CN108760904A - 一种血浆样品前处理技术结合uplc-ms/ms测定健康人血浆中头孢地尼含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种血浆样品前处理技术结合UPLC‑MS/MS测定人血浆中头孢地尼含量的方法，属于体内药物痕量分析领域。血浆样品经10%三氯醋酸沉淀蛋白后，以超高效液相色谱‑质谱（UPLC‑MS/MS）为检测工具，直接测定人血浆中头孢地尼的含量。本发明对检测条件进行了考察和优化，建立了最优的UPLC‑MS/MS分析方法，并成功运用于实际血浆样品的测定。与传统方法相比，本方法具有灵敏度高、分析速度快、重现性好等优点。

Description

一种血浆样品前处理技术结合UPLC-MS/MS测定健康人血浆中 头孢地尼含量的方法

技术领域

本发明属于体内药物痕量分析领域，特别地提供一种新的样品前处理技术和灵敏的检测方式，具体来说是样品前处理技术结合UPLC-MS/MS直接测定健康人血浆中头孢地尼的浓度的分析方法的建立。

背景技术

头孢地尼（Cefdinir）是日本藤泽药品株式会于1988年首次合成的第三代口服头孢类抗菌药物，在水、乙醇或乙醚中不溶。与其他第三代口服头孢菌素相比，头孢地尼口服吸收性好，对β-内酰胺酶具有高度稳定性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌属、链球菌属等的抗菌活性明显增强，临床上用于治疗皮肤感染，术后伤口感染，呼吸道感染等。

样品前处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难、最繁琐的工作。前处理是为了除去生物介质中含有的大量内源性及外源性干扰物质，因此，样品的前处理是关系到分析结果准确性的重要步骤。根据国内外文献报道，头孢地尼血浆样品前处理方法应用最多的是固相萃取法和蛋白沉淀法。但固相萃取法成本较高，耗时较长；蛋白沉淀法操作简便易行，血浆用量少，避免了提取物处理的损失，回收率高。本发明尝试以10%三氯醋酸于96孔板中沉淀蛋白，离心后，移液工作站提取上清后直接进样。该法萃取效果好、专属性强且重现性好、样品处理时间短、节省时间和试剂，适合药物代谢动力学研究中大量血浆样品的前处理，以求在体内药物分析领域成为最省时、省力、省财的分析技术，并致以推广于其他领域。

目前，国内外头孢地尼血药浓度测定方法主要有微生物法，HPLC-UV法和LC-MS/MS法。但这些方法都存在一定的局限性，如微生物法过程复杂，操作繁琐，而且灵敏度也较低；HPLC-UV法灵敏度较低，样品保留时间较长。本发明建立了一套完整的UPLC-MS-MS法测定健康人血浆中痕量的头孢地尼，定量下限可达5 ng/mL，灵敏度相对较高；头孢地尼和内标头孢克洛的保留时间均在4 min左右，大大缩短了保留时间，分析速度快，峰形也较好；本法具有操作简便、快速准确等特点，适于健康人血浆中痕量的头孢地尼的测定。

发明内容

本发明的目的在于减少血浆样品前处理时间和提高分析灵敏度，提供一种血浆样品中头孢地尼新的分析测定方法。本发明采用96孔板中沉淀蛋白结合移液工作站的前处理技术，并利用UPLC-MS/MS液质联用为分析仪器，该方法克服了现有方法有机试剂消耗大、处理时间长、干扰多以及检测限等的不足，灵敏度高，分析速度快，结果灵敏准确，干扰少，重复性和重现性好。

本发明是通过以下技术方案实现上述目的：

一种血浆样品前处理技术结合UPLC-MS/MS测定人血浆中头孢地尼的方法，减少干扰、降低有机溶剂用量和检测限等，选择最优的条件提高对头孢地尼的回收率和重现性，其具体步骤如下：

（1）血浆样品的前处理

于96孔板中先加入血浆样品，再依次加入内标溶液和三氯醋酸溶液，涡旋，离心，移液工作站取上清液，再次离心，直接于UPLC-MS/MS分析；

（2）UPLC-MS/MS测定人血浆样品中头孢地尼的含量

超高效液相色谱分离

有机相为甲醇或乙腈等（B），水相为水缓冲溶液（A），采用B相：A相大约在30:70-10:90的范围内（V/V）的等度比例洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为40℃；

质谱检测

离子源为电喷雾离子源（ESI源），离子极性为正离子（Positive），干燥气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，喷雾压为45 psi，鞘气温度为380 ℃，鞘气流速为12 L/min，毛细管电压为4000 V，喷嘴电压为0 V，扫描时间为100 ms，离子检测方式为多反应选择监测（MRM）；

取步骤（1）前处理后进行UPLC-MS/MS分析，进样量为5-20 μL；

其中，步骤（1）中血浆样品的用量为100-200 μL，内标溶液为头孢克洛溶液（1 µg/mL，10mM乙酸铵为溶剂），用量为5-50 μL，三氯醋酸溶液的含量为10%-30%，用量为100-300 μL；

涡旋转速为1000-2000 rpm，时间为3-10 min，离心转速为2000-4000 rpm，离心时间为10-30 min，温度0-10 ℃。

具体地，本发明可以采用如下方法制备：

（1）血浆样品的前处理

于96孔板中先加入血浆样品100 µL，再依次加入内标溶液20 µL（1 µg/mL，10mM乙酸铵为溶剂）和10%三氯醋酸溶液180 µL，1500 rpm涡旋5 min，4℃ 4000 rpm离心10 min，移液工作站取上清液150 µL，再次离心10 min，直接于自动进样器进行UPLC-MS/MS分析，进样量10 µL；

（2）UPLC-MS/MS测定人血浆样品中头孢地尼的含量

超高效液相色谱分离

有机相为甲醇（B），水相为含0.05%甲酸的2 mM乙酸铵溶液（A），采用B相：A相=17:83（V/V）的等度比例洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃；

质谱检测

离子源为安捷伦特有的电喷雾离子源（AJSESI源），离子极性为正离子（Positive），干燥气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，喷雾压为45 psi，鞘气温度为380 ℃，鞘气流速为12 L/min，毛细管电压为4000 V，喷嘴电压为0 V，扫描时间为100 ms，离子检测方式为多反应选择监测（MRM）；

（3）血浆样品中头孢地尼含量测定结果的计算。

本发明的有益效果：

本方法以10%三氯醋酸为沉淀剂除去血浆样品中含有的大量内源性及外源性干扰物，降低了基质效应，为前处理的技术的开发和应用提供了新思路，也为体内样品中痕量药物的提取和分离提供了新方法。本方法以UPLC-MS/MS为检测定量工具，特有的安捷伦电喷雾离子源，测定人血浆样品中头孢地尼的含量，与普通的检测方式相比，实现了对头孢地尼高选择性和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快，适用范围广的特点。

具体实施方式

本发明采用强酸沉淀蛋白和UPLC-MS/MS相结合的方法对血浆样品中的头孢地尼进行含量测定并成功应用到人体生物等效性研究中。在中国健康受试者中，比较单次口服头孢地尼和参比制剂的药代动力学和安全性特征，并评价其生物等效性。与普通的检测方式相比，本方法实现了对头孢地尼高选择性和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快，适用范围广的特点。

本发明的具体检测方法如下：

（1）血浆样品的获得

本研究为随机、开放、双周期、交叉设计研究，受试者单剂量口服头孢地尼受试制剂和参比制剂；

给药试验第一周期：受试者将在试验当天分别送服规定剂量受试制剂或参比制剂。于口服给药前和给药后各时间点取血。离心，分离血浆，放置于-70℃冰箱中保存待测；

给药试验第二周期：经过清洗期，交叉服用参比制剂和受试制剂。所有程序与第一周期相同。

（2）血浆样品的前处理

于-70℃冰箱取出血浆样品，平衡至室温，精密吸取血浆100 μL，加入内标溶液（头孢克洛，1 μg/mL）20 μL，加入10%三氯醋酸溶液180 μL，25℃ 1500 rpm涡旋5 min，4 ℃ 4000rpm的转速下离心10 min，移液工作站取上清液150 μL，在4 ℃ 4000rpm的转速下再次离心10min，直接进行UPLC-MS/MS分析，进样量为10 μL。

（3）利用Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色谱和Agilent G6470A TripleQuad 质谱系统测定健康人血浆样品中头孢地尼的含量；

色谱柱：ZORBAX RRHD 50×3.0 mm，1.8 µm；

流动相：有机相为甲醇（B），水相为含0.05%甲酸的2mmol/L乙酸铵溶液（A），采用B相：A相=17:83（V/V）的等度比例洗脱；

流速：0.3mL/min；

柱温：40 ℃；

进样量：10 μL；

离子源：安捷伦特有的电喷雾离子源（AJSESI源）；

离子极性：正离子（Positive）；

离子检测方式：多反应选择监测（MRM）；

Gas Temp：325℃；

Gas Flow：7 L/min；

Nebulizer：45 psi；

Sheath Gas Temp：380℃；

Sheath Gas Flow：12L/min；

Capillary：4000V；

Nozzle Voltage：0V；

头孢地尼用于定量分析的质谱参数见下表：

。

（4）灵敏度及线性范围

用分析天平精密称定头孢地尼和头孢克洛对照品，用10 mM乙酸铵溶液溶解，稀释成系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线。以信噪比的3倍为方法的检测限，则检测范围为5-2000 ng/mL，灵敏度高；且线性相关系数均在0.99以上，线性关系良好；

方法学考察结果如下表

基质效应的计算

为了评价基质效应，用与选择性实验同一来源的空白基质提取物配制LQC和HQC浓度的头孢地尼，加入内标，制备后进行色谱分析，每个来源基质每个浓度分析3个样，共6个来源。此外，每个QC水平再分析相应浓度的3个重复的纯溶液样本；

计算基质效应，用空白基质提取-面积与纯溶液的平均峰面积比较，表示为纯溶液峰面积的百分比；

基质效应计算公式如下：

基质效应结果如下表：

提取回收率计算方法如下：

头孢地尼的总体提取回收率在97.4%左右，头孢克洛在99.8%左右，回收率均较高。

血浆中头孢地尼的测定

采用标准曲线法计算血浆中头孢地尼的含量。按上述步骤（1）收集血浆样品、（2）前处理、（3）测样，得到响应结果，带入各自标准曲线中计算，结果如下表：

口服剂量为100mg的头孢地尼后，个体的头孢地尼血药浓度数据

注：BLQ表示低于定量下限5 ng/mL。在C_max之前，BLQ以0值计算；C_max之后，BLQ不参与计算。

实验结果表明：所建方法成功应用于血浆中头孢地尼的含量测定。

为了证明本实验室建立的血浆前处理技术结合UPLC-MS/MS方法具有很好的优越性，与其他方法比较，10%三氯乙酸沉淀蛋白相比甲醇和乙腈，干扰少，相比固相萃取减少时间；应用移液工作站96孔板处理100个血浆样品约需要1小时，而处理同样数量血样采用1.5mL EP管处理需要至少3小时，此方法为通量处理血样节省了时间；安捷伦G6470A的AJSESI源，灵敏度高且重现性好；相比液液萃取，有机溶剂消耗较少。因此，本实验建立的方法消耗有机溶剂相对较少，实验操作过程简单，整个实验过程所需时间较少，灵敏度高，以求致力于推广通量技术领域，为新药研发减少时间和成本。

Claims (10)

1.一种血浆样品前处理技术结合UPLC-MS/MS测定健康人血浆中头孢地尼的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）血浆样品的前处理

于96孔板中先加入血浆样品，再依次加入内标溶液和三氯醋酸溶液，涡旋，离心，移液工作站取上清液，再次离心，直接于UPLC-MS/MS分析；

（2）UPLC-MS/MS测定人血浆样品中头孢地尼的含量

超高效液相色谱分离：

有机相为甲醇（B），水相为含0.05%甲酸的2 mM乙酸铵溶液（A）；

采用B相：A相=17:83（V/V）的等度比例洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃；

质谱检测：

离子源为安捷伦特有的电喷雾离子源（AJSESI源），离子极性为正离子（Positive），干燥气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，喷雾压为45 psi，鞘气温度为380 ℃，鞘气流速为12 L/min，毛细管电压为4000 V，喷嘴电压为0 V，扫描时间为100 ms，离子检测方式为多反应选择监测（MRM）；

取步骤（1）再次离心后的上清液进行UPLC-MS/MS分析；

血浆样品中头孢地尼含量测定结果的计算。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤（1）中血浆样品来源于健康受试者给药之后收集的血浆，抗凝剂为肝素钠，用量为100μL。

3.根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，

步骤（1）中内标溶液为头孢克洛溶液，浓度为1 μg/ml，溶剂为10mM乙酸铵溶液，用量为20μL。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，

步骤（1）中三氯醋酸溶液的浓度为10%，用量为180μL。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，

步骤（1）中涡旋转速为1500 rpm，涡旋时间为5 min，离心转速为4000 rpm，离心温度为4℃，离心时间为10 min。

6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于，

步骤（1）中96孔板的高度为41 mm，移液工作站整体移液150μL。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于，

步骤（2）中流动相比例为B相：A相=17:83（V/V），固定相为ZORBAX RRHD 50×3.0 mm，1.8 μm，采集时间为5 min。

8.根据权利要求1-7所述的方法，其特征在于，

步骤（2）中自动进样器温度为4℃，离子源为AJSESI源。

9.根据权利要求1-8所述的方法，其特征在于，

步骤（2）中分析质谱仪器为安捷伦G6470A，进样量为10μL。

10.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于，

（1）血浆样品的预处理

采血后，立即移入经肝素钠抗凝处理的采血负压管中，冰浴条件下转移，4℃离心（3500 rpm）10min，分离血浆，24 h内放置于-70℃冰箱中保存待测；

临用前解冻至室温，混匀；

（2）前处理

依次加入1-3倍体积的10-30%的三氯醋酸溶液和适当体积和浓度的内标溶液，充分混匀，涡旋转速为1000-2000 rpm，时间为3-10 min；离心转速为2000-4000 rpm，离心时间为10-30 min，温度0-10 ℃，移液工作站移取适当体积沉淀上清液，再次离心；

（3）UPLC-MS/MS测定人血浆中头孢地尼的含量

有机相为甲醇或乙腈等（B），水相为水缓冲溶液（A），采用B相：A相大约在30:70-10:90的范围内（V/V）的等度比例洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温为40℃；

质谱检测：

离子源为安捷伦特有的电喷雾离子源（AJSESI源），离子极性为正离子（Positive），干燥气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，喷雾压为45 psi，鞘气温度为380 ℃，鞘气流速为12 L/min，毛细管电压为4000 V，喷嘴电压为0 V，扫描时间为100 ms，离子检测方式为多反应选择监测（MRM）；

取步骤（1）再次离心后的上清液进行UPLC-MS/MS分析，进样量为5-20μL；

（4）健康人血浆中头孢地尼含量测定结果的计算。