CN108103201B - 外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试剂盒 - Google Patents

外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试剂盒，涉及医学分子生物学技术领域，本发明提供的microRNA分子标志物通过实验发现在患有食管癌的体液外泌体表达变化显著。因此本发明中提供的体液外泌体中microRNA分子标志物可以作为标志物用于食管癌的风险预估与检测，对我国食管癌的预防及治疗有很好的帮助。另外，本发明还提供了用于诊断食管癌的试剂盒，包括检测microRNA分子标志物的引物和探针。其逆转录效率高，引物特异性强，灵敏度高，检测全面、快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床指导用药。

Description

外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试 剂盒
技术领域
本发明涉及医学分子生物学技术领域，尤其是涉及一种外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试剂盒。
背景技术
食管癌是常见的消化道肿瘤之一，在世界恶性肿瘤中居第六位。在我国恶性肿瘤发病率、死亡率中分别排第五位和第四位。但从全球范围来看，我国食管癌发病率世界排名第一，每年因食管癌死亡的患者中约有一半是中国人(全世界每年约有30万人死于食管癌，而我国每年平均死亡率约15万人)。大部分就医时已到中晚期，治疗费用较高。其防治的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。
鉴于其早期症状的隐蔽性和非特异性，临床上得到诊治的多数已经是中、晚期患者。而早期食管癌与中、晚期食管癌的预后有着很大的差别。早期食管癌手术治疗后，5年生存率能够达到80％以上。因此对于食管癌的早发现以及早治疗是改善食管癌患者生存率的最佳方式。食管癌的发生发展包含多个阶段，研究食管癌组织中差异表达的基因，可以从分子水平了解食管癌的演变机制，寻找各阶段的标志性基因特征，从而对高危人群进行监测和早期诊断。随着对miRNA研究的不断深入，发现miRNA参与多种肿瘤的发生、发展，并在诊断中扮演着极为重要的作用。在外周血中的miRNA有希望作为食管癌诊断的标志物。有报道称miRNA会像其他物质一样从破碎的组织细胞或凋亡细胞中被动漏出，也可能从患病组织细胞主动分泌进入血液循环，而后者被认为是主要方式。miRNA的主动分泌有两种形式，一种是游离的miRNA直接被细胞分泌；另一种则是miRNA先被选择性地包装在外泌体、微小体等膜性结构中，以包裹的形式从细胞分泌至胞外进入血液循环。游离的miRNA具有有限的半衰期，并且易于被血液中的酶(核酸酶、蛋白酶)降解，因此它们通常不成为用于个性化诊断的方法。肿瘤外泌体是稳定的，半侵入性的，可检测肿瘤异质性，可用于个性化诊断和治疗。所以相对于循环miRNA，exosome对肿瘤的诊断，进展监控具有较多优势。
外泌体(Exosome)是一种直径为30-150纳米的囊泡状结构，广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液等生物体液中。它形成于多种细胞，如树突状细胞、肿瘤细胞等的胞吐作用。外泌体的外膜为脂质双层结构，其内包裹有特异的蛋白、信使RNA和非编码RNA等。外泌体中的非编码RNA以miRNA为主，且种类丰富，其可以影响干细胞分化、器官形成、造血作用、肿瘤发生以及新陈代谢等诸多生理活动。
miRNA(microRNA)是广泛存在于生物体内的19-25nt的非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因mRNA的互补配对降解靶mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗与诊断的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3′-UTR或5′-UTR)存在着一对多的关系。在癌症病例中经常发现miRNA群表达失调的现象，而这些miRNA表达的改变与癌症发生密切相关。在体外实验中，改变一个或者多个miRNA的表达能够促进或者抑制癌细胞恶化，促进癌细胞恶化的miRNA可以认为是一类癌基因。
然而，到目前为止，外泌体相关miRNA作为分子标志物用于食管癌诊断中的应用报道甚少，现有食管癌诊断标记物均没有针对疾病中外泌体miRNA表达变化的特点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供外泌体相关microRNA分子标志物在制备用于诊断食管癌的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的对食管癌相关的特定小RNA研究尚有不足的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断食管癌的试剂盒，以缓解现有技术中存在的对食管癌外泌体相关microRNA分子标志物的检测特异性不够强的技术问题。
本发明提供了外泌体microRNA分子标志物在制备用于诊断食管癌的产品中的应用，所述用于诊断食管癌的产品的检测样本为外泌体。
进一步地，所述外泌体microRNA分子标志物包括在食管癌外泌体中增量表达的microRNA和/或减量表达的microRNA中的一种或多种。
进一步地，所述增量表达的microRNA包括：miR-21、miR-223、miR-25、miR-146b-5p或miR-194中的至少一种；
所述减量表达的microRNA包括：miR-205、miR-203a、miR-375或miR-145中的至少一种。
进一步地，所述外泌体的来源包括体液和细胞；
优选地，所述体液包括血液、唾液、痰液、胃液或尿液中的一种或多种。
进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
另外，本发明还提供了一种用于诊断食管癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测外泌体microRNA分子标志物的PCR上下游引物、探针、逆转录引物、外泌体microRNA分子标志物标准品及microRNA两步法检测体系；
所述逆转录引物为特异性茎环结构逆转录引物。
进一步地，所述检测外泌体microRNA分子标志物的引物和探针包括：
用于检测miR-21的引物和探针；所述miR-21的上游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
用于检测miR-223的引物和探针；所述miR-223的上游引物具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列；
用于检测miR-25的引物和探针；所述miR-25的上游引物具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
用于检测miR-146b-5p的引物和探针；所述miR-146b-5p的上游引物具有如SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQID NO.13所示的核苷酸序列；
用于检测miR-194的引物和探针；所述miR-194的上游引物具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列；
用于检测miR-205的引物和探针；所述miR-205的上游引物具有如SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.19所示的核苷酸序列；
用于检测miR-203a的引物和探针；所述miR-203a的上游引物具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列；
用于检测miR-375的引物和探针；所述miR-375的上游引物具有如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.25所示的核苷酸序列；
用于检测miR-145的引物和探针；所述miR-145的上游引物具有如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针具有如SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列。
进一步地，所述外泌体microRNA分子标志物的逆转录引物颈部的loop环部设有非连续互补碱基对构成钥匙状结构；
优选地，所述非连续互补碱基对为TG-CG和CG-CA。
进一步地，所述外泌体相关microRNA分子标志物的逆转录引物包括：
miR-21的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；miR-223的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；miR-25的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；miR-146b-5p的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；miR-194的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；miR-205的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列；miR-203a的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列；miR-375的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列；miR-145的逆转录引物，具有如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。
进一步地，所述外泌体microRNA分子标志物的标准品的浓度为1013copy/μL；
优选地，所述外泌体microRNA分子标志物的标准品在使用时稀释为梯度标准品。
本发明提供的外泌体microRNA分子标志物通过实验发现在患有食管癌的外泌体中表达变化显著，且肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，因此本发明中提供的外泌体相关microRNA分子标志物可以作为标志物用于食管癌的风险预估与检测，具有灵敏度高，准确性强的优点，为食管癌诊断方面提供了一定的应用价值，为食管癌的诊断和预后提供有利的技术支持，对我国食管癌的预防及治疗有很好的帮助。另外，本发明还提供了用于诊断食管癌的试剂盒，包括检测外泌体microRNA分子标志物的PCR上下游引物、探针、特异性茎环结构逆转录引物、外泌体microRNA分子标志物标准品及microRNA两步法检测体系。其逆转录效率高，引物特异性强，灵敏度高，检测全面、快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床指导用药。
附图说明
图1为miRNA两步法扩增原理图；
图2-1为miR-205的PCR最低检测下限；图2-2为miR-205的PCR标准曲线；图2-3为miR-223的PCR最低检测下限；图2-4为miR-223的PCR标准曲线；图2-5为miR-25的PCR最低检测下限；图2-6为miR-25的PCR标准曲线；图2-7为miR-21的PCR最低检测下限；图2-8为miR-21的PCR标准曲线；图2-9为miR-203a的PCR最低检测下限；图2-10为miR-203a的PCR标准曲线；图2-11为miR-375的PCR最低检测下限；图2-12为miR-375的PCR标准曲线；图2-13为miR-146b-5p的PCR最低检测下限；图2-14为miR-146b-5p的PCR标准曲线；图2-15为miR-194的PCR最低检测下限；图2-16为miR-194的PCR标准曲线；图2-17为miR-145的PCR最低检测下限；图2-18为miR-145的PCR标准曲线；
图3A为同一样本批内差异；图3B为同一样本批间差异；
图4-1A为食管癌组织样本miR-205联合miR-21检测结果散点图，图4-1B为食管癌组织样本miR-205联合miR-21检测结果ROC曲线；图4-2A为食管癌血清外泌体miR-205联合miR-21检测结果散点图，图4-2B为食管癌血清外泌体miR-205联合miR-21检测结果ROC曲线；图4-3A为食管癌血浆外泌体miR-205联合miR-21检测结果散点图，图4-3B为食管癌血浆外泌体miR-205联合miR-21检测结果ROC曲线；图4-4A为食管癌尿液外泌体miR-205联合miR-21检测结果散点图，图4-4B为食管癌尿液外泌体miR-205联合miR-21检测结果ROC曲线；
图5-1A为食管癌组织样本miR-223联合miR-205检测结果散点图，图5-1B为食管癌组织样本miR-223联合miR-205检测结果ROC曲线；图5-2A为食管癌血清外泌体miR-223联合miR-205检测结果散点图，图5-2B为食管癌血清外泌体miR-223联合miR-205检测结果ROC曲线；图5-3A为食管癌血浆外泌体miR-223联合miR-205检测结果散点图，图5-3B为食管癌血浆外泌体miR-223联合miR-205检测结果ROC曲线；图5-4A为食管癌尿液外泌体miR-223联合miR-205检测结果散点图，图5-4B为食管癌尿液外泌体miR-223联合miR-205检测结果ROC曲线；
图6-1A为食管癌组织样本miR-25联合miR-375检测结果散点图，图6-1B为食管癌组织样本miR-25联合miR-375检测结果ROC曲线；图6-2A为食管癌血清外泌体miR-25联合miR-375检测结果散点图，图6-2B为食管癌血清外泌体miR-25联合miR-375检测结果ROC曲线；图6-3A为食管癌血浆外泌体miR-25联合miR-375检测结果散点图，图6-3B为食管癌血浆外泌体miR-25联合miR-375检测结果ROC曲线；图6-4A为食管癌尿液外泌体miR-25联合miR-375检测结果散点图，图6-4B为食管癌尿液外泌体miR-25联合miR-375检测结果ROC曲线；
图7-1A为食管癌组织样本miR-146b-5p联合miR-205检测结果散点图，图7-1B为食管癌组织样本miR-146b-5p联合miR-205检测结果ROC曲线；图7-2A为食管癌血清外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果散点图，图7-2B为食管癌血清外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果ROC曲线；图7-3A为食管癌血浆外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果散点图，图7-3B为食管癌血浆外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果ROC曲线；图7-4A为食管癌尿液外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果散点图，图7-4B为食管癌尿液外泌体miR-146b-5p联合miR-205检测结果ROC曲线；
图8-1A为食管癌组织样本miR-194联合miR-145检测结果散点图，图8-1B为食管癌组织样本miR-194联合miR-145检测结果ROC曲线；图8-2A为食管癌血清外泌体miR-194联合miR-145检测结果散点图，图8-2B为食管癌血清外泌体miR-194联合miR-145检测结果ROC曲线；图8-3A为食管癌血浆外泌体miR-194联合miR-145检测结果散点图，图8-3B为食管癌血浆外泌体miR-194联合miR-145检测结果ROC曲线；图8-4A为食管癌尿液外泌体miR-194联合miR-145检测结果散点图，图8-4B为食管癌尿液外泌体miR-194联合miR-145检测结果ROC曲线；
图9-1为术前和术后血清外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-146b-5p，miR-194，miR-205，miR-203a，miR-375，miR-145表达水平及其差异；图9-2为术前和术后血浆外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-146b-5p，miR-194，miR-205，miR-203a，miR-375，miR-145表达水平及其差异；图9-3为术前和术后尿液外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-146b-5p，miR-194，miR-205，miR-203a，miR-375，miR-145表达水平及其差异；
图10-1A为血清外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果散点图，图10-1B为血清外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图10-1C和图10-1D为血清外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图10-2A为血浆外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果散点图，图10-2B为血浆外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图10-2C和图10-2D为血浆外泌体miR-205联合miR-21检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图10-3A为尿液外泌体miR-205联合miR-21联合检测对食管癌预后评估结果散点图，图10-3B为尿液外泌体miR-205联合miR-21联合检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图10-3C和图10-3D为尿液外泌体miR-205联合miR-21联合检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；
图11-1A为血清外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果散点图，图11-1B为血清外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图11-1C和图11-1D为血清外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图11-2A为血浆外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果散点图，图11-2B为血浆外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图11-2C和图11-2D为血浆外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图11-3A为尿液外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果散点图，图11-3B为尿液外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图11-3C和图11-3D为尿液外泌体miR-223联合miR-205检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；
图12-1A为血清外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果散点图，图12-1B为血清外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图12-1C和图12-1D为血清外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图12-2A为血浆外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果散点图，图12-2B为血浆外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图12-2C和图12-2D为血浆外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线；图12-3A为尿液外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果散点图，图12-3B为尿液外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果ROC曲线，图12-3C和图12-3D为尿液外泌体miR-25联合miR-375检测对食管癌预后评估结果Kaplan-Meier曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了外泌体microRNA分子标志物在制备用于诊断食管癌的产品中的应用，其中，用于诊断食管癌的产品的检测样本为外泌体。
本发明提供的外泌体microRNA分子标志物通过实验发现在患有食管癌的外泌体中表达变化显著，且肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，因此本发明中提供的外泌体microRNA分子标志物可以作为标志物用于食管癌的风险预估与检测，具有灵敏度高，准确性强的优点，对我国食管癌的预防及治疗有很好的帮助。
在一个优选的实施方式中，外泌体microRNA分子标志物包括在食管癌外泌体中增量表达的microRNA和/或减量表达的microRNA中的一种或多种。
外泌体中的miRNA能以稳定的形式存在于人类的体液如血清、血浆中而不被降解，通过特定的分离纯化手段能够被检测到，而且外泌体中生物活性物质可分析活细胞的动态变化，允许实时捕获肿瘤异质性，因此，外泌体中的miRNA可作为无创检测筛查的新型重要标志物。
其中，增量表达的microRNA包括：miR-21、miR-223、miR-25、miR-146b-5p或miR-194中的至少一种。检测样本的至少一种microRNA基因产物的水平高于对照样品的对应microRNA基因产物的水平，即，microRNA基因产物增量表达。减量表达的microRNA包括：miR-205、miR-203a、miR-375或miR-145中的至少一种。检测样本的至少一种microRNA基因产物的水平低于对照样品的对应microRNA基因产物的水平，即，microRNA基因产物减量表达。
在一个优选的实施方式中，增量表达的分子标志物和减量表达的分子标志物联合使用，其中较优的组合是，miR-21和miR-205联合使用，miR-223和miR-205联合使用，miR-146b-5p和miR-205联合使用，miR-25和miR-375联合使用，miR-194和miR-145联合使用。上述组合可为食管癌的早期诊断，疗效监测，复发及预后判断提供更好的依据，能够准确预示疾病风险。
本发明还提供了一种用于诊断食管癌的试剂盒，包括检测外泌体microRNA分子标志物的PCR上下游引物、探针、特异性茎环结构逆转录引物、外泌体microRNA分子标志物标准品及microRNA两步法检测体系。
本发明还提供了用于诊断食管癌的试剂盒，该试剂盒是基于PCR平台miRNA两步法检测试剂盒，说明书中所述的所有两步法检测体系为构建该试剂盒的理论基础，其引物特异性强，灵敏度高，检测全面、快速、准确，应用广泛，检测结果可用于临床指导用药。
其中，检测外泌体microRNA分子标志物的特异性上游引物加上Tag标签从而延长扩增模板增加扩增效率，并调整下游引物使上下游引物Tm值基本相同，使得在PCR预变性后上下游引物可同时与模板结合并进行扩增，退火和延伸同一温度下进行。在有效减少实验步骤的情况下，提高检测准确率。
在一个优选的实施方式中，可检测的外泌体microRNA分子标志物至少为两种，其中一种选自增量表达标志物miR-21、miR-223、miR-25、miR-146b-5p或miR-194中的一种或多种；另一种选自减量表达标志物miR-205、miR-203a、miR-375或miR-145中的一种或多种。
同时，本发明采用TaqMan技术的设计方法，设计一条与模版互补的特异性检测microRNA分子标志物的探针(图1)，增强检测的特异性。
在一个优选的实施方式中，microRNA分子标志物的逆转录引物颈部的loop环部设有非连续互补碱基对构成钥匙状结构。
优选地，非连续互补碱基对为TG-CG和CG-CA，逆转录反应时通过连接酶将短臂与microRNA分子相连接。
本发明利用特异性的逆转录引物结合了茎环引物(Stem-loop RT-PCR)法和key-like法的设计优点，将外泌体microRNA分子标志物的逆转录引物(图1)颈部Stem碱基对延长，并且在loop环部设计了4对非连续互补碱基对加强其形成key-like结构的能力，从而促使RT引物在整个逆转录过程能更好地保持茎环结构，不仅杜绝了茎环引物与非目标miRNA的错配提高特异性，而且使逆转录产物碱基数增加，更有利于后续的PCR检测。同时，Stem-loop RT与miRNA有5对碱基完全互补，并且在逆转录前增加了酶连接步骤(图1)，使miRNA与Stem-loop RT结合更牢固，增强了逆转录的效率。此外，本发明利用Stem-loop RT引物对miRNA逆转录产物也可用于荧光染料法PCR检测。
对一种miRNA标志物定量检测，选取该miRNA作为miRNA标志物的内控基因，根据CP值，使用相对定量公式(2-ΔΔCp)计算标志物相对表达量的倍数变化，算出miRNA的得分。临床病理诊断用作参考标准确定miRNA标志物的敏感性和特异性。使用ROC特征曲线和AUC分析来确定miRNA联合检测的准确度，以cut off值对样本结果进行判读。
在一个优选的实施方式中，miR-21分子标志物标准品为miR-21，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-223分子标志物标准品为miR-223，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-25分子标志物标准品为miR-25，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-146b-5p分子标志物标准品为miR-146b-5p，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-194分子标志物标准品为miR-194，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-205分子标志物标准品为miR-205，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-203a分子标志物标准品为miR-203a，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-375分子标志物标准品为miR-375，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品；miR-145分子标志物标准品为miR-145，浓度为1013copy/μL，使用时稀释为梯度标准品。
本发明提供的用于诊断食管癌的试剂盒，可进行食管癌早期筛查、辅助诊断、疗效评价、预后评估、复发监控等方面的临床应用。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。
如未特殊说明，本发明实施例所用的仪器如下：
4℃低温离心机(Thermo Fisher Fresco17)、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)、超净工作台(SW-CJ-1D，龙扬科学仪器)、常规PCR仪(A100，杭州朗基科学仪器有限公司)。
实施例1基于PCR平台miRNA的两步法检测体系试剂盒及使用
1、RNA逆转录反应体系：
试剂：用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录引物(RT-Primer，上海英潍捷基合成)，miRNA标准品粉末(上海英潍捷基合成)、T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase，供应商：NEB，商品号：M0202S，包含10×T4 DNA Ligase Buffer)、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor，供应商：Fermentas，商品号：K1622)、转录酶Transcriptase(供应商：上海英潍捷基生物技术有限公司，商品号：K1622，包含RNase inhibitor、dNTPs、nuclease-free water)、T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，供应商：NEB，商品号：M0201S)和无核酸酶纯水(nuclease-free water，供应商：上海英潍捷基生物有限公司，商品号：K1622)。用于配制逆转录反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例制成逆转录体系，逆转录反应体系为20μL/次，分装的体积是50次的用量。如表1所示。
表1通用逆转录反应体系组分表
Figure GDA0003345679560000061
表2通用RNA逆转录条件
Figure GDA0003345679560000062
cDNA 10倍稀释后4℃保存用于后续PCR扩增。
2、PCR反应体系：
试剂：用于配制PCR反应体系的试剂包括PCR反应混合液(TaqMan 2×UniversalPCR Master Mix，供应商：ABI，货号：4398965)。上游引物液(F primer，苏州金唯智合成)、通用下游引物液(R primer，苏州金唯智合成)、探针(Probe，ABI合成)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG，供应商：NEB，商品号：M0280S)和超纯水(ddH2O)。
表3优化后的PCR反应体系
Figure GDA0003345679560000063
表4 PCR热循环条件
Figure GDA0003345679560000064
Figure GDA0003345679560000071
3、miRNA两步法分子标志物标准品配置：
标准品miRNA经逆转录后cDNA原液为1012copy/μL，取10μL cDNA原液加入90μL灭菌纯化水稀释到1011copy/μL，再取10μL 1011copy/μL稀释液加入90μL灭菌纯化水稀释到1010copy/μL,依次逐级稀释到1copy/μL的稀释液。
4、miRNA两步法检测灵敏度：
采用实施例1中基于PCR平台miRNA的两步法检测体系试剂盒，检测miR-21、miR-223、miR-25、miR-205、miR-203a、miR-375的标准品，得出检测下限及扩增效率。
以miR-21为例，miR-21两步法分子标志物标准品配置：
标准品miR-21经逆转录后cDNA原液为1012copy/μL，取10μL cDNA原液加入90μL灭菌纯化水稀释到1011copy/μL，再取10μL 1011copy/μL稀释液加入90 μL灭菌纯化水稀释到1010copy/μL，依次逐级稀释到1copy/μL的稀释液。
其他miRNA分子标志物两步法检测体系构建及标准品配置参考miR-21，仅模板、引物、及探针不同，PCR反应条件相同。
两步法检测体系miRNA标准品检测结果，如表5所示。
表5 miRNA标准品检测结果
Figure GDA0003345679560000072
5、两步法miRNA检测体系对临床样本检测稳定性评价
食管癌临床样本血清Exo-miR-21联合Exo-miR-205对检测结果稳定性进行评价。4例不同临床血清样本，每例样本分3个批次检测，每个批次3个重复，验证检测评价体系(包括Exo-miRNA提取纯化、逆转录、PCR上机检测)稳定性。结果如图3所示：图3A表示同一样本批内差异CV值可达到5％以内，图3B表示批间差异CV值可达到10％以内，说明miRNA两步法检测评价体系具有良好的稳定性。
实施例2 miRNA的两步法检测体系的食管癌辅助诊断检测试剂盒效果评价
1、样本采集
收集经医院检查确诊的食管癌(包括不同分期、不同亚型、不同性别及不同年龄段)、食管疾病良性病变和健康人等系列人群的组织、血清、血浆、尿液样本。
2、组织miRNA提取纯化
采用QIAGEN公司商业化产品miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒(货号217184)，提取纯化组织和血清中的miRNA，并利用Nano-Drop 2000测RNA核酸质量，记录RNA浓度及纯度，并对组织miRNA进行归一化处理。
3、血清外泌体miRNA、血浆外泌体miRNA提取纯化
采用SBI公司商业化产品ExoQuickTM试剂盒(货号EXOQ5A-1)提取血清和血浆外泌体。采用QIAGEN公司商业化产品miRNeasy mini kit试剂盒(货号217004)，提取纯化外泌体中的miRNA，并利用Nano-Drop 2000测RNA核酸质量，记录RNA浓度及纯度。
4、尿液外泌体miRNA提取纯化
采用SBI公司商业化产品ExoQuick-TC for Tissue Culture Media and Urine试剂盒(货号EXOTC10A-1)提取尿液外泌体。采用QIAGEN公司商业化产品miRNeasy mini kit试剂盒(货号217004)，提取纯化外泌体中的miRNA，并利用Nano-Drop 2000测RNA核酸质量，记录RNA浓度及纯度。
5、miRNA两步法检测体系
采用实施例1中基于PCR平台miRNA的两步法检测体系试剂盒。对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(健康人和良性病变)的血清，血浆，尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测miR-21、miR-223、miR-25、miR-205、miR-203a、miR-375的CP值，根据CP值，使用相对定量公式计算相对表达量。
6、食管相关疾病miRNA检测结果
(1)临床样本miR-21联合miR-205检测结果
如图4-1A和图4-1B所示，对食管癌病人30例癌组织和30例癌旁组织样本，检测miR-21及miR-205的CP值，根据CP值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.976，具有显著优势。
如图4-2A和图4-2B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照的血清样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-21和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.914，Cutoff值取6.300时，诊断灵敏度88.2％，特异性93.5％。具有显著优势。
如图4-3A和图4-3B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照的血浆样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-21和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.835，Cutoff值取6.157时，诊断灵敏度95％，特异性70％。具有显著优势。
如图4-4A和图4-4B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(健康人和良性病变)的尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-21和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.810，Cutoff值取6.580时，诊断灵敏度85％，特异性80％。具有显著优势。
通过组织及血清、血浆外泌体miRNA标志物诊断效果显示，与肿瘤组织穿刺活检、血浆外泌体miRNA诊断效果相比，血清外泌体miRNA有着无创，诊断效果显著的优点。
(2)临床样本miR-223联合miR-205检测结果
如图5-1A和图5-1B所示，对食管癌病人30例癌组织和30例癌旁组织样本，检测miR-223及miR-205的CP值，根据CP值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.958，具有显著优势。
如图5-2A和图5-2B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血清样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-223和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.884，Cutoff值取4.119时，诊断灵敏度81.5％，特异性81.2％。具有显著优势。
如图5-3A和图5-3B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血浆样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-223和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.809，Cutoff值取6.382时，诊断灵敏度77.8％，特异性82.4％。具有显著优势。
如图5-4A和图5-4B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-223和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.801，Cutoff值取7.250时，诊断灵敏度87.5％，特异性71.4％。具有显著优势。
(3)临床样本miR-25联合miR-375检测结果
如图6-1A和图6-1B所示，对食管癌病人30例癌组织和30例癌旁组织样本，检测miR-25及miR-375的CP值，根据CP值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.925，具有显著优势。
如图6-2A和图6-2B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血清样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-25和miR-375的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.800，Cutoff值取9.554时，诊断灵敏度83.3％，特异性70％。
如图6-3A和图6-3B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血浆样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-25和miR-375的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.779，Cutoff值取12.100时，诊断灵敏度77.4％，特异性72.3％。
如图6-4A和图6-4B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-25和miR-375的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.742。
(4)临床样本miR-146b-5p联合miR-205检测结果
如图7-1A和图7-1B所示，对食管癌病人30例癌组织和30例癌旁组织样本，检测miR-146b-5p及miR-205的CP值，根据CP值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.911，具有显著优势。
如图7-2A和图7-2B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血清样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-146b-5p和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.836，Cutoff值取19.85时，诊断灵敏度75％，特异性75％。
如图7-3A和图7-3B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血浆样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-146b-5p和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.823，Cutoff值取6.513时，诊断灵敏度80％，特异性82.9％。
如图7-4A和图7-4B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-146b-5p和miR-205的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.815。
(5)临床样本miR-194联合miR-145检测结果
如图8-1A和图8-1B所示，对食管癌病人30例癌组织和30例癌旁组织样本，检测miR-194及miR-145的CP值，根据CP值，得出miRNA的拷贝数。使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.937，具有显著优势。
如图8-2A和图8-2B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血清样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-194和miR-145的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.856，Cutoff值取13.05时，诊断灵敏度75％，特异性80％。
如图8-3A和图8-3B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的血浆样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-194和miR-145的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.824，Cutoff值取12.15时，诊断灵敏度80％，特异性72.5％。
如图8-4A和图8-4B所示，对Ⅰa期早期食管癌病人30例，30例对照(癌前病变、健康人和良性病变)的尿液样本的Exo-miRNA进行检测，检测标志物miR-194和miR-145的表达量CP值，根据CP值，使用相对定量公式值，计算联合标志物相对表达量的倍数变化，进而得出miRNA相对表达量的得分。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05，说明联合标志物与早期食管癌预测显著相关。AUC＝0.809。
实施例3食管癌术前和术后体液外泌体miRNA表达水平及其差异
1、收集经医院检查确诊的食管癌(包括不同分期、不同亚型、不同性别及不同年龄段)、收集未经任何治疗的10例食管癌患者术前体液(血清、血浆、尿液)样本和对应的术后体液(血清、血浆、尿液)样本。检测miR-21、miRNA-223、miRNA-25、miRNA-205、miR-203a、miR-375、mi-R-146b-5p、miR-194、miR-145的表达水平。
2、miRNA标志物miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375，miR-203a进行临床样本检测，对未经任何治疗的10例食管癌患者术前体液(血清、血浆、尿液)样本和对应的术后体液(血清、血浆、尿液)样本的Exo-miRNA进行检测，检测miRNA标志物miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375，miR-203a的表达量。对检测结果采用SPSS17.0进行t检测分析P<0.05。结果如图9-1所示，血清外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375，miR-203a术前和术后1周之间比较差异有统计学意义；如图9-2所示血浆外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375，miR-203a术前和术后1周之间比较差异有统计学意义；如图9-3所示尿液外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375术前和术后1周之间比较差异有统计学意义。说明体液外泌体miR-21，miR-223，miR-25，miR-205，miR-375，miR-203a有可能成为食管癌术后检测的生化标志物。
实施例4外泌体miRNA用于预后评估检测结果
1、对无远处转移、无全身重大疾病、可手术根治的Ⅰa期早期食管癌患者共20例样本的Exo-miRNA进行检测。样本纳入标准为：能够按预定方案完成化疗。可从化疗前后收集体液，通过病理诊断将样本分为10例治疗有效组，10例治疗无效组。检测miR-21、miRNA-223、miRNA-25、miRNA-205、miR-203a、miR-375、mi-R-146b-5p、miR-194、miR-145的表达水平。采用相对定量法，计算基因的相对表达量F＝2-△△cp。
2、外泌体miR-21和miR-205联合检测对食管癌预后评估
如图10-1A和图10-1B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血清外泌体miR-21和miR-205联合检测结果，AUC＝0.890，与疗效显著性相关；如图10-1C和图10-1D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血清Exo-miR-21联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图10-2A和图10-2B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血浆外泌体miR-21和miR-205联合检测结果，AUC＝0.790，与疗效显著性相关；如图10-2C和图10-2D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血浆Exo-miR-21联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图10-3A和图10-3B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，尿液外泌体miR-21和miR-205联合检测结果，AUC＝0.802，与疗效显著性相关；如图10-3C和图10-3D所示，Kaplan-Meier曲线显示，尿液Exo-miR-21联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
3、外泌体miR-223和miR-205联合检测对食管癌预后评估
如图11-1A和图11-1B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血清外泌体miR-223和miR-205联合检测结果，AUC＝0.850，与疗效显著性相关；如图11-1C和图11-1D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血清Exo-miR-223联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图11-2A和图11-2B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血浆外泌体miR-223和miR-205联合检测结果，AUC＝0.770，与疗效显著性相关；如图11-2C和图11-2D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血浆Exo-miR-223联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图11-3A和图11-3B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，尿液外泌体miR-223和miR-205联合检测结果，AUC＝0.800；如图11-3C和图11-3D所示，Kaplan-Meier曲线显示，尿液Exo-miR-223联合miR-205表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
4、外泌体miR-25和miR-375联合检测对食管癌预后评估
如图12-1A和图12-1B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血清外泌体miR-25和miR-375联合检测结果，AUC＝0.809，与疗效显著性相关；如图12-1C和图12-1D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血清Exo-miR-25联合miR-375表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图12-2A和图12-2B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，血浆外泌体miR-25和miR-375联合检测结果，AUC＝0.760，与疗效显著性相关；如图12-2C和图12-2D所示，Kaplan-Meier曲线显示，血浆Exo-miR-25联合miR-375表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
如图12-3A和图12-3B所示，10例治疗有效样本和10例治疗无效样本，尿液外泌体miR-25和miR-375联合检测结果，AUC＝0.780，与疗效显著性相关；如图12-3C和图12-3D所示，Kaplan-Meier曲线显示，尿液Exo-miR-25联合miR-375表达水平与患者PFS和OS密切相关，F>cutoff组的患者PFS和OS更长(P<0.05)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司
<120> 外泌体microRNA分子标志物的应用及用于诊断食管癌的试剂盒
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatgaggaga gtgctggagt gccgtatttc ctcatctcaa catc 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccgagtcgg tagcttatca gactga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcaagtgtc gtggagtcgg c 21
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<212> DNA
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tttcctcatc tcaacatc 18
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<212> DNA
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<400> 5
gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatctggg gta 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcgctcaggg tgtcagtttg tcaaata 27
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<400> 7
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<400> 8
gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatccaat tgcc 44
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aataatactg aggcggagac ttggg 25
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<212> DNA
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tttcctcatc caattgcc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcagcc tat 43
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<212> DNA
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ctgttacgtg agaactgaat tccat 25
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<212> DNA
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<400> 13
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<212> DNA
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ctgttacgtg taacagcaac tccat 25
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<212> DNA
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<400> 16
tttcctcatc tccacat 17
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<212> DNA
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tcagtccttc attccaccgg 20
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<212> DNA
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gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcctag tg 42
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<400> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgaggagt gtcgtggagt cggcaatttc ctcatcactc gggg 44
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctccgtcagg gtcctgtact gagctg 26
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<211> 18
<212> DNA
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<400> 25
tttcctcatc actcgggg 18
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tttcctcatc agggatt 17

Claims (6)

1.外泌体microRNA分子标志物在制备用于诊断食管癌的产品中的应用，所述用于诊断食管癌的产品的检测样本为外泌体，所述外泌体来源血清、血浆或尿液；所述用于诊断食管癌的产品包括检测外泌体microRNA分子标志物的引物、探针和逆转录引物；所述外泌体microRNA分子标志物为增量表达的miR-194和减量表达的miR-145。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-194的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述miR-194的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述miR-194的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述miR-145的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述miR-145的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述miR-145的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括，外泌体microRNA分子标志物标准品及microRNA两步法检测体系；
所述逆转录引物为特异性茎环结构逆转录引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外泌体microRNA分子标志物的逆转录引物颈部的loop环部设有非连续互补碱基对构成钥匙状结构；所述非连续互补碱基对为TG-CG和CG-CA。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外泌体microRNA分子标志物的标准品的浓度为1013copy/μL；所述外泌体microRNA分子标志物的标准品在使用时稀释为梯度标准品。
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