蛋白酶抑制剂(Abcam)、蛋白酶抑制剂混合物(Promega)等可以用于本文提供的方法。此外，蛋白酶抑制剂混合物可以定制，以通过确定单个蛋白酶抑制剂对感兴趣的蛋白(多种蛋白)(例如，蛋白图谱中的蛋白)的水平变化的影响来提高感兴趣的蛋白(多种蛋白)的水平变化。基于蛋白酶抑制剂对例如针对特定的疾病蛋白图谱测量的蛋白(多种蛋白)的表达的影响，可以在特定蛋白酶抑制剂混合物中包含蛋白酶抑制剂或从特定蛋白酶抑制剂混合物中排除蛋白酶抑制剂。
在一些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与前述蛋白酶抑制剂的组合(例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和/或氨基肽酶抑制剂的组合)接触。在一些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种金属蛋白酶抑制剂、一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂和/或一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种金属蛋白酶抑制剂接触。在一些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种天冬氨酰蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在又其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种金属蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种丝氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在又其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种金属蛋白酶抑制剂接触。在一些其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂接触。在某些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种金属蛋白酶抑制剂和/或一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种金属蛋白酶抑制剂和/或一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂、一种或多种金属蛋白酶抑制剂、一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂和/或一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种金属蛋白酶抑制剂和一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种金属蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种金属蛋白酶抑制剂、一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种天冬氨酸蛋白酶抑制剂和一种或多种氨基肽酶抑制剂接触。
在又其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者的蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者以及一种或多种金属蛋白酶的蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者以及一种或多种天冬氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者以及一种或多种氨基肽酶的蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者、一种或多种金属蛋白酶以及一种或多种天冬氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶二者、一种或多种金属蛋白酶、一种或多种天冬氨酸蛋白酶和一种或多种氨基肽酶的蛋白酶抑制剂接触。在某些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种特异性蛋白酶抑制剂(例如，丝氨酸、半胱氨酸、金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶或氨基肽酶抑制剂)和一种或多种非特异性蛋白酶抑制剂(例如，EDTA)接触。在一些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与包含蛋白酶抑制剂混合物的前述蛋白酶抑制剂中的一种或多种接触。在某些实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与蛋白酶抑制剂混合物A8127s接触。
在某些实施方案中，许多前述蛋白酶抑制剂可以组合使用。例如，在一些实施方案中，可以使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂、两种或更多种蛋白酶抑制剂、三种或更多种蛋白酶抑制剂、四种或更多种蛋白酶抑制剂、五种或更多种蛋白酶抑制剂、六种或更多种蛋白酶抑制剂、七种或更多种蛋白酶抑制剂、八种或更多种蛋白酶抑制剂、九种或更多种蛋白酶抑制剂、十种或更多种蛋白酶抑制剂、十一种或更多种蛋白酶抑制剂、十二种或更多种蛋白酶抑制剂、十三种或更多种蛋白酶抑制剂、十四种或更多种蛋白酶抑制剂、十五种或更多种蛋白酶抑制剂、十六种或更多种蛋白酶抑制剂、十七种或更多种抑制剂、十八种或更多种蛋白酶抑制剂、十九种或更多种蛋白酶抑制剂或二十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与两种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与三种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与四种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在一些其他实施方案中、使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与五种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与六种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在一些其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与七种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在又其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与八种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在再其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与九种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与十五种或更多种蛋白酶抑制剂接触。在又其他实施方案中，使全血样品、富含红细胞的样品和/或红细胞成分与二十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。
阳离子盐的用途
某些实施方案还包括使富含红细胞的样品与至少一种阳离子盐接触，所述阳离子盐升高和/或提高样品中的一种或多种蛋白的可检测水平。如本领域普通技术人员所确定的，阳离子盐可以是一种或多种适用于所述方法的阳离子盐。在一些实施方案中，阳离子盐是单价或多价(例如，二价、三价)金属离子盐。在其他实施方案中，阳离子盐是铵盐。
适用于该方法的单价金属阳离子盐可以包括例如，钠盐、钾盐、锂盐等或其组合。适合的钠盐可以包括例如，氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乳酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、硬脂酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、亚硫酸氢钠、硼酸钠、葡萄糖酸钠、偏硅酸钠、丙酸钠等或其组合。适合的钾盐可以包括例如，氯化钾、柠檬酸钾、溴化钾、碘化钾、碳酸氢钾、亚硝酸钾、过硫酸钾、亚硫酸钾、硫酸钾、亚硫酸氢钾、磷酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、谷氨酸钾、鸟苷酸二钾、葡萄糖酸钾、苹果酸钾、抗坏血酸钾、山梨酸钾、琥珀酸钾、酒石酸钾及其组合。适合的锂盐包括例如，氯化锂、溴化锂、碳酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸锂、乳酸锂、柠檬酸锂、天冬氨酸锂、葡萄糖酸锂、苹果酸锂、抗坏血酸锂、乳清酸锂、琥珀酸锂或其组合。
适用于该方法的二价金属阳离子盐可以包括例如，钙盐、钾盐、铍盐、锶盐、钡盐、镭盐、铁(亚铁)盐等或其组合。适合的钙盐包括例如氯化钙、硫酸钙、乳酸钙、柠檬酸钙、碳酸钙、乙酸钙、磷酸钙、海藻酸钙、硬脂酸钙、山梨酸钙、葡萄糖酸钙等或其组合。适合的镁盐可以包括例如，氟化镁、氯化镁、溴化镁、碘化镁、乳酸镁、磷酸镁、硫酸镁、亚硫酸镁、碳酸镁、氧化镁、硝酸镁、硼酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、葡萄糖酸镁、马来酸镁、琥珀酸镁、苹果酸镁、牛磺酸镁、乳清酸镁、甘氨酸镁、环烷酸镁、乙酰丙酮镁、甲酸镁、氢氧化镁、硬脂酸镁、六氟硅酸镁、水杨酸镁或其组合。适合的铍盐可包括例如，磷酸铍、乙酸铍、酒石酸铍、柠檬酸铍、葡萄糖酸铍、马来酸铍、琥珀酸铍、苹果酸铍钠、α-溴樟脑磺酸铍、乙酰丙酮铍、甲酸铍或其组合。合适的锶盐可包括例如，氯化锶、磷酸锶、硫酸锶、碳酸锶、氧化锶、硝酸锶、乙酸锶、酒石酸锶、柠檬酸锶、葡萄糖酸锶、马来酸锶、琥珀酸锶、苹果酸锶、L和/或D-形式的天冬氨酸锶、富马酸锶、L-和/或D-形式的谷氨酸锶、戊二酸锶、乳酸锶、L-苏糖酸锶、丙二酸锶、雷尼酸锶(有机金属螯合物)、抗坏血酸锶、丁酸锶、氯膦酸锶、伊班膦酸锶、水杨酸锶、乙酰水杨酸锶或其组合。适合的钡盐可以包括例如，氢氧化钡、氟化钡、氯化钡、溴化钡、碘化钡、硫酸钡、硫化钡(S)、碳酸钡、过氧化钡、氧化钡、硝酸钡、乙酸钡、酒石酸钡、柠檬酸钡、葡萄糖酸钡、马来酸钡、琥珀酸钡、苹果酸钡、谷氨酸钡、草酸钡、丙二酸钡、环烷酸钡、乙酰丙酮钡、甲酸钡、苯甲酸钡、对叔丁基苯甲酸钡、己二酸钡、庚二酸钡、辛二酸钡、壬二酸钡、癸二酸钡、邻苯二甲酸钡、间苯二甲酸钡、对苯二甲酸钡、邻氨基苯甲酸钡、扁桃酸钡、水杨酸钡、钛酸钡或其组合。适合的镭盐可以包括例如，氟化镭、氯化镭、溴化镭、碘化镭、氧化镭、氮化镭或其组合。适合的镭盐包括例如、氟化镭、氯化镭、溴化镭、碘化镭、氧化镭、氮化镭等。适合的铁(亚铁)盐可以包括例如，硫酸亚铁、氧化亚铁、乙酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸亚铁铵、葡萄糖酸亚铁、草酸亚铁、富马酸亚铁、马来酸亚铁、苹果酸亚铁、乳酸亚铁、抗坏血酸亚铁、异抗血酸亚铁、甘油酸亚铁、丙酮酸亚铁等或其组合。
在某些实施方案中，阳离子盐是可以防止富含红细胞的样品(例如氯化物或碳酸盐)中的pH变化和/或使该pH变化最小化的盐。因此，在某些实施方案中，阳离子盐是碳酸盐。在进一步的实施方案中，阳离子盐还可以防止对细胞膜(例如RBC膜)的损害或使其最小化。在某些实施方案中，阳离子盐是氯化物盐。在其他实施方案中，阳离子盐是氯化钙、氯化钾、氯化锶、氯化钡、氯化镭或其组合。在再其他实施方案中，阳离子盐是氯化钠、氯化钾、氯化铷、氯化铯、氯化锂或其组合。在其他实施方案中，阳离子盐是氯化锂。在其他实施方案中，阳离子盐可以是氯化钠。在某些实施方案中，阳离子盐可以是碳酸钙、碳酸钾、碳酸锶、碳酸钡或碳酸镭。在再其他实施方案中，阳离子盐是碳酸钠、碳酸钾、碳酸铷、碳酸铯、碳酸锂或其组合。在又其他实施方案中，阳离子盐是碳酸锂。在其他实施方案中，阳离子盐是碳酸钠。
在该方法中可以使用除一价或二价金属阳离子盐以外的盐，包括例如三价或其他多价盐，如铝、硅、钪、钛、钒、铬、钴、镍、铜、锰、锌、锡、银等或其组合。
铵盐也可以与适合的铵盐一起用于该方法中，所述铵盐包括碳酸铵、氯化铵、硝酸铵、乙酸铵、硼酸铵、溴化铵、氨基甲酸铵、硫酸铈(IV)铵、铬酸铵、重铬酸铵、磷酸二氢铵、氟化铵、甲酸铵、磷酸铵、磷酸氢铵钠四水合物、硫代硫酸铵、锆酸铵等或其组合。
在某些实施方案中，阳离子盐是氯化铵。在其他实施方案中，阳离子盐是碳酸铵。
在某些实施方案中，使富含红细胞的样品与一种或多种前述阳离子盐的组合接触以升高和/或提高样品中一种或多种蛋白的可检测水平。在一些实施方案中，使富含红细胞的样品与至少一种阳离子盐接触。在其他实施方案中，使富含红细胞的样品与至少两种阳离子盐接触。在再其他实施方案中，使富含红细胞的样品与至少三种阳离子盐接触。
在某些实施方案中，在血液样品的红细胞富集之前，使血液样品与一种或多种前述阳离子盐的组合接触以升高和/或提高样品中一种或多种蛋白的可检测水平。在一些实施方案中，使血液样品与至少一种阳离子盐接触。在其他实施方案中，使血液样品与至少两种阳离子盐接触。在再其他实施方案中，使血液样品与至少三种阳离子盐接触。
本文对盐(例如含钠盐)的提及包括盐的无水形式和水合形式。
在某些实施方案中，使全血样品接触前述阳离子盐中的至少一种以产生蛋白图谱。可以使用本领域普通技术人员可获得的方法从静脉血、毛细血管血、动脉血或其组合获得全血样品。
在其他实施方案中，使选自血浆、血清、血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)及其组合的一种或多种另外的血液隔室与前述阳离子盐中的至少一种接触以产生蛋白图谱。可以使用现有技术(例如，流式细胞术、磁珠分离、离心等)制备用于分析的另外的血液隔室(多个血液隔室)。
蛋白检测和图谱分析
本公开提供由包含RBC成分的血液样品(例如，富含RBC的样品、富含RBC的部分或全血样品)产生蛋白图谱的方法。这样的图谱的产生可以提供对生物过程的了解，包括但不限于炎症、免疫应答和/或细胞修复和/或疾病状态。
虽然对在通过本公开的方法生成蛋白图谱中可检测或测量的蛋白类型(多种类型)没有特别限制，但非限制性实例包括信号分子，例如趋化因子、细胞因子、其他炎性蛋白、糖蛋白、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质和细胞外基质成分以及酶。例如，生长因子可以包括例如刺激皮肤细胞的生长、增殖、愈合或分化的因子(例如，表皮生长因子(EGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF))，刺激神经细胞/神经系统的生长、增殖、愈合或分化的因子(例如，神经调节蛋白(例如，神经调节蛋白1-4)和神经营养蛋白(例如，神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)))，刺激结缔组织和间充质细胞的生长、增殖、愈合或分化的因子(如成纤维细胞生长因子(FGF))，刺激血管细胞的生长、增殖、愈合或分化的因子(例如，血小板源性生长因子(PDGF)、胎盘生长因子(PGF)、血管内皮生长因子(VEGF))，刺激血细胞的生长、增殖、愈合或分化的因子(例如，促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，和刺激细胞增殖的因子(如胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2))以及多效生长因子(例如，转化生长因子-β(TGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF))。
受体可以包括细胞内受体(例如，核(例如，转录因子)、胞浆(例如，类固醇)和内质网(例如，IP3)受体、细胞表面受体(例如，离子通道偶联受体、G蛋白偶联受体、酶偶联受体、toll门控受体和配体门控受体、整联蛋白)、可溶性受体(如可溶性细胞因子受体)和清道夫受体(例如，SR-A1、SR-A2、SCARA1-SCARA5、SCARB1-SCARB3、CD68、dSR-C1、LOX-1、sPD-1、sCTLA-4)。激素可包括脂质衍生的激素(例如，前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素)；氨基酸衍生的激素(例如，肾上腺素、褪黑激素、甲状腺素)；肽(例如，胰淀素、脂联素、血管紧张素原、降钙素、脑利钠肽(BNP)、促红细胞生成素、卵泡刺激素(FSH)、饥饿素(ghrelin)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)等；和类固醇(例如雄激素、雌激素、糖皮质激素、孕激素、开环类固醇(secosteroid)等)。细胞内信号递质或转导因子可以包括蛋白和蛋白激酶家族(例如，Ras和Src家族)和Wnt信号传导家族蛋白。神经递质可以包括氨基酸、肽(例如，β-内啡肽、阿片样物质)、单胺、痕量胺、嘌呤和气体递质。核转录因子可以包括DNA转录调节剂(例如fos、myc、N-myc)、mRNA转录调节剂和细胞分裂抑制剂(例如p53、pRb)。酶可以包括氧化还原酶(例如，醇、醛、氨基酸、硫、联苯酚、过氧化物等)、NADH、NADPH、核酸酶、蛋白酶、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。趋化因子和细胞因子很多，可以包括例如下表1和表2中列出的那些。
在某些实施方案中，所述方法包括产生蛋白图谱，所述蛋白图谱由如下表1和2中所示的单一蛋白或蛋白的组合组成，或包含下表1和2中所示的单一蛋白或蛋白的组合。所述图谱可以由包含RBC成分(例如，富含红细胞的样品、富含RBC的部分或全血样品)的血液样品生成。另外的图谱(多种图谱)可以由其他细胞隔室(多个细胞隔室)生成，所述细胞隔室包括但不限于，血浆、血清、血小板、白细胞、富集的血小板部分、富集的白细胞部分、富含血小板的血浆、富含白细胞的血浆、血小板和白细胞的混合物、特定白细胞(多种白细胞)(例如，T淋巴细胞(例如，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞)、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等中的一种或多种)或其组合。
表1：可以包括在通过本公开的方法产生的蛋白图谱中的单个蛋白的非限制性实例。蛋白图谱可以包含所列举的蛋白中的一种或多种或由其组成。
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表2：可以包括在通过本公开的方法产生的蛋白图谱中的蛋白对的非限制性实例。蛋白图谱可以包含所列举的一种或多种蛋白对或由其组成。
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在某些实施方案中，在富含红细胞的样品和/或红细胞成分中检测或测量一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、十六种或更多种、十七种或更多种、十八种或更多种、十九种或更多种、二十种或更多种、二十一种或更多种、二十二种或更多种、二十三种或更多种、二十四种或更多种、二十五种或更多种、二十六种或更多种、二十七种或更多种、二十八种或更多种、二十九种或更多种或三十种或更多种蛋白的存在、水平或水平变化。
在某些其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测一种或多种蛋白的存在，测量一种或多种蛋白的水平或确定一种或多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测两种或更多种蛋白的存在，测量两种或更多种蛋白的水平或确定两种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测三种或更多种蛋白的存在，测量三种或更多种蛋白的水平或确定三种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测四种或更多种蛋白的存在，测量四种或更多种蛋白的水平或确定四种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测五种或更多种蛋白的存在，测量五种或更多种蛋白的水平或确定五种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测六种或更多种蛋白的存在，测量六种或更多种蛋白的水平或确定六种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测七种或更多种蛋白的存在，测量七种或更多种蛋白的水平或确定七种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测八种或更多种蛋白的存在，测量八种或更多种蛋白的水平或确定八种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测九种或更多种蛋白的存在，测量九种或更多种蛋白的水平或确定九种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十种或更多种蛋白的存在，测量十种或更多种蛋白的水平或确定十种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十一种或更多种蛋白的存在，测量十一种或更多种蛋白的水平或确定十一种或更多种蛋白的水平变化。在一些实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十二种或更多种蛋白的存在，测量十二种或更多种蛋白的水平或确定十二种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十三种或更多种蛋白的存在，测量十三种或更多种蛋白的水平或确定十三种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十四种或更多种蛋白的存在，测量十四种或更多种蛋白的水平或确定十四种或更多种蛋白的水平变化。在进一步的实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十五种或更多种蛋白的存在，测量十五种或更多种蛋白的水平或确定十五种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十六种或更多种蛋白的存在，测量十六种或更多种蛋白的水平或确定十六种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十七种或更多种蛋白的存在，测量十七种或更多种蛋白的水平或确定十七种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十八种或更多种蛋白的存在，测量十八种或更多种蛋白的水平或确定十八种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测十九种或更多种蛋白的存在，测量十九种或更多种蛋白的水平或确定十九种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十种或更多种蛋白的存在，测量二十种或更多种蛋白的水平或确定二十种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十一种或多种蛋白的存在，测量二十一种或多种蛋白的水平或确定二十一种或多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十二种或更多种蛋白的存在，测量二十二种或更多种蛋白的水平或确定二十二种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十三种或更多种蛋白的存在，测量二十三种或更多种蛋白的水平或确定二十三种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十四种或更多种蛋白的存在，测量二十四种或更多种蛋白的水平或确定二十四种或更多种蛋白的水平变化。在又其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十五种或更多种蛋白的存在，测量二十五种或更多种蛋白的水平或确定二十五种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十六种或更多种蛋白的存在，测量二十六种或更多种蛋白的水平或确定二十六种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十七种或更多种蛋白的存在，测量二十七种或更多种蛋白的水平或确定二十七种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十八种或更多种蛋白的存在，测量二十八种或更多种蛋白的水平或确定二十八种或更多种蛋白的水平变化。在其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测二十九种或更多种蛋白的存在，测量二十九种或更多种蛋白的水平或确定二十九种或更多种蛋白的水平变化。在再其他实施方案中，从富含红细胞的样品或红细胞成分检测三十种或更多种蛋白的存在，测量三十种或更多种蛋白的水平或确定三十种或更多种蛋白的水平变化。
例如，通过检测根据本公开的方法中的一种或多种制备的裂解物、细胞洗液、细胞上清液或其组合中的一种或多种蛋白的存在可以产生或生成蛋白图谱。还可以定量(例如，测量的水平)所检测的蛋白(多种蛋白)以产生或生成蛋白图谱。在其他实施方案中，通过测量一种或多种蛋白的水平变化，可以根据本文提供的方法产生蛋白图谱，其中所述蛋白图谱可以包括具有水平变化的一种或多种蛋白和/或一种或多种蛋白的水平变化的测量值。
用于检测和/或定量单一或混合血细胞群和血浆/血清中的蛋白的方法是本领域普通技术人员可获得的。适合的方法的非限制性实例包括通常的基于抗体的方法、流式细胞术、ELISA、横向流动、免疫染色、免疫荧光、免疫电泳(包括例如Western印迹)等。供选择地，可以使用质谱、光谱、色谱、电泳、二喹啉甲酸分析(BCA)、酶分析等检测和/或定量蛋白。仅借助实例的方式，蛋白定量方法描述于美国专利第7,501,286号、第8,530,182号和美国专利公开第2013028838号中。方法也呈现在本说明书的实施例中。
本公开还提供了通过计算蛋白比由富含红细胞的样品或红细胞成分产生蛋白图谱的方法，所述蛋白比包括红细胞中的一种或多种蛋白的水平与血浆中的一种或多种蛋白的水平之比。可以通过将测量的RBC和血浆中的蛋白浓度归一化，然后将RBC中的蛋白(多种蛋白)的浓度除以血浆中的蛋白(多种蛋白)的浓度来计算蛋白比。通过计算RBC和血浆中的蛋白(多种蛋白)在全血中的每毫升相对浓度(例如，全血中的百分比)来归一化RBC和血浆中的蛋白(多种蛋白)的浓度。
在某些实施方案中，包括红细胞中的一种或多种蛋白的水平与血浆中的该一种或多种蛋白的水平之比的蛋白比为至少2:1、至少10:1、至少20:1、至少30:1、至少40:1、至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1、至少100:1、至少110:1、至少120:1、至少130:1、至少140:1、至少150:1、至少160:1、至少170:1、至少180:1、至少190:1或至少200:1。在其他实施方案中，所述蛋白比为至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少11:1、至少12:1、至少13:1、至少14:1、至少15:1、至少16:1、至少17:1、至少18:1、至少19:1、至少20:1、至少21:1、至少22:1、至少23:1、至少24:1、至少25:1、至少26:1、至少27:1、至少28:1、至少29:1、至少30:1、至少31:1、至少32:1、至少33:1、至少34:1、至少35:1、至少36:1、至少37:1、至少38:1、至少39:1或至少40:1。
疾病图谱分析和评价
本公开提供了用于在血液样品(例如，全血样品或富含红细胞的血液样品或富含红细胞的部分)中产生疾病蛋白图谱的方法。在某些实施方案中，可以针对疾病或障碍产生疾病图谱，其中与未接触蛋白酶抑制剂的样品相比，已接触蛋白酶抑制剂的富含红细胞的样品或红细胞成分相关的一种或多种蛋白的存在和/或水平存在差异。供选择地或另外地，可以针对疾病或障碍产生疾病蛋白图谱，其中与来自未患有疾病或障碍的对象的富含红细胞的样品或红细胞成分(例如，与蛋白酶抑制剂接触的样品)相比，与来自患有疾病或障碍的对象的蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品或红细胞成分相关的一种或多种蛋白的存在和/或水平存在差异。在又其他实施方案中，可以针对疾病或障碍产生疾病蛋白图谱，其中患有疾病或障碍的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平变化和来自未患有所述疾病或障碍的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平变化之间存在差异。借助非限制性实例，可以针对疾病或障碍产生疾病图谱，其中表1中列出的蛋白中的一种或多种或者表2中列出的蛋白的一种或多种组合的存在或水平存在差异。
在某些实施方案中，通过根据本文提供的方法从患有疾病或障碍的一个或多个对象获得至少一种蛋白图谱，并比较与蛋白酶抑制剂接触或未与蛋白酶抑制剂接触的红细胞富集的样品中的一种或多种蛋白的存在、水平或水平变化，产生疾病蛋白图谱(多种疾病蛋白图谱)。在其他实施方案中，通过根据所述方法从未患有疾病或障碍一个或多个对象获得至少一种蛋白图谱，并比较根据所述方法从患有疾病或障碍的一个或多个对象获得的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平，产生疾病蛋白图谱(多种疾病蛋白图谱)。在某些实施方案中，从患有疾病或障碍的对象获得至少一种蛋白图谱。在其他实施方案中，从未患有所述疾病或障碍的对象获得至少一种图谱。在进一步的实施方案中，从患有疾病或障碍的对象获得至少一种蛋白图谱，并且从未患有所述疾病或障碍的对象获得至少一种蛋白图谱。在其他实施方案中，从患有疾病或障碍的一个或多个对象获得血液样品并且合并。在其他实施方案中，从未患有疾病或障碍的一个或多个对象获得血液样品并且合并。可以根据所述方法由患有疾病或障碍的一个或多个对象和/或未患有疾病或障碍的一个或多个对象的合并的血液样品获得蛋白图谱。可以通过比较蛋白图谱中一种或多种蛋白的存在或水平，在确定包含疾病蛋白图谱的蛋白之前的时间获得蛋白图谱。
在一些实施方案中，疾病蛋白图谱由一种或多种蛋白组成，与来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的富含红细胞的样品或红细胞成分相比，所述蛋白在来自已与蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的富含红细胞的样品或红细胞成分中具有不同的存在、水平或水平变化。在其他实施方案中，疾病蛋白图谱是根据所述方法产生的，并且包含一种或多种蛋白，与来自未患有疾病或障碍的对象的富含红细胞的样品或红细胞成分相比，所述蛋白在来自患有疾病或障碍的对象的富含红细胞的样品或红细胞成分中具有不同的存在、水平或水平变化。本领域技术人员可以使用确定蛋白的存在和/或水平的统计学相关差异的分析确定蛋白是否具有不同(例如，变化或改变)的存在和/或水平(例如，更高或更低的水平)或不同的水平变化(例如，倍数变化)。
在某些实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其存在于来自与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品(例如，全血样品或富含红细胞的样品)或红细胞成分中，而不存在于来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品中。在其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其不存在于来自已与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品或红细胞成分中，而存在于来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品或红细胞成分中。在其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品或红细胞成分相比，所述蛋白在来自与蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品或红细胞成分中具有更高的水平。在再其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品相比，所述蛋白在来自与蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品或红细胞成分中具有更低的水平。
在又其他实施方案中，根据所述方法产生的疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与未患有所述疾病或障碍的对象相比，其在患有疾病或障碍的对象中具有不同的水平变化。在其他实施方案中，在患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化是与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平降低相比，水平升高。在再其他实施方案中，患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化是与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平升高相比，水平降低。在其他实施方案中，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化的升高或降低的幅度相比，一种或多种蛋白的水平变化的升高或降低的幅度在患有疾病或障碍的对象中更大。在其他实施方案中，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化的升高的幅度相比，一种或多种蛋白的水平变化的升高或降低的幅度在患有疾病或障碍的对象中更小。在其他实施方案中，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化相比，患有疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白不存在显著的水平变化。在又其他实施方案中，与患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化相比，未患有疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白不存在显著的水平变化。
在其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含前述的组合-例如，其包含与来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品或红细胞成分中的该一种或多种蛋白的水平相比，在来自已与蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品或红细胞成分中具有更高水平的一种或多种蛋白和具有更低水平的一种或多种蛋白。在某些实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与来自未与蛋白酶抑制剂接触的对象的血液样品或红细胞成分中的该一种或多种蛋白的水平相比，所述蛋白在来自已与蛋白酶抑制剂接触的患有疾病或障碍的对象的血液样品或红细胞成分中具有不同的水平。
在其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，所述蛋白存在于患有疾病或障碍的对象中，而不存在于未患有所述疾病或障碍的对象中。在其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，所述蛋白不存在于患有疾病或障碍的对象中，而是存在于未患有所述疾病或障碍的对象中。在一些其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白相比，所述蛋白在患有疾病或障碍的对象中具有更高的水平。在又其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与未患有疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白相比，所述蛋白在患有疾病或障碍的对象中具有更低的水平。在再其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含前述的组合-例如，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白相比，在患有疾病或障碍的对象具有更高水平的一种或多种蛋白和具有更低水平的一种或多种蛋白。在某些实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与未患有所述疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白相比，所述蛋白在患有疾病或障碍的对象中具有不同的水平。在再其他实施方案中，疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，与未患有疾病或障碍的对象中的一种或多种蛋白的水平变化相比，所述蛋白在患有疾病或障碍的对象中具有不同的水平变化。
在某些实施方案中，疾病蛋白图谱是包含一种或多种选自以下的蛋白的癌症蛋白图谱：IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF和IL-12p40。在其他实施方案中，疾病蛋白图谱是包含一种或多种选自以下的蛋白的先兆子痫蛋白图谱：IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra和HGF。
本公开还提供了使用通过本文提供的方法产生的疾病蛋白图谱来确定对象是否患有疾病或障碍的方法。可以从对象获得通过本文提供的方法之一产生的至少一种蛋白图谱。可以将对象的蛋白图谱(多种蛋白图谱)与通过本文提供的方法产生的疾病蛋白图谱进行比较，以获得两种蛋白图谱之间的相似性(例如，蛋白存在、蛋白水平或蛋白水平的变化)。对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱之间的相似性可以表明对象患有疾病或障碍。在某些实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少一种蛋白、至少两种蛋白、至少三种蛋白、至少四种蛋白、至少五种蛋白、至少六种蛋白、至少七种蛋白、至少八种蛋白、至少九种蛋白、至少十种蛋白、至少十一种蛋白、至少十二种蛋白、至少十三种蛋白、至少十四种蛋白、至少十五种蛋白、至少十六种蛋白、至少十七种蛋白、至少十八种蛋白、至少十九种蛋白、至少二十种蛋白、至少二十一种蛋白、至少二十二种蛋白、至少二十三种蛋白、至少二十四种蛋白、至少二十五种蛋白、至少二十六种蛋白、至少二十七种蛋白、至少二十八种蛋白、至少二十九种蛋白或至少三十种蛋白之间存在相似性。在其他实施方案中，与疾病蛋白图谱中的至少一种蛋白相比，对象的蛋白图谱中的至少一种蛋白之间存在相似性。在又其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少3种蛋白之间存在相似性。在再其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少5种蛋白之间存在相似性。在再其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少10种蛋白之间存在相似性。在又其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少15种蛋白之间存在相似性。在其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少20种蛋白之间存在相似性。在其他实施方案中，与疾病蛋白图谱相比，对象的蛋白图谱中的至少30种蛋白之间存在相似性。
在某些实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱具有相同或相似的存在、水平或水平变化，表明对象可能患有疾病或障碍。一种或多种蛋白的相同或基本相同的水平或水平变化可以从例如相同的蛋白水平(例如，在本领域技术人员确定的相关统计分析内)到低于本领域普通技术人员通过例如统计分析或阈值倍数差异确定为不同的那些的蛋白水平(例如，低于两倍不同的蛋白水平)。在一些实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化是相同的。在又其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化基本相似。在其他实施方案中，如通过本领域技术人员可获得的统计学方法确定的(例如，p值为0.05或更小的Student T检验)，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化的差异基本相似。在又其他实施方案中，通过与本领域技术人员可获得或本领域技术人员可确定的预定参考范围(例如，蛋白的健康或正常浓度范围)比较来确定对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平小于0.5倍不同。在某些其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平小于1倍不同。在又其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平小于1.5倍不同。在再其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平小于2倍不同。
在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱具有不同的蛋白存在、水平或水平变化，表明对象未患有疾病或障碍。在某些实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱包含一种或多种不同的蛋白。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱具有不同或基本不同水平的一种或多种蛋白。一种或多种蛋白的不同或基本不同的水平或水平变化可以从例如不同的蛋白水平(例如，不在本领域技术人员确定的相关统计分析内)到高于本领域普通技术人员通过例如统计分析或阈值倍数差异确定为相似的那些的蛋白水平(例如，高于两倍不同的蛋白水平)。在一些实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化是不同的。在又其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化是基本不同的。在其他实施方案中，如通过本领域技术人员可获得的统计学方法确定的(例如，p值为0.05或更大的Student T检验)，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化的差异基本不同。在又其他实施方案中，通过与本领域技术人员可获得或本领域技术人员可确定的预定参考范围(例如，蛋白的健康或正常浓度范围)比较来确定对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化的差异。在某些实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化为0倍至5倍不同。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于0.5倍不同。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于1.0倍不同。在某些其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于1.5倍不同。在又其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于2.0倍不同。在再其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于2.5倍不同。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于3.0倍不同。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于3.5倍不同。在再其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于4.0倍不同。在进一步的实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于4.5倍不同。在其他实施方案中，对象的蛋白图谱和疾病蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化高于5.0倍不同。
治疗评价
本公开还提供了使用通过本文提供的方法产生的蛋白图谱监测对象的治疗的方法。在某些实施方案中，在治疗之前和在治疗之后从对象获得根据本文提供的方法产生的蛋白图谱，并且比较两者之间的蛋白图谱的差异(例如，蛋白存在、水平或水平变化)。在其他实施方案中，在治疗之前和在治疗期间从对象获得根据本文提供的方法产生的蛋白图谱，并且比较两者之间的蛋白图谱的差异。在再其他实施方案中，在治疗期间和在治疗之后从对象获得根据本文提供的方法产生的蛋白图谱，并且比较两者之间的蛋白图谱的差异。在其他实施方案中，在治疗完成后和在治疗完成后的后续时间从对象获得根据本文提供的方法产生的蛋白图谱，并且比较两者之间的蛋白图谱的差异。
在某些实施方案中，接受治疗的对象可以经历一种或多种治疗或许多治疗。在其他实施方案中，对象已经接受和/或正在接受特定治疗。在某些实施方案中，在治疗之前获得的蛋白图谱可以从未经治疗的对象获得，并与在治疗之后的对象的蛋白图谱进行比较。在其他实施方案中，在治疗过程中获得蛋白图谱，其中将在治疗期间的一个时间点获得的对象的至少一种蛋白图谱与在治疗期间的不同时间点获得的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。在某些实施方案中，从在治疗期间经历相同治疗的对象获得蛋白图谱。在其他实施方案中，在治疗之前和在治疗之后从在治疗期间经历不同的治疗的对象获得蛋白图谱(例如，已经转换治疗的对象)。在治疗之前获得的对象的蛋白图谱(例如，蛋白存在、水平或水平变化)与治疗之后的对象的蛋白图谱相比之间的差异可以表明该治疗对对象具有影响。在治疗期间的不同时间点获得的对象的蛋白图谱之间的差异可以表明该治疗对对象具有影响。在治疗期间和在治疗之后获得的对象的蛋白图谱之间的差异可以表明治疗对对象具有影响。
在某些实施方案中，在治疗之前和之后，蛋白图谱中的至少一种蛋白、至少两种蛋白、至少三种蛋白、至少四种蛋白、至少五种蛋白、至少六种蛋白、至少七种蛋白、至少八种蛋白、至少九种蛋白、至少十种蛋白、至少十一种蛋白、至少十二种蛋白、至少十三种蛋白、至少十四种蛋白、至少十五种蛋白、至少十六种蛋白、至少十七种蛋白、至少十八种蛋白、至少十九种蛋白、至少二十种蛋白、至少二十一种蛋白、至少二十二种蛋白、至少二十三种蛋白、至少二十四种蛋白、至少二十五种蛋白、至少二十六种蛋白、至少二十七种蛋白、至少二十八种蛋白、至少二十九种蛋白或至少三十种蛋白之间存在差异。
在某些实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少一种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少3种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少5种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少10种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少15种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少20种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，治疗之前的蛋白图谱中的至少30种蛋白之间存在差异。在某些实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少一种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少3种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少5种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少10种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少15种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少20种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与在治疗期间的另一个时间点的蛋白图谱相比，在治疗期间的一个时间点的蛋白图谱中的至少30种蛋白之间存在差异。在某些其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少一种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少3种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少5种蛋白之间存在差异。在再其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少10种蛋白之间存在差异。在又其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少15种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少20种蛋白之间存在差异。在其他实施方案中，与治疗之后的蛋白图谱相比，在治疗期间的蛋白图谱中的至少30种蛋白之间存在差异。
在某些实施方案中，在治疗之前获得的对象的蛋白图谱包含与在治疗之后获得的蛋白图谱不同的蛋白(多种蛋白)，表明该治疗可能对对象具有影响。在其他实施方案中，与在治疗之后获得的蛋白图谱相比，在治疗之前获得的对象的蛋白图谱具有不同水平的一种或多种蛋白，表明该治疗可能对对象具有影响。如前所述，本领域技术人员可以适当地确定一种或多种蛋白水平的差异(例如，使用统计分析或测量并比较蛋白水平以确定蛋白存在或水平的统计学显著差异)。一种或多种蛋白的不同水平可以包括例如大于1倍差异的水平。在某些实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于1倍、大于1.5倍、大于2倍、大于2.5倍、大于3倍、大于3.5倍、大于4倍、大于4.5倍、大于5倍、大于5.5倍、大于6倍、大于6.5倍、大于7倍、大于7.5倍、大于8倍、大于8.5倍、大于9倍、大于9.5倍或大于10倍。在一些实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于1.5倍。在其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于2倍。在其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于2.5倍。在再其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于3倍。在再其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于4倍。在其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于5倍。在其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于6倍。在再其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于7倍。在其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于8倍。在又其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于9倍。在再其他实施方案中，治疗之前和之后的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平差异大于10倍。
在某些实施方案中，获得小体积血液样品以在治疗之前和在治疗之后产生蛋白图谱，以监测对象的治疗。小体积血液样品允许频繁对对象采样，因此允许以先前无法实现的频率进行治疗监测。在一些实施方案中，可以以每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次或每天五次或更多次的频率获得小体积血液样品。在其他实施方案中，每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次或每周七次或更多次获得小体积血液样品。在其他实施方案中，每天获得小体积血液样品。在再其他实施方案中，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次获得小体积血液样品。在某些实施方案中，每月一次获得小体积血液样品。
本公开还提供了使用通过本文提供的方法产生的蛋白图谱确定对象中的治疗有效性的方法。在某些实施方案中，从已经历治疗的对象获得至少一种蛋白图谱。在其他实施方案中，从未经历治疗的对象获得至少一种蛋白图谱，并且将已经历治疗的对象的至少一种蛋白图谱与未经历治疗的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。在其他实施方案中，使用从未经历治疗的一个或多个对象获得的血液样品产生蛋白图谱，并合并血液样品。在其他实施方案中，使用从已经历治疗的对象获得的一种或多种血液样品产生蛋白图谱，并合并血液样品。可以从未经历治疗的一个或多个对象的合并的血液样品和/或从未经历治疗的对象的一种或多种血液样品获得蛋白图谱。在其他实施方案中，从未经历治疗的一个或多个对象获得一种或多种蛋白图谱，和/或从已经历治疗的对象获得一种或多种蛋白图谱，并且通过本领域可用的方法进行统计分析，以(通过存在和/或水平的统计学显著差异)确定将包含未经历治疗的对象的蛋白图谱的蛋白，和/或将健康个体(多个健康个体)的参考范围与已经历治疗的对象的蛋白图谱进行比较。已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱可以在比较两种蛋白图谱之前的时间产生。
与未经历治疗的对象的蛋白图谱相比，已经历治疗的对象的蛋白图谱之间的一种或多种蛋白的存在、水平或水平变化的相似性可以表明治疗的有效性。在某些实施方案中，在至少一种蛋白、至少两种蛋白、至少三种蛋白、至少四种蛋白、至少五种蛋白、至少六种蛋白、至少七种蛋白、至少八种蛋白、至少九种蛋白、至少十种蛋白、至少十一种蛋白、至少十二种蛋白、至少十三种蛋白、至少十四种蛋白、至少十五种蛋白、至少十六种蛋白、至少十七种蛋白、至少十八种蛋白、至少十九种蛋白、至少二十种蛋白、至少二十一种蛋白、至少二十二种蛋白、至少二十三种蛋白、至少二十四种蛋白、至少二十五种蛋白、至少二十六种蛋白、至少二十七种蛋白、至少二十八种蛋白、至少二十九种蛋白或至少三十种蛋白之间存在相似性，在其他实施方案中，在至少一种蛋白之间存在相似性。在又其他实施方案中，在至少3种蛋白之间存在相似性。在再其他实施方案中，在至少5种蛋白之间存在相似性。在再其他实施方案中，在至少10种蛋白之间存在相似性。在又其他实施方案中，在至少15种蛋白之间存在相似性。在其他实施方案中，在至少20种蛋白之间存在相似性。在其他实施方案中，在至少30种蛋白之间存在相似性。
在某些实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱存在相同的一种或多种蛋白，表明该治疗可能是有效的。在其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白具有相同或基本相似的水平或水平变化，表明该治疗可能是有效的。一种或多种蛋白的相同或基本相似的水平或水平变化可以包括例如，蛋白水平或水平变化相同(例如，在本领域技术人员确定的相关统计分析内)至本领域普通技术人员通过例如统计分析或确定的阈值倍数差异(例如，低于两倍差异)确定为足够不同的蛋白水平。在一些实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化相同。在又其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化基本相似。在其他实施方案中，通过本领域技术人员可获得的统计学方法(例如，p值为0.05或更小的Student T检验)确定已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化的差异。在又其他实施方案中，通过与本领域技术人员可获得或本领域技术人员确定的预定参考范围(例如，健康或正常浓度范围)比较来确定已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化的差异。在其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化小于0.5倍不同。在其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化小于1倍不同。在再其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化小于1.5倍不同。在再其他实施方案中，已经历治疗的对象的蛋白图谱和未经历治疗的对象的蛋白图谱的一种或多种蛋白的水平或水平变化小于2倍不同。
对象
某些实施方案涉及确定来自对象的血液样品或其成分的蛋白图谱。
对象可以是其中血液包含红细胞的动物(例如哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。适合的对象的非限制性实例包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿动物物种。因此，在一些实施方案中，对象可以是人或非人动物。在其他实施方案中，对象可以是小鼠、大鼠、仓鼠、雪貂、沙鼠、兔、猴、黑猩猩、马、小马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。
试剂盒
本公开还提供了包含实施本文所述方法所必需的成分的试剂盒。
借助非限制性实例，所述试剂盒可以包括用于以下的装置：收集血液，抑制蛋白酶，防止血液凝固，稳定血液，富集RBC，获得红细胞成分，去除/分离非RBC血液成分，快速冷冻血液或其成分(多种成分)，裂解细胞，洗涤细胞，培养细胞，检测细胞内和/或细胞外的特异性靶蛋白(多种蛋白)，测量特定蛋白的水平和/或其组合。在某些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种对血液样品进行白细胞去除并产生富含红细胞的样品的试剂和至少一种检测小体积富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在或测量其水平的试剂。在某些实施方案中，检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平的试剂是ELISA装置。在其他实施方案中，试剂盒还包含至少一种获得来自对象的血液样品的试剂。
在一些实施方案中，根据本公开的试剂盒可以包括以下一种或多种：用于从对象获得血液样品的装置(多种装置)(例如，注射器、针、蝶形针、管、持针器、血液采集装置、转移装置、真空采血管、hemaPENTM)；用于从对象获得干燥血液样品的装置(多种装置)(例如，滤纸、卡片、HemaSpotTM)；用于从液体血液样品获得红细胞部分、白细胞部分和/或血小板部分的装置(多种装置)(例如，抗体涂覆的磁珠)；蛋白酶抑制剂；抗凝血剂；蛋白变性剂；等等，及其组合。
实施例
现在将参考具体实施例来描述本公开，这些实施例不应被解释为以任何方式进行限制。
实施例1.小血液体积中的蛋白水平的测量
例如，与血浆中等效体积的水平相比，红细胞中高水平的各种蛋白的发现表明可以使用小体积的全血和/或RBC来确定蛋白标记物。在小体积的全血和RBC中分析了许多蛋白的水平。
通过扎手指(n＝1)将全血从健康志愿者直接收集到EDTA溶液(3mg/mL)中。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前细胞完全裂解。将红细胞进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。裂解后，用5μL全血(在45μL PBS中)、10μL全血(在40μL PBS中)、15μL全血(在35μL PBS中)、20μL全血(在30μLPBS中)或25μL全血(在25μL PBS中)在多重细胞因子分析中分析全血。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
全血中所示蛋白在各种稀释度(1:10，1:5，1:3.3，1:2.5，1:2)下的浓度示于图1A-1TT中(反算成未稀释的浓度)。对全血的分析显示存在许多蛋白，并且这些蛋白也在一系列稀释度下存在。然而，许多分析的蛋白没有稀释线性，这不是全血独有的；在Luminex平台，例如BioPlex上的血浆分析中也观察到该现象(通常用稀释度检测更多蛋白)。结果表明，可以在小体积全血(低至5μL)中监测蛋白。检测全血中的多种蛋白的容易性表明可以收集非常小的血液体积(例如从指尖获得)并用于分析蛋白水平。
实施例2.指尖血样品与静脉血样品中的蛋白的存在的比较
为了进一步探索小血液体积中蛋白的检测，将扎手指中的多种蛋白的水平与通过可用方法收集的静脉血液中的多种蛋白的水平进行比较。
通过静脉穿刺或扎手指(n>12)将全血从健康志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)或EDTA溶液(3mg/mL)中。收集血液部分并在收集后4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前细胞完全裂解。如下使用葡聚糖沉降分离血浆和红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并收集上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff，Beckman Coulter)，然后冷冻(-80℃)直至分析。
将红细胞进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多重细胞因子分析来分析这些裂解物。使用一种多重分析。用27-重人细胞因子平板分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF(Bio-PlexPro 27-plex，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
从静脉血和指尖血分离的血浆中的指定蛋白的浓度，或从静脉血和指尖血分离的红细胞的裂解物中的指定蛋白的浓度描述于图2A-2AA中。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。当比较指尖血和静脉血时，血浆和红细胞中的蛋白水平之间存在一致的趋势。例如，与静脉血浆中的IL-6浓度相比，从指尖分离的血浆中的IL-6浓度显著更高。用红细胞观察到相同的趋势，在从指尖血中分离的细胞中观察到显著更高的蛋白水平。对于许多蛋白，包括例如IL-2、RANTES和IP-10，观察到该趋势。对于许多蛋白，在从指尖血中分离的血浆和红细胞中观察到更高的浓度，包括例如IL-1β、IL-8和TNF-α。
对于红细胞，指尖样品中的生物学变化(标准偏差)低于静脉样品中的生物学变化(例如，MIP-1β、G-CSF)。这表明从指尖收集的红细胞的分析比静脉血的分析更可重现。对于血浆中的许多蛋白观察到相反的情况，其中静脉血浆比指尖血(例如，IL-7、PDGF-bb)变化更小。这些结果支持从指尖分离和分析红细胞的情况，其中可以使用频繁的血液采集。
实施例3.使用阳离子盐的RBC中的蛋白图谱
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，分离下部红细胞部分，并丢弃白细胞。将下部的红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次。丢弃上清液，并将红细胞沉淀重悬于PBS或含有100mM LiCl的PBS中。
将红细胞进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。在21-重人细胞因子平板上分析红细胞裂解物，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
如图3A-图3G所示，氯化锂增加和/或提高了分析中几种蛋白的水平。
实施例4.与患有先兆子痫或癌症的个体相比，来自健康个体的RBC中的蛋白图谱
测量与患有疾病或障碍的个体相比，健康个体的血液中的蛋白水平的差异。从四组人中收集全血，包括：1)健康志愿者，2)健康的妊娠妇女，3)患有先兆子痫的妊娠妇女，和4)肿瘤患者(参见表1)。根据妊娠期，将健康的妊娠对照与先兆子痫样品匹配。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BDBiosciences)中。
表1.参与者概要
对象 病症 相关信息
OBS-101 淋巴瘤 化疗和放疗
OBS-102 淋巴瘤 化疗
OBS-103 癌症(具体类型未知) 化疗
PE-001 先兆子痫 妊娠晚期
PE-002 先兆子痫 妊娠晚期
PE-003 先兆子痫 妊娠晚期
收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前细胞完全裂解。
如下使用葡聚糖沉降分离血浆和红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并收集上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，然后冷冻(-80℃)直到分析。
将红细胞进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。裂解后，将红细胞裂解物在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL。然后用多重细胞因子分析来分析这些裂解物和血浆样品(未稀释的)。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
图4A-图4VV显示来自参与者组的血浆和红细胞裂解物(4亿个细胞/mL)中指定蛋白的浓度反算成每毫升全血的相对浓度(约5x 109个细胞/mL)。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。将健康(非妊娠)个体的血液中的蛋白水平与肿瘤患者进行比较，并将健康妊娠个体的血液中的蛋白水平与患有先兆子痫的妊娠个体进行比较。图5A-图5C显示红细胞中的蛋白浓度与血浆相比的倍数差异。
在一系列蛋白中，健康对照个体的蛋白水平和患有疾病或障碍的个体的蛋白水平之间存在显著差异。例如，从肿瘤组收集的红细胞中的IL-2显著低于(大约低10倍)健康组，并且从先兆子痫组收集的红细胞中的趋化因子CTACK显著高于健康妊娠组。此外，48种细胞因子中的28种在RBC中的蛋白水平显著超过血浆水平(大于2:1)，倍数变化范围为2:1至～280:1(RBC:血浆比)。中值RBC-血浆比为5.9:1。该研究的结果表明，红细胞可能是确定疾病中生物标志物的有用工具。此外，与血浆结合的红细胞分析可以提供有关目前无法得到的疾病状态的更多信息，例如，在单独的血浆中的蛋白水平没有明显差异，但在红细胞(例如，bFGF)中或在红细胞和血浆之间有可确定的差异的情况下。
实施例5.与患有先兆子痫或癌症的个体相比，来自健康个体的RBC中的蛋白图谱和RBC蛋白释放
在健康个体和患有疾病或障碍的个体中评价红细胞释放的蛋白水平。从四组人中收集全血，包括：1)健康志愿者，2)健康的妊娠妇女，3)患有先兆子痫的妊娠妇女，和4)肿瘤患者(表2)。
表2.参与者概要
根据妊娠期，将健康的妊娠对照样品与先兆子痫样品匹配。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前细胞完全裂解。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)。将红细胞在PBS中稀释至相当于4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。孵育后，通过离心(500g，5分钟)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃，并在分析前进行3次冻/融循环。用多重细胞因子分析来分析条件PBS样品。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
图6A-图6RR显示来自参与者组的红细胞条件PBS中指定蛋白的浓度。红细胞在37℃下孵育24小时后产生条件PBS。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。健康对照个体和疾病组的个体之间的蛋白水平存在显著差异。例如，与健康对照相比，从患有癌症的人中分离的红细胞中释放的IL-1α和GCS-F明显更少，并且从癌症患者分离的红细胞释放的IL-12(p40)和嗜酸性粒细胞趋化因子比从健康个体分离的红细胞释放的明显更多。类似地，健康妊娠组和患有先兆子痫的组之间的一些细胞因子明显不同，例如MIF。
结果表明，红细胞分泌蛋白组的分析可能是确定和跟踪疾病中生物标志物的有用的诊断工具。分析红细胞的分泌(红细胞蛋白释放)可以提供关于疾病状态的额外信息。
实施例6.蛋白酶抑制剂对RBC中存在的蛋白的影响
通过静脉采血将全血收集到EDTA真空采血管中。离心后收集血浆，并如上所述使用FACS或葡聚糖沉降分离细胞。通过离心(2000g，10分钟)沉淀分离的细胞和全血，并重悬至设定浓度。将样品在-80℃下冷冻，并进行3次冻/融循环以裂解细胞。在Hu 27-重BioPlex上分析样品。此外，分析了RBC释放或分泌的蛋白。通过静脉采血将全血收集到EDTA真空采血管中，并如上所述通过葡聚糖沉降分离RBC。将分离的RBC等分成在100uL PBS或PBS+蛋白酶抑制剂(PI)(1x)中有两千万个细胞，并将细胞在37℃，5％CO2下孵育24小时。孵育后，通过离心分离上清液和细胞，将样品在-80℃下冷冻，并进行3次冻/融循环以裂解细胞。在Hu27-重BioPlex上分析样品。
在RBC培养期间添加蛋白酶抑制剂改变了蛋白释放或分泌(在37℃下24小时)。
孵育条件如下：
1.RBC+PBS(100uL PBS中有两千万个RBC)
2.RBC+PBS+蛋白酶抑制剂(PI)(100uL PBS+PI中有两千万个RBC)
图7A-7Z中所示的一系列图表描绘了蛋白酶抑制剂(PI)对从RBC释放或分泌的蛋白浓度(黑色柱)和释放或分泌后在细胞中剩余的蛋白浓度(灰色柱)的影响。在培养溶液中包含蛋白酶抑制剂通常导致释放或分泌和细胞裂解物的可检测浓度更低，但是存在一些例外(即MIP-1b)。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。
实施例7.与患有先兆子痫或癌症的个体相比，蛋白酶抑制剂对来自健康个体的RBC的蛋白水平的影响
在来自健康个体和患有疾病或障碍的个体的红细胞中评价红细胞释放的蛋白水平。从四组人中收集全血，包括：1)健康志愿者，2)健康的妊娠妇女，3)患有先兆子痫的妊娠妇女，和4)肿瘤患者(表3)。
表3.参与者概要
对象 病症 相关信息
OBS-101 淋巴瘤 化疗和放疗
OBS-102 淋巴瘤 化疗
OBS-103 癌症(具体类型未知) 化疗
PE-001 先兆子痫 妊娠晚期
PE-002 先兆子痫 妊娠晚期
PE-003 先兆子痫 妊娠晚期
根据妊娠期，将健康的妊娠对照样品与先兆子痫样品匹配。通过静脉穿刺(n≥3)将血液从每个志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在-80℃下进行3次冻融循环以确保在分析之前细胞完全裂解。
将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。然后如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。此后，丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤两次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,BeckmanCoulter)。将红细胞在PBS中稀释至4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。
在一个情况下，如表4所示，将全血样品分成两等份，并且在每组(健康志愿者，健康妊娠，先兆子痫，肿瘤)过夜孵育期间用蛋白酶抑制剂混合物(1x)、mini cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)处理一份等分试样。然后使用葡聚糖沉降从全血中分离红细胞。在另一个情况下，如表4所示，首先通过葡聚糖沉降从全血中分离红细胞，并将红细胞部分分成两等份，并且在每组(健康志愿者，健康妊娠，先兆子痫，肿瘤)过夜孵育期间用蛋白酶抑制剂混合物(1x，mini cOmplete蛋白酶抑制剂混合物片剂，Roche)处理。
表4.实验条件
孵育后，通过离心(500g，5分钟)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃，并在分析前进行3次冻/融循环。用多重细胞因子分析来分析条件PBS样品。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
图8A-图8ZZ和图9A-图9FF显示在存在或不存在蛋白酶抑制剂的情况下，来自参与者组的红细胞条件PBS中指定蛋白的浓度。红细胞在37℃下孵育24小时后产生条件PBS。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。与其中蛋白水平通常在蛋白酶抑制剂存在下降低的来自健康对象的血液样品相反(参见图7A-7Z)，当患有先兆子痫或癌症的对象的血液样品与蛋白酶抑制剂一起孵育时，存在相似或升高的蛋白水平的趋势。结果表明，可以通过使任一种血液样品与蛋白酶抑制剂接触并检测/测量蛋白水平的变化来区分健康和患病的血液样品。
图10A-图10D和图11A-图11D显示在存在或不存在蛋白酶抑制剂的情况下，来自参与者组的红细胞条件PBS中细胞因子分析的累积荧光数据(log2)。红细胞在37℃下孵育24小时后产生条件PBS。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。这些数据显示，与不存在蛋白酶抑制剂相比，当用蛋白酶抑制剂处理时，从患有先兆子痫的妇女中分离的红细胞释放出显著更多的细胞因子(参见图10C)。相比之下，对于健康非妊娠参与者(参见图10A)或健康妊娠参与者(参见图10B)，在蛋白酶抑制剂存在和不存在的情况下未观察到显著差异。类似地，在健康非妊娠和健康妊娠个体之间用蛋白酶抑制剂处理的细胞因子水平之间存在显著差异(图10B)，并且在健康参与者和肿瘤患者之间(图11D)存在显著性趋势(图11D)。结果表明，使用蛋白酶抑制剂处理血液样品可能有助于区分健康组和患病组。
实施例8.特定蛋白酶抑制剂对来自健康个体的红细胞的蛋白的影响
来自健康志愿者的血液样品用于评价特定蛋白酶抑制剂对来自红细胞的蛋白的影响。通过静脉穿刺(n≥3)将全血从健康志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下。
如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。然后丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤一次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)。将红细胞在PBS中稀释至4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。在PBS孵育期间，一些样品也与表5中所示的蛋白酶抑制剂一起孵育。
表5.蛋白酶抑制剂
孵育后，通过离心(500g，5分钟)分离得到的条件PBS，然后储存在-80℃下。用多重细胞因子分析来分析条件PBS样品。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
在用蛋白酶抑制剂混合物或来自健康参与者的单个蛋白酶抑制剂在37℃下孵育24小时后，测定红细胞条件PBS中的蛋白在4亿个细胞/mL下的倍数变化。如果p<0.05，则值与未处理的对照显著不同(*表示p＝0.05–0.01；**表示p＝0.01–0.001；***表示p<0.001)。倍数变化>1的值表明与没有用蛋白酶抑制剂(多种蛋白酶抑制剂)处理的样品(对照)相比，在用蛋白酶抑制剂(多种蛋白酶抑制剂)孵育的样品中的蛋白浓度更高，并且倍数变化<1的值表明与没有用蛋白酶抑制剂(多种蛋白酶抑制剂)处理的样品(对照)相比，在用蛋白酶抑制剂(多种蛋白酶抑制剂)孵育的样品中的蛋白具有更低的浓度。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。
表6.由蛋白酶抑制剂引起的红细胞中的蛋白的倍数变化
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与对照细胞(无蛋白酶抑制剂)相比，使用单个蛋白酶抑制剂改变了从红细胞释放的多种细胞因子的浓度(参见表6)。尽管多种蛋白酶抑制剂改变了相同细胞因子的浓度，但这种变化的方向是可变的。例如，乌苯美司和胃酶抑素是不同蛋白酶抑制剂对来自红细胞的蛋白释放的复杂影响的主要实例。用乌苯美司(一种氨基肽酶抑制剂)孵育红细胞改变释放的IFN-a2、IL-18、MIF、TRAIL、HGF和IL12-p40的浓度。胃酶抑素(一种天冬氨酸蛋白酶)也影响IFN-a2、MIF和HGF的浓度。然而，在每种情况下，胃酶抑素产生与乌苯美司相反的作用。类似地，用乌苯美司孵育红细胞后HGF的浓度急剧升高，但在用胃酶抑素孵育红细胞后HGF浓度显著降低(表6)。特异性蛋白酶抑制剂与多种细胞因子浓度之间的这种相互作用的复杂性质提供了令人信服的证据，即不只是抑制细胞因子的非特异性蛋白水解会导致蛋白酶抑制剂介导的蛋白浓度影响。
为了确定蛋白酶抑制剂的组合对来自红细胞的蛋白释放的影响，从用蛋白酶抑制剂混合物孵育的健康红细胞获得蛋白图谱。蛋白酶抑制剂混合物A8127s通过组合表5中的单个蛋白酶抑制剂产生(抗痛素二盐酸盐50μg/mL；乌苯美司40μg/mL；E-64 10μg/mL；亮抑酶肽5μg/mL；胃酶抑素0.7μg/mL；膦酰二肽330μg/mL；Pefabloc SC 1mg/mL；EDTA-Na20.5mg/mL；抑肽酶2μg/mL)，其各自对从健康红细胞单独释放的细胞因子具有显著影响(表6和图12A-图12VV)。将健康的红细胞与A8127s和cOmplete蛋白酶抑制剂混合物(Roche)一起孵育。A8127s在IL-17、嗜酸性粒细胞趋化因子、GM-CSF、PDGF-bb、INF-a2、IL-2ra、CTACK、MCP-3、MIG和IL-3中产生统计学显著的变化(图13A-图13VV)，而cOmplete蛋白酶抑制剂混合物在实验中没有使细胞因子浓度产生显著变化。
总之，数据表明蛋白酶抑制剂使从分离自健康个体的红细胞释放的细胞因子浓度产生显著变化。单个蛋白酶与细胞因子浓度变化之间的复杂关系表明，这种影响不太可能仅与细胞因子的非特异性蛋白水解的抑制有关。此外，商业抑制剂混合物(RochecOmplete)和A8127s蛋白酶抑制剂混合物的比较显示，A8127s具有更大的能力使从分离自健康参与者的红细胞释放的细胞因子的浓度/图谱产生显著变化。
实施例9.蛋白酶抑制剂对来自红细胞膜的蛋白的影响
为了确定蛋白酶抑制剂是否对来自红细胞膜的蛋白释放有影响，从分离的红细胞和全血中获得红细胞膜，然后与蛋白酶抑制剂一起孵育。通过静脉穿刺将全血从健康志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，在分析之前将样品储存在-80℃下。
收集全血的等分试样并在-80℃下冷冻。如下使用葡聚糖沉降从剩余的新鲜全血中分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。然后丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤一次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)，并在-80℃下冷冻细胞的等分试样。
为了分离红细胞膜，将冷冻的全血和分离的红细胞二者的等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL 4000万个红细胞)以1:20的比例(裂解物:PBS)加入PBS中。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。一些样品也与表5中的蛋白酶抑制剂一起孵育。
孵育后，通过离心(16,000g，20分钟，4℃)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃下直至分析。然后用多重细胞因子分析来分析条件PBS样品。27-重人细胞因子平板用于碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
图14A-图14AA显示在存在或不存在蛋白酶抑制剂混合物(A8127s和cOmplete(Roche))的情况下，在条件PBS中孵育的红细胞膜中的几种蛋白的浓度。数据表明，即使在较低的红细胞数量下，在红细胞膜条件PBS(来自全血和富集的红细胞裂解物二者)中仍然存在大量以易于检测的水平存在的细胞因子。每毫升4亿个红细胞的浓度相当于每毫升仅80μL全血(假设每毫升新鲜全血的正常浓度为5x 109个红细胞)。因为该实验仅在200μL的4亿个细胞/mL的溶液中进行，因此仅16μL的全血的起始样品就足以检测以上观察到的细胞因子浓度。
实施例10.蛋白酶抑制剂对来自癌症群组的红细胞蛋白的影响
许多蛋白的存在或水平的变化是多种疾病的特征。特别地，癌症是涉及炎性蛋白(例如细胞因子)等蛋白的差异水平的疾病。因此，研究了来自患有结肠直肠癌和淋巴瘤的红细胞的蛋白的浓度。
通过静脉穿刺将全血从志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，在分析之前将样品储存在-80℃下。如下使用葡聚糖沉降分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。然后丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤一次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff,Beckman Coulter)。然后将红细胞在PBS中稀释至4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。在PBS孵育期间，一些样品也与表5中的单个蛋白酶抑制剂(商业蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete，Roche)或A8127s蛋白酶抑制剂混合物)一起孵育。A8127s蛋白酶抑制剂混合物包含抗痛素二盐酸盐(50μg/mL)；乌苯美司(40μg/mL)；E-64(10μg/mL)；亮抑酶肽(5μg/mL)；胃酶抑素(0.7μg/mL)；膦酰二肽(330μg/mL)；Pefabloc SC(1mg/mL)；EDTA-Na2(0.5mg/mL)；和抑肽酶(2μg/mL)。
孵育后，通过离心(500g，5分钟)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃下。然后在27重人细胞因子平板上分析条件PBS样品，所述27重人细胞因子平板用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF(Bio-Plex Pro 27-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
10.1结肠直肠癌
图15A-图15AA显示了从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的指定蛋白的浓度，其中红细胞已经与单个蛋白酶抑制剂或商业蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete，Roche)一起孵育。使用Student T检验确定显著差异(p<0.05)。与对照(无蛋白酶抑制剂)相比，单个蛋白酶抑制剂改变了从来自结肠直肠癌参与者的红细胞释放的多种细胞因子的浓度。单个蛋白酶抑制剂以非常不同的方式改变释放的细胞因子图谱。例如，用抗痛素二盐酸盐(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和组织蛋白酶的抑制剂)处理红细胞增加了释放的IFN-γ、IL-12(p70)、IL-15、IL-17、IL-13、IL-7、IP-10、PDGF-bb和IL-2的浓度，同时降低IL-1β、IL-8、TNF-α、MIP-1α、G-CSF和IL-6的浓度。相比之下，Pefabloc SC(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)仅增加IL-13和IL-7的释放浓度，同时降低IL-1β、IL-8、IL-9、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、MIP-1α、G-CSF和IL-6的浓度。特异性蛋白酶抑制剂与多种细胞因子的释放之间的相互作用的复杂性质提供了令人信服的证据，即不只是抑制细胞因子的非特异性蛋白水解导致蛋白酶抑制剂介导的对蛋白水平的影响。图16A-图16AA显示从来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放到含有商业蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete，Roche)或A8127s的条件PBS中的蛋白浓度。与对照样品相比，cOmplete蛋白酶抑制剂混合物仅显著改变IL-2的浓度。相比之下，与对照样品相比，红细胞与A8127s蛋白酶抑制剂混合物一起孵育显著改变了IL-1β、IL-15和GM-CSF的浓度。数据表明，使从结肠直肠癌患者中分离的红细胞暴露于蛋白酶抑制剂导致释放到条件PBS中的细胞因子的浓度发生显著变化。此外，cOmplete蛋白酶抑制剂混合物和A8127s蛋白酶抑制剂混合物的比较显示，A8127s混合物具有更大的能力使从分离自结肠直肠癌参与者的红细胞释放的细胞因子的图谱产生显著变化。
接下来，评估与蛋白酶抑制剂对患有结肠直肠癌的个体的红细胞释放的蛋白的影响相比，其对从来自健康个体的红细胞释放的蛋白的影响的差异。来自与表5中的单个蛋白酶抑制剂一起孵育的红细胞的蛋白的浓度显示在图17A-图17AA中。该数据提供了一种方法，通过该方法可以针对特定疾病状态优化蛋白酶抑制剂混合物。细胞因子IL-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和IL-6被确定为在与来自结肠直肠癌参与者的A8127s一起孵育的红细胞中具有统计学显著的变化。单个蛋白酶抑制剂数据显示，Pefabloc SC以相同的方式影响健康和结肠直肠癌参与者的IL-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和IL-6。因此，从A8127s蛋白酶混合物中去除Pefabloc SC可以增加在健康和结肠直肠癌细胞因子图谱之间观察到的差异。
图18A-图18AA显示当红细胞与蛋白酶抑制剂混合物(A8127s和cOmplete(Roche))一起孵育时，来自健康个体的红细胞与来自结肠直肠癌参与者的红细胞相比的蛋白浓度的倍数变化。结果表明，红细胞与蛋白酶抑制剂一起孵育导致来自健康和结肠直肠癌参与者组二者的红细胞条件PBS的细胞因子图谱的显著变化。与健康和结肠直肠癌参与者二者的未处理的样品相比，A8127s蛋白酶抑制剂混合物产生了细胞因子水平的最大数量的统计学显著变化。结果与健康个体中的先前数据一致，其显示与cOmplete蛋白酶抑制剂混合物相比，A8127s蛋白酶抑制剂混合物导致细胞因子图谱的更显著的变化。
从健康和结肠直肠癌群组中分离的样品在它们对蛋白酶抑制剂的反应方式上有所不同。当来自结肠直肠癌患者的完整红细胞与A8127s蛋白酶抑制剂混合物—IL-8、IL-15、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和IL-6一起孵育时，有许多细胞因子发生了显著变化。相比之下，当从健康参与者分离完整的红细胞并与A8127s一起孵育时，未检测到显著变化。这表明，在A8127s蛋白酶抑制剂混合物存在或不存在的情况下孵育的完整红细胞可能在确定对结肠直肠癌具有特异性的细胞因子图谱中是有价值的。表7总结了在每种蛋白酶抑制剂混合物的情况下在健康和结肠直肠癌参与者中显著改变的细胞因子的数量。
表7.在用蛋白酶抑制剂混合物孵育红细胞后具有显著改变的浓度的蛋白的数量
在蛋白酶抑制剂存在和不存在的情况下，从来自健康和结肠直肠癌群组的红细胞膜释放的蛋白也具有不同的浓度。为了分离红细胞膜，将冷冻的全血的等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。此后，将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL 1.2亿个红细胞)以1:20的比例加入PBS(裂解物:PBS)。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至12亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。将与蛋白酶抑制剂在37℃下孵育24小时后在12亿个细胞/mL下的红细胞膜条件PBS(从全血裂解物中分离)中的蛋白的倍数变化与无蛋白酶抑制剂孵育来自健康参与者或患有结肠直肠癌的参与者的红细胞膜进行比较。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据是平均值±标准偏差。图19A-19VV显示，与健康个体相比，八种细胞因子对来自患有结肠直肠癌的个体的红细胞膜中的蛋白酶抑制剂混合物A8127s具有差异反应。
在用来自健康个体和患有结肠直肠癌的个体的蛋白酶抑制剂孵育的红细胞中分析另外的蛋白的浓度。使用分析sEGFR、碱性FGF、G-CSF、HGF、sHER-2/neu、sIL-6Ra、瘦素、骨桥蛋白、PECAM-1、PDGF-AB/BB、催乳素、SCF、sTIE-2、sVEGFR-1和sVEGFR-2的16重人癌症生物标志物平板1，和分析APRIL/TNFSF13、BAFF/TNFSF13B、sCD30/TNFRF8、sCD163、几丁质酶-3-样蛋白1、gp130/sIL-6Rβ、IFN-α2、IFN-γ、IL-2、sIL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-27(p28)、IL-28A/IFN-λ2、IL-29/IFN-λ1、IL-32、IL-34、IL-35、LIGHT/TNFSF14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、骨钙素、骨桥蛋白、正五聚蛋白-3、sTNF-R1、sTNF-R2、TSLP和TWEAK/TNFSF12的37-重人炎症细胞因子平板(Bio-Plex癌症生物标志物16-重平板和炎症37-重平板，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
图20A-20LL显示对于健康参与者(n＝3)或患有结肠直肠癌的参与者(n＝2)，在没有蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物的情况下，在37℃下孵育24小时后在4亿个细胞/mL下的红细胞条件PBS中的蛋白浓度。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据表示为平均值±标准偏差。数据表明蛋白酶抑制剂对从红细胞释放的一系列激素、可溶性受体、蛋白和细胞因子的浓度有影响。从在37℃下在PBS中孵育24小时的分离自健康个体的红细胞释放高浓度的分子，如骨桥蛋白、几丁质酶3-样蛋白1和MMP-1(图20A-20LL)。向红细胞中添加蛋白酶抑制剂混合物导致蛋白浓度的改变。例如，与对照(无蛋白酶抑制剂)相比，用A8127s孵育的sCD30/TNFRSF8、IL-19和LIGHT/TNFSF14显著更高(图20A-20LL)。蛋白酶抑制剂孵育后观察到的变化在从健康参与者分离的红细胞和从患有结肠直肠癌的参与者分离的红细胞之间是不同的。例如，骨桥蛋白的浓度在A8127s孵育来自健康组的红细胞的情况下增加，但在结直肠癌组中在相同条件下没有变化。相反，在结肠直肠癌组中IL-27(p28)浓度在A8127s存在的情况下显著降低，但健康组没有变化。在一个群组中在蛋白酶抑制剂存在下蛋白浓度显著改变，而在另一个群组蛋白浓度中在相反方向上移动或未发生变化的趋势发生在10种蛋白中。
接下来，对于健康个体，评估与用蛋白酶抑制剂混合物孵育的红细胞膜相比，从红细胞膜释放的蛋白是否在红细胞中的浓度不同。为了获得红细胞膜，将冷冻的全血的等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。此后，将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL 1.2亿个红细胞)以1:20的比例加入PBS(裂解物:PBS)。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至12亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。在PBS孵育期间，用蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete或A8127s)处理一些样品。在蛋白酶抑制剂不存在的情况下和在来自健康参与者(n＝3)或患有结肠直肠癌的参与者(n＝2)的蛋白酶抑制剂混合物存在的情况下，在37℃下孵育24小时后，在4亿个细胞/mL下(完整红细胞)的红细胞条件PBS或在120亿个细胞/mL下(红细胞膜)的红细胞膜条件PBS中的蛋白浓度。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据表示为平均值±标准偏差。
如图21A-21LL所示，来自健康参与者的完整红细胞和红细胞膜的蛋白图谱存在明显差异。在对照(无蛋白酶抑制剂)中，对于16种蛋白，红细胞膜释放的蛋白浓度显著高于完整红细胞释放的蛋白浓度，并且对于6种蛋白，红细胞膜释放的蛋白浓度显著低于完整红细胞释放的蛋白浓度。在完整细胞和红细胞膜二者中，蛋白酶抑制剂改变条件PBS的蛋白图谱的方式也存在差异。例如，与对照相比，用A8127孵育的红细胞膜中的PDGF-AB/BB显著更低，但在完整细胞组中没有变化。对于催乳素、gp130/sIL-6Rb、BAFF/TNFSF13B、MMP-2和TWEAK/TNFSF12等观察到类似的趋势(参见图21A-21LL)。在其他情况下，蛋白酶抑制剂混合物的加入显著改变了完整红细胞的条件PBS中的蛋白浓度，但不影响来自红细胞膜的蛋白释放。其实例包括骨桥蛋白、sVEGR-1、IL-19、MMP-1和正五聚蛋白-3。结果表明，与完整红细胞相比，调节对蛋白酶抑制剂的响应和条件PBS中的蛋白浓度的机制在红细胞膜中显著改变。
10.2淋巴瘤
为了进一步探索蛋白酶抑制剂对从来自患有癌症的个体的红细胞成分释放的蛋白浓度的影响，评估了来自健康个体和患有淋巴瘤的个体的红细胞膜的蛋白浓度的变化。为了分离红细胞膜，将冷冻的全血和红细胞的等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。此后，将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL 1.2亿个红细胞)以1:20的比例加入PBS(裂解物:PBS)。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至12亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。在PBS孵育期间，用蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete或A8127s)处理一些样品。
图22A-22VV显示了来自从全血裂解物中分离的红细胞膜的蛋白水平的变化，而图23A-23VV显示了在蛋白酶抑制剂混合物存在下来自从分离的红细胞获得的红细胞膜的蛋白的水平变化。从在12亿个细胞/mL下的全血裂解物或富集的红细胞裂解物中分离的红细胞膜条件PBS在37℃下在蛋白酶抑制剂存在或不存在的情况下与来自健康参与者或患有淋巴瘤的参与者的红细胞一起孵育24小时。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据表示为平均值±标准偏差。从数据可以得出以下结论，即蛋白酶抑制剂对细胞因子释放的影响(如已在完整红细胞中显示)在分离的红细胞膜中仍然有效。除了来自健康参与者的富集红细胞膜以外，A8127s在每组中产生最大数量的细胞因子变化。这与先前的数据一致，表明A8127s导致细胞因子图谱的变化比商业蛋白酶抑制剂混合物(Roche cOmplete)更显著。
值得注意的是，从健康和淋巴瘤组分离的样品在它们对蛋白酶抑制剂孵育的反应方式上存在差异。当用A8127s孵育来自淋巴瘤患者的红细胞膜时，还有许多细胞因子发生了显著变化。相比之下，当从健康参与者中分离红细胞膜并以相同方式处理时，未检测到显著变化。对于从全血分离的红细胞膜，细胞因子IL-8、IL-6、IP-10、IL-3和SCF以这种方式起作用。同样地，从富集的红细胞分离的红细胞膜中的细胞因子IL-12p70、IL-17、IL-4、MCP-1、GM-CSF、IFN-a2、IL-1a、IL-18、M-CSF、SCGF-B、IL-12p40遵循相同的模式。这表明从富集的红细胞裂解物中分离的红细胞膜在确定对淋巴瘤具有特异性的细胞因子图谱中可能是有价值的。
数据还表明IL-4、IFN-a2、IL-18、SCGF-b和LIF可以一起用作区分健康和淋巴瘤样品的平板。在用A8127s孵育后，细胞因子不仅在淋巴瘤样品中发生统计学变化，而且与来自健康个体的样品相比，淋巴瘤样品的倍数变化趋势(从未孵育的对照到用A8127s孵育)是不同的。表8总结了由使用的蛋白酶抑制剂混合物引起的在来自健康和淋巴瘤参与者二者的红细胞膜中显著改变的细胞因子的数量。
表8.与每个样品组的未孵育对照相比，在用每种蛋白酶抑制剂(PI)混合物孵育后，统计学显著(p<0.05)改变的细胞因子的数量
实施例11.蛋白酶抑制剂对来自炎性疾病群组的红细胞成分的影响
为了进一步探索蛋白酶抑制剂是否对来自患有一系列炎性病症的个体的红细胞成分的蛋白产生不同的影响，将从患有各种炎性病症的个体的红细胞或红细胞膜与蛋白酶抑制剂混合物一起孵育，并评估蛋白水平的变化。
通过静脉穿刺将全血从志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，将样品储存在-80℃下，并在分析之前在-80℃下进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。
收集后，将全血等分并在-80℃下冷冻。为了分离红细胞膜，将冷冻的全血等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。此后，将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL1.2亿个红细胞)以1:20的比例加入PBS(裂解物:PBS)。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至12亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。一些样品也与蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete,Roche；A8127s)一起孵育。A8127s蛋白酶抑制剂混合物由以下组成：抗痛素二盐酸盐(50μg/mL)；乌苯美司(40μg/mL)；E-64(10μg/mL)；亮抑酶肽(5μg/mL)；胃酶抑素(0.7μg/mL)；膦酰二肽(330μg/mL)；Pefabloc SC(1mg/mL)；EDTA-Na2(0.5mg/mL)；和抑肽酶(2μg/mL)。
孵育后，通过离心(16,000g，20分钟，4℃)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃下，并在分析前进行3次冻/融循环。然后用多重细胞因子分析来分析条件PBS样品。使用两种多重分析。第一种是27-重人细胞因子平板，其用于分析碱性FGF、嗜酸性粒细胞趋化因子、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、RANTES、TNF-α和VEGF，第二种是21-重人细胞因子平板，其用于分析IL-1α、IL-2Ra、IL-3、IL-12、IL-16、IL-18、CTACK、GRO-α、HGF、IFN-α2、LIF、MCP-3、M-CSF、MIF、MIG、β-NGF、SCF、SCGF-β、SDF-1α、TNF-β、TRAIL(Bio-Plex Pro 27-重和21-重，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
将蛋白酶抑制剂对健康个体的红细胞膜的影响与其对来自患有以下疾病的个体的红细胞膜的影响进行比较：骨关节炎(图24A-24VV)；先兆子痫(图25A-25VV)；先兆子痫合并宫内生长受限(图26A-26VV)；溃疡性结肠炎(图27A-27VV)；以及十二指肠溃疡和感染(图28A-28VV)。将与蛋白酶抑制剂在37℃下孵育24小时后在12亿个细胞/mL下的红细胞膜条件PBS(从全血裂解物中分离)中的蛋白的倍数变化与无蛋白酶抑制剂孵育来自健康参与者或患有骨关节炎(OA)、先兆子痫(PE)、先兆子痫合并宫内生长受限(PE+IUGR)、溃疡性结肠炎(UC)以及十二指肠溃疡和感染(DU)的参与者的红细胞膜进行比较。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据是平均值±标准偏差。
数据显示，红细胞膜与蛋白酶抑制剂的孵育导致来自健康和疾病参与者的红细胞膜条件PBS的细胞因子图谱的显著变化。数据还显示，与对照和cOmplete蛋白酶抑制剂混合物相比，A8127s产生更大的细胞因子水平变化(图24A-图28VV)。
从健康组和患病组分离的样品对蛋白酶抑制剂孵育的反应方式不同。图24A-图28VV确定了许多细胞因子的实例，与健康样品相比，所述细胞因子在A8127s如何影响患病样品中的细胞因子浓度方面显示出明显的差异。例如，IFN-a2浓度在来自用蛋白酶抑制剂治疗的健康组的红细胞膜中降低，但在骨关节炎组中显著增加。同样地，来自具有蛋白酶抑制剂孵育的健康妊娠群组的红细胞膜中的IP-10升高，但在先兆子痫群组中降低。所研究的每种疾病显示在蛋白酶抑制剂孵育后在来自健康和疾病群组的红细胞膜之间表现出差异反应的许多细胞因子。表9总结了显示出显著差异影响的每种疾病状态的细胞因子总数。
表9.显示与健康和疾病参与者组之间的蛋白酶抑制剂孵育相关的差异浓度变化的每种疾病状态的细胞因子总数
分析用蛋白酶抑制剂孵育的来自患有各种疾病的个体的红细胞膜的涉及疾病状态的其他蛋白。红细胞膜获得自健康个体，以及患有淋巴瘤、骨关节炎和溃疡性结肠炎的个体。使用两种多重分析。第一种是16-重人癌症生物标志物平板1，其用于分析sEGFR、碱性FGF、G-CSF、HGF、sHER-2/neu、sIL-6Ra、瘦素、骨桥蛋白、PECAM-1、PDGF-AB/BB、催乳素、SCF、sTIE-2、sVEGFR-1和sVEGFR-2，第二种是37-重人炎症细胞因子平板，其用于分析APRIL/TNFSF13、BAFF/TNFSF13B、sCD30/TNFRF8、sCD163、几丁质酶-3-样蛋白1、gp130/sIL-6Rβ、IFN-α2、IFN-γ、IL-2、sIL-6Rα、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-27(p28)、IL-28A/IFN-λ2、IL-29/IFN-λ1、IL-32、IL-34、IL-35、LIGHT/TNFSF14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、骨钙素、骨桥蛋白、正五聚蛋白-3、sTNF-R1、sTNF-R2、TSLP和TWEAK/TNFSF12(Bio-Plex癌症生物标志物16-重平板和炎症37-重平板，Bio-Rad)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex Pro II,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。将与蛋白酶抑制剂在37℃下孵育24小时后在12亿个细胞/mL下的红细胞膜条件PBS(从全血裂解物中分离)中的蛋白的倍数变化与无蛋白酶抑制剂孵育来自健康参与者或患有淋巴瘤、骨关节炎(OA)和溃疡性结肠炎(UC)的参与者的红细胞膜进行比较。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据是平均值±标准偏差。
数据表明蛋白酶抑制剂改变了健康参与者组中的几种蛋白的释放(图29A-图31NN)，并且还改变了淋巴瘤(图29A-图29LL)、骨关节炎(图30A-图30NN)和溃疡性结肠炎(图31A-图31NN)参与者组中的几种蛋白的释放。蛋白酶抑制剂的影响在蛋白和疾病组之间是可变的。例如，在淋巴瘤参与者组中，在用A8127s孵育的红细胞膜中观察到PECAM-1显著降低，但在健康组中未检测到显著变化。类似地，在与蛋白酶抑制剂一起孵育后，催乳素显著降低，但在健康组中没有显著改变。虽然没有统计学意义，但在健康和淋巴瘤组之间观察到几丁质酶3-样蛋白1、IL-26和IL-35在A8127s孵育后倍数变化的差异趋势，其中各蛋白的浓度在健康组中升高并且在淋巴瘤组中降低，反之亦然。
所研究的每种疾病具有在蛋白酶抑制剂孵育后在健康和疾病群组之间表现出差异反应的许多蛋白。在患有骨关节炎的参与者中，12种细胞因子表现出差异反应，包括正五聚蛋白-3和几丁质酶3-样蛋白1。类似地，在患有溃疡性结肠炎的参与者中，26种细胞因子具有差异反应，包括IL-20、IL-27(p28)和BAFF/TNFSF13B。使用前述信息，可以开发诊断平板以区分健康和患病群组。
实施例12.蛋白酶抑制剂对来自癌症组群的红细胞成分的细胞检查点调节蛋白的影响
在蛋白酶抑制剂存在和不存在的情况下，在红细胞和红细胞膜中研究特异性地涉及致癌作用等疾病状态的蛋白浓度和蛋白浓度的变化。从健康志愿者或患有癌症的志愿者收集全血。通过静脉穿刺将血液从每个志愿者直接收集到EDTA真空采血管(k2EDTA真空采血管，BD Biosciences)中。收集血液部分并在收集4小时内在室温下处理。对于多重分析(BioPlex分析)，在分析之前将样品储存在-80℃下。收集后，将全血的等分试样在-80℃下冷冻。如下使用葡聚糖沉降从剩余的全血中分离红细胞。将全血离心(1500g，10分钟)并丢弃上部血浆层。将剩余的细胞沉淀重悬于等体积的氯化钠(0.15M)中。然后将葡聚糖(在0.15M氯化钠中6％w/v)以1:4的比例(葡聚糖:细胞悬液)加入到该细胞悬液中。将该溶液在室温下放置30分钟，使红细胞沉降到管底部。丢弃上部富含白细胞的层，并分离下部红细胞部分。将红细胞部分在磷酸盐缓冲盐水(PBS，500g，5分钟)中洗涤一次，并对剩余的红细胞沉淀进行计数(Coulter Act Diff，Beckman Coulter)。然后将红细胞在PBS中稀释至4亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。在PBS孵育期间，一些样品也与表5中的单个蛋白酶抑制剂(商业蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete,Roche)或A8127s蛋白酶抑制剂混合物)一起孵育。A8127s蛋白酶抑制剂混合物包含：抗痛素二盐酸盐(50μg/mL)；乌苯美司(40μg/mL)；E-64(10μg/mL)；亮抑酶肽(5μg/mL)；胃酶抑素(0.7μg/mL)；膦酰二肽(330μg/mL)；Pefabloc SC(1mg/mL)；EDTA-Na2(0.5mg/mL)；和抑肽酶(2μg/mL)。
为了分离红细胞膜，将冷冻的全血的等分试样进行3次冻融循环以确保细胞完全裂解。此后，将裂解物的等分试样(体积相当于每100μL 1.2亿个红细胞)以1:20的比例(裂解物:PBS)加入PBS中。然后通过从溶液中离心出来(16,000g，20min，4℃)分离红细胞膜。然后丢弃上部部分，然后将得到的膜在PBS中稀释至12亿个细胞/mL，并在37℃和5％CO2下孵育24小时。一些红细胞膜样品也用蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete,Roche；A8127s)处理。
孵育后，通过离心(16,000g，20分钟，4℃)分离得到的条件PBS。将样品储存在-80℃下。然后用多重分析来分析条件PBS样品。使用14-重人免疫肿瘤检查点平板，其用于分析CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD223(Lag-3)、CD27、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD279(PD-1)、CD28、CD357(GITR)、CD80(B7-1)、TIM3(ProcartaPlex14-重人免疫肿瘤检查点平板，Affymetrix eBioscience)。根据制造商的说明书使用自动磁力清洗站(BioPlex ProII,Bio-Rad)进行洗涤步骤以进行分析。在200TM系统(Bio-Rad)上进行分析并收集荧光值。使用BioPlex管理软件(5.0版，Bio-Rad，USA)，使用5参数逻辑曲线回归分析每种细胞因子的校正曲线。
在37℃下与单个蛋白酶抑制剂、来自健康参与者或患有癌症的参与者的红细胞一起孵育24小时后，测量在4亿个细胞/mL下的红细胞条件PBS中的蛋白的浓度。数据表明与来自健康个体的蛋白浓度相比，来自患有癌症的个体的红细胞中蛋白浓度的变化(图32-45)。此外，单个蛋白酶抑制剂对蛋白浓度具有不同的影响。这些信息可以用于定制蛋白酶抑制剂混合物，使得对来自患有癌症的个体的红细胞成分中的蛋白浓度具有更大程度的影响。例如，基于表明蛋白酶抑制剂对蛋白浓度的影响的数据，可以从蛋白酶抑制剂混合物中添加或去除特定的单个蛋白酶抑制剂。可以优化蛋白酶抑制剂混合物以强调/最大化健康和癌症图谱之间的统计学显著的差异。
在无蛋白酶抑制剂的情况下或在蛋白酶抑制剂混合物的情况下，在来自健康参与者或患有癌症的参与者的红细胞成分中在37℃下孵育24小时后，测量在4亿个细胞/mL下的红细胞条件PBS和在12亿个细胞/mL下的红细胞膜条件PBS中的蛋白的浓度。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据表示为平均值±标准偏差。从红细胞和红细胞膜释放一系列癌症检查点蛋白(图46-59)。数据进一步表明蛋白酶抑制剂对从健康个体和患有癌症的个体的红细胞和红细胞膜释放的一系列癌症检查点蛋白的浓度有影响(图46-59)。此外，蛋白酶抑制剂孵育后观察到的变化在从健康参与者和患有结肠直肠癌的参与者分离的红细胞成分之间是不同的。
将在37℃下与蛋白酶抑制剂孵育24小时后，在4亿个细胞/mL下的红细胞条件PBS和在12亿个细胞/mL下的红细胞膜条件PBS(从全血裂解物分离)中的蛋白的倍数变化与未在来自健康参与者或患有癌症的参与者的红细胞成分中蛋白酶抑制剂孵育进行比较。如果p<0.05，则值显著不同(*)。数据是平均值±标准偏差。数据表明用蛋白酶抑制剂孵育红细胞和红细胞膜导致来自健康和癌症参与者组的红细胞和红细胞膜条件PBS的癌症检查点蛋白的图谱发生显著变化(图60-73和图74-87)。从健康组和癌症组分离的样品在它们对蛋白酶抑制剂孵育的响应方式上有所不同。存在许多检查点蛋白，所述检查点蛋白当来自癌症患者的红细胞或红细胞膜与例如A8127s蛋白酶抑制剂混合物一起孵育时发生显著变化(图60-73和图74-87)。相比之下，蛋白酶抑制剂对来自健康个体的红细胞和红细胞膜中那些相同的检查点蛋白的表达具有不同的影响(图60-73和图74-87)。
使用上述数据，可以开发诊断平板以区分健康和癌症群组。
实施例13.其他示例性非限制性实施方案
通过描述所要求保护的主题的某些实施方案的以下实例，所要求保护的主题的其他优点将变得显而易见。
1.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得血液样品；
b.)获得来自所述血液样品的红细胞成分；
c.)测量来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；
d.)使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
e.)测量来自与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；和
f.)确定在与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后，来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化，
其中所述产生的蛋白图谱包含在所述红细胞成分与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后具有水平变化的一种或多种蛋白。
2.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得血液样品或来自血液样品的红细胞成分；
b.)获得来自所述血液样品或所述红细胞成分的第一和第二部分；
c.)使来自所述血液样品或所述红细胞成分的第二部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
d.)测量来自所述血液样品或所述红细胞成分的第一和第二部分的一种或多种蛋白的水平，其中所述第一部分未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；和
e.)确定来自所述血液样品或所述红细胞成分的所述第一部分和来自所述血液样品或所述红细胞成分的所述第二部分的一种或多种蛋白的水平变化，
其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种蛋白，来自所述血液样品或所述红细胞成分的所述第一部分和所述血液样品或所述红细胞成分的所述第二部分的所述一种或多种蛋白的水平发生变化。
3.实施例2所述的方法，其中获得血液样品和红细胞成分二者。
4.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得来自未患有疾病或障碍的对象的血液样品；
b.)获得来自所述血液样品的红细胞成分；
c.)测量来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；
d.)使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
e.)测量来自与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；和
f.)确定在与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后，来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化，
其中所述产生的蛋白图谱包括在与一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平变化。
5.一种产生疾病蛋白图谱的方法，包括：
a.)从患有疾病或障碍的对象获得根据实施例1至3中一项或多项产生的第一蛋白图谱；
b.)从未患有疾病或障碍的对象获得根据实施例4产生的第二蛋白图谱，其中从与获得第一蛋白图谱的红细胞成分相同的红细胞成分获得所述第二蛋白图谱；和
c.)比较来自患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化与来自未患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化之间的差异，
其中所述产生的疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其中来自患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化与来自未患有所述疾病或障碍的对象的一种或多种蛋白的水平变化之间存在差异。
6.实施例1至5中一项或多项所述的方法，其中所述红细胞成分从全血或分离的红细胞获得。
7.实施例6所述的方法，其中所述红细胞成分是红细胞或红细胞膜。
8.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白或十种或更多种蛋白的水平。
9.实施例8所述的方法，其中测量三种或更多种蛋白的水平。
10.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂、两种或更多种蛋白酶抑制剂、三种或更多种蛋白酶抑制剂、四种或更多种蛋白酶抑制剂、五种或更多种蛋白酶抑制剂、六种或更多种蛋白酶抑制剂、七种或更多种蛋白酶抑制剂、八种或更多种蛋白酶抑制剂、九种或更多种蛋白酶抑制剂或十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。
11.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中使所述红细胞成分与包含至少两种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物接触。
12.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中使所述红细胞成分与蛋白酶抑制剂混合物A8127s接触。
13.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和氨基肽酶抑制剂。
14.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中通过统计分析确定所述一种或多种蛋白的水平变化，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。
15.实施例1至7中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白的水平变化是0倍至5倍的倍数变化。
16.实施例5至7中一项或多项所述的方法，其中通过统计分析确定来自所述患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化和来自所述未患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化之间的差异，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。
17.实施例5至7中一项或多项所述的方法，其中来自所述患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化和来自所述未患有疾病或障碍的对象的所述一种或多种蛋白的水平变化之间的差异是水平变化升高或水平变化降低。
18.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中所述对象是人或非人动物。
19.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中使用一种或多种抗体测量所述一种或多种蛋白的水平。
20.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分、糖蛋白、炎性蛋白和酶。
21.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自表1中列出的蛋白或表2中列出的蛋白。
22.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中所述疾病或障碍是先兆子痫。
23.实施例22所述的方法，其中所述疾病蛋白图谱是先兆子痫蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra和HGF的蛋白。
24.实施例1至17中一项或多项所述的方法，其中所述疾病或障碍是结肠直肠癌。
25.实施例24所述的方法，其中所述疾病蛋白图谱是癌症蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTES、IL-7、IP-10、PDGF和IL-12p40的蛋白。
26.一种监测对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)在第一时间点从患有疾病或障碍的对象获得第一血液样品，并且在第二时间点获得第二血液样品；
b.)针对第一血液样品和第二血液样品中的疾病或障碍测量来自根据实施例5产生的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平；和
c.)确定第一血液样品和第二血液样品中的至少一种蛋白的水平变化之间的差异，
其中所述第一血液样品和第二血液样品中的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明疾病或障碍的变化。
27.一种监测对象中的治疗效果的方法，包括：
a.)在第一时间点从所述对象获得根据实施例1至3中一项或多项产生的第一蛋白图谱，并且在第二时间点获得根据实施例1至4中一项或多项产生的第二蛋白图谱；和
b.)将来自所述第一蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自所述第二蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，
其中来自所述第一蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化和来自所述第二蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明治疗效果。
28.实施例27所述的方法，其中所述第一时间点在治疗之前，所述第二时间点在治疗之后。
29.实施例27所述的方法，其中所述第一时间点在治疗之前，所述第二时间点在治疗期间。
30.实施例27所述的方法，其中所述第一时间点和所述第二时间点在治疗期间。
31.实施例27所述的方法，其中所述第一时间点在治疗期间，所述第二时间点在治疗之后。
32.实施例27所述的方法，其中所述第一时间点和所述第二时间点在治疗之后。
33.实施例27所述的方法，其中所述对象已经接受了相同的治疗。
34.实施例27所述的方法，其中所述对象已经接受了不同的治疗。
35.实施例27至34中一项或多项所述的方法，其中所述血液样品是小体积血液样品。
36.实施例34所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次和每天五次或更多次。
37.实施例35所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次和每周七次或更多次。
38.实施例35所述的方法，其中每天监测所述对象。
39.实施例35所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次。
40.一种诊断疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得至少一种根据权利要求3产生的疾病蛋白图谱；
b.)获得来自对象的血液样品；
c.)获得来自所述血液样品的红细胞成分；
d.)使所述红细胞成分的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
e.)测量来自所述红细胞成分的第一部分中的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白的水平；
f.)确定所述红细胞成分的第一部分中的至少一种蛋白和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白之间的水平变化；和
g.)将所述红细胞成分的第一部分和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白之间的水平变化与疾病蛋白图谱中的至少一种蛋白的水平变化进行比较，
其中与疾病蛋白图谱中的至少一种蛋白的水平变化相比，所述红细胞成分的第一部分和所述红细胞成分的第二部分中的至少一种蛋白的相同或相似的水平变化表明所述对象患有疾病或障碍。
41.一种诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得至少一种根据实施例1至3中一项或多项产生的对象的蛋白图谱；和
b.)将来自所述至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自根据实施例5产生的疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，
其中与来自疾病蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化相同或相似的来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化表明所述对象患有疾病或障碍。
42.一种诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得对象的至少一种根据实施例1至3中一项或多项产生的蛋白图谱；
b.)获得至少一种根据实施例4产生的蛋白图谱；和
c.)将来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自至少一种根据实施例4产生的蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化进行比较，
其中来自对象的至少一种蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化与来自至少一种根据实施例4产生的蛋白图谱的至少一种蛋白的水平变化之间的差异表明所述对象患有疾病或障碍。
43.一种用于产生血液样品的蛋白图谱的试剂盒，包含：
a.)至少一种获得红细胞成分的试剂；
b.)一种或多种蛋白酶抑制剂；和
c.)至少一种测量来自红细胞成分的一种或多种蛋白的水平的试剂。
44.实施例43所述的方法，其中所述试剂盒还包含至少一种获得来自对象的血液样品的试剂。
45.实施例43所述的方法，其中测量一种或多种蛋白的水平的试剂是一种或多种抗体。
46.实施例45所述的方法，其中检测一种或多种蛋白的测量水平的试剂是酶联免疫吸附分析(ELISA)装置。
47.实施例43所述的方法，其中一种或多种蛋白酶抑制剂包含蛋白酶抑制剂混合物。
48.实施例47所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂混合物是A8127s。
49.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)使所述富含红细胞的样品与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；和
d.)检测富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在，
其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种在富含红细胞的样品中检测到的蛋白。
50.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)分离富含红细胞的样品中的红细胞和血浆；
d.)使所述红细胞与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
e.)测量红细胞中的一种或多种蛋白的水平和血浆中的一种或多种蛋白的水平；和
e.)计算蛋白比，其包括红细胞中的一种或多种蛋白的水平与血浆中的一种或多种蛋白的水平之比，
其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种蛋白，其具有至少2:1的蛋白比。
51.实施例49所述的方法，其中所述一种或多种蛋白具有选自至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1和至少20:1的蛋白比。
52.一种产生蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得来自患有疾病或障碍的对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)在包含一种或多种蛋白酶抑制剂的介质中孵育富含红细胞的样品中的红细胞；和
d.)检测介质中的一种或多种蛋白，
其中所述产生的蛋白图谱包含在介质中检测到的一种或多种蛋白。
53.实施例48或实施例51所述的方法，其中所述方法还包括测量在富含红细胞的样品中检测到的一种或多种蛋白的水平。
54.实施例48至52中一项或多项所述的方法，其中检测两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白或十种或更多种蛋白的存在，或测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白、或十种或更多种蛋白、十一种或更多种蛋白、十二种或更多种蛋白、十三种或更多种蛋白、十四种或更多种蛋白或十五种或更多种蛋白的水平。
55.实施例53所述的方法，其中检测三种或更多种蛋白的存在，或测量三种或更多种蛋白的水平。
56.实施例48至54中一项或多项所述的方法，其中使所述富含红细胞的样品与两种或更多种蛋白酶抑制剂、三种或更多种蛋白酶抑制剂、四种或更多种蛋白酶抑制剂、五种或更多种蛋白酶抑制剂、六种或更多种蛋白酶抑制剂、七种或更多种蛋白酶抑制剂、八种或更多种蛋白酶抑制剂、九种或更多种蛋白酶抑制剂或十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。
57.实施例55所述的方法，其中使所述富含红细胞的样品与三种或更多种蛋白酶抑制剂接触。
58.实施例55所述的方法，其中使所述富含红细胞的样品与三种或更多种蛋白酶抑制剂接触，并且其中检测两种或更多种蛋白的存在或测量两种或更多种蛋白的水平。
59.实施例55所述的方法，其中使所述红细胞与两种或更多种蛋白酶抑制剂接触，并且其中检测三种或更多种蛋白的存在或测量三种或更多种蛋白的水平。
60.实施例48至58中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
61.实施例48至59中一项或多项所述的方法，其中所述对象是人或非人动物。
62.实施例48至60中一项或多项所述的方法，其中使用一种或多种抗体检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平。
63.实施例48至60中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分和酶。
64.实施例48至60中一项或多项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自表1中列出的蛋白或表2中列出的蛋白。
65.实施例48至60中一项或多项所述的方法，其中通过选自以下的一种或多种方法对所述血液样品进行白细胞去除：流式细胞术、磁珠分离、离心、纤维素柱和葡聚糖沉降。
66.实施例64所述的方法，其中通过葡聚糖沉降对所述血液样品进行白细胞去除。
67.一种监测对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)在第一时间点和第二时间点从对象获得至少一种根据实施例48至60中一项或多项产生的蛋白图谱；和
b.)将第一时间点的对象的至少一种蛋白图谱与第二时间点的对象的至少一种蛋白图谱进行比较，
其中与第二时间点的对象的至少一种蛋白图谱相比，第一时间点的对象的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平的差异表明疾病或障碍的变化。
68.一种监测对象的治疗的方法，包括：
a.)在治疗之前和在治疗之后从对象获得至少一种根据实施例48至60中一项或多项产生的蛋白图谱；和
b.)将在治疗之前的对象的至少一种蛋白图谱与在治疗之后的对象的至少一种蛋白图谱进行比较，
其中与在治疗之后的对象的至少一种蛋白图谱相比，在治疗之前的对象的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平的差异表明对对象的治疗效果。
69.实施例67所述的方法，其中将未接受治疗的对象的至少一种蛋白图谱与接受治疗后的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。
70.实施例67所述的方法，其中将在治疗之后的一个时间点的对象的至少一种蛋白图谱与在治疗之后的不同时间点的对象的至少一种蛋白图谱进行比较。
71.实施例69所述的方法，其中所述对象已经接受了相同的治疗。
72.实施例69所述的方法，其中所述对象已经接受了不同的治疗。
73.实施例66至71中一项或多项所述的方法，其中所述血液样品是小体积血液样品。
74.实施例66至72中一项或多项所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每天一次或更多次、每天两次或更多次、每天三次或更多次、每天四次或更多次和每天五次或更多次。
75.实施例66至72中一项或多项所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每周一次或更多次、每周两次或更多次、每周三次或更多次、每周四次或更多次、每周五次或更多次、每周六次或更多次和每周七次或更多次。
76.实施例66至72中一项或多项所述的方法，其中每天监测所述对象。
77.实施例66至72中一项或多项所述的方法，其中监测所述对象多次，所述次数选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次。
78.一种产生疾病或障碍蛋白图谱的方法，包括：
a.)获得来自一种或多种患有疾病或障碍的对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)使所述富含红细胞的样品的第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
d.)测量所述富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和
e.)将所述富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，
其中所述产生的疾病蛋白图谱包含一种或多种蛋白，所述蛋白与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，在富含红细胞的样品的第一部分中具有不同的水平。
79.实施例77所述的方法，其中通过统计分析确定与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平的差异水平，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和以及Spermans秩相关。
80.实施例77或实施例78所述的方法，其中测量两种或更多种蛋白、三种或更多种蛋白、四种或更多种蛋白、五种或更多种蛋白、六种或更多种蛋白、七种或更多种蛋白、八种或更多种蛋白、九种或更多种蛋白或十种或更多种蛋白的水平。
81.实施例79所述的方法，其中测量三种或更多种蛋白的水平。
82.实施例80所述的方法，其中所述疾病或障碍是先兆子痫。
83.实施例81所述的方法，其中所述疾病蛋白图谱是先兆子痫蛋白图谱，其包含一种或多种选自IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-1ra、MCP-1、G-CSG、GM-CSF、IL-6、IFNα2、IL-1a、IL-18、MIF、IL-2ra和HGF的蛋白。
84.实施例80所述的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
85.实施例83所述的方法，其中所述疾病蛋白图谱是包含选自一种或多种以下蛋白的癌症蛋白图谱：IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-13、MIF、嗜酸性粒细胞趋化因子、RANTE、IL-7、IP-10、PDGF和IL-12p40。
86.一种诊断疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得来自对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)使所述富含红细胞的样品的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
d.)测量富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和
e.)将所述富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，
其中与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平的差异表明所述对象患有疾病或障碍。
87.实施例85所述的方法，其中一种或多种蛋白的水平无差异表明对象未患有所述疾病或障碍。
88.一种确定对象是否患有疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得来自对象的血液样品；
b.)对血液样品的至少部分进行白细胞去除以产生富含红细胞的样品；
c.)使富含红细胞的样品的至少第一部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
c.)测量富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平和未与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触的富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平；和
d.)将富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平进行比较，
其中与富含红细胞的样品的第二部分中的一种或多种蛋白的水平相比，富含红细胞的样品的第一部分中的一种或多种蛋白的水平无差异表明对象未患有疾病或障碍。
89.一种诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得根据实施例48至60中一项或多项产生的来自所述对象的至少一种蛋白图谱；和
b.)将所述至少一种蛋白图谱与至少一种疾病蛋白图谱进行比较，
其中至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平与至少一种疾病蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平类似表明对象患有所述疾病或障碍。
90.实施例88所述的方法，其中获得的所述至少一种疾病蛋白图谱是根据实施例30至33中一项或多项产生的。
91.一种诊断对象的疾病或障碍的方法，包括：
a.)获得根据实施例48至60中一项或多项产生的来自对象的至少一种蛋白图谱；
b.)获得来自未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象的至少一种蛋白图谱；和
c.)将从所述对象获得的所述至少一种蛋白图谱与从未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象获得的至少一种蛋白图谱进行比较，
其中与从未患有所述疾病或障碍的一个或多个对象获得的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白的存在或水平相比，从所述对象获得的至少一种蛋白图谱中的一种或多种蛋白存在或水平的差异表明所述对象患有疾病或障碍。
92.一种用于产生血液样品的蛋白图谱的试剂盒，包含：
a.)至少一种对血液样品进行白细胞去除并产生富含红细胞的样品的试剂；
b.)一种或多种蛋白酶抑制剂；和
c.)至少一种检测富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的存在或测量富含红细胞的样品中的一种或多种蛋白的水平的试剂。
93.实施例91所述的方法，其中所述试剂盒还包含至少一种获得来自对象的血液样品的试剂。
94.实施例91所述的方法，其中检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平的所述试剂是一种或多种抗体。
95.实施例93所述的方法，其中检测一种或多种蛋白的存在或测量一种或多种蛋白的水平的所述试剂是酶联免疫吸附分析(ELISA)装置。

Claims (12)

1.一种产生蛋白图谱的方法，所述方法为非诊断和治疗目的，所述方法包括：
A)
a.)获得来自对象的血液样品的红细胞成分，其中所述红细胞成分为红细胞或红细胞膜；
b.)获得来自所述红细胞成分的第一和第二部分；
c.)使所述红细胞成分的第二部分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
d.)测量来自所述红细胞成分的第一部分和红细胞成分的接触的第二部分的一种或多种蛋白的水平，其中所述第一部分未与一种或多种蛋白酶抑制剂接触，其中所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分、糖蛋白、炎性蛋白和酶；和
e.)确定来自所述红细胞成分的所述第一部分和来自所述红细胞成分的所述接触的第二部分的一种或多种蛋白的测量的水平变化，
其中所述产生的蛋白图谱包含一种或多种蛋白，来自所述红细胞成分的所述第一部分和所述红细胞成分的所述第二部分的所述一种或多种蛋白的测量的水平存在差异；或
B)
a.)获得来自对象的血液样品的红细胞成分，其中所述红细胞成分为红细胞或红细胞膜；
b.)测量来自所述红细胞成分的一种或多种蛋白的水平，其中所述一种或多种蛋白选自趋化因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞内信号递质、激素、核转录因子、神经递质、细胞外基质成分、糖蛋白、炎性蛋白和酶；
c.)使所述红细胞成分与一种或多种蛋白酶抑制剂接触；
d.)测量来自所述接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的水平；和
e.)确定来自所述红细胞成分和所述接触的红细胞成分的一种或多种蛋白的测量的水平差异；
其中所述产生的蛋白图谱包括一种或多种蛋白，在与所述一种或多种蛋白酶抑制剂接触之前和之后，所述一种或多种蛋白在来自所述红细胞成分中的测量的水平存在差异。
2.权利要求1所述的方法，其中：
所述红细胞成分与所述一种或多种蛋白酶抑制剂的接触发生在含有所述一种或多种蛋白酶抑制剂的培养基中，并且测量一种或多种蛋白的水平包含测量释放到培养基中的一种或多种蛋白的水平。
3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中血液样品是全血或分离的红细胞。
4.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中使所述红细胞成分与一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种蛋白酶抑制剂接触。
5.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中使所述红细胞成分与包含至少两种蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物接触。
6.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中使所述红细胞成分与包含蛋白酶抑制剂混合物A8127s的至少两种蛋白质抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物接触，其中蛋白酶抑制剂混合物A8127s包含抗痛素二盐酸盐、乌苯美司、E-64、亮抑酶肽、胃酶抑素、膦酰二肽、pefablocSC、EDTA-Na2和抑肽酶。
7.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和氨基肽酶抑制剂。
8.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中通过统计分析确定所述一种或多种蛋白的水平变化，所述统计分析选自Student T检验、ANOVA检验、混合效应模型、Mann-Whitney检验、Wilcoxon秩和、以及Spermans秩相关。
9.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白的水平变化是0倍至5倍的倍数变化。
10.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述对象是人或非人动物。
11.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中使用一种或多种抗体测量所述一种或多种蛋白的水平。
12.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白选自由碱性FGF、CCL27、嗜酸性粒细胞趋化因子1、G-CSF、GM-CSF、HGF、IFN-α2、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-12p40、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-18、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IP-10、LIF、M-CSF、CXCL9、MIP-1α、MIP-1β、PDGF-BB、SDF-1α、TNF-α、TNF-β、TRAIL、VEGF、IL-8、MCP-1、MGSA、PGE-2、RANTES、MIF、GRO-α、CRP、DDT、IGF-1、sEGFR、CD340、sIL-6Ra、瘦素、骨桥蛋白、PECAM-1、PDGF-AB/BB、催乳素、sTIE-1、sTIE-2、sVEGFR-1、sVEGFR-2、TNFSF13、TNFSF13B、TNFRSF8、sCD163、CHl3L1、sIL-6Rβ、IL-11、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26、IL-27(p28)、IL-28A、IL-29/IFN-λ1、IL-32、IL-34、IL-35、TNFSF14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、骨钙素、正五聚蛋白-3、sTNF-R1、sTNF-R2、TSLP、TWEAK、CD137、CTLA-4、Lag-3、CD27、CD270、CD272、CD279、CD28、CD357、CD80和TIM3组成的组。
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