CN109810184B - 人nf155抗原、人nf155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人NF155抗原、人NF155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。所述人NF155抗原包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，还提供了五种分别含有上述五种人NF155抗原的检测试剂盒，以及一种同时含有上述五种人NF155抗原的检测试剂盒。该人NF155检测试剂盒，检测人血清中的NF155抗体，特异性强，反应灵敏度高，高通量、成本低，能够对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)进行诊断，适于大规模推广应用。

Description

人NF155抗原、人NF155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及人NF155抗原、人NF155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyradiculoneuropathy，CIDP)是一类由免疫介导的慢性运动感觉性周围神经病。该病在世界范围内较为常见，发病率为(1～9)/10万。根据临床表现，CIDP可分为经典型和变异型。经典型CIDP表现为对称的肢体无力和感觉障碍，腱反射减弱或消失，病程为慢性进展或缓解复发并持续≥8周。2010年欧盟神经学会/周围神经学会诊断标准将变异型CIDP分为远端获得性脱髓鞘性对称性神经病(distal acquired demyelinating symmetric)、非对称型(Lewis－Sumner syndrome)、纯运动型、纯感觉型和局灶型。在CIDP的发病机制中，细胞及体液免疫均发挥了作用。但长期以来，相关抗体的研究并未取得突破性进展。CIDP特异性抗体的研究首先集中在髓鞘蛋白，但目前并未发现髓鞘蛋白0、髓鞘蛋白2或髓鞘蛋白22(myelinprotein22)参与了CIDP的发病机制。

近年来，有关CIDP生物标志物的研究转向朗飞结相关区域，一些重要的细胞黏附分子成为研究的热点。朗飞结是有髓纤维的重要结构，包括结区、结旁区、近结旁区及结间区共5个区域。每个区域由不同的离子通道、蛋白和细胞黏附分子等有序排列，共同维持神经的正常结构及功能。结区分布有密集的Na+通道和K+通道，主要参与神经冲动的传导；神经束蛋白(neurofascin，NF)186、神经细胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule，NrCAM)和神经胶质蛋白(gliomedin)则参与维持朗飞结的稳定和Na+通道的聚集。结旁区的重要结构是由位于轴膜端的接触蛋白1(contactin-1，CNTN1)、接触蛋白相关蛋白1(contactin-associatedprotein1，CASPR1)以及位于髓鞘端的NF155组成的复合体，该复合体的功能是阻隔结区的Na+通道和近结旁区的K+通道，并使髓鞘锚定在轴膜上。结构蛋白、细胞黏附分子抗体的发现有助于揭示CIDP的发病机制，寻找特异性的生物标志物并制定个体化的治疗方案。从微观结构角度提出的朗飞结/结旁疾病(nodo－paranodopathy)概念，为深入了解CIDP提供了更加广阔的视角。研究表明，30％的CIDP患者血清中的IgG抗体会与结区、结旁区结构结合，参与CIDP的病理生理机制。此外，结区/结旁区抗体阳性的患者具有特征性的临床表现和特殊的治疗选择。NF155神经束蛋白(Neurofascin)是郎飞氏结的一种蛋白组分，CIDP患者中检出的抗神经束蛋白抗体主要针对的靶点是NF155。NF155主要位于结旁区的髓鞘端，与位于轴膜端的CNTN1和CASPR1组成复合体，隔离结区与近结旁区的离子通道，维持结旁区的正常结构和神经冲动的正常传递。目前还没有人NF155抗体检测试剂盒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种人NF155抗原及其制备方法、人NF155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒具有较高灵敏度和特异性，对慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)的检测有重要价值。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于一种人NF155抗原，包括以下任意一种片段或者五种片段：

片段1：NF155-25，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段2：NF155-344，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

片段3：NF155-530，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：NF155-824，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：NF155-1048，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的目的之二在于提供人NF155抗原的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将NF155-25、NF155-344、NF155-530、NF155-824、NF155-1048的5个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建5个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建5个重组表达工程菌；

步骤3、NF155-25、NF155-344、NF155-530、NF155-824、NF155-1048的抗原片段的诱导表达及纯化。

具体地，所述步骤1中所述5个片段的引物对分别为：

NF155-25-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

NF155-25-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

NF155-344-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

NF155-344-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

NF155-530-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

NF155-530-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

NF155-824-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

NF155-824-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

NF155-1048-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

NF155-1048-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

具体地，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E 0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

具体地，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将5个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时。

具体地，所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mMNa₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M Nacl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

本发明的目的之三在于提供一种人NF155抗原的表达载体，所述表达载体为5个，所述5个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

本发明的目的之四在于提供一种人NF155抗原的表达工程菌，该工程菌为5个，所述5个工程菌分别包含所述5个人NF155抗原的表达载体。

本发明的目的之五在于提供人NF155抗体检测试剂盒，所述的ELISA检测试剂盒包括：

(A)包被有所述的人NF155抗原的ELISA酶标板；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-344、NF155-530、NF155-824、NF155-1048中的任意一种或者五种；

(B)标准阴性血清：NF155抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：NF155抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

其中，所述人NF155抗原中NF155-25，NF155-344、NF155-530、NF155-824和NF155-1048的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、150ng/ml和250ng/ml。

本发明的目的之六在于提供人NF155抗体的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：

S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将所述的人NF155抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-344、NF155-530、NF155-824、NF155-1048中的任意一种或者五种；

S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。

本发明的目的之七在于提供所述的检测试剂盒在诊断慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病中的应用。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供了人NF155抗体检测试剂盒及检测方法，首先制备得到人NF155抗原(NF155-25，NF155-344、NF155-530、NF155-824和NF155-1048)，然后以人NF155抗原为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该试剂盒可以用于检测诊断慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP，特异性强，灵敏度高，稳定性好。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的构建的重组质粒的酶切图；其中，(A)为包含NF155-25的重组质粒的酶切图；(B)为包含NF155-344的重组质粒的酶切图；(C)为包含NF155-530的重组质粒的酶切图；(D)为包含NF155-824的重组质粒的酶切图；(E)为包含NF155-1048的重组质粒的酶切图；其中1泳道为未酶切的质粒，2泳道为经相应的内切酶酶切的条带；(F)为Marker条带图，该Marker为1Kb ladder；

图2为本发明实施例2提供的NF155-25、NF155-344、NF155-530、NF155-824和NF155-1048片段的纯化产物电泳图。

具体实施方式

实施例1构建重组表达质粒以及工程菌

1、NF155，相对分子质量为155000，成熟的NF155抗原由1323个氨基酸组成。本研究对NF155蛋白的氨基酸序列经过包括亲水性、表面可及性等分析，并结合其空间构象和各个结构域的修饰特点，将成熟的CNTN1蛋白分成了5个片段以分别获取。

2、PCR扩增人NF155抗原基因

1、将5个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物(带上酶切位点)PCR扩增，设计PCR引物如表1所示，下划线的部分是限制性核酸内切酶位点。

表1

2、运用PCR扩增体系如表2所示，温度循环参数：94℃，5min→(94℃,45S,→57℃,150S,→72℃,90S)×32→72℃,10min。扩增产物用于后续酶切酶连。

表2

4、PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，酶切，酶连，分别将5个DNA片段连接进PET-28a表达载体构建重组表达质粒。重组质粒跑胶酶切图见说明书附图1。

5、将构建好的重组质粒转化BL21(DE3)菌，构建重组菌，重组菌的测序后结果验证本实施例的重组质粒构建成功。

实施例2抗原的表达及纯化

1、用构建成的重组蛋白表达工程菌进行诱导表达实验。将5个重组菌分别接种于600ml的LB培养液(成分：10g氯化钠/升、10g蛋白胨/升和5g酵母浸膏/升)，37度200RPM摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4小时。离心，收菌，准备纯化。

2、纯化选择的填料是GE的Ni Sepharose(货号是17-0729-10)，根据其说明书分别配制如下溶液：

上样缓冲液A：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+10mM咪唑。

结合缓冲液B：0.5M NaCl+20mM Na₂HPO₃+20mM咪唑

洗脱缓冲液C：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑；

以及用于纯化包涵体的溶液：

纯化包涵体抗原的上样缓冲液a：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

结合缓冲液b：0.5MNaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑、8M尿素；

洗脱缓冲液c：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、300mM咪唑、8M尿素。

3、将5种离心收集的细菌用上样缓冲液A分散均匀，超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、第一次离心(12000RPM，15min，4℃)，得到含较高浓度的目的抗原的上清溶液。包涵体抗原需将第一次离心的沉淀用上样缓冲液a再分散均匀，再超声(250W，超3s，间隔3s，全程20min)、再离心(12000RPM，15min，4℃)，弃掉沉淀，得到含较高浓度的目的抗原的溶液。将该5种目的蛋白的溶液对填料柱分别进行上样、洗涤、洗脱，分别得到5个目的蛋白。纯化好的包涵体抗原需复性，采用与待复性包涵体抗原同体积的含不同尿素浓度(4.5M、3.5M、2.5M、1.5M、0.5M、0M)的复性缓冲液继续透析复性，每种复性缓冲液透析4小时。

可溶性抗原(NF155-824)和复性完的包涵体抗原(NF155-25，NF155-344、NF155-530、和NF155-1048)，进行12％浓度凝胶的SDS-PAGE电泳，检测五个目的蛋白纯度分别为：95.5％，94.9％，93.4％，93.8％，和95.1％。见说明书附图2。每种抗原测定浓度后储存备用。

实施例3人NF155抗体检测试剂盒及使用方法

1、包被酶标板

(1)包被液：NaCl 8.5g,Na₂HPO₄·12H₂O 30.8g，KH₂PO₄2.2g,加ddH₂O至1000ml，调PH至7.4。

(2)包被用洗液：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

(3)包被方法：将5个NF155抗原片段分别用0.1M PBS(PH7.4)包被缓冲液进行包被在酶标板孔内，4度过夜，其中NF155-25，NF155-344、NF155-530、NF155-824和NF155-1048的包被浓度分别为200ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、150ng/ml和250ng/ml。96孔酶标板中每孔加100μL，置2-8℃吸附24小时。空去包被液，包被用洗液洗板3次。

2、封闭：

(1)包被用封闭液：Na₂HPO₄·12H₂O 3.582g，NaH₂PO₄·2H₂O1.561g，NaCl 9.0g，BSA20g，木糖10g，调pH至7.2，定容至1000ml。

(2)封闭操作：空干包被用洗液，用1.5％BSA封闭液37度封闭2小时，或者置2-8℃过夜。去除封闭液后自然干燥密封备用。

3、阴阳性血清的孵育(一抗孵育)

将待检测的血清按10-100倍稀释，分别加入5种抗原的板条内(每种抗原有经过优化的特定的血清稀释倍数)，并加入阳性对照和阴性对照，37度孵育1小时，用洗涤液进行洗板，所述洗涤液的配方如下：

洗涤液(0.15M)：NaCl 8.0g、KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、TWEEN200.5ml，加至ddH₂O至1000ml，调至PH7.4。

操作：待检血清用PBS液作血清稀释液，按1:400倍的比例稀释，加入包被板孔中，100μL/孔。直接吸取标准阳性血清或标准阴性血清加入包被板孔中，100μL/孔。置酶标板于37℃，30min。

4、酶标二抗的孵育

加入一定浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗(抗人IGG、IGM和IGA)，向酶标板孔中加入100μL/孔，置37℃，15min，洗板。

5、显色：

加入底物液A50μL，底物液B 50μL，轻摇混合，37℃反应15min。

(1)底物溶液A：醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml、蒸馏水加至500ml

(2)底物溶液B：取0.2g TMB溶于20mlDMSO中、乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml、蒸馏水加至500ml。

6、终止：

终止液：2mol/L H₂SO₄。

显色结束后每孔加入50ul终止液进行终止。

7、读板：

用酶标仪测量OD450值。

需要说明的是，血清经5种抗原的板条检测，其中任何一种板条的OD450值达到阳性值时，则判定该血清对NF155是阳性，对该抗原片段成阳性。该血清个体体内存在对NF155以及该NF155片段的抗体。这5种抗原制备成的5种检测试剂盒可以分开使用也可以组合使用。

本发明提供的人NF155抗体检测试剂盒也可用于制备免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。

实施例4人NF155抗体检测试剂盒的应用

一、应用

1、本研究对613份神经系统自身免疫性疾病患者血清按照实施例3进行了检测，这613份血清来自于慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP、格林巴利GBS和重症肌无力MG等患者，其中慢性炎性脱髓性多发性神经炎神经病CIDP患者血清已在医院经临床检测验证是CIDP抗体阳性的血清，本研究也同批检测了300份正常人血清样本。

2、实验结果如下表(仅列出60份样本数据)，本次检测结果显示，NF155-824抗体检测试剂盒在CIDP阳性患者血清的阳性率达100％，在MG患者血清的阳性率达35％，在正常人血清的阳性率达20％，临界值为0.49。

表3-样本数据检测结果

4、此外，NF155-25，NF155-344、NF155-530和NF155-1048检测也表明在NF155阳性患者血清的阳性比例是正常人的2倍以上。数据分析如下。结果用SPSS统计分析软件17.0，进行单因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls进行多重比较检验。结果如下表：

表4-检测结果统计分析表

注：检测数据用SPSS 17.0统计分析软件的One-WayANOVA程序的Student-Newman-Keuls检验方法进行多重比较分析，同栏中带有不同字母肩号(a,b,c)的组之间差异显著(P<0.05)。

二、5种ELISA检测试剂盒的技术指标

1、临界值：按照实施例3进行检测患者血清和正常人血清，确定了试验有效性的判定方法、临界值(CUT OFF)的计算方法、样品阴阳性判定方法。

(1)NF155-25：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.55；阴性对照平均值≤0.23；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.14＝0.37；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.37)为NF155-25抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.37)为NF155-25抗体阳性。

(2)NF155-344：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.55；阴性对照平均值≤0.24；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.14＝0.38；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.38)为NF155-344抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.38)NF155-344抗体阳性。

(3)NF155-530：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.55；阴性对照平均值≤0.22；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.14＝0.36；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.36)为NF155-530抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.36)NF155-530抗体阳性。

(4)NF155-824：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.55；阴性对照平均值≤0.35；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.14；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.49)为NF155-824抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者(0.49)为NF155-824抗体阳性。

(5)NF155-1048：

试验有效性判定：阳性对照孔平均值≥0.55；阴性对照平均值≤0.21；

临界值＝阴性对照孔平均值+0.14＝0.35；

阴性判定：样品OD值＜临界值者(0.35)为NF155-1048抗体阴性；

阳性判定：样品OD值≥临界值者为(0.35)NF155-1048抗体阳性。

2、特异性：除阳性血清外，其他检测样品均为阴性。这些数据表明，本发明提供的试剂盒与其他血清抗体之间不存在交叉反应。

3、灵敏性：阳性血清12800倍稀释能检出(即1μL血清加到12800μL样品稀释液中，取其中100μL加入样品检测孔)能检出。

4、稳定性：将试剂盒置于37℃不少于2天与4℃存放的试剂盒同步检测20份样品，其符合率为100％。

5、精密度：取浓度呈梯度的5种血清标本，分别稀释，分别同批测定10次，批内变异系数为均低于4％；同样5份血清，隔天再测定10次，变异均低于5％；符合试剂盒精密度要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉明德生物科技股份有限公司

<120> 人NF155抗原、人NF155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 人NF155(NF155-25)

<400> 1

Ile Glu Ile Pro Met Asp Leu Thr Gln Pro Pro Thr Ile Thr Lys Gln

1 5 10 15

Ser Ala Lys Asp His Ile Val Asp Pro Arg Asp Asn Ile Leu Ile Glu

20 25 30

Cys Glu Ala Lys Gly Asn Pro Ala Pro Ser Phe His Trp Thr Arg Asn

35 40 45

Ser Arg Phe Phe Asn Ile Ala Lys Asp Pro Arg Val Ser Met Arg Arg

50 55 60

Arg Ser Gly Thr Leu Val Ile Asp Phe Arg Ser Gly Gly Arg Pro Glu

65 70 75 80

Glu Tyr Glu Gly Glu Tyr Gln Cys Phe Ala Arg Asn Lys Phe Gly Thr

85 90 95

Ala Leu Ser Asn Arg Ile Arg Leu Gln Val Ser Lys Ser Pro Leu Trp

100 105 110

Pro Lys Glu Asn Leu Asp Pro Val Val Val Gln Glu Gly Ala Pro Leu

115 120 125

Thr Leu Gln Cys Asn Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Pro Val Ile Phe

130 135 140

Trp Met Ser Ser Ser Met Glu Pro Ile Thr Gln Asp Lys Arg Val Ser

145 150 155 160

Gln Gly His Asn Gly Asp Leu Tyr Phe Ser Asn Val Met Leu Gln Asp

165 170 175

Met Gln Thr Asp Tyr Ser Cys Asn Ala Arg Phe His Phe Thr His Thr

180 185 190

Ile Gln Gln Lys Asn Pro Phe Thr Leu Lys Val Leu Thr Asn His Pro

195 200 205

Tyr Asn Asp Ser Ser Leu Arg Asn His Pro Asp Met Tyr Ser Ala Arg

210 215 220

Gly Val Ala Glu Arg Thr Pro Ser Phe Met Tyr Pro Gln Gly Thr Ala

225 230 235 240

Ser Ser Gln Met Val Leu Arg Gly Met Asp Leu Leu Leu Glu Cys Ile

245 250 255

Ala Ser Gly Val Pro Thr Pro Asp Ile Ala Trp Tyr Lys Lys Gly Gly

260 265 270

Asp Leu Pro Ser Asp Lys Ala Lys Phe Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu

275 280 285

Arg Ile Thr Asn Val Ser Glu Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Phe Cys Leu

290 295 300

Ala Ser Asn Lys Met Gly Ser Ile Arg His Thr Ile Ser Val Arg Val

305 310 315 320

Lys Ala Ala

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 人NF155(NF155-344)

<400> 2

Val Lys Ala Ala Pro Tyr Trp Leu Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Leu

1 5 10 15

Ala Pro Gly Glu Asp Gly Arg Leu Val Cys Arg Ala Asn Gly Asn Pro

20 25 30

Lys Pro Thr Val Gln Trp Met Val Asn Gly Glu Pro Leu Gln Ser Ala

35 40 45

Pro Pro Asn Pro Asn Arg Glu Val Ala Gly Asp Thr Ile Ile Phe Arg

50 55 60

Asp Thr Gln Ile Ser Ser Arg Ala Val Tyr Gln Cys Asn Thr Ser Asn

65 70 75 80

Glu His Gly Tyr Leu Leu Ala Asn Ala Phe Val Ser Val Leu Asp Val

85 90 95

Pro Pro Arg Met Leu Ser Pro Arg Asn Gln Leu Ile Arg Val Ile Leu

100 105 110

Tyr Asn Arg Thr Arg Leu Asp Cys Pro Phe Phe Gly Ser Pro Ile Pro

115 120 125

Thr Leu Arg Trp Phe Lys Asn Gly Gln Gly Ser Asn Leu Asp Gly Gly

130 135 140

Asn Tyr His Val Tyr Glu Asn Gly Ser Leu Glu Ile Lys Met Ile Arg

145 150 155 160

Lys Glu Asp Gln Gly Ile Tyr Thr Cys Val Ala Thr Asn Ile Leu Gly

165 170 175

Lys Ala Glu Asn Gln Val Arg Leu Glu Val Lys Asp

180 185

<210> 3

<211> 307

<212> PRT

<213> 人NF155(NF155-530)

<400> 3

Lys Asp Pro Thr Arg Ile Tyr Arg Met Pro Glu Asp Gln Val Ala Arg

1 5 10 15

Arg Gly Thr Thr Val Gln Leu Glu Cys Arg Val Lys His Asp Pro Ser

20 25 30

Leu Lys Leu Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Asp Glu Pro Leu Tyr Ile

35 40 45

Gly Asn Arg Met Lys Lys Glu Asp Asp Ser Leu Thr Ile Phe Gly Val

50 55 60

Ala Glu Arg Asp Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Val Ala Ser Thr Glu Leu

65 70 75 80

Asp Gln Asp Leu Ala Lys Ala Tyr Leu Thr Val Leu Ala Asp Gln Ala

85 90 95

Thr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Ala Leu Pro Lys Gly Arg Pro Asp Arg

100 105 110

Pro Arg Asp Leu Glu Leu Thr Asp Leu Ala Glu Arg Ser Val Arg Leu

115 120 125

Thr Trp Ile Pro Gly Asp Ala Asn Asn Ser Pro Ile Thr Asp Tyr Val

130 135 140

Val Gln Phe Glu Glu Asp Gln Phe Gln Pro Gly Val Trp His Asp His

145 150 155 160

Ser Lys Tyr Pro Gly Ser Val Asn Ser Ala Val Leu Arg Leu Ser Pro

165 170 175

Tyr Val Asn Tyr Gln Phe Arg Val Ile Ala Ile Asn Glu Val Gly Ser

180 185 190

Ser His Pro Ser Leu Pro Ser Glu Arg Tyr Arg Thr Ser Gly Ala Pro

195 200 205

Pro Glu Ser Asn Pro Gly Asp Val Lys Gly Glu Gly Thr Arg Lys Asn

210 215 220

Asn Met Glu Ile Thr Trp Thr Pro Met Asn Ala Thr Ser Ala Phe Gly

225 230 235 240

Pro Asn Leu Arg Tyr Ile Val Lys Trp Arg Arg Arg Glu Thr Arg Glu

245 250 255

Ala Trp Asn Asn Val Thr Val Trp Gly Ser Arg Tyr Val Val Gly Gln

260 265 270

Thr Pro Val Tyr Val Pro Tyr Glu Ile Arg Val Gln Ala Glu Asn Asp

275 280 285

Phe Gly Lys Gly Pro Glu Pro Glu Ser Val Ile Gly Tyr Ser Gly Glu

290 295 300

Asp Tyr Pro

305

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 人NF155(NF155-824)

<400> 4

Ser Gly Glu Gly Tyr Pro Arg Ala Ala Pro Thr Glu Val Lys Val Arg

1 5 10 15

Val Met Asn Ser Thr Ala Ile Ser Leu Gln Trp Asn Arg Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Thr Val Gln Gly Gln Leu Arg Glu Tyr Arg Ala Tyr Tyr Trp Arg

35 40 45

Glu Ser Ser Leu Leu Lys Asn Leu Trp Val Ser Gln Lys Arg Gln Gln

50 55 60

Ala Ser Phe Pro Gly Asp Arg Leu Arg Gly Val Val Ser Arg Leu Phe

65 70 75 80

Pro Tyr Ser Asn Tyr Lys Leu Glu Met Val Val Val Asn Gly Arg Gly

85 90 95

Asp Gly Pro Arg Ser Glu Thr Lys Glu Phe Thr Thr Pro Glu Gly Val

100 105 110

Pro Ser Ala Pro Arg Arg Phe Arg Val Arg Gln Pro Asn Leu Glu Thr

115 120 125

Ile Asn Leu Glu Trp Asp His Pro Glu His Pro Asn Gly Ile Met Ile

130 135 140

Gly Tyr Thr Leu Lys Tyr Val Ala Phe Asn Gly Thr Lys Val Gly Lys

145 150 155 160

Gln Ile Val Glu Asn Phe Ser Pro Asn Gln Thr Lys Phe Thr Val Gln

165 170 175

Arg Thr Asp Pro Val Ser Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Ser Ala Arg Thr

180 185 190

Gln Val Gly Ser Gly Glu Ala Val Thr Glu Glu Ser Pro Ala Pro Pro

195 200 205

Asn Glu Ala Thr Pro Thr Ala Ala Tyr Thr

210 215

<210> 5

<211> 142

<212> PRT

<213> 人NF155(NF155-824)

<400> 5

Thr Asn Asn Gln Ala Asp Ile Ala Thr Gln Gly Trp Phe Ile Gly Leu

1 5 10 15

Met Cys Ala Ile Ala Leu Leu Val Leu Ile Leu Leu Ile Val Cys Phe

20 25 30

Ile Lys Arg Ser Arg Gly Gly Lys Tyr Pro Val Arg Glu Lys Lys Asp

35 40 45

Val Pro Leu Gly Pro Glu Asp Pro Lys Glu Glu Asp Gly Ser Phe Asp

50 55 60

Tyr Ser Asp Glu Asp Asn Lys Pro Leu Gln Gly Ser Gln Thr Ser Leu

65 70 75 80

Asp Gly Thr Ile Lys Gln Gln Glu Ser Asp Asp Ser Leu Val Asp Tyr

85 90 95

Gly Glu Gly Gly Glu Gly Gln Phe Asn Glu Asp Gly Ser Phe Ile Gly

100 105 110

Gln Tyr Thr Val Lys Lys Asp Lys Glu Glu Thr Glu Gly Asn Glu Ser

115 120 125

Ser Glu Ala Thr Ser Pro Val Asn Ala Ile Tyr Ser Leu Ala

130 135 140

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacggatcca tcgaaattcc tatggatc 28

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agctcgagag cagcctttac tctcac 26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacggatccg taaaggctgc tccctac 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctcgaggt ctttgacctc caggcg 26

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacggatcca ggaagacgac tccctgac 28

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agctcgagtc agggataatc ttctccg 27

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacggatcct ccggagaaga ttatcccag 29

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctcgaggg tgtaagctgc ggttggag 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacggatcca ccaacaacca agcggacatc 30

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agctcgagtt aggccagaga gtagatag 28

<210> 16

<211> 972

<212> DNA

<213> 人NF155(NF155-25)

<400> 16

atcgaaattc ctatggatct gacgcagccg ccaaccatca ccaagcagtc agcgaaggat 60

cacatcgtgg acccccgtga taacatcctg attgagtgtg aagcaaaagg gaaccctgcc 120

cccagcttcc actggacacg aaacagcaga ttcttcaaca tcgccaagga cccccgggtg 180

tccatgagga ggaggtctgg gaccctggtg attgacttcc gcagtggcgg gcggccggag 240

gaatatgagg gggaatatca gtgcttcgcc cgcaacaaat ttggcacggc cctgtccaat 300

aggatccgcc tgcaggtgtc taaatctcct ctgtggccca aggaaaacct agaccctgtc 360

gtggtccaag agggcgctcc tttgacgctc cagtgcaacc ccccgcctgg acttccatcc 420

ccggtcatct tctggatgag cagctccatg gagcccatca cccaagacaa acgtgtctct 480

cagggccata acggagacct atacttctcc aacgtgatgc tgcaggacat gcagaccgac 540

tacagttgta acgcccgctt ccacttcacc cacaccatcc agcagaagaa ccctttcacc 600

ctcaaggtcc tcaccaacca cccttataat gactcgtcct taagaaacca ccctgacatg 660

tacagtgccc gaggagttgc agaaagaaca ccaagcttca tgtatcccca gggcaccgcg 720

agcagccaga tggtgcttcg tggcatggac ctcctgctgg aatgcatcgc ctccggggtc 780

ccaacaccag acatcgcatg gtacaagaaa ggtggggacc tcccatctga taaggccaag 840

tttgagaact ttaataaggc cctgcgtatc acaaatgtct ctgaggaaga ctccggggag 900

tatttctgcc tggcctccaa caagatgggc agcatccggc acacgatctc ggtgagagta 960

aaggctgctt aa 972

<210> 17

<211> 567

<212> DNA

<213> 人NF155(NF155-25)

<400> 17

gtaaaggctg ctccctactg gctggacgaa cccaagaacc ttattctggc tcctggcgag 60

gatgggagac tggtgtgtcg agccaatgga aaccccaaac ccactgtcca gtggatggtg 120

aatggggaac ctttgcaatc ggcaccacct aacccaaacc gtgaggtggc cggagacacc 180

atcatcttcc gggacaccca gatcagcagc agggctgtgt accagtgcaa cacctccaac 240

gagcatggct acctgctggc caacgccttt gtcagtgtgc tggatgtgcc gcctcggatg 300

ctgtcgcccc ggaaccagct cattcgagtg attctttaca accggacgcg gctggactgc 360

cctttctttg ggtctcccat ccccacactg cgatggttta agaatgggca aggaagcaac 420

ctggatggtg gcaactacca tgtttatgag aacggcagtc tggaaattaa gatgatccgc 480

aaagaggacc agggcatcta cacctgtgtc gccaccaaca tcctgggcaa agctgaaaac 540

caagtccgcc tggaggtcaa agactaa 567

<210> 18

<211> 924

<212> DNA

<213> 人NF155(NF155-530)

<400> 18

aaagacccca ccaggatcta ccggatgccc gaggaccagg tggccagaag gggcaccacg 60

gtgcagctgg agtgtcgggt gaagcacgac ccctccctga aactcaccgt ctcctggctg 120

aaggatgacg agccgctcta tattggaaac aggatgaaga aggaagacga ctccctgacc 180

atctttgggg tggcagagcg ggaccagggc agttacacgt gtgtcgccag caccgagcta 240

gaccaagacc tggccaaggc ctacctcacc gtgctagctg atcaggccac tccaactaac 300

cgtttggctg ccctgcccaa aggacggcca gaccggcccc gggacctgga gctgaccgac 360

ctggccgaga ggagcgtgcg gctgacctgg atccccgggg atgctaacaa cagccccatc 420

acagactacg tcgtccagtt tgaagaagac cagttccaac ctggggtctg gcatgaccat 480

tccaagtacc ccggcagcgt taactcagcc gtcctccggc tgtccccgta tgtcaactac 540

cagttccgtg tcattgccat caacgaggtt gggagcagcc accccagcct cccatccgag 600

cgctaccgaa ccagtggagc accccccgag tccaatcctg gtgacgtgaa gggagagggg 660

accagaaaga acaacatgga gatcacgtgg acgcccatga atgccacctc ggcctttggc 720

cccaacctgc gctacattgt caagtggagg cggagagaga ctcgagaggc ctggaacaac 780

gtcacagtgt ggggctctcg ctacgtggtg gggcagaccc cagtctacgt gccctatgag 840

atccgagtcc aggctgaaaa tgacttcggg aagggccctg agccagagtc cgtcatcggt 900

tactccggag aagattatcc ctga 924

<210> 19

<211> 657

<212> DNA

<213> 人NF155(NF155-824)

<400> 19

tccggagaag attatcccag ggctgcgccc actgaagtta aagtccgagt catgaacagc 60

acagccatca gccttcagtg gaaccgcgtc tactccgaca cggtccaggg ccagctcaga 120

gagtaccgag cctactactg gagggagagc agcttgctga agaacctgtg ggtgtctcag 180

aagagacagc aagccagctt ccctggtgac cgcctccgtg gcgtggtgtc ccgcctcttc 240

ccctacagta actacaagct ggagatggtt gtggtcaatg ggagaggtga tgggcctcgc 300

agtgagacca aggagttcac caccccggaa ggagtaccca gtgcccctag gcgtttccga 360

gtccggcagc ccaacctgga gacaatcaac ctggaatggg atcatcctga gcatccaaat 420

gggatcatga ttggatacac tctcaaatat gtggccttta acgggaccaa agtaggaaag 480

cagatagtgg aaaacttctc tcccaatcag accaagttca cggtgcaaag aacggacccc 540

gtgtcacgct accgctttac cctcagcgcc aggacgcagg tgggctctgg ggaagccgtc 600

acagaggagt caccagcacc cccgaatgaa gctactccaa ccgcagctta cacctga 657

<210> 20

<211> 429

<212> DNA

<213> 人NF155(NF155-1048)

<400> 20

accaacaacc aagcggacat cgccacccag ggctggttca ttgggcttat gtgcgccatc 60

gccctcctgg tgctgatcct gctcatcgtc tgtttcatca agaggagtcg cggcggcaag 120

tacccagtac gagaaaagaa ggatgttccc cttggccctg aagaccccaa ggaagaggat 180

ggctcatttg actatagtga tgaggacaac aagcccctgc agggcagtca gacatctctg 240

gacggcacca tcaagcagca ggagagtgac gacagcctgg tggactatgg cgagggtggc 300

gagggtcagt tcaatgaaga cggctccttc atcggccagt acacggtcaa aaaggacaag 360

gaggaaacag agggcaacga aagctcagag gccacgtcac ctgtcaatgc tatctactct 420

ctggcctaa 429

Claims (8)

1.一种人NF155抗原的制备方法，其特征在于，所述人NF155抗原包括以下任意一种片段或者三种片段：

片段1：NF155-25，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段4：NF155-824，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：NF155-1048，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述人NF155抗原的制备过程包括如下步骤：

步骤1、将NF155-25、NF155-824、NF155-1048的3个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建3个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建3个重组表达工程菌；

步骤3、NF155-25、NF155-824、NF155-1048的抗原片段的诱导表达及纯化。

2.如权利要求1所述人NF155抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述5个片段的引物对分别为：

NF155-25-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

NF155-25-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

NF155-824-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

NF155-824-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

NF155-1048-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

NF155-1048-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.如权利要求1所述人NF155抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；Taq E0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

4.如权利要求1所述人NF155抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将3个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时；

所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

5.一种人NF155抗原的表达载体，其特征在于，所述表达载体为3个，所述3个表达载体的表达区的核苷酸序列分别为：如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示。

6.一种人NF155抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求1所述的人NF155抗原的ELISA酶标板；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-824、NF155-1048中的任意一种或者三种；

(B)标准阴性血清：NF155抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：NF155抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

7.如权利要求6所述的人NF155抗体检测试剂盒，其特征在于，所述人NF155抗原中NF155-25，NF155-824和NF155-1048的包被浓度分别为200ng/ml、150ng/ml和250ng/ml。

8.一种人NF155抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人NF155抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-824、NF155-1048中的任意一种或者三种；

S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值；

所述检测方法为非疾病的诊断和治疗目的。

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