CN109942624B - 草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了本发明提供草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置，大大提高草铵膦抗体的效价和灵敏度，具有降低的与其它类似化合物的交叉反应，能更加快速、灵敏、简便、准确地检测草铵膦残留，满足了快速检测的需要。

Description

草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置

技术领域

本发明涉及属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置。

背景技术

草铵膦（Glufosinate ammonium，GA）是一类属广谱触杀型除草剂，因其高效、广谱、低毒等特性使其被广泛应用于农业、林业及园艺的栽培。 随着草铵膦除草剂使用量的日益增大，使其常被发现存在于环境水样、土壤及植物中，这样长期积累会引起环境污染，从而对人类健康造成严重威胁。

目前，可用于检测草铵膦农药残留量的主要方法有液相色谱法，柱前衍生后气相色谱法、气相色谱-质谱法及液相色谱-质谱/质谱法。快速发展起来的超高效液相色谱-质谱联用技术，具有检测灵敏度高、适用范围广、分析速度快和能有效排除复杂基质产生的干扰等优点，当今已成为检测型实验室检测农药残留的首选。

上述检测方法中所用仪器设备操作复杂、成本高、对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果，不适用于食品、商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象进行快速的在线检测和监控。

与上述检测方法相比，免疫学检测技术具有经济、快速、技术要点低、操作简便且可实现现场检测等有点。免疫分析检测技术是近年来在环境及食品检测等领域开发出来的一种新型快速准确检测方法，现已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，也为草铵膦的检测提供了新的途径。

在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测草铵膦农药残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的草铵膦半抗原及其人工抗原。

虽然草铵膦本身具有活性基团，但由于其分子量较小，分子结构比较简单，空间结构不突出，直接制备人工抗原存在灵敏度低的重大不足，无法满足现有市场的需求。目前，国内关于草铵膦免疫检测的相关报道较少，国内检测市场上更是缺少草铵膦农药残留免疫检测的产品。目前仅报道过N-乙缩醛草铵膦活性半抗原，但是发明人在实践中发现，这种半抗原制备获得的抗体存在特异性差、亲和力低等不足。

因此，本领域亟需开发出一种检测系统，该检测系统能够特异性地针对草铵膦，具有降低的与其它类似物的交叉反应，能够准确地定性食品中的草铵膦及半定量检测。另外，该系统能够实现对草铵膦准确、快速和方便的检测。

发明内容

为了弥补已有技术的缺陷，针对现有检测草铵膦技术的不足，本发明提供草铵膦半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与检测装置，大大提高草铵膦抗体的效价和灵敏度，具有降低的与其它类似化合物的交叉反应，能更加快速、灵敏、简便、准确地检测草铵膦残留，满足了快速检测的需要。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

本发明的第一个目的是提供一种草铵膦半抗原，其具有如下结构式：

。

本发明的第二个目的是提供一种草铵膦半抗原的制备方法，是由草铵膦与2,4-二硝基氟苯反应得到。

进一步地，该制备方法为：向反应容器中加入草铵膦、弱碱和水，加热搅拌，待固体完全溶解后，加入用甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯，在55-70℃下持续反应20-40min，反应完毕后，进行萃取、分离纯化后获得草铵膦半抗原；

其中，所述草铵膦、弱碱和2,4-二硝基氟苯的摩尔质量比为1:5-12:3-6；所述弱碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢钙中的任意一种。

进一步地，该制备方法的具体步骤如下：

向反应容器中加入草铵膦1.0g、碳酸钠4.8g、蒸馏水30ml，于60℃条件下加热搅拌，待固体完全溶解后，加入4.0g用5ml甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯；60℃下持续反应30min后，反应完毕后降至室温，用二氯甲烷萃取未反应的2,4-二硝基氟苯，用6N HCl将溶液pH调为1-2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯相再用蒸馏水洗涤一遍，然后将乙酸乙酯相蒸干、过柱提纯得到草铵膦半抗原。

本发明的第三个目的是提供一种草铵膦人工抗原，是载体和上述草铵膦半抗原偶联得到的偶联物。

进一步地，所述载体为蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸，其中，所述蛋白质为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛乳铁蛋白或血蓝蛋白。

本发明的第四个目的是提供一种草铵膦人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

将所述草铵膦半抗原溶于有机溶剂中，接着搅拌下加入二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，0-4℃下搅拌6-12h，接着离心并保留上清液，所述上清液即为A液，其中，所述草铵膦半抗原半抗原、所述二环已基碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-3:1-3；

将载体溶解在pH值为7.4-9.6的PBS缓冲液中，得到B液；以及

在0-4℃搅拌下将所述A液滴加到所述B液中，4℃下反应6-24h，纯化后得到所述草铵膦人工抗原。

本发明的第五个目的是提供一种草铵膦抗体，它是由上述草铵膦人工抗原经动物免疫得到，其能与草铵膦发生特异性免疫反应。

进一步地，所述草铵膦抗体为单克隆单体或多克隆抗体。

本发明的第六个目的是提供一种用于检测草铵膦的快速免疫检测装置，包括上述草铵膦人工抗原和/或草铵膦抗体。

进一步地，所述快速免疫检测装置包括反应杯和试纸条，包含试纸条和反应杯，所述试纸条包含样品垫和层析膜，所述层析膜包含检测线和质控线，所述检测线由上述草铵膦人工抗原制备获得；所述反应杯包括标记有标记指示物的草铵膦抗体。

进一步地，所述标记指示物为胶体金。

本发明具有如下有益效果：

本发明的草铵膦半抗原是在草铵膦的氨基位点上衍生连接臂，衍生的连接臂为2,4-二硝基苯环结构，提供的草铵膦半抗原既最大程度保留了草铵膦的特征结构，使得草铵膦半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体发生偶联的羧基；草铵膦半抗原与载体偶联后得到的草铵膦人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。

本发明中，发明人在众多的衍生化试剂中进行选择，创造性地采用草铵膦与2,4-二硝基氟苯反应制备草铵膦半抗原，不仅方法步骤简单，所需的实验条件温和，而且草铵膦半抗原的纯度和产率较高，同时对于后续草铵膦快速免疫检测装置的样品的处理极为有利。

采用本发明的草铵膦人工抗原得到的草铵膦抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，与其他农药的交叉反应率低，特异性更好，灵敏度更高。

采用本发明的快速免疫检测装置，特异性强，检测灵敏度高，灵敏度可达20ppb，与其他农药的交叉反应率低，CV值小于15%，准确性高，重复性好，能更加快速、灵敏、简便地检测草铵膦残留。

采用本发明的草铵膦快速免疫检测装置，不需要任何仪器设备，便于携带，检测成本低；试纸条使用简单，无需专业人士操作；试纸制作容易，成本低廉，储存方便，稳定性好，在室温下至少可以保存一年。

附图说明

图1是本发明的草铵膦半抗原的合成路线；

图2是本发明实施例1中草铵膦半抗原的质谱图；

图3是本发明的用于检测草铵膦的快速免疫检测装置一个具体实施方式。

具体实施方式

本发明的目的是为了提供一种草铵膦检测系统，该检测系统能够特异性地针对草铵膦，具有较高的灵敏度，能够准确地定性及半定量食品中的草铵膦。另外，该系统相对于现有技术或者设备，更为准确、快速、方便。

因此，在第一方面，本发明提供一种草铵膦半抗原，其具有如下结构式：

半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立农药残留免疫分析方法的关键步骤。人工抗原的制备，包括结合位点、结合方式、载体种类及半抗原与目标分析物质任何结构上的差异，诸如分子大小、形状、成分、构型、构象、极性、电子云密度等在内的拓扑性征，都可能极大的影响着相应抗体的性质。能否设计出性能、效果更好的半抗原与仍抗原，正是本发明所关注的重点。

所谓半抗原，是指这样的一类小分子物质：其单独存在时并不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性；但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，由此诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性即免疫反应性，但是不具免疫原性。

具体到草铵膦半抗原，很容易理解的是，这是一类对特异性针对草铵膦的抗体具有免疫反应性、但不具备免疫原性的小分子物质。换言之，在存在草铵膦抗体的情况下，这类草铵膦半抗原可以与之发生抗原-抗体结合反应；然而，在将该草铵膦半抗原接种到动物体内进行免疫时，其并不能激发免疫的动物产生相应的抗体。

草铵膦自身作为半抗原，由于草铵膦结构极为简单，并不能产生良好的免疫反应性，制备出来的抗体其滴度和灵敏度及其低很难达到检测的要求，因此在将其用作半抗原时需要对其进行修饰。

本发明的草铵膦半抗原是在氨基位点上衍生连接臂，衍生的连接臂为2,4-二硝基苯环结构，提供的草铵膦半抗原既最大程度保留了草铵膦的特征结构，使得草铵膦半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体发生偶联的羧基；草铵膦半抗原与载体偶联后得到的草铵膦人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。

本发明的草铵膦半抗原，不仅合成方法简便、纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系，弥补了国内草铵膦免疫学检测方法技术领域的空白，为草铵膦免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。

在第二方面，本发明提供一种草铵膦半抗原的制备方法，所述草铵膦半抗原是由草铵膦与2,4-二硝基氟苯反应得到。

优选地，草铵膦半抗原的制备方法为：向反应容器中加入草铵膦、弱碱和水，加热搅拌，待固体完全溶解后，加入用甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯，在55-70℃下持续反应20-40min，反应完毕后，进行萃取、分离纯化后获得草铵膦半抗原；

其中，所述草铵膦、弱碱和2,4-二硝基氟苯的摩尔质量比为1:5-12:3-6。

本发明中在草铵膦半抗原的制备中，先加入草铵膦和弱碱，弱碱起到中和草铵膦中的酸使其中的胺成游离状态便于和后续加的衍生化试剂2,4-二硝基氟苯反应的作用，而且为后续的衍生化反应提供碱性条件。

本发明中，并不具体限定弱碱的种类，可以采用已有的各种弱碱，作为举例，所述弱碱可以为碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢钙中的任意一种；作为优选，所述弱碱为碳酸钠。

本发明中，草铵膦和2,4-二硝基氟苯的摩尔质量比需要进行严格限定。若草铵膦的用量过多，则草铵膦反应不完全，影响后续快速免疫检测装置的样品衍生化效率；若草铵膦的用量过少，不仅造成2,4-二硝基氟苯的浪费，而且由于2,4-二硝基氟苯本身有黄色，除去这种颜色的过程也非常困难。

本发明中，发明人在众多的衍生化试剂中进行选择，创造性地采用草铵膦与2,4-二硝基氟苯反应制备草铵膦半抗原，不仅方法步骤简单，所需的实验条件温和，而且草铵膦半抗原的纯度和产率较高，同时对于后续草铵膦快速免疫检测装置的样品的处理极为有利。

本发明中，草铵膦半抗原合成原料获取容易、价格便宜、反应条件温和；合成的草铵膦半抗原产率在90％以上。

在第三方面，本发明提供一种草铵膦人工抗原，是载体和上述草铵膦半抗原偶联得到的偶联物。

草铵膦半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予草铵膦半抗原分子以免疫原性，还需要将该草铵膦半抗原分子与合适的载体分子偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的草铵膦人工抗原。

在本文中所提及的术语“载体”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质，包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例，可以使用的载体包括但不限于大分子蛋白质，例如牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、血蓝蛋白（KLH）、卵蛋白（OVA）、牛乳铁蛋白（BLF）。

在第四方面，本发明提供一种草铵膦人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

将所述草铵膦半抗原溶于有机溶剂中，接着搅拌下加入二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，0-4℃下搅拌6-12h，接着离心并保留上清液，所述上清液即为A液，其中，所述草铵膦半抗原半抗原、所述二环已基碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-3:1-3；

将载体溶解在pH值为7.4-9.6的PBS缓冲液中，得到B液；以及

在0-4℃搅拌下将所述A液滴加到所述B液中，4℃下反应6-24h，纯化后得到所述草铵膦人工抗原。

在第五方面，本发明提供一种草铵膦抗体，它是由上述草铵膦人工抗原经动物免疫得到，其能与草铵膦发生特异性免疫反应。

采用本发明的草铵膦人工抗原得到的草铵膦抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，与其他农药的交叉反应率低，特异性更好，灵敏度更高。

所述草铵膦抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外，对于所述草铵膦抗体，可以采用本领域常规方法来进行制备。例如，在所述草铵膦抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用所述草铵膦人工抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等、随后分离血清获得。在所述草铵膦抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。

另外，正如本领域技术人员可以理解的那样，对于所述草铵膦抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，所述草铵膦抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物（不包括人类）的多克隆或者单克隆抗体。

在一个具体的实施方案中，所述草铵膦抗体为特异性针对上述草铵膦半抗原的草铵膦人工抗原的鼠源单克隆抗体。

在第六方面，本发明提供一种用于检测草铵膦的快速免疫检测装置，包括上述草铵膦人工抗原和/或草铵膦抗体。

需要说明的是，本发明中所述的快速免疫检测装置可以为酶联免疫试剂盒，也可以为胶体金试纸条，还可以为化学发光试剂盒、荧光免疫试剂盒，但不局限，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他快速免疫检测装置。

更优选地，所述快速免疫检测装置包括反应杯和试纸条，包含试纸条和反应杯，所述试纸条包含样品垫和层析膜，所述层析膜包含检测线和质控线，所述检测线由草铵膦人工抗原制备获得；所述反应杯包括标记有标记指示物的草铵膦抗体。

如上所述，所述试纸条包含样品垫和层析膜，但是该试纸条还可以包含其它组件。例如，该试纸条还可以包含底板以及吸水垫。在这种情况下，样品垫、层析膜和吸水垫可以通过搭接粘贴依次铺设在该底板上。

所述样品垫为具有样本过滤功能的聚酯膜、玻纤或滤纸；本发明的样品垫包括但不限于前面所列举的几种材料，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。

所述吸水垫为吸水纸；本发明的吸水垫包括但不限于前面所列举的几种材料，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。

所述层析膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本发明的层析膜包括但不限于前面所列举的几种材料，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。

所述标记指示物为可用于识别和检测采集信号的物质，例如胶体金，但不局限于此，作为举例，还可以是胶乳。

如上所述，所述层析膜包含检测线和质控线。通常情况下，将检测线设置在靠近样品垫一侧。

所述检测线由上述草铵膦人工抗原在所述层析膜上进行线性点样制得。

本发明的用于检测草铵膦的快速免疫检测装置包含质控线。设置质控线的目的是为了指示该装置在使用时检测体系是有效的，以确保所获得结果的可靠性和正确性。

所述质控线是通过将另外的抗原或者抗体在所述层析膜上进行线性点样获得的。

所述质控线可以通过将抗原或者抗体在所述层析膜上进行线性点样获得。在一个实施方案中，所述质控线由针对本发明第五方面的草铵膦抗体的第二抗体点样获得的。在胶体金标记的草铵膦抗体通过毛细作用移动至质控线时，其会与形成该质控线的该第二抗体发生结合反应，由此显现颜色。作为举例，所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体或羊抗鼠IgG抗体。

如果质控线显色，则指示该检测系统成立，检测结果可用。相反，如果质控线不显色，则指示该检测系统不成立，检测结果不可用。

检测线和质控线应相互平行并相距合适距离，由此实现最佳检测。在一个实施方案中，检测线和质控线相距至少0.3cm。

如上所述，所述反应杯包含标记有标记指示物的草铵膦抗体，该草铵膦抗体特异性地针对形成所述检测线的草铵膦人工抗原。

所述草铵膦抗体只要能够与所述草铵膦人工抗原发生抗原-抗体结合反应即可，而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而从需要更高特异性的角度上考虑，所述草铵膦抗体优选地为单克隆抗体。

在一个实施方案中，所述草铵膦抗体为本发明第五方面的草铵膦抗体。在一个具体实施方案中，所述草铵膦抗体为特异性针对上述草铵膦半抗原的草铵膦人工抗原的鼠源单克隆抗体。

本发明的用于检测草铵膦的快速免疫检测装置可以实现多种样品中草铵膦残留的快速检测，所述样品可以是土壤、果蔬、茶叶、池水、粮食等。

在采用本发明的快速免疫检测装置进行检测之前，可以根据样品的具体来源对其进行对应的预处理。例如，对于果蔬，可以先将剪碎，再对其中所包含的草铵膦进行提取，随后再进行草铵膦检测。

在对样品进行相应预处理之后，将其加入至反应杯中并孵育几分钟，例如3-5min，随后插入试纸条，再孵育几分钟，例如3-5min。孵育完成之后，若观察到质控线显现出紫红色条带，则指示该检测系统成立、可用，此时进行如下判断：（1）若检测线同质控线一样显现出紫红色条带，并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含草铵膦；（2）若检测线不显色，或者与质控线相比显色更浅，则表明样品含有草铵膦。

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。

本发明所使用的各种仪器及试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。

实施例1

一种草铵膦半抗原的制备方法，步骤如下：向反应容器中加入草铵膦1.0g、碳酸钠4.8g、蒸馏水30ml，于60℃条件下加热搅拌，待固体完全溶解后，加入4.0g用5ml甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯；60℃下持续反应30min后，反应完毕后降至室温，用二氯甲烷萃取未反应的2,4-二硝基氟苯，用6N HCl将溶液pH调为1-2，用乙酸乙酯萃取三次，每次乙酸乙酯的用量为30ml，乙酸乙酯相再用蒸馏水洗涤一遍，然后将乙酸乙酯相蒸干、过柱提纯得到草铵膦半抗原（GAH）。

参考图3的草铵膦半抗原的质谱图，并且可以获知，该半抗原的分子式如下：

实施例2

一种草铵膦半抗原的制备方法，步骤如下：向反应容器中加入草铵膦1.0g、碳酸钾3.2g、蒸馏水30ml，于60℃条件下加热搅拌，待固体完全溶解后，加入2.6g用5ml甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯；55℃下持续反应40min后，反应完毕后降至室温，用二氯甲烷萃取未反应的2,4-二硝基氟苯，用6N HCl将溶液pH调为1-2，用乙酸乙酯萃取三次，每次乙酸乙酯的用量为30ml，乙酸乙酯相再用蒸馏水洗涤一遍，然后将乙酸乙酯相蒸干、过柱提纯得到草铵膦半抗原（GAH）。

实施例3

一种草铵膦半抗原的制备方法，步骤如下：向反应容器中加入草铵膦1.0g、碳酸氢钠4.7g、蒸馏水30ml，于60℃条件下加热搅拌，待固体完全溶解后，加入5.2g用5ml甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯；70℃下持续反应20min后，反应完毕后降至室温，用二氯甲烷萃取未反应的2,4-二硝基氟苯，用6N HCl将溶液pH调为1-2，用乙酸乙酯萃取三次，每次乙酸乙酯的用量为30ml，乙酸乙酯相再用蒸馏水洗涤一遍，然后将乙酸乙酯相蒸干、过柱提纯得到草铵膦半抗原（GAH）。

实施例4

一种草铵膦人工抗原的制备方法，步骤如下：

取实施例1制备的草铵膦半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，搅拌加入0.15 mmol二环己基碳二亚胺（DCC）和0.1 mmol N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；

称取牛血清白蛋白（BSA）、牛乳铁蛋白（BLF）各150 mg，将其分别溶于10 mL浓度为0.1 mol/L的PBS缓冲液（pH8.0）中，加入二甲基甲酰胺（DMF）1 mL，搅拌溶解制备得到B液；

在0-4℃磁力搅拌下，将A液逐渐滴入B液中，4℃下反应 12小时，离心后取上清夜，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，由此可以获得分别与牛血清白蛋和牛乳铁蛋白偶联的草铵膦人工抗原；将所得草铵膦人工抗原以1 mg/mL的浓度分装于0.5 mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中，即GAH-BSA，GAH-BLF。

实施例5

一种草铵膦抗体，其制备方法为：

使用经鉴定的草铵膦人工抗原GAH-BLF免疫10只8周龄BALB/c小鼠，加强免疫三次后，采血测效价，待血清效价不再上升，用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠，三天后脱颈致死小鼠，在无菌条件下取脾脏制备脾细胞，与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50 mL离心管，加入30 mL无血清IPMI 1640培养基，1100 r/min离心5min弃上清，将细胞团轻轻振松，置于37℃水浴中。把 1 mL 50% （体积百分比）PEG-4000缓缓加入细胞中，在1min内滴完，同时轻轻搅动底部沉淀，静置1min后，前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基1 mL，后30秒加入2 mL，然后快速加入27 mL终止融合过程，1100 r/min离心5min，弃上清，用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96 孔细胞培养板中，并于37℃、体积分数5%的CO₂条件下培养。7天后将培养基换成HT培养液，待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时，用间接ELISA法筛选，选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，经3次以上的克隆培养和检测，均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备；然后，采用体内诱生腹水法生产草铵膦单克隆抗体，具体如下：选4只经产昆明小鼠，腹腔注射液体石蜡油 0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞3-5×10⁶/只，10天后，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，用Protein A来纯化腹水，经紫外测定抗草铵膦单克隆抗体的含量。

实施例6

标记有胶体金的草铵膦抗体的制备方法，步骤如下：

（1）胶体金的制备

取1％（质量百分比）氯金酸溶液1ml，加入99ml超纯水成终浓度0.01％（质量百分比）的氯金酸溶液，将该氯金酸溶液加热沸腾后，取1％（质量百分比）柠檬酸三钠1.6 ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热直至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。

（2）标记有胶体金的草铵膦抗体的制备

调节上述获得的胶体金溶液pH值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入实施例3制备的草铵膦抗体，1小时后加入草铵膦抗体量相当的聚乙二醇（PEG），充分反应30min后加入草铵膦抗体量相当的牛血清蛋白（BSA），加完后，继续搅拌30min；在9000 rpm离心30min，获得均一性金标抗体沉淀物，再加对硝基苯酚丁酸酯（PNPB）重悬备用，得到标记有胶体金的草铵膦抗体。

实施例7

用于检测草铵膦的快速免疫检测装置的制备方法，步骤如下：

步骤（一）：制备硝酸纤维素膜，并在该硝酸纤维素膜上将实施例4制备的草铵膦人工抗原GAH-BSA进行线性点样，由此形成检测线；并将购买的羊抗鼠IgG抗体进行线性点样，由此形成质控线；所述检测线和控制线相互平行，两者距离0.5cm；

步骤（二）：在一块底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，由此制备获得试纸条；

步骤（三）：将实施例6制备的标记有胶体金的草铵膦抗体加入至反应杯中，冻干，由此形成所需反应杯；

将步骤（二）得到的试纸条和步骤（三）得到的反应杯组合在一起就形成了本发明的快速免疫检测装置。

实施例8

样品中草铵膦残留的检测方法，步骤如下：

取蔬菜样品5 g，加入5%的碳酸钾溶液5ml，然后再加入10%甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯100ul，置于60℃下反应30min，降至室温后离心，取200ul上层清液置于反应杯中，室温孵育3min；随后将实施例7制备的试纸条插入反应杯中，再于室温孵育4min；取出试纸条，轻轻刮除试海绵垫，进行结果判读：若检测线（T线）与质控线（C线）同时显示紫红色条带，并且检测线的颜色深度与质控线的颜色深度相当或者更深，则结果为阴性，表明样品中不含草铵膦；若T线颜色比C线浅，或C线显色而T线不显色，则结果为阳性，表明样品中含有草铵膦；若C线、T线均不显色，则检测装置已失效。

实施例7

用于检测草铵膦的快速免疫检测装置的灵敏度检测，方法如下：

设置一系列的浓度梯度，草铵膦衍生物（草铵膦半抗原）浓度分别为500 ppb，100ppb，20 ppb, 5ppb；用实施例7中的快速免疫检测装置进行测试，测试后使用仪器比较检测线与质控线颜色深浅。当草铵膦衍生物浓度为20 ppb时，检测线颜色深度为质控线的90%以下，因此其灵敏度为20 ppb。

选取20 ppb平行实验5次，统计检测限颜色深度与质控线颜色深度的比例，其CV值小于15%。

实施例8

用于检测草铵膦的快速免疫检测装置的特异性实验，方法如下：

在阴性的蔬菜5g样品中，分别加入100 ppb草铵膦，200 ppb草铵膦衍生物，100ppb草甘膦，200 ppb草甘膦衍生物（草甘膦与2,4-二硝基氟苯合成获得），采用实施例7中的快速免疫检测装置进行检测，实验结果发现只有草铵膦衍生物能够检出，而加入草铵膦、草甘膦及草甘膦衍生物的样品无法检出。以上结果表明，本发明装置对草铵膦的特异性较好，对类似作用和结构化合物的交叉反应较少。

实施例9

用于检测草铵膦的快速免疫检测装置的保质期实验，方法如下：

用三批常规生产的快速免疫检测装置分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，间隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，20 ppb，40 ppb和100 ppb样品，重复三次，观察产品显色变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，实验结果表明在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定保质期为1年。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种草铵膦半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：

2.如权利要求1所述的草铵膦半抗原的制备方法，其特征在于，其是由草铵膦与2,4-二硝基氟苯反应得到。

3.如权利要求2所述的草铵膦半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法为：向反应容器中加入草铵膦、弱碱和水，加热搅拌，待固体完全溶解后，加入用甲醇溶解的2,4-二硝基氟苯，在55-70℃下持续反应20-40min，反应完毕后，进行萃取、分离纯化后获得草铵膦半抗原；

其中，所述草铵膦、弱碱和2,4-二硝基氟苯的摩尔质量比为1:5-12:3-6；所述弱碱为碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或磷酸氢钙中的任意一种。

4.如权利要求2所述的草铵膦半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：向反应容器中加入草铵膦1.0g、碳酸钠4.8g、蒸馏水30ml，于60℃条件下加热搅拌，待固体完全溶解后，加入4.0g 2,4-二硝基氟苯，其中所述2,4-二硝基氟苯用5ml甲醇溶解；60℃下持续反应30min后，反应完毕后降至室温，用二氯甲烷萃取未反应的2,4-二硝基氟苯，用6N HCl将溶液pH调为1-2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯相再用蒸馏水洗涤一遍，然后将乙酸乙酯相蒸干、过柱提纯得到草铵膦半抗原。

5.一种草铵膦人工抗原，其特征在于，其是载体和权利要求1所述的草铵膦半抗原偶联得到的偶联物；所述载体为蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸，其中，所述蛋白质为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛乳铁蛋白或血蓝蛋白。

6.如权利要求5所述的草铵膦人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述草铵膦半抗原溶于有机溶剂中，接着搅拌下加入二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，0-4℃下搅拌6-12h，接着离心并保留上清液，所述上清液即为A液，其中，所述草铵膦半抗原、所述二环已基碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1-3:1-3；

将载体溶解在pH值为7.4-9.6的PBS缓冲液中，得到B液；以及

在0-4℃搅拌下将所述A液滴加到所述B液中，4℃下反应6-24h，纯化后得到所述草铵膦人工抗原。

7.一种草铵膦抗体，其特征在于，它是由权利要求5所述的草铵膦人工抗原经动物免疫得到，其能与草铵膦发生特异性免疫反应。

8.一种用于检测草铵膦的免疫检测装置，其特征在于，包括草铵膦人工抗原和/或草铵膦抗体，其中，所述草铵膦人工抗原为权利要求5所述的草铵膦人工抗原，所述草铵膦抗体为权利要求7所述的草铵膦抗体。

9.如权利要求8所述的用于检测草铵膦的免疫检测装置，其特征在于，所述免疫检测装置包括反应杯和试纸条，包含试纸条和反应杯，所述试纸条包含样品垫和层析膜，所述层析膜包含检测线和质控线，所述检测线由上述草铵膦人工抗原制备获得；所述反应杯包括标记有标记指示物的草铵膦抗体。

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