CN107988156B - T细胞活化的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及T细胞活化的抑制剂。本发明提供一种双特异性生物制品，包含对CTLA‑4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体。

Description

T细胞活化的抑制剂
本发明申请是基于申请日为2012年6月29日，申请号为“201280042085.9” (国际申请号为“PCT/US2012/045017”)，名称为“T细胞活化的抑制剂”的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求下述美国临时申请的权益：2011年6月30日提交的61/503,282 号，其全部内容通过援引并入本申请。
技术领域
本发明涉及T细胞活化的抑制剂。本发明还涉及双特异性生物制品，其包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体。
发明背景
使用新鲜分离的、离体扩增的或体外诱导的Treg的细胞疗法在自身免疫性疾病或器官移植的模型中已经显示Treg的过继性转移能够恢复Treg相对效应T细胞的平衡，从而控制与这些疾病相关的自身免疫力(Allan et al.,(2008) Immunol.Rev.223:391-421；Jiang et al.,(2006)Expert review of clinical immunology 2:387-392；Riley et al.,(2009)Immunity 30:656-665；Tangetal.,(2012)Journal of molecular cellbiology 4:11-21)。然而，使用过继性转移作为治疗策略在临床转化上面临若干挑战。从人类受试者外周血中能够分离的自身Treg的数目有限，并且对Treg的高度离体扩增可能改变它们的功能性和/ 或纯度。由于分离的Treg是多克隆的，它们可能对非目标的效应T细胞产生泛免疫抑制功能。重要的是，Treg的可塑性(plasticity)是一个严重的挑战 (Bluestoneet al.,(2009)Nat Rev Immunol 9:811-816；Zhou et al.,(2009a)Curr Opin Immunol21:281-285)，因为过继转移的Treg可能丧失Foxp3表达并重新分化成Th17细胞(Koenen etal.,(2008)Blood 112:2340-2352.)或致病性记忆T 细胞(Zhou et al.,(2009b)NatImmunol 10:1000-1007)，从而提高了加重自身免疫或炎症的风险。
可以以抗原特异性方式原位诱导Treg生成的治疗剂相比于过继Treg细胞疗法可能有优势。细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4；CD 152)是一种公认的T细胞应答负调节物，对T细胞内稳态和自身耐受的维持有重要作用。 CTLA-4与共刺激分子CD28同源，并拥有相同的配体：CD80(B7.1)和CD86 (B7.2)，这些配体在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。然而，APC上的 CD80/CD86对效应T细胞上CD28和CTLA-4的不同的结合导致相反的后果： CD28触发T细胞活化，而CTLA-4导致T细胞抑制。
由于CD28在T细胞上组成型表达，而CTLA-4仅在T细胞活化之后才被诱导，并在2-3日之后达到峰值(Jago et al.,(2004)Clinical&Experimental Immunology,136:463-471)，因此在CTLA-4接合之前可能已经发生了大范围的T细胞活化。因此，CTLA-4的主要作用是充当防止过度T细胞应答的防卫，而非抑制T细胞活化。然而，如果CTLA-4过早被其配体接合，然后与T细胞受体(TCR)交联，可能提前减弱TCR信号传导，导致T细胞抑制和应答过低，或无应答(anergy)。该观点已经通过多种方法得到了实验验证，包括下述：(i) 通过在珠子上共固定(co-immobilization)或介由第二种抗体来用激动性抗 CTLA-4抗体交联T细胞活化性抗体(抗-CD3/抗-CD28)(Blair et al.,(1998)J. Immunol.160:12-15；Krummeland Allison,(1996)J Exp Med 183:2533-2540； Walunas et al.,(1996)J.Exp.Med.183:2541-2550)；(ii)在APC上用分子手段构建针对CTLA-4的表面连接的激动性scFv(Fife et al.,(2006)J.Clin.Invest. 116(8):2252-61；Griffin et al.,(2001)J.Immunol.Methods.248(1-2):77-90； Griffin et al.,(2000)J.Immunol.164(9):4433-42)；和(iii)将特异性识别APC上的抗原的抗体与激动性抗CTLA-4抗体化学交联(Li etal.,(2007).J.Immunol. 179(8):5191-203；Rao et al.,(2001)Clin.Immunol.101(2):136-45；Vasu et al., (2004)J.Immunol.173(4):2866-76)。
恢复Treg对效应T细胞的平衡是治疗自身免疫性疾病的一种有前景的手段。然而，涉及Treg转移的细胞疗法有某些不足之处。因此，急切需要能够以抗原特异性方式诱导Treg产生的治疗手段(例如CTLA-4)用于自身免疫性疾病的治疗。
发明内容
本发明涉及配体，所述配体在T细胞活化的早期将配体接合的 (ligand-engaged)细胞毒性T淋巴细胞抗体-4(CTLA-4)与T细胞受体(TCR)交联，从而弱化TCR信号传导，导致T细胞抑制。为了开发能抑制T细胞活化的作用剂，制作了一种双特异性融合蛋白，其包含多个部分，这些部分可选择性结合并活化CTLA-4并将其共连接(co-ligate)于TCR。与现有技术的手段不同，该双特异性融合蛋白被工程构建为使MHC与CTLA-4交联，然后二者都被拉向(drawn to)TCR，从在免疫突触内CTLA-4/MHCII/TCR三分子复合物。
在同种异体MLR中将配体接合的细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4) 与一种包含突变的小鼠CD80和淋巴细胞活化抗原-3的双特异性融合蛋白 (BsB)交联弱化了TCR信号传导和T细胞向Foxp3+调节性T细胞(Treg)的直接分化。如本文中描述的，抗原特异性Treg也可以在抗原特异性环境下被诱导。用BsB短期处理非肥胖糖尿病(NOD)小鼠少许延迟了自身免疫性1型糖尿病 (T1D)的发病，同时在血液中Treg短暂增加。然而，用BsB更长期地处理NOD 动物显著延迟了疾病发病，而且还减少了表现糖尿病的动物的发生率。对于保持无糖尿病的BsB处理小鼠的胰脏进行的组织病理学分析揭示在胰岛周围有与其他CD3+ T细胞及非T细胞白细胞混在的Treg存在。该胰岛周围炎 (peri-insulitis)伴随的侵袭性胰岛炎极少，而且没有对产生胰岛素的β-细胞的破坏。因此，能够接合CTLA-4和MHCII，并间接地将其与TCR共连接的双功能蛋白可能在体内诱导抗原特异性Treg以保护小鼠免遭T1D或其他自身免疫性疾病。
具体地，本发明描述了双特异性融合蛋白，它们将CTLA-4交联到 pMHCII复合物。例如，描述了一种包含突变的小鼠CD80(CD80w88a)和淋巴细胞活化抗原-3(LAG-3)的双特异性融合蛋白，其被工程构建为同时接合 CTLA-4并将其藉由pMHCII交联于TCR。因此，在第一个方面，提供一种双特异性生物制品，其包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体。
在一个方面，本发明提供一种双特异性生物制品，其包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体。根据本发明的双特异性生物制品能够将T细胞上存在的CTLA-4与抗原呈递细胞(APC)上的肽MHC(pMHC) 复合物交联。肽MHC复合物被T细胞上的相关的T细胞受体(TCR)结合，意味着依照本发明的双特异性生物制品可产生CTLA-4/MHC/TCR三元复合物。
在本文中描述的各方面的多个实施方案中，对CTLA-4特异性的配体选自：对CTLA-4特异性的抗体、以及CD80(B7-1)或CD86(B7-2)。在一个具体的实施方案中，对CTLA-4特异性的抗体、以及CD80(B7-1)或CD86(B7-2) 是激动性抗体。对CTLA-4特异性的抗体可以是工程构建的，而CD80和CD86 都是CTLA-4的天然配体。在一个方面中，使用CD80或其突变体，这是因为 CD80优先于CD28与CTLA-4结合，因此促进T细胞失活而非活化。
在本文中描述的各方面的多个实施方案中，对pMHC复合物特异性的配体可以选自：抗MHC抗体，以及LAG-3。LAG-3多肽是MHCII蛋白的一种天然配体。在一个实施方案中，MHC是MHC II(其与CD4+ T细胞相互作用)。在另一个实施方案中，MHC是MHC-I，其与CD8+ T相互作用。
在依照本发明的双特异性生物制品中，对CTLA-4特异性的配体和对 pMHC复合物特异性的配体优选被接头分隔开来。接头的形式可以是下述中的一种或多种：聚氨基酸序列，以及抗体Fc域。一种合适的聚氨基酸序列是 G9(Gly-9)。
在本文中描述的各方面的多个实施方案中，对CTLA-4特异性的配体是 CD80，或者是它的突变体，该突变体被突变以提高其对CTLA-4相比于CD28 的特异性。在一个实施方案中，突变的CD80包含选自下组的一个或多个突变，使用小鼠CD80前体中的序列编号：W88A,K75G.K75V,S112G,R126S, R126D,G127L,S193A,和S204A，或它们的人CD80对应物(W84A,K71G, K71V,S109G,R123S,R123D,G124L,S190A,和S201A)；以及还有R63A, M81A,N97A,E196A。
在一个实施方案中，所述双特异性生物制品包含CD80，后者包含突变 W84A(人)或W88A(小鼠)。
在一个具体的实施方案中，对MHCII复合物特异性的配体是LAG-3。有利的是，LAG-3被突变以增加对pMHCII的特异性。例如，LAG-3包含选自下组的一个或多个突变：R73E,R75A,R75E和R76E(Huard et al.,(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94(11):5744-5749)。在一个实施方案中，LGA-3包含突变R75E。
所述双特异性融合蛋白对CTLA-4相比于对CD2的优先结合是利用突变体CD80(CD80w88a)作为配体实现的，后者在氨基酸88(在小鼠CD80中编号) 处含有丙氨酸而不是色氨酸。CD80w88a结合CTLA-4，但对CD28显示的亲和力最小(Wu et al.,(1997),J.Exp.Med.185:1327-1335)。
选择了淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)，MHCII的一种天然配体，来作为所述双特异性融合蛋白的另一个结合组分(Baixeras et al.,(1992)J.Exp.Med. 176:327-337；Triebel et al.,(1990)J.Exp.Med.171:1393-1405)。我们显示，具有这样的双重功能性的融合蛋白可有效地抑制T细胞活化并刺激抗炎细胞因子IL-10和TGF-β产生。更重要的是，该双特异性融合蛋白还指导T细胞分化为高度抑制性的Foxp3+ Treg。这在改为使用常规的共刺激抑制剂CTLA-4Ig (Bluestone et al.,(2006)Immunity 24:233-238；Linsley andNadler(2009) Immunol.Rev.229:307-321)时没有发生。由此可见，CTLA-4的早期接合以及在T细胞活化过程中CTLA-4与TCR的交联可积极地影响T细胞分化。因此这样的双特异性融合蛋白可能代表了一类能够用来在自身免疫性疾病中控制过度的T细胞应答的新的生物制品。
在本发明的第二个方面，提供了依照本发明第一个方面的包含对 CTLA-4特异性的配体以及对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品用于耐受化(tolerisation)T细胞的用途，所述耐受化是通过使所述T细胞与呈递有与MHC分子复合的衍生自所述抗原的肽的抗原呈递细胞及所述双特异性生物制品接触来实施的。
在第三个方面，提供依照本发明第一个方面的包含对CTLA-4特异性的配体以及对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品在治疗选自自身免疫性疾病和移植排斥的疾病中的用途。
例如，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病(T1D)，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))、多发性硬化(MS)、硬皮病、以及其他疾病和病症，如PV(寻常型天疱疮)、银屑病、特应性皮炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病(甲状腺)、舍格伦综合征、格林-巴利综合征、古德帕斯彻综合征、阿狄森氏病、韦格纳肉芽肿、原发性胆汁性硬化(primary biliarysclerosis)、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛。雷诺氏现象，颞动脉炎、巨细胞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎。贝切特氏病、原发性胆汁性肝硬化(primary bilary cirrhosis)、葡萄膜炎、心肌炎、风湿热、强直性脊柱炎、肾小球性肾炎(glomerulenephritis)、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃、和白癜风。
在第四个方面，提供一种使T细胞对抗原耐受化的方法，包括使所述T 细胞与抗原呈递细胞及依照本发明第一方面的双特异性生物制品接触，所述抗原呈递细胞呈递有与MHC分子复合的衍生自所述抗原的肽。
在第五个方面，提供一种治疗患有选自自身免疫性疾病和移植排斥的病况的受试者的方法，包括向有此需要的受试者施用依照本发明第一方面的包含对CTLA-4特异性的配体以及对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品。
例如，所述自身免疫性疾病是1型糖尿病(T1D)。
本发明还涉及如下各项：
1.包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品用于耐受化T细胞的用途，所述耐受化是通过使所述T细胞与抗原呈递细胞及所述双特异性生物制品接触而进行的，所述抗原呈递细胞呈递有与MHC分子复合的衍生自所述抗原的肽。
2.包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品在治疗选自自身免疫性疾病和移植排斥的疾病中的用途。
3.根据项2的用途，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病(T1D)。
4.根据前述项中任一项的用途，其中所述对CTLA-4特异性的配体选自对CTLA-4特异性的抗体，以及CD80(B7-1)或CD86(B7-2)。
5.根据前述项中任一项的用途，其中所述对pMHC复合物特异性的配体选自抗MHC抗体和LAG-3。
6.根据前述项中任一项的用途，其中所述对CTLA-4特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体被接头分隔开来。
7.根据项6的用途，其中所述接头是聚氨基酸序列和抗体Fc域中的一种或多种。
8.根据项7的用途，其中所述聚氨基酸序列是G9(Gly-9)。
9.根据项4的用途，其中所述对CTLA-4特异性的配体是CD80。
10.根据项9的用途，其中CD80被突变而增加了对CTLA-4的特异性。
11.根据项10的用途，其中CD80是包含下述突变中的至少一个的人 CD80：W84A,K71G,K71V,S109G,R123S,R123D,G124L,S190A,S201A, R63A,M81A,N97A和E196A。
12.根据项11的用途，其中CD80包含人CD80的突变W84A或E196A。
13.根据项5的用途，其中所述对MHC复合物特异性的配体是LAG-3。
14.根据项13的用途，其中LAG-3被突变而增加了对pMHCII的特异性。
15.根据项14的用途，其中LAG-3是包含下述突变中的至少一个的人 LAG-3：R73E,R75A,R75E和R76E。
16.根据项15的用途，其中LAG-3包含突变R75A或R75E。
17.一种双特异性生物制品，其包含对CTLA-4特异性的配体和对pMHC 复合物特异性的配体。
18.根据项17的双特异性生物制品，其中所述对CTLA-4特异性的配体选自对CTLA-4特异性的抗体，以及CD80(B7-1)或CD86(B7-2)。
19.根据项17或项18的双特异性生物制品，其中所述对pMHC复合物特异性的配体选自抗MHC抗体和LAG-3。
20.根据前述项中任一项的的双特异性生物制品，其中所述对CTLA-4 特异性的配体和对pMHC复合物特异性的配体被接头分隔开来。
21.根据项20的双特异性生物制品，其中所述接头是聚氨基酸序列和抗体Fc域中的一种或多种。
22.根据项21的双特异性生物制品，其中所述聚氨基酸序列是G9 (Gly-9)。
23.根据项18的双特异性生物制品，其中所述对CTLA-4特异性的配体是CD80。
24.根据项23的双特异性生物制品，其中CD80被突变而增加了对 CTLA-4的特异性。
25.根据项24的双特异性生物制品，其中CD80是包含下述突变中的至少一个的人CD80：W84A,K71G,K71V,S109G,R123S,R123D,G124L,S190A, S201A,R63A,M81A,N97A和E196A。
26.根据项25的双特异性生物制品，其中CD80包含人CD80的突变 W84A或E196A。
27.根据项19的双特异性生物制品，其中对MHC复合物特异性的配体是 LAG-3。
28.根据项27的双特异性生物制品，其中LAG-3被突变而增加了对 pMHCII的特异性。
29.根据项28的双特异性生物制品，其中LAG-3是包含下述突变中的至少一个的人LAG-3：R73E,R75A,R75E和R76E。
30.根据项29的双特异性生物制品，其中LAG-3包含突变R75A或R75E。
31.一种使T细胞对抗原耐受化的方法，包括使所述T细胞与抗原呈递细胞及根据项17-30中任一项的双特异性生物制品接触，所述抗原呈递细胞呈递有与MHC分子复合的衍生自所述抗原的肽。
32.一种治疗患有选自自身免疫性疾病或移植排斥的病况的受试者的方法，包括对有此需要的受试者施用根据项17-30中任一项的包含对CTLA-4 特异性的配体以及对pMHC复合物特异性的配体的双特异性生物制品的步骤。
33.根据项32的方法，其中所述双特异性生物制品与其他免疫抑制剂或调节剂组合施用。
34.根据项32或项33的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：1型糖尿病(T1D)，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、多发性硬化(MS)、硬皮病、寻常型天疱疮(PV)、银屑病、特应性皮炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病(甲状腺)、舍格伦综合征、格林-巴利综合征、古德帕斯彻综合征、阿狄森氏病、韦格纳肉芽肿、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、雷诺氏现象、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、贝切特氏病、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、风湿热、强直性脊柱炎、肾小球性肾炎、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃、和白癜风。
附图说明
图1. BsB与BsBΔ的设计。(A) BsB (双特异性生物制品)和BsBΔ融合蛋白的示意图。(B) pMHCII、TCR和共刺激分子在免疫突触中的示意图，以及CTLA-4在BsB介导下藉由CTLA-4/MHC 11/TCR三分子复合物与TCR交联的供讨论方案。在免疫突触中该融合蛋白接合CTLA-4并通过结合间接地将TCR与MHCII连接。三角形的两条实线边表示MHCI I与CTLA-4的交联以及MHCI I与TCR的交联；虚线边表示CTLA-4与TCR的连接。点线表示被BsB接合的CTLA-4对TCR信号传导的抑制。(C) 显示BsBΔ的作用的示意图，与BsB相似，只是它不能连接TCR。
图2.BsB在混合淋巴细胞反应中对同种异体T细胞活化的抑制。将来自 C57BL/6小鼠的幼稚T细胞与经LPS处理并经辐射的BALB/c APC与测试构建物混合2日。然后收获培养基，测定IL-2。只有BsB和CTLA-4Ig抑制了T细胞活化，表现为培养基中IL-2的量减少。该图代表了多于5次独立但相似的研究。
图3.BsB诱导Foxp3+ Treg以及IL-10和TGF-β产生.(A)如图2图例中所述建立同种异体混合淋巴细胞反应，使用在测试构建体的存在下从 Foxp3-EGFP敲入小鼠分离而来的幼稚CD4+CD62LhiCD25-GFP”细胞。活化后 5日，通过流式细胞术分析CD4+ T细胞的GFP表达。Treg作为GFP+与CD25+细胞设门。仅有BsB处理导致了GFP表达，表明Foxp3+ Treg的诱导(中左小图)。收集培养基进行细胞因子分析(右边小图)，发现在BsB存在下IL-10和TGF-β水平上升。该数据代表了若干次独立但类似的研究。(B)在TGF-β封闭抗体的存在下Treg诱导完全被阻断，而对照抗体未显著影响Treg诱导，表明Treg诱导需要自分泌的TGF-β。
图4.体外BsB介导的抗原特异性Treg的诱导。(A)Ova233-339-特异性Treg 的体外诱导。在0.5μg/ml Ova233-239肽的存在下将幼稚OT-II T细胞与LPS活化并经辐射的同基因APC混合。然后如标示的那样加入对照mIgG2a、BsB、及 BsB加抗TGF-β抗体(αTGF-β)并测试(左边小图)。将细胞培养5日，然后用抗 CD25和抗Foxp3抗体标记，再用流式细胞术分析。通过ELISA测定培养基中的IL-2,IL-10和TGF-β水平(右边小图)。(B)对诱导出的Treg的增殖的监测。如 A一样进行实验，只是幼稚OT-II T细胞在与APC混合之前用CFSE预先标记。在Foxp3和CFSE荧光频道上对细胞设门。
图5.BsB诱导的Treg的抑制性功能。(A)将BsB诱导或TGF-β诱导的Treg 用流式细胞术纯化，并与自C57BL/6小鼠制备的CFSE标记的幼稚应答T细胞按标示的比例在transwell(实心柱形)或普通培养孔(阴影线柱形)中混合。加入 LPS处理过的同种异体BALB/c APC以刺激T细胞活化。结果(均值+标准偏差) 显示了增殖的应答T细胞(Tresp)的百分比，以没有Treg的CFSE稀释物(Tresp+ 仅APC)作为100％。(B)向普通培养孔中的Tresp:Treg比例为1:1的细胞加入抗 IL-10和抗TGF-β以确定这些细胞因子对T细胞增殖的贡献。抗TGF-β抗体部分抑制了TGF-β诱导的Treg的抑制性功能，但未影响BsB诱导的Treg(右边小图)。该图代表了多于三次独立但相似的研究。
图6.BsB对AKT和mTOR磷酸化的下调。在用抗-CD3，抗-CD28以及 BsB，小鼠IgG(mIgG)或小鼠PD-L1(mPD-L1)共包被的圆底96孔平板中培养幼稚T细胞18h。将认为未活化的细胞在仅用IgG包被的孔中培养。然后用针对磷酸化AKT和mTOR的荧光标记抗体染色，再通过流式细胞术监测AKT和 mTOR的磷酸化状态。MFI表示平均荧光强度。该图代表了三次独立实验中的一次。
图7.Foxp3在Treg中响应于BsB连续刺激的持续表达。用抗-CD3、抗 -CD28和BsB或小鼠IgG共包被圆底96孔平板。将来自Foxp3-EGFP敲入小鼠的幼稚T细胞培养5日以诱导Treg(左边小图)，然后将它们从BsB处理的细胞中纯化出来(红色方块)，并在另一轮如上所述的共包被孔中的培养中再刺激5 日，然后通过流式细胞术分析GFP+细胞。将纯化Treg与小鼠IgG对照再培养5 日导致～60％的细胞中Foxp3+表达丧失(右上小图的右上象限)。而与BsB再次培养的Treg中有～7％丧失了Foxp3+表达(右下小图的右上象限)。该图代表3个独立实验之一。
图8.BsB的体内药动学和生化分析。(A)BsB在小鼠中的药动学规律。正常C57BL/6小鼠(n＝5)腹膜内给药20mg/kg的BsB。在标示的不同时间点收集血液样品并利用ELISA测定BsB水平。(B)BsB和小鼠IgG2a对FcRn的结合的比较。FcRn固定化于Biacore芯片。将不同浓度的BsB或对照小鼠IgG2a加载到该芯片上，然后记录信号。
图9.对BsB上天冬酰胺连接的糖基化的分析。将BsB的氨基酸序列提交到NetNGlyc1.0服务器以预测Asn连接的糖基化位点。预测出总共10个Asn连接的糖基化位点(标记为N)；其他的氨基酸以点表示。还进行了BsB的单糖组成分析(monosaccharide composition)以确定聚糖的组成岩藻糖(Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖(Gal),甘露糖(Man),唾液酸(N-乙酰神经氨酸)。唾液酸:半乳糖比例0.68表明有大约三分之一的半乳糖残基可用来结合无唾液酸糖蛋白受体。
图10.按照晚期预防处理范式(late prevention treatment paradigm)用 BsB处理非糖尿病(NOD)小鼠延迟了1型糖尿病(T1D)的发病。(A)BsB处理的 NOD小鼠(实心圆，n＝15)和盐水处理的对照NOD小鼠(实心三角形，n＝14)的血液中Foxp3+ Treg的水平。与对照动物中所见相比，BsB处理的动物中Treg 的数目发生了有限(moderate)但显著的增加。(B)用BsB(实心圆)或盐水(实心三角形)处理的NOD动物中显性糖尿病的累计发生率。
图11.按照早期预防处理范式(early prevention treatment paradigm)用 BsB处理NOD小鼠延迟了T1D发病。(A)用BsB(实心圆,n＝10)、盐水(实心三角形,n＝10)、CTLA-4Ig(实心方块,n＝10)和小鼠IgG2a(空心方块,n＝10)处理的小鼠的血液中Foxp3+ Treg的水平。与盐水或mIgG2a处理的对照相比，用 BsB处理2周之后未检测到Foxp3+ Treg数目的增加。然而，用CTLA-4Ig处理导致血液中Foxp3+ Treg的数目统计学显著地减少。(B)在用BsB或对照处理的动物中显性糖尿病的累积发生率。在24周龄之前，与盐水或小鼠IgG2a处理的对照组相比，BsB处理导致T1D发病显著延迟(p＝0.04)。然而，在研究结束时，各组之间未见显著差异。数据代表了结果相似的两次不同研究，每组中共有26只NOD小鼠。
图12.用BsB更长期地处理NOD小鼠显著延迟了NOD小鼠中T1D的发病。(A)在BsB处理(n＝16)和未处理(n＝16)的小鼠中显性糖尿病的累积发生率。与盐水处理的小鼠相比，BsB处理显著降低了T1D的发生率(p<0.01)。(B)对来自BsB或盐水处理的动物的胰脏组织的组织病理学分析。小图a-c呈现对来自盐水处理的、保持无糖尿病的小鼠的切片用H&E、抗胰岛素抗体、或抗 -CD3和叉头框蛋白P3(FoxP3)分别处理的结果。对BsB处理的、保持无病的NOD小鼠观察到了类似的结果。在所有这些切片中均未发现浸润或胰岛炎的证据；可能存在少数Foxp3+ Treg(小图c中的箭头)。小图d-f呈现了来自糖尿病NOD动物的胰脏切片。明显可见侵袭性胰岛炎，且产胰岛素的β-细胞全部被破坏(e)。还观察到某些CD3+ T细胞浸润，以及极少Treg和许多有蓝色细胞核的非T细胞白细胞(f)。小图g-i显示了BsB处理后保持无糖尿病的动物的胰岛，其显示典型的胰岛周围炎(peri-insulitis)。观察到了白细胞浸润，但局限于胰岛周围。此外，产胰岛素的β-细胞没有明显的破坏。周围的白细胞大多是非T细胞(蓝色细胞核)。放大的胰岛(小图j，在i中呈现红色方块)表明在胰岛周围Foxp3+ Treg(黄色箭头)与其他CD3+ T细胞和非T细胞白细胞(蓝色细胞核)混杂在一起。用40x物镜获取图像；用60x物镜捕获胰岛图像，然后再数字放大3x。
发明详述
除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语的意思与本发明相关技术领域的普通技术人员所通常理解的意思相同。与本申请中描述的方法和材料具有类似或等同的功能的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明。下面描述适合此类应用的方法、装置和材料。本文通过援引并入本文中引用的所有出版物的全部内容，用于描述和公开这些出版物中报道的可能用于本发明的方法学、试剂或工具之目的。
除非另有说明，本申请的方法和技术一般是根据本领域技术人员公知的常规方法，并按照本申请通篇各处中引用并讨论的各种一般性或者更专门的参考文献中描述的那样实施的。这样的技术在文献中有充分的解释。参见例如Gennaro,A.R.,ed.(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed., Mack Publishing Co.；Hardman,J.G.,Limbird,L.E.,and Gilman,A.G.,eds. (2001)The Pharmacological Basis ofTherapeutics,10th ed.,McGraw-Hill Co.； Colowick,S.et al.,eds.,Methods InEnzymology,Academic Press,Inc.；Weir,D. M.,and Blackwell,C.C.,eds.(1986)Handbook of Experimental Immunology, Vols.I-IV,Blackwell ScientificPublications；Maniatis,T.et al.,eds.(1989) Molecular Cloning:ALaboratoryManual,2nd edition,Vols.I-III,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.,eds.(1999)Short Protocols in Molecular Biology,4th edition,JohnWiley&Sons；Ream et al.,eds.(1998) Molecular Biology Techniques:An IntensiveLaboratory Course,Academic Press； Newton,C.R.,and Graham,A.,eds.(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series),2nd ed.,Springer-Verlag。
术语“抗体”，除非另有说明，用来指完整抗体，也指这样的抗体的抗原结合部分。例如，该术语涵盖四链IgG分子，以及抗体片段。
如本文中所使用的，术语“抗体片段”指完整全长抗体的部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab,Fab’,F(ab’)2,和Fv 片段；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；多特异性抗体片段诸如双特异性、三特异性和多特异性抗体(例如双抗体、三抗体、四抗体)；结合域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体；迷你抗体；螯合性重组抗体；三抗体或双抗体；胞内抗体(intrabodies)；纳米抗体(nanobodies)；小型模块性免疫药 (smull modular immunopharmaceuticals,SMIP),含VHH的抗体；和任何其他从抗体片段形成的多肽，例如如下文中详述的。
抗体可以属于任何类别，如IgG,IgA或IgM；和任何亚类，诸如IgG1或 IgG4。不同的免疫球蛋白类型和亚类有不同的性质，这些可能在不同的应用中是有利的。
在本发明的语境中，特异性需要要求保护的抗体能够选择性地结合其确定的关联抗原，即CTLA-4或pMHC复合物。
天然存在的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两条相同的轻链(大约24kD)和两条相同的重链(大约55或70kD)形成四聚体。每条链的氨基末端部分称作可变(V)区，可以与每条链上其余部分的更保守的恒定(C)区区分开来。在轻链可变区(又称VL域)的内部有一C末端部分，称为J区。在重链可变区(又称VH域)内部除了J区之外还有一D区。免疫球蛋白的大部分氨基酸序列变异都局限在V区中的三个不同的位置，称为高变区或互补决定区(CDR)，它们直接参与抗原结合。从氨基末端开始，这些区域分别命名为CDR1、CDR2 和CDR3。CDR被更保守的框架区(FR)保持定位，从氨基末端开始，这些区域分别命名为FR1、FR2、FR3和FR4。Kabat等人(Kabat,E.A.,et al.,(1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,U.S.Government Printing Office已经定义了 CDR和FR区域的位置以及一套编号系统，可以在网上找到它们的更新。
本申请中提及的人源化单克隆抗体是由其中移植了来自非人抗体的 CDR的人抗体框架构成。设计和生产人源化抗体的程序是本领域公知的，例如在下述文献中有记载：Cabilly et al.,美国专利No.4,816,567；Cabilly et al., 欧洲专利申请0 125 023；Boss et al.,美国专利No.4,816,397；Boss et al.,欧洲专利申请0 120 694；Neuberger,M.S.et al.,WO 86/01533；Neuberger,M.S.et al.,欧洲专利申请0 194 276Bl；Winter,美国专利No.5,225,539；Winter,欧洲专利申请0 239 400；Padlan,E.A.et al.,欧洲专利申请0 519 596。关于抗体、人源化抗体、人工程化抗体和它们的制备方法可见Kontermann,R.and Dübel, S.eds.(2001,2010)Antibody Engineering,2nd ed.,Springer-Verlag,New York, NY,2001。
恒定区可衍生自任何人抗体恒定区。典型地，将可变区基因克隆到表达载体中使之与恒定区合框，以表达免疫球蛋白重链和轻链。可以将这样的表达载体克隆到产生抗体的宿主细胞中以合成抗体。
所需的抗体可变和恒定区可或其序列数据库。例如，免疫球蛋白序列可从IMGT/LIGM数据库(Giudicelli et al.,(2006)Nucleic Acids Res.34:(suppl. 1):D781-D784)或VBase(vbase.mrccpe.cam.ac.uk)获得。
本文中提到的“核酸”通常包括编码本发明的抗体的DNA分子。优选的是表达载体，其适于在宿主细胞中表达抗体基因。用于抗体基因表达的表达载体和宿主细胞是本领域已知的，参见例如Morrow,K.J.(2008)Genetic Engineering&Biotechnology News.(June15,2008)28(12),and Backliwal,G., et al.(2008)Nucleic Acids Res.36(15):e96-e96。
“CD80”，如本申请中所用的，是指哺乳动物CD80抗原，及其具有增加的对CTLA-4的结合亲合力或特异性的突变体。参见Linsley et al.,(1994) Immunity 1:793-801，和Wuet al.,(1997)J.Exp.Med.185(7):1327-1335，兹通过提述并入本申请。哺乳动物CD80可以选自啮齿动物，如小鼠，或人CD80。
“CD86”，如本申请中所用的，是指哺乳动物CD86抗原，及其具有增加的对CTLA-4的结合亲合力或特异性的突变体。参见Linsley et al.,(1994) Immunity 1:793-801，兹通过提述并入本申请。哺乳动物CD86可以选自啮齿动物，如小鼠，或人CD86。
CTLA-4”，如本文中使用的，是指哺乳动物细胞毒T细胞相关抗原-4 (CTLA-4)。人CTLA-4的序列可见于GenBank,登录号AAH74893.1, GI:49904741。哺乳动物CTLA-4可以选自啮齿动物，如小鼠，或人CTLA-4。
“LAG-3”，如本文中使用的，是指哺乳动物淋巴细胞活化抗原3(LAG-3)。人LAG-3的序列可见于Huard et al.,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci,USA 94:5744-5749，兹通过提述并入本申请。哺乳动物LAG-3可以选自啮齿动物，如小鼠，或人LAG-3。
“MHC”是参与抗原呈递细胞对抗原衍生肽的呈递的复合物，其被TCR 所识别。在特定的方面，所述MHC是MHC II，其将抗原呈递给CD4+辅助T 细胞。参见例如，Wucherpfenniget al.,CSH Perspect.Biol.2(4):a005140,epub 2010Mar 17。
双特异性生物制品，又可称为双特异性配体，是能够在同时期(contemporaneously)结合两个靶物，或被两个靶物所结合的配体。双特异性抗体是本领域已知的，并在下文中有进一步描述。在本发明的语境中，两个靶物是T细胞上的CTLA-4分子和APC上的MHC肽复合物。依照本发明的双特异性生物制品可借助在免疫突触中pMHC结合TCR来交联该两个靶物，因此它将CTLA-4分子与TCR交联。“生物制品”，一般而言，是生物治疗剂或作用剂，其可以用于治疗、诊断和/或研究目的，等等。
接头是任何连接并分隔蛋白质中的两个多肽域的氨基酸序列。在本发明的双特异性配体的语境中，接头是将CTLA-4配体与MHC配体连接的序列。示例的接头有某种氨基酸的序列，例如多聚甘氨酸，如Gly-9。一种备选的接头是抗体Fc区。这样的接头将两个配体域分开大约
Figure BDA0001497978520000151
依照本发明的配体可包含任何组合的抗体与非抗体配体。例如，CTLA-4 配体可以是抗CTLA-4抗体，而MHC配体可以是LAG-3。或者，可以用CD80 作为CTLA-4配体，与LAG-3或抗MHC抗体组合。两个配体可以都是抗体，或者可以都是自然配体，CD80和LAG-3。
细胞毒性淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)
细胞毒性淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)，又称CD152，是一种T细胞应答负调控子，在T细胞稳态的维持和自身耐受的诱导中起着重要作用 (Karandikar et al.,(1996)JExp Med 184:783-788；Krummel and Allison,(1995) J Exp Med 182:459-465；Linsleyand Golstein,(1996)Curr Biol 6:398-400； Walunas and Bluestone,(1998)J Immunol160:3855-3860；Walunas et al.,(1994) J Immunol 160:3855-3860).Mice deficientin CTLA-4develop multi-organ autoimmune disease and typically succumb to theailment by 4weeks of age (Tivol et al.,(1995)Immunity 3:541-547；Waterhouse etal.,(1995)Science 270:985-988)。CTLA-4调控T细胞活性的分子机制是多方面的，人们认为这些机制内在地在常规T细胞上发生或者通过调节性T细胞(Treg)(Ise et al., (2010)Nat Immunol 11:129-135；Jain et al.,(2010)Proc Natl Acad Sci U S A 107:1524-1528；Paterson and Sharpe,(2010)Nat Immunol 11:109-111)。
这些机制包括与CD28竞争配体结合(Linsley et al.,(1994)Immunity 1:793-801)，包括在APC中诱导致耐受酶吲哚胺2,3-双加氧酶的产生 (Grohmann et al.,(2002)Nat Immunol 3:1097-1101；Onodera et al.,(2009)J Immunol 183:5608-5614)，和从免疫突触中置换CD28(Pentcheva-Hoang et al., (2004)Immunity 21:401-413)。CTLA-4与共刺激分子CD28同源，并享有相同的配体，CD80(B7.1)和CD86(B7.2)，它们在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。然而，APC上的CD80/CD86对效应T细胞上的CD28和CTLA-4的结合的差异导致相反的结果，CD28触发T细胞活化，CTLA-4导致T细胞抑制。APC 上的CTLA-4配体(CD80/86)接合CTLA-4也刺激磷酸酶SHP-1(Guntermann and Alexander,(2002)J Immunol168:4420-4429)和PP2A(Baroja et al.,(2002)J Immunol 168:5070-5078；Chuang etal.,(2000)Immunity 13:313-322)募集到经历活化的T细胞的TCR附近。接下来对TCR相关的关键信号分子的去磷酸化导致T细胞活化终止(Griffin et al.,(2000)J Immunol 164:4433-4442)。此外，促进CTLA-4早期与其配体接合并交联于TCR的干预导致关键的信号签名(signaling signatures)的提前衰减，由此T细胞活化被抑制，导致T细胞低应答或无应答(Blair et al.,(1998)Immunol 160:12-15；Griffin et al.,(2000)J Immunol 164:4433-4442；Krummel and Allison,(1996)J Exp Med 182:459-465； Walunas et al.,(1996)J Exp Med 183:2541-2550)。
为了促进CTLA-4在T细胞活化的早期与TCR交联，生成了一种双特异性融合蛋白(命名为“BsB”)，其包含突变体CD80(CD80w88a)和淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)。BsB被设计为在免疫突触中同时接合CTLA-4和MHCII，由此通过MHCII与TCR的关联性配对来间接地将其与TCR交联(Karman et al., (2012)J Biol Chem epub 2012Feb 15)。在一个同种异体MLR中，显示BsB可有效抑制T细胞活化。令人惊奇的是，BsB还诱导了IL-10和TGF-β产生，并促进了正经历活化的T细胞分化成Treg。IL-10通过其控制巨噬细胞和树突细胞，以及自调控Th1细胞的能力能够广泛地发挥免疫抑制性质(Ohata et al., (2007)Arthritis Rheum56:2947-2956)。TGF-β可充当T细胞分化(Kehrl et al., (1986)J Exp Med 163:1037-1050)，巨噬细胞活化(Tsunawaki et al.,(1988) Nature 334:260-262；Wahl et al.,(1990)Ann N Y Acad Sci 593:188-196)、和树突细胞成熟(Steinman et al.,(2003)AnnuRev Immunol 21:685-711)的抑制物。除了它们的抗炎功能，据称IL-10和TGF-β还能够影响Treg功能。例如，已经显示IL-10能够诱导产IL-10的Tr1细胞(Roncarolo et al.,(2006)Immunol Rev 212:28-50)，并能够作用于Foxp3+ Treg以维持Foxp3的表达，从而扩大它们的抑制功能(Murai et al.,(2009)Nat Immunol 10:1178-1184)。类似地，已经有报道称TGF-β对Treg的诱导(Chen et al.,(2003)J Exp Med 198:1875-1886；Zheng et al.,(2002)J Immunol 169:4183-4189)，以及维持通过促进Fox3表达以维持它们的抑制功能(Marie et al.,(2005)J Exp Med 201:1061-1067)是必要的。
调节性T细胞(Treg)
Treg是功能上独特的T细胞亚群，能够控制针对非自身抗原的免疫应答。 Treg的缺乏导致免疫应答升高和自身免疫性疾病的呈现(Sakaguchi et al., (1995)J Immunol155:1151-1164)。大量的研究已经证明了这些特化的T细胞在控制免疫应答的所有方面中，尤其是在引起自身耐受中的作用。不拘于某一特定理论，这些发现表明能够增强Treg的原位产生、或者Treg的过继转移的作用剂可以用来治疗自身免疫性疾病。实际上，已经证明利用新鲜分离的或离体扩增的Treg进行的基于Treg细胞的疗法可有效地治疗1型糖尿病(T1D)(Tang et al.,(2004)J Exp Med 199:1455-1465；Tarbell et al.,(2007)J ExpMed 204:191-201)和抑制物抗宿主病(Anderson et al.,(2004)；Taylor et al., (2002)Blood 99:3493-3499；Zhao et al.,(2008)Blood 112:2129-2138)的动物模型。作为从外周血或淋巴结分离和扩增Foxp3+CD4+CD25+ Treg(常称为天然 Treg或nTreg)的替代，可以在TCR活化的背景下，在TGF-β的同时存在下从幼稚的CD4+CD25-T细胞诱导Treg。这些Treg常被称为过继性Treg(aTreg)或诱导Treg(iTreg)。它们也是Foxp3+，并且据称可展示与nTreg同样强的抑制功能 (Chen et al.,(2003)J Exp Med 198:1875-1886；Yamagiwa et al.,(2001)J Immunol 166:7282-7289；Zheng et al.,(2002)J Immunol 169:4183-4189)。已经显示在胶原诱导的关节炎的动物模型中aTreg或iTreg的过继性转移可有效地赋予对抗自身免疫性疾病的保护作用(Gonzalez-Rey et al.,(2006)Arthritis Rheum 54:864-876)。然而，越来越明显的是，抗原特异性Treg提供的治疗商 (therapeutic quotient)显著高于具有泛-TCR库的多克隆Treg(Masteller et al., (2005)J Immunol 175:3053-3059；Tang et al.,(2004)J Exp Med 199:1455-1465； Tarbell et al.,(2007)J ExpMed 204:191-201)，而且对泛免疫抑制的潜在副作用更少。由于该原因，我们试图评价BsB在体外抗原特异性T细胞活化环境中在产生抗原特异性Treg方面的相对优劣性。此外，我们在非肥胖糖尿病 (NOD)小鼠中测试了它治疗自身免疫性糖尿病的潜力。
1型糖尿病
1型糖尿病(T1D)是一种由于产胰岛素的胰腺β细胞的组织特异性破坏所致，因而发生高血糖的自身免疫性疾病。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(尤其是雌性小鼠)自发产生针对胰岛特异性自身抗原(例如胰岛素和谷氨酸脱羧酶65) 的自身反应性T细胞。与其他的淋巴细胞相呼应，这些自身免疫性T细胞在3 周到4周龄时启动胰岛周围炎(peri-insulitis)，然后在第9周时发生侵袭性胰岛炎，第12-35周发生自发的显性糖尿病(Anderson andBluestone,(2005)Annu Rev Immunol 23:447-485)。NOD小鼠与人受试者的疾病有许多相似之处，例如胰腺特异性自身抗体的产生和自身反应性CD4+和CD8+ T细胞的活化。和人类中一样，这些小鼠对自身免疫的易感性受到主要组织相容性复合物 (MHC)、CTLA-4、和LAG-3的基因的影响。NOD小鼠携带一种独特的主要组织相容性复合物(MHC)单体型(H-2g7)，据称这种单体型赋予最高的疾病易感性风险(McDevitt et al.,(1996)Hormone andmetabolic research 28:287-288； Wicker et al.,(1995)Annu Rev Immunol 13:179-200)。还在NOD小鼠(Ueda et al.,(2003)Nature 423:506-511)和人(Qu et al.,(2009)Genes and immunity 10 Suppl 1:S27-32)中发现了CTLA-4多态性，且NOD背景下的LAG-3缺陷可加速 T1D发病，外显率达100％(Bettini et al.,(2011)J Immunol 187:3493-3498)。由于BsB接合所有这些靶物，在这种T1D小鼠模型中测试了BsB的治疗价值。
抗体
本发明涵盖权利要求书中所述的抗体的抗原结合片段。如本文中使用的，术语“片段”指完整的全长抗体的部分，如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子如上所述。
本文中使用的术语“片段”是指能够结合特定的靶物，CTLA-4分子或 pMHC复合物，的片段。这些片段可能缺少完整抗体的Fc片段，从循环中清除更迅速，而且可能有相比于完整抗体更少的非特异性组织结合。这些片段可以使用公知的方法从完整抗体制备，例如通过用木瓜蛋白酶(用来产生Fab 片段)或胃蛋白酶(用来产生F(ab’)2片段)等酶来蛋白水解切割，或者通过用重组技术表达这样的片段。
所述抗体和片段也涵盖结合CTLA-4分子或pMHC复合物的单链抗体片段(scFv)。scFv包含一条抗体重链可变区(VH)及与之可操作连接的抗体轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区和轻链可变区一起或个别地形成结合CTLA-4 分子或pMHC复合物的结合位点。scFv可包含位于氨基末端的VH区和位于羧基末端的VL区。或者，scFv可包含位于氨基末端的VL区和位于羧基末端的 VH区。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH是由不同的基因编码的，但通过重组方法可以用合成接头将它们连接起来，使得它们能够作为单一蛋白链制备，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。scFv可任选地还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的多肽接头。
所述抗体和片段还涵盖如Ward,E.S.et al.(1989)Nature 341:544-546中描述的域抗体(dAb)片段，其由VH域组成。
所述抗体和片段还涵盖重链抗体(HCAb)。这些抗体表观上可以仅使用重链可变区形成抗原结合区，因为这些功能性抗体仅是重链的二聚体(称为“重链抗体”或“HCAb”)。相应地，抗体和片段可以是特异性结合CTLA-4或 pMHC靶物的重链抗体(HCAb)。
所述抗体和片段还涵盖对CTLA-4或pMHC靶物特异性的、属于SMIP或结合域免疫球蛋白融合蛋白(binding domain immunoglobulin fusion proteins) 的抗体。这些构建体是单链多肽，包含与执行抗体效应器功能所必须的免疫球蛋白域融合的抗原结合域(见WO2005/017148)。
所述抗体和片段还包含双抗体。它们是二价抗体，其中VH和VL域表达在单一多肽链上，但使用的接头短到不容许同一链上的两个域配对。这强迫这些域与另一条链上的互补域配对，从而形成两个抗原结合位点(参见，例如WO 93/11161)。双抗体可以是双特异性的或者是单特异性的。
根据本发明的抗体或其抗体片段不与除预期的CTLA-4或pMHC靶物之外的任何靶物交叉反应。
所述抗体或其片段可能本身是双特异性的。例如，双特异性抗体可能与单一抗体(或抗体片段)相似，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。双特异性抗体可以用不同的方法制备-诸如化学技术，“多形瘤”(polydoma)技术或重组DNA技术。双特异性抗体可能具有对至少两个不同表位的结合特异性，例如CTLA-4和pMHC靶物上各一个表位。
包含VH和VL区的互补配对的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体包含两对VH和VL，每对VH和VL结合单一抗原或表位。这样的双特异抗体包括杂交瘤(Milstein,C.and Cuello,A.C.,(1983)Nature 305(5934): 537-40),迷你抗体(Hu et al.,(1996)Cancer Res.56:.3055-3061),双抗体 (Holliger et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；WO 94/13804), 螯合性重组抗体(CRAbs)(Neriet al.,(1995)J.Mol.Biol.246,367-373),biscFv (例如Atwell et al.,(1996)Mol.lmmunol.33:1301-1312)，“孔中节”(“knobs in holes”)稳定化抗体(Carter et al.,(1997)Protein Sci.6:781-788)。在所有情况下，每个抗体种类均包含两个抗原结合位点，每个位点都是由一对互补的VH和 VL形成。因此，每个抗体都能够同时结合两个不同的抗原或表位，其中对每个抗原或表位的结合由VH及其互补的VL域所介导。
已经有人描述了多反应性(polyreactive)的天然自身抗体(Casali and Notkins(1989)Ann.Rev.Immunol.7:515-531)，其与至少两个(通常更多)在结构上不相关的不同抗原或表位反应。已经显示利用噬菌体展示技术针对某一单克隆抗体选择随机肽库将会鉴定出一系列与抗原结合位点相适合的肽序列。这些序列中的一些是高度近缘的，符合某一共有序列，而其它的序列则是差异甚大，已有人称其为模拟位(mimotopes)(Lane andStephen(1993) Current Opinion in Immunology 5:268-271)。由此可见，抗体的结合位点，包含结合并互补的VH和VL域，具有结合来自海量已知抗原的多种不同抗原的潜力。
WO 03/002609(Domantis)描述了双重特异性抗体的生产，其中每个VHVL对都具有双重特异性，即能够结合相同或不同抗原上的两个表位。构象可以是开放的或是封闭的；在开放构象中，两个表位可以同时被结合，但在封闭构象中，对第一个表位的结合会防止或阻碍对第二个表位的结合。
自然界中具有多种结合特异性的非免疫球蛋白蛋白是已知的，例如，多种转录因子既结合DNA也结合其他蛋白分子。然而，现有技术中选择结合肽的方法仅选择具有一种，而非两种或多种特异性的肽。不同的研究团队已经将具有半胱氨酸的多肽与合成分子结构扣锁起来(Kemp,D.S.and McNamara, P.E.,(1985)J.Org.Chem.Timmerman,P.et al.,(2005)ChemBioChem. 6(5):821-4)。Meloen及其同事使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化到合成的支架上，以模拟蛋白质表面的结构(Timmerman,P.et al.,(2005)同上)。WO 2004/077062和WO 2006/078161公开了生成候选药物化合物的方法，其中所述化合物是通过将含有半胱氨酸的多肽与分子支架，例如三(溴甲基)苯连接而生成的。WO 2009/098450描述了利用展示技术选择此类分子的方法。在WO 2010/089117中进一步描述了双重特异性的实施方案。
配体，诸如抗体或其片段，可以加以修饰以增加其血清半寿期，例如，通过添加分子，如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖聚合物，来增加半寿期。在一个实施方案中，可以将抗体Fc区添加到根据本发明的双特异性接头，以增加循环半寿期。
抗体生产
抗体生产可以利用任何本领域已知的技术进行，包括在转基因生物如山羊(参见Pollock et al.(1999)J.lmmunol.Methods 231:147-157),鸡(参见 Morrow,KJJ(2000)Genet.Eng.News 20:1-55),小鼠(参见Pollock et al.同上) 或植物中(参见Doran PM(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11:199-204；Ma, JK-C(1998)Nat.Med.4:601-606；Baez,J.et al.(2000)BioPharm.13:50-54； Stoger,E.et al.(2000)Plant Mol.Biol.42:583-590)。抗体还可以通过化学合成制备；但优选的是在宿主细胞中表达编码抗体的基因。
编码抗体的多核苷酸被分离并插入可复制构建体或载体例如质粒中，用于在宿主细胞中进一步增殖或表达。适合于表达根据本发明的人源化免疫球蛋白的构建体或载体(例如表达载体)在现有技术中是可得的。有多种载体可用，包括在宿主细胞中以单拷贝或多拷贝维持的载体，或整合到宿主细胞的染色体的载体。可以将构建体或载体导入合适的宿主细胞，由此可以产生表达人源化免疫球蛋白的细胞并在培养中维持。人源化免疫球蛋白的表达可以使用单一载体或多个载体。
使用常规程序容易地分离和测序编码抗体的多核苷酸(例如，寡核苷酸探针)。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体，其中质粒是典型的实施方式。一般地，这些载体还包括与轻链和/或重链多核苷酸可操作连接的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列以便于表达。编码轻链和重链的多核苷酸可以插入独立的载体中，并同时地或次序地导入(例如，通过转化、转染、电穿孔或转导)相同的宿主细胞，或者，如果希望，可以将重链和轻链插入相同的载体，然后进行这种导入。
可提供启动子以供在合适的宿主细胞中表达。启动子可以是组成型或诱导型的。例如，启动子可以与编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸可操作连接，使其指导被编码的多肽的表达。有多种用于原核和真核宿主的合适启动子可供使用。原核启动子包括用于大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子，3-磷酸甘油酸激酶或其他解糖酶例如烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。真核启动子包括可诱导的酵母启动子，如乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和对氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用负责的酶；RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子例如多形瘤、禽痘和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是即时早期启动子)、逆转录病毒、B型肝炎病毒、肌动蛋白、劳氏肉瘤病毒 (RSV)启动子和早期或晚期猿猴病毒40和非病毒启动子，例如EF-1alpha(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17)：5322)。本领域技术人员将能够选择合适启动子用于表达本发明的人源化抗体或其部分。
当适合时，例如，用于在高等真核生物中表达时，可以包括其他增强子元件，来代替或附加于发现位于如上所述的启动子中的那些。适合的哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。做为选择，人们可以使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多形瘤增强子、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座(参见WO04/009823)。虽然这些增强子一般位于载体上启动子上游的位置，它们也可以位于其它地方，例如在非翻译区域内，或多聚腺苷酸信号的下游。增强子的选择和位置可以基于与用于表达的宿主细胞的兼容性。
另外，载体(例如表达载体)通常包含可选择标志，用于选出携带载体的宿主细胞，并且在可复制表达载体的情况下，选出携带复制起点的宿主细胞。赋予抗生素或药物抗性的基因编码产物是常见的可选择标志，并且可以在原核(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、Tet基因(四环素抗性))和真核细胞 (例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)中使用。二氢叶酸还原酶标志基因允许在多种宿主中用甲氨蝶呤选择。编码宿主的营养缺陷型标志的基因产物(例如LEU2，URA3，HIS3)的基因经常被用作酵母中的可选择标志。还涵盖使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体，以及能够整合到宿主细胞的基因组中的载体如逆转录病毒载体。
在真核系统中，多腺苷酸化和终止信号被可操作连接到编码本发明的抗体的多核苷酸上。这种信号一般位于开放阅读框的3’。在哺乳动物系统中，多腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括来自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如，SV40)基因或逆转录病毒长末端重复者。在酵母系统中，多聚腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括来自磷酸甘油酸激酶(PGK)和乙醇脱氢酶1(ADH)基因者。在原核系统中，一般不需要多腺苷酸化信号，而是通常是采用较短的和更为确定的终止子序列。多聚腺苷酸化/终止序列的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的兼容性。除了以上的之外，可以采用其他特征来增加产量，包括染色质重塑元件，内含子和宿主细胞特异性的密码子修饰。可以对本发明的抗体的密码子利用率加以修饰使之适应宿主细胞的密码子偏好，以增加转录产物和/或产物产率(eg Hoekema Aet al(1987)Mol Cell Biol 7(8):2914-24)。密码子的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的兼容性。
因此，本发明涉及编码本发明的人源化免疫球蛋白或其重链或轻链的分离的核酸分子。本发明还涉及编码所述免疫球蛋白及其链的抗原结合部分的分离的核酸分子。
根据本发明的抗体可以通过，例如，在合适的宿主细胞中表达一种或多种编码所述抗体的重组核酸来制备。宿主细胞可使用任何合适的方法来产生。例如，可以将本文中描述的表达载体(例如一种或多种载体，例如哺乳动物细胞表达载体)导入合适的宿主细胞，然后可以将所得的细胞维持(例如，在培养物中，在动物中，在植物中)在适合于构建体或载体表达的条件下。合适的宿主细胞可以是原核的，包括细菌细胞如大肠杆菌(例如菌株DH5aTM (Invitrogen,Carlsbad,CA),PerC6细胞(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母、曲霉属(Aspergillus)菌种、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，或其它低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞如那些来自于昆虫 (例如Drosophila Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O’Connor))， TN5BI-4(HIGH FIVETM)昆虫细胞(Invitrogen)，哺乳动物(例如COS细胞，如 COS-1(ATCC登录号CRL-1650)和COS-7(ATCC登录号CRL-1651)、CHO(例如ATCC登录号CRL-9096)，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Pr°C.Natl. Acad.Sci.USA，77(7):4216-4220(1980)))、293(ATCC登录号CRL-1573)、HeLa(ATCC登录号CCL-2)、CV1(ATCC登录号CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J. Virol.，54:739-749(1985)，3T3、293T(Pear，W.S.等，Pr°C.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，90:8392-8396(1993))，NSO细胞、SP2/0细胞、HuT 78细胞等，或植物(例如烟草、浮萍(水萍)、和藻类)的细胞。参见例如Ausubel，F.M.等编. Current Prot°Cols in Molecular Biology，GreenePublishing Ass°Ciates and John Wiley&Sons Inc.(1993)。在一些实施方案中，宿主细胞不是多细胞生物(例如植物或动物)的一部分，例如，它是分离的宿主细胞或者是细胞培养物的一部分。
宿主细胞可以培养在旋转烧瓶、摇瓶、滚瓶、波式生物反应器(wave bioreactors)(例如来自wavebiotech.com的System 1000)或空心纤维系统中，但是对于大规模生产而言，优选使用搅拌罐生物反应器或袋式生物反应器(例如，Wave Biotech,Somerset,NewJersey USA)，特别是用于悬浮培养。典型地，搅拌罐生物反应器适合于曝气，例如利用起泡器、挡板或低剪切转子的曝气。对于泡柱和气升生物反应器，可以用空气或氧气泡直接曝气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，可以给培养基补充细胞保护剂，例如pluronicF-68，以帮助防止曝气过程所致的细胞损伤。取决于宿主细胞的特性，可以微载体用作锚基依赖性细胞系(anchorage dependent cell lines)的生长基质，或者可以使细胞适应于悬浮培养。宿主细胞，特别是脊椎动物宿主细胞的培养可以利用多种操作模式，例如分批、补料分批、重复的分批过程(参见Drapeau et al(1994)Cytotechnology 15:103-109)、长期分批过程(extended batch process) 或灌流培养(perfusion culture)。虽然重组转化的哺乳动物宿主细胞可以在含有血清的培养基中，例如包含胎牛血清(FCS)的培养基中培养，但优选的是将这样的宿主细胞在无血清培养基中，如Keen et al(1995)Cytotechnology17:153-163中所公开的无血清培养基，或在可商购的培养基如ProCHO-CDM 或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)中培养，培养基中必要时补充能量来源例如葡萄糖和合成的生长因子例如重组胰岛素。宿主细胞的的无血清培养可能需要适应于在无血清条件中生长的那些细胞。一种导致适应的方法是在含有血清的培养基中培养这种宿主细胞，并重复地将80％的培养基交换为无血清培养基，使得宿主细胞学会适应无血清条件(参见例如，ScharfenbergK.et al(1995)in Animal Cell Technology Developments Towards the 21st Century(Beuvery E.C.et al eds),pp619-623,Kluwer Academic publishers)。
根据本发明的抗体可以被分泌到培养基中，并利用多种技术从培养基中回收和纯化，以提供适于预定用途的纯化程度。例如，与包含治疗性抗体的培养基相比，用于治疗人类患者的本发明的治疗抗体的使用一般需要如还原 SDS-PAGE所测定的至少95％的纯度，更典型地98％或99％纯度。在第一种情况下，来自培养基的细胞碎片一般使用离心、随后通过利用例如微量过滤、超滤和/或深度过滤的上清液澄清步骤来除去。做为选择，抗体可以不预先离心而通过微量过滤、超滤或深度过滤来收获。有各种其他技术可用，例如透析和凝胶电泳和层析技术例如羟基磷灰石(HA)、亲和层析(任选地包括亲和标签系统，例如聚组氨酸)和/或疏水性相互作用层析(HIC)(参见 US5,429,746)。在一个实施方式中，在各种澄清步骤之后使用蛋白A或G亲和层析来捕获本发明的抗体，随后是进一步的层析步骤，例如离子交换和/或 HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析和硫酸铵沉淀。一般地，还采用各种病毒去除步骤(例如纳滤，例如使用DV-20过滤器的纳滤)。在这些不同步骤之后，提供了包含至少10mg/ml或更高、例如100mg/ml或更高的本发明的抗体的纯化的制备物，因而该制品构成本发明的实施方式。100mg/ml 或更高的浓度可以通过超离心来产生。这样的制备物基本上不含聚集形式的本发明的抗体。
细菌系统特别适合于抗体片段的表达。这样的片段定位在细胞内或周质中。对于不溶的周质蛋白，可以提取并根据本领域技术人员已知的方法重折叠形成活性蛋白质，参见Sanchez et al.(1999)J.Biotechnol.72:13-20；Cupit, PM et al.(1999)Lett.Appl.Microbiol.29:273-277。
本发明还涉及包含本发明的核酸，例如载体(如表达载体)的细胞。例如，编码依照本发明的人源化免疫球蛋白的重链和轻链的核酸(即一个或多个核酸)，或包含这样的核酸的构建体(即一个或多个构建体，例如一个或多个载体)，可以通过对所选的宿主细胞适宜的方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)导入合适的宿主细胞，该核酸与或将要与一个或多个表达控制元件(例如在载体中，在通过细胞内的过程创建的构建体中，整合到宿主细胞基因组中) 可操作连接。宿主细胞可以维持在适合于表达的条件下(例如在诱导物、补充有适宜盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的合适培养基的存在下)，使得被编码的多肽得以产生。如果期望，可以将编码的人源化抗体分离，例如从宿主细胞、培养基、或乳汁分离。该过程包括了在转基因动物或植物(例如烟草)的宿主细胞(例如乳腺细胞)中表达(参见例如WO92/03918)。
CD80配体
CD80配体的设计和构建的意图是使配体对CTLA-4的特异性相比于对 CD28的特异性最大化。CD80的序列是本领域已知的，例如在Wu et al.,1997 中有引证。CD80包含一个细胞外的类Ig-V可变域，和一个细胞内的类IgC恒定域。在一个优选的实施方案中，使用CD80的细胞外域作为配体。例如，见SEQ ID NO:15，尤其是残基1-241。
可以在人CD80中制造突变以改善结合亲和力、以及改善相比于CD28对 CTLA-4的选择性。参见，例如，Wu et al.,1997。
可以制造W84A之外的突变，包括K71G,K71V,S109G,R123S,R123D, G124L,S190A,S201A,R63A,M81A,N97A,E196A。见Peach et al.,JBC 1995. 270(6):21181-21187。突变体对CTLA-4和CD28的结合亲和力的评估可以通过如下实现：进行定点诱变，然后表达突变多肽，再利用CTLA-4和CD28Biocore 芯片通过表面等离子共振来测定Kd。参见例如Guo etal.,(1995)J.Exp.Med. 181:1345-55。
可以选择具有有利的结合和选择性规律的突变体，然后在基于细胞的测定法中进一步评估。例如，可以利用流式细胞术来测定转染到细胞中的野生型或突变体CD80的作用。
LAG-3配体
LAG-3在现有技术中已有描述，而且对MHC蛋白的结合位点已得到表征。参见Huardet al.,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(11):5744-9。LAG-3 具有四个细胞外Ig样域，可以向这些域中导入突变来最优化对MHCII的结合。
突变的有效性可以如上文就CD80配体所述的那样进行分析。
在一个实施方案中，LAG＝3的四个Ig样域中只有域1和域2(D1和D2)被用于依照本发明的配体中。据信这些域负责与MHCII蛋白的相互作用。
双特异性配体构建体
双特异性配体的构建依照通式“配体—接头—配体”来进行。双特异性抗体是本领域已知的，在上文中已有描述。
双特异性配体的构建优选涉及构建和表达编码期望多肽的合适基因。其他构建方法包括在允许共价、离子或疏水键合的条件下混合两个多肽。在优选的实施方案中，其包括共价键合这些多肽。当构建包含三个组分的双特异性分子，例如CTLA-4配体、接头和MHC配体时，可以将三者中的两者混合、结合到一起，然后将第三个多肽添加到该融合产物并结合，从而产生包含所有三个多肽的融合产物。
依照本发明的多肽可以通过任何期望的技术，包括化学合成、从生物样品分离、或者表达编码此类多肽的核酸，来加以制备。而核酸可以合成或者从生物来源分离，而且如果期望可以通过定点诱变来修饰。
因此，本发明涉及编码依照本发明的双特异性配体、或其片段的载体。所述载体可为，例如，噬菌体、质粒、病毒、或逆转录病毒载体。
依照本发明的核酸可以是含有用于在宿主中扩增的选择标志的载体的一部分。通常而言，质粒载体以沉淀物，例如磷酸钙沉淀物，或者与带电脂质的复合物的形式被导入。
如果载体是病毒，它可以在体外用合适的包装细胞系加以包装，然后转导到宿主细胞中。
核酸插入物与合适的启动子可操作连接，所述载体例如λ噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac,trp,phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子，以及逆转录病毒LTR的启动子。本领域技术人员知道其他的合适启动子。所述表达构建体还包含用于转录起始、终止的位点，以及，在被转录的区域中，包含用于翻译的核糖体结合位点。这些构建体所表达的转录物的编码部分优选包含位于要翻译的多肽的起始位置的起始密码子，和位于要翻译的多肽的末尾合适位置处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如已指出的，表达载体可能优选地包含至少一个选择标志。这样的选择标志包括四氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，用于真核细胞培养；和四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因，用于培养大肠杆菌和其他细菌。合适的宿主的代表性例子包括，但不限于，细菌细胞，诸如大肠杆菌，链霉属 (Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞；诸如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞诸如果蝇 (Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞如CHO、COS、 HEK293、和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。
用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的，并且可以通过商购获得。
优选用于细菌的载体包括pQE70,pQE60和pQE-9，可获自QIAGEN,Inc.；pBluescript载体,Phagescript载体,pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A，可获自StratageneCloning Systems,Inc.；和ptrc99a,pKK2233,pKK233-3,pDR540, pRIT5，可获自PharmaciaBiotech,Inc。优选的真核载体包括pWLNEO, pSV2CAT,p0G44,pXTI和pSG，，可获自Stratagene；和pSVK3,pBPV,pMSG 和pSVL，，可获自Pharmacia。优选用于哺乳动物细胞表达的载体包括pSG5 载体,pCMV·SPORT6,pcDNA,pCEP4,pREP4,pCI,pSI和pBICEP-CMV。优选用于酵母系统中的表达载体包括，但不限于pYES2,pYDI,pTEFI/Zeo, pYES2/GS,pPICZ,pGAPZ,pGAPZalph,pPIC9,pPIC3.5,pHILD2,pHIL-SI, pPIC3.5K,pPIC9K,和PA0815(都可获自Invitrogen,Carlsbad,CA)。
将构建体导入宿主细胞中可以通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，感染，或其他方法来实现。这样的方法在许多常规实验室手册中，例如上文援引的Sambrook et al.中有描述。可以通过公知的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和几丁质层析来从重组细胞培养物中回收并纯化根据本发明的多肽。更优选的是，使用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。
还可以从生物来源，包括体液、组织和细胞，尤其是来自受试者的肿瘤组织或疑似肿瘤组织的细胞，回收依照本发明的多肽。
此外，可以使用本领域已知的技术(例如参见Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y.,and Hunkapiller etal.,(1984)Nature,310:105-111)来化学合成依照本发明的多肽。例如，通过利用肽合成仪，可以合成包含依照本发明的双特异性配体的全部或一部分的多肽。
依照本发明的双特异性配体在本文随附的SEQ ID NO中有详细说明。 SEQ ID NO:1和2提供了如下所述的双特异性配体的小鼠替身DNA (surrogate DNA)和蛋白序列，所述双特异性配体中CTLA-4配体和CD80w88a 与MHC配体LAG-3配对，并且被IGg2a Fc区和一个Gly-9(G9)序列所分隔。在C末端提供末端His标签(H6)序列。SEQ ID NO:3和4提供了这样的构建体的小鼠替身DNA和蛋白序列：该构建体与SEQ ID NO:1和2相同，只是IgG2a Fc区被置于LAG-3多肽之C末端侧，从而CD80和LAG-3肽仅被G9隔开。这两种布置，其中Fc区位于配体之间或配体C端侧，分别命名为基因1构建体和基因2构建体。SEQ ID NO:5和6提供了其中保守了野生型序列的人DNA和蛋白序列。没有进行突变，无论是对CD80还是对LAG-3。在SEQ IDNO:7和8中，对人CD80进行了W84A突变(等同于小鼠中的W88A)，且对LAG-3进行了 R75E突变。其他SEQ ID NO(NO 7-14)描述了CD80和LAG-3序列中的其他突变。
治疗应用
在许多有必要免疫抑制的情况下，和/或在发生了自身免疫状况的情况下，抑制T细胞活性是期望的。相应地，在涉及不适宜或不期望的免疫应答的疾病如炎症、自身免疫，以及涉及这些机制的状况的治疗中，有必要靶向 CTLA-4/MHC相互作用。在一个实施方案中，这样的疾病或病症是自身免疫和/或炎症疾病。此类自身免疫和/或炎症疾病的例子如上所述。
在一个实施方案中，这样的疾病或病症是1型糖尿病(T1D)。
在另一个实施方案中，应用依照本发明的配体，通过免疫抑制受试者来帮助移植。此类应用可缓解移植物抗宿主病。现有的移植物抗宿主病的治疗的描述可见Svennilson,(2005)Bone Marrow Transplantation 35:S65–S67，以及其中引证的参考文献。有利的是，可以将本发明的抗体与其他可用的疗法组合使用。
关于自身免疫性疾病的治疗，组合疗法可包括将本发明的配体与药物一起施用，所述药物与该配体一同构成预防或治疗此类自身免疫性疾病的有效量。当所述自身免疫病是1型糖尿病时，组合疗法可包含一种或多种可促进胰腺β细胞生长或增强β细胞抑制的作用剂，例如β细胞生长或存活因子或免疫调节抗体。当所述自身免疫病是类风湿性关节炎时，所述组合疗法可包含下述的一种或多种：甲氨蝶呤，抗TNF-α抗体，TNF-α受体-Ig融合蛋白，抗 -IL-6、或抗-IL17或抗-IL-15或抗-IL-21抗体，非甾体抗炎药(NSAID)，或缓解疾病的抗风湿药(DMARD)。例如，额外的作用剂可为生物作用剂，诸如抗-TNF剂(例如
Figure BDA0001497978520000301
英夫利昔单抗(
Figure BDA0001497978520000302
和阿达木单抗
Figure BDA0001497978520000303
或利妥昔单抗
Figure BDA0001497978520000304
当所述自身免疫性疾病是造血移植排斥时，可以施用造血生长因子(如红细胞生成素,G-CSF,GM-CSF,IL-3,IL-11,血小板生成素,等等)或抗微生物剂(如抗生素、抗病毒药、抗真菌药)。当所述自身免疫性疾病是银屑病时，额外的作用剂可以是下述的一种或多种：阿片树胶(tar)或其衍生物、光疗、皮质类固醇、环胞素A、维生素D类似物、甲氨喋呤、 p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)抑制剂，以及生物作用剂诸如抗-TNF-α剂和
Figure BDA0001497978520000305
当所述自身免疫性疾病是炎性肠病(IBD)诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎时，额外的作用剂可以是下述的一种或多种：氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素、或生物制剂如
Figure BDA0001497978520000306
和
Figure BDA0001497978520000307
组合治疗可以按照本领域技术人员视为必要或方便的任何方式来实施，而且为本说明书的目的，不考虑任何关于组合中要使用的化合物的次序、量、重复次数或相对量的限制。因此，用于治疗的依照本发明的抗体可以配制为药物组合物。本发明也涉及包含依照本发明的肽的药物组合物。
药物组合物
在一个优选的实施方案中，提供药物组合物，其包含依照本发明的双特异性配体，或者一种或多种能够通过本发明的前述方面中定义的测定法鉴定的配体。配体可以是如本文所讨论的免疫球蛋白、肽、核酸或小分子。在下面的讨论中将它们称为“化合物”。
依照本发明的药物组合物是这样的物质组合，其包含一种或多种能够调节T细胞活性的化合物作为有效成分。典型地，所述化合物的形式是任何药学上可接受的盐，或者，例如，当适宜时，是它的类似物、游离碱形式、互变异构体、对映异构体、外消旋化合物、或其组合。预期包含依照本发明的有效成分的药物组合物的有效成分当以根据具体情况而定的量施用时，可发挥优秀的治疗活性(例如在移植物抗宿主病中)。
在另一个实施方案中，一种或多种本发明的化合物可以与本领域公知的适于在任何前述状况的治疗中治疗特定适应证的化合物组合使用。因此，可以将一种或多种本发明的化合物与一种或多种本领域公知的、已知适于治疗前述适应证的化合物组合，从而可以向受试者施用简便的单一组合物。可以调整给药方案以提供最优的治疗应答。
例如，可以每日施用数个分割的剂量，或者可以视治疗状况的紧急程度按比例地减少剂量。
活性成分可以按照方便的方式施用，例如通过口服、静脉内(当其为水溶性时)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径，或植入(例如利用缓释分子)。
取决于施用途径，活性成分可能需要包被到某种材料中以保护所述成分免受酶、酸、和其他可能使所述成分失活的天然条件的作用。
为了通过非胃肠施用之外的途径施用有效成分，可以将有效成分用防止其失活的材料包被或者与防止其失活的材料一起施用。例如，可以将有效成分在佐剂中施用、与酶抑制剂共同施用、或在脂质体中施用。“佐剂”以其最宽泛的意义使用，包括任何免疫刺激性化合物，诸如干扰素。本文考虑的佐剂包括间苯二酚类(resorcinols)、非离子型表面活性剂诸如聚氧乙烯油基醚，以及正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂(pancreatic trypsin)。
脂质体包括水包油包水(water-in-oil-in-water)CGF乳液，以及常规的脂质体。
活性成分还可以通过非胃肠道或腹膜内施用。
悬液还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中制备，以及在油中制备。在通常的贮存和使用条件下，这些制备物包含防腐剂以防止微生物生长。
适于可注射用途的药物形式包括无菌水性溶液(当可溶于水时)或分散液，和用于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，而且以容易通针为限，必须是液体，其在制造条件下必须是稳定的，并且必须在防止细菌和真菌等微生物的污染作用的条件下保存。载体可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)、它们的合适的混合物、以及植物油的溶剂或分散介质。合适的流动性可以通过例如下述方式来维持：使用包衣，如卵磷脂；在分散剂的场合，通过维持必要的颗粒大小；以及通过使用表面活性剂。
防止微生物作用可以由各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来实现。在特定情况下，理想的是包含等张剂，例如糖或氯化钠。在可注射组合物中使用可延迟吸收的作用剂，如单硬脂酸铝和明胶，能够延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液通过将要求量的活性成分、以及上文列举的各种其他成分(视需要)纳入合适的溶剂中，然后进行过滤除菌来制备。一般而言，分散液是通过将经灭菌的活性成分纳入含有基本分散介质和所述的其他成分(选自上述列举的那些)的无菌媒介(vehicle)来制备的。在无菌粉末的情况下，为了制备无菌可注射溶液，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从包含活性成分加上任何其他期望的组分的预先经无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他期望的组分。
如本文中使用的，“药学可接受的载体和/或稀释剂”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等等。为药学活性物质使用此类介质和作用剂是本领域公知的。除非任何常规介质或作用剂与活性成分不兼容，否则考虑任何常规介质或作用剂在治疗组合物中的使用。组合物中还可以纳入补充的活性成分。特别有利的是，将非胃肠组合物配制成剂量单位的形式，以方便施用和使剂量均一。如本文中所使用的，剂量单位形式是指物理上离散的单位，这些单位被调整为供要治疗的受试者使用的单元(unitary)剂量；每个单位含有据计算可以产生期望的治疗效果的预定量的活性材料，以及与之一起的所需的药物载体。新的剂量单位形式的规格可取决于并依赖于(a)活性材料的独特特征以及希望获得特定治疗效果，和(b)现有技术中对于为了治疗具有损害身体健康的疾病状态的活体受试者的疾病而配合这样的活性材料的内在限制。
将主要的活性成分与合适的药学可接受载体配合成单位剂型，以便方便、有效地以有效量进行施用。在含有补充活性成分的组合物的情况下，通过参考所述成分的通常剂量和施用方式来确定剂量。
为了帮助肽化合物(包括抗体)对细胞的投递，可以对肽加以修饰以改善它们跨越细胞膜的能力。例如，US 5,149,782公开了使用致融合肽、形成离子通道的肽、膜肽、长链脂肪酸和其他膜掺混剂(membrane blending agents) 来增加蛋白质的跨细胞膜转运。这些方法以及其他方法在WO 97/37016和US 5,108,921(通过援引并入本文)中也有描述。
在另一个方面，提供了如上文定义的本发明的活性成分用于单独治疗疾病或与现有技术中已知适于治疗特定适应证的公知化合物联合治疗疾病。因此，提供了本发明的活性成分用于制造用于治疗与异常免疫应答相关的疾病的药物的用途。
此外，提供一种治疗与异常免疫应答相关的状况的方法，包括对受试者施用治疗有效量的可通过如上所述的测定方法鉴定的配体。
仅出于示例说明的目的，在下面的实施例中进一步说明本发明。
实施例
实施例1
设计可接合CTLA-4并将其藉由MHC11与TCR交联的双特异性融合蛋白
为了生成可选择性和激动性地接合CTLA-4并同时将其与TCR连接的双特异性融合蛋白，将可结合CTLA-4但对CD28的亲和力最小的突变型CD80 (CD80w88a,后文中称为CD80wa)(Wu et al.,1997)与LAG-3融合，LAG-3是 MHCII的一种天然配体(Baixeras etal.,1992；Triebel et al.,1990)。使用一个由 9个甘氨酸组成的接头将CD80wa与LAG-3连接起来，而LAG-3则与小鼠 IgG2a的Fc部分搭接，据信这样可增加其循环半寿期(图1A)。响应于具有此种构型的配体，预期会通过在早期T细胞活化的过程中在免疫突触中形成三分子复合物(CTLA-4/MHCII/TTCR)而间接发生CTLA-4接合和对TCR的连接 (图1B)。从概念上说，在免疫突触的语境之外，双特异性融合蛋白对单独 CTLA-4或MHCII、或CTLA-4或MHCII二者的结合应该不会导致T细胞活性的抑制。CD80wa对CTLA-4的接合被设计为藉由募集磷酸酶到CTLA-4的胞质尾巴而触发CTLA-4信号传导。同时，意图通过LAG-3对MHCII的结合将CTLA-4带入到关联TCR的附近，关联TCR在免疫突触中结合pMHCII复合物 (图1B)。预期这两个结合事件的组合会将抑制信号输送给TCR。还构建了包含CD80wa和IgG2a Fc的对照融合蛋白(图1A)，其应该不能将CTLA-4与TCR 交联(图1C)，因为它缺少LAG-3。
将测试融合蛋白和对照融合蛋白在中华仓鼠卵巢细胞中表达，然后用蛋白G柱通过亲和色谱加以纯化。利用大小排阻色谱去除聚集体。将测试双特异性融合蛋白(CD80wa-LAG-3-Fc)称为BsB(核苷酸序列：SEQ ID NO.3；氨基酸序列：SEQ ID NO:4)，对照构建体(CD80wa-Fc)称为BsBΔ(核苷酸序列： SEQ ID NO.16；氨基酸序列：SEQ ID NO:17)。如预期的，两种融合蛋白在非还原性SDS-PAGE凝胶上都表现为二聚体(BsB,200kDa；BsBΔ140kDa)，而在还原性SDS-PAGE凝胶上都表现为单体(BsB,100kDa；BsBΔ70kDa)。使用针对LAG-3和CD80的抗体进行Western印迹进一步确认了它们的身份。
实施例2
BsB在同种异体混合淋巴细胞反应中抑制T细胞活化。
在一个同种异体淋巴细胞混合反应中通过测量IL-2产生评估了BsB和 BsBΔ抑制T细胞活化的相对能力。在有或无BsB或BsBΔ存在的条件下，将从 BALB/c小鼠纯化的幼稚CD4+CD25-CD62L高CD44低 T细胞与从C57BL/6小鼠分离的APC混合。纳入小鼠IgG2a和CTLA-4Ig(一种共刺激抑制物，结合 CD80/86并阻断它们对CD28的结合)，分别作为阴性和阳性对照。在混合淋巴细胞反应中纳入BsB而非BsBΔ抑制了IL-2产生，尽管抑制的程度不及 CTLA-4Ig(图2)。这种差异可能是BsB介导的T细胞抑制晚于CTLA-4Ig-介导的抑制发生的结果。更具体地说，对于BsB而言，抑制仅在T细胞活化、继而CTLA-4上调之后才发生。BsBΔ无法减少IL-2产生强烈暗示仅有CTLA-4接合不足以阻止T细胞活化，因为还需要同时交联TCR。为了排除BsB的LAG-3 部分在T细胞抑制中起作用的可能性，在本测定法中测试了LAG-3Ig，并确认了其不抑制T细胞活化。
实施例3
BsB指导T细胞向Treg分化。
已经显示，由于抗原刺激停止而导致的TCR信号传导过早终止、mTOR 信号传导的抑制、由于抗原亲和力低而未达到最优的TCR刺激，或者T细胞活化过程中共刺激弱等原因可诱导Foxp3+表达，并使T细胞分化偏向Treg表型(Delgoffe et al.,(2009)Immunity 30:832-844；Haxhinasto et al.,(2008)J.Exp. Med.205:565-574；Sauer et al.,(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:7797-7802)。鉴于BsB可强迫活化诱导的CTLA-4(activation-induced)提前接合TCR，继而导致TCR信号传导弱化，还评估了BsB产生Foxp3+Treg的能力。将从Foxp3-EGFP敲入小鼠(Haribhai et al.,(2007)J.Immunol 178:2961-2972)制备的幼稚CD4+CD62L高GFP”T细胞在BsB或BsBΔ的存在下与经LPS处理的同种异体APC混合。培养5日后对细胞的流式细胞术分析揭示在BsB处理的细胞中有大量的CD4+CD25+GFP+ T细胞(图3A，左边中间小图)，但在小鼠IgG2a处理的细胞中(图3A，左边上部小图)或BsBΔ对照处理的细胞中(图3A，左边底下小图)都没有，提示这些CD4+CD25+GFP+ T细胞是Foxp3+ Treg。为了验证该发现，收集细胞培养基并测定特征Treg细胞因子：IL-10和 TGF-β(Cools et al.,(2008)J.Cell Mo/.Med.12:690-700)。在BsB处理的细胞的培养基中检出了大量的IL-10和TFG-β(图3A,左边的各小图)但在BsBΔ或 mIgG2a处理的细胞的培养基中则没有。令人惊奇的是，CTLA-4Ig没有诱导 GFP+ Treg的生成，也没有诱导IL-10与TGF-β产生。不拘于任何具体理论，CTLA-4lg降低T细胞应答的机理与BsB不同。LAG-3Ig单独或与BsBΔ组合也未能诱导GFP+ Treg的生成，提示BsB介导的CTLA-4与TCR的交联是Treg诱导所必需的。
实施例4
BsB诱导Treg需要自刺激的TGF-β
在BsB处理后同时检测到IL-10和TGF-β的升高水平提示了这样的可能性，即这些细胞因子，尤其是TGF-β，在帮助Treg生成中发挥作用(图3A)。为考察这一点，在5天时间内收集培养基，分析细胞因子和Foxp3+ Treg含量。早在处理后第2天就检测到了升高的IL-10和TGF-β水平，而Foxp3+ Treg在第3 天之后检出。不拘于具体理论，推定的由BsB刺激的内源TGF-β产生与Treg 分化有牵连。向Treg诱导测定系统中添加抗TGF-β抗体(克隆1D11)完全阻断了Foxp3+ Treg的出现，但同种型对照IgG(克隆13C4)则不然(图3B)。不拘于具体理论，BsB导致的CTLA-4提前接合以及随后CTLA-4与TCR的交联刺激了内源TGF-β产生，而内源TGF-β产生则促进Treg分化。先前已有报道称 CTLA-4与TCR的交联可诱导TGF-β产生(Chenet al.,(1998)J.Exp.Med. 188:1849-1857)，虽然在本研究中未评估Treg分化。
Treg在数种自身免疫病的动物模型中在调节疾病表现方面已显示出相当大的治疗潜力。但是，迄今为止被强调的是诱导出的Treg针对相关抗原的特异性的重要性。不会在自身抗原特异性反应性T细胞(autoantigen-specific reactive T cells)的背景下针对某种特定的自身抗原被活化的非抗原特异性 Treg(Non-antigen specific Tregs)据推测没有功能性的免疫抑制作用。因此，对于治疗这些疾病，有助于生成大量的抗原特异性Treg的手段是非常令人期望的。而且，相比于利用体外分化或扩增的Treg进行过继性转移，更优选有助于原位(例如对于T1D，在胰腺的胰岛；对于溃疡性结肠炎或克罗恩氏病，在固有层(lamina propria))从头诱导(de novo induction)抗原特异性Treg的手段。
实施例5
BsB诱导的Treg以细胞-细胞接触依赖性的方式发挥功能性抑制作用
为了评估BsB诱导的Treg是否有功能性抑制作用，将BsB诱导的Treg和 TGF-β诱导的Treg(作为对照)使用荧光活化细胞分选(FACS)进行纯化，并与不同比例的CFSE标记的同基因应答T细胞以及同种异体APC混合。将细胞在 transwell或常规培养孔中共培养三天，然后利用流式细胞术分析应答T细胞的增殖。如图5A中总结的，BsB诱导的Treg和TGF-β诱导的Treg在常规培养孔中培养时几乎都完全抑制了应答T细胞的增殖。BsB诱导的Treg的抑制活性的强度与TGF-β诱导的Treg相仿。与之对照的是，当在transwell中将T细胞与Treg 分离时，无论是BsB产生的Treg或是TGF-β产生的Treg都没有显著抑制应答T 细胞的增殖。不拘于任何理论，Treg抑制活性依赖于细胞-细胞接触而不是由分泌的细胞因子或其他因子介导的。对该观点构成支持的是，在常规培养孔中纳入针对IL-10的抗体(克隆JES5-2A5)没有影响BsB诱导的Treg或TGF-β诱导的Treg的抑制活性(图5B)。添加针对TGF-β1D11的抗体也没有影响BsB诱导的Treg的抑制活性，虽然部分地减少了TGF-β诱导的Treg所致的抑制(图 5B)。
实施例6
BsB指导OT-II T细胞分化成抗原特异性Treg。
由于发现一种包含CD80wa和LAG3、可将CTLA-4与TCR交联(藉由 MHCII)的双功能融合蛋白(BsB)能在同种异体MLR中诱导Foxp3+ Treg的产生，考察了BsB引发抗原特异性Treg产生的潜力。为了研究这一问题，从携带编码针对一种鸡卵清蛋白肽(323-339)(Barnden et al.,1998)的TCR(α-和β- 亚单位)的转基因的转基因小鼠纯化幼稚OT-II T细胞，并在Ova323-339的存在下与同基因APC混合。培养5天后，在经过BsB处理的OT-II T细胞(图4A，左边中间小图)中检出的Foxp3+ Treg的量显著大于mIgG对照处理的(图4A，左边上部小图)或CTLA-4Ig处理的OT-II T细胞(数据未显示)。在培养物中纳入抗TGF-β抗体则该Treg诱导作用被抑制(图4A，左边底下小图)。不拘于特定理论，分化是由内源产生的TGF-β以自分泌或旁分泌方式所介导的。在BsB 处理的细胞的培养基中，IL-2的水平下降，而IL-10和TGF-β的水平增加(图 4A，右边各小图)。
为了监测诱导出的Treg的增殖活性，在OT-II细胞上预加载荧光示踪剂 CFSE。如图4B所示，从CFSE信号的稀释可确定BsB诱导的Foxp3+ Treg有增殖性(proliferative)。如预料的，添加共刺激阻断物CTLA-4Ig减少了T细胞增殖。由此可见，BsB在同种异体MLR和抗原特异性环境中都能够抑制T细胞活化并诱导Treg产生。
实施例7
BsB诱导Treg可能涉及AKT/mTOR信号传导途径的弱化。
新近的报道表明AKT和mTOR信号传导途径在T细胞命运的决定中起着重要作用。T细胞中组成性活性AKT的存在以雷帕霉素敏感的方式减少Treg 分化(Haxhinasto et al.,2008)，提示AKT和mTOR信号传导途径相互交叉以影响Treg命运。此外，mTOR缺陷的T细胞分化成Treg比正常对照T细胞更快 (Delgoffe et al.,(2009)Immunity 30:832-844)。还报道了共刺激分子 PD-1/PD-L1在控制适应性Treg发生(adaptive Treg development)中发挥拮抗 AKT/mTOR的必要作用(Francisco et al.,(2009)J.Exp.Med.206:3015-3029)。为了确定BsB介导的Treg诱导中是否也牵涉这些途径，将抗CD3和抗CD28抗体在96孔板上与BsB、mIgG或PD-L1共固定，将幼稚T细胞接种到该平板上。活化后18小时，用针对磷酸化AKT和mTOR的荧光标记抗体将细胞染色，并用流式细胞术分析。BsB和PD-L1共固定弱化了AKT和mTOR二者的磷酸化 (图6)。不拘于特定理论，在T细胞活化的过程中，CTLA-4和PD-L1抑制分子介导的信号传导事件可能在AKT/mTOR信号传导途径上的某点汇合以调控 Treg分化。
实施例8
对BsB的暴露可维持被诱导的Treg中的Fox3+表达。
不同于完全定型的(fully committed)天然Treg，体内诱导的Treg据报道稳定性较差，在缺少原先的诱导物(例如TGF-β或视黄酸)的条件下长期培养时可能丧失Foxp3+表达(Selvaraj and Geiger,(2007)J.lmmunol.178:7667-7677)。在本研究中，BsB诱导的Treg显示了类似的不稳定性，一些细胞在重复培养后丧失了Foxp3表达(图7)。为了测试用BsB再刺激是否能够延长Foxp3表达，首先通过用抗-CD3/抗-CD28抗体和BsB包被96孔板诱导了Treg。然后将经纯化的Treg在有或无BsB存在下再进行一轮培养。用BsB再刺激纯化的Treg能够维持大的Foxp3+ Treg群体(总Treg的～93％)(图7，右下小图)，与之相比，响应IgG对照的Foxp3表达为～40％(图7，右上小图)。
实施例9
BsB在小鼠中的药动学
在用自身免疫性疾病动物模型测试BsB的治疗用处之前，确定了BsB的药动学规律以帮助设计体内的给药方案。C57BL/6小鼠腹膜内注射BsB导致循环水平的可测量的上升，然后迅速清除，估计的血浆半寿期(t1/2)为～12小时(图8A)。该规律是出人预料的，因为含Fc的融合蛋白或抗体的药动学通常时间更长。由于抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的结合是它们半寿期长的主要原因(Roopenian and Akilesh,2007)，比较了BsB和一种对照IgG2a结合FcRn的相对能力。图8B显示这两种蛋白质对FcRn的结合特征非常相似，表明BsB对 FcRn的结合的缺陷不太可能是BsB从循环迅速清除的原因。
BsB的迅速清除的另一个可能的解释是由于它被非靶细胞上的糖受体所攫取。这样的受体包括肝细胞上的无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)(Weigel,1994)和网状内皮系统(reticuloendothelial system) 的内皮细胞和巨噬细胞上的甘露糖受体(Pontow et al.,1992)。利用NetNGlyc 服务器分析BsB提示其具有每个分子包含多达10个天冬酰胺连接的寡糖侧链的潜力(图9)。单糖组成分析显示BsB含有大约37个甘露糖残基，而且所有预测的天冬酰胺连接的糖基化位点可能都已被使用，因为这些天冬酰胺连接的寡糖聚糖含有具备三个甘露糖残基的核心甘露糖结构(总共30个甘露糖残基)。此外，还可能存在少量的高甘露糖型寡糖来解释多余的甘露糖残基的去向。实际上，对从该蛋白质释放的泛甲基化(permethylated)聚糖的质谱鉴定了显著量的低唾液酸化(under-sialylated)三触角和四触角型天冬酰胺连接 (tri-and tetra-antennaryasparagine-linked)寡糖，以及一些高甘露糖型寡糖。这种预测也与SDS-PAGE分析显示的BsB分子量100kDa相一致；而BsB的计算得到的分子量是80kDa。这些寡糖的存在合起来贡献了分子量的差异(20 kDa)。此外，BsB显示唾液酸对半乳糖的比例为0.68(图9)，表明这些聚糖的唾液酸化不完全。不拘于特定理论，糖介导的ASGPR对BsB的清除对BsB从循环的迅速清除有贡献。
实施例10
用BsB短期治疗延迟了NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的发病
由于BsB在体外诱导Treg的EC50估计为大约100nM，且其循环半寿期短 (t1/2为～12h)，因此在NOD小鼠中以晚期预防范式(late prevention paradigm)测试BsB。当NOD小鼠为9-12周龄时，以短时间间隔(每隔一天，历时四周)对其施用BsB。该年龄的小鼠已经明显有自身反应性T细胞和胰岛炎，但尚未发生显性糖尿病。如图10A所示，与盐水处理的对照相比，用BsB处理2周的 NOD小鼠的血液中的Foxp3+ Treg数目显示有限的、但统计学显著的增加 (25％)。但是，Treg的这种增加是瞬时性的，因为在治疗4周之后以及更晚的时间点不能检测到Treg数目的差异。先前已有人提到用抗CD3抗体处理NOD 小鼠后在淋巴器官中有类似的Treg瞬时增加(Nishio et al.,2010)。不拘于特定理论，BsB诱导的Treg可能在治疗停止后变回Foxp3-T细胞。它们还可能已被特定的靶组织(例如胰腺)募集以执行其功能。无论如何，这项按照晚期预防处理范式进行的短期BsB处理似乎有限地延迟了疾病发作并减少了表现显性 T1D的小鼠数目(图10B)。
所观察到的有限应答可能是由于治疗开始前的9周龄NOD小鼠中存在活动的胰岛炎。已经证明，炎性环境有利于活化T细胞向Th17细胞转化，而抑制它们向Treg转化。还已经证明，炎症因子如IL-6或IL-4可抑制Treg转化并促进Treg中Foxp3+表达的丧失(Carettoet al.,2010；Kastner et al.,2010；Koenen et al.,2008)。为了回避这些难题，在更早的年龄(4周)，在明显的自身反应性T 细胞和胰岛素炎的诱导发生之前，开始处理NOD小鼠。该研究中还纳入了 CTLA-4Ig作为阳性对照，因为Bluestone及其同事(Lenschow et al.,1995)已经显示在这种模型中使用这种作用剂有好处；除了盐水之外还使用mIgG2a作为额外的阴性对照。与更年长的小鼠中的结果(图10A)形成对照的是，在用BsB 处理2周的更年幼的NOD小鼠的外周血中Foxp3+ Treg的数目相对于施用盐水或mIgG的小鼠没有增加(图11A)。不拘于特定理论，这可能是由于在4周龄 NOD小鼠(相对于早先的研究中使用的9-12周龄的小鼠)自身反应性T细胞的数目非常低。诱导出的抗原特异性Treg的数目可能过小而不足以表现出高于这些动物中存在的基础水平。在24周龄之前，与盐水处理的对照相比，施用 BsB的NOD小鼠中T1D的发生率显著更低(图11B)。但在更晚的时间点，这种有益效果减少。
与有关施用CTLA-4Ig的NOD小鼠的报道(Salomon et al.,2000)一致，血液中Treg的水平(图11A)被显著压低，推测这可能是由于CTLA-4Ig对 CD28/B7信号传导的作用(Tanget al.,2003)。CTLA-4Ig处理还加重了疾病：与盐水处理和mIgG处理的对照(图11B)相比，小鼠显示出更早的疾病发作(图 11B)和更高的疾病外显率。这些实验结果与Bluestone及其同事(Lenschow et al.,1995)报道结果的差异的原因不明，但有可能是由于所用的CTLA-4Ig或者采用的给药方案的差异所致。在本研究中，使用10mg/kg剂量的人CTLA-4Ig(Orencia)，而非Bluestone及其同事使用的2.5mg/kg小鼠CTLA-4Ig。而且， BsB处理未持续超过7周。不拘于特定理论，更高剂量的CTLA-4Ig的使用提供了对Treg内稳态所需的共刺激信号的更完全的阻断。
实施例11
更长期的BsB处理显著延迟了NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的发病并减少了自身免疫性糖尿病的发生率。
早前的研究观察到NOD小鼠中BsB应对疾病取得的有益效果有限，其可能的原因包括：采用的疗程相对较短，BsB诱导Treg产生的效力有限(EC50> 100nM)，还有BsB的循环半寿期短，可能限制了BsB暴露。鉴于BsB的效力和循环半寿期是该分子固有的性质，因而难以轻易改变，测试了更长的疗程。为此目的，当NOD小鼠为4周龄时，用BsB处理10周而非4周。如图12A所示，用BsB处理10周的NOD小鼠显示出T1D发作显著延迟。重要的是，到35周龄为止，BsB处理的NOD小鼠只有～13％发生了T1D，相比之下，在盐水处理的对照中超过70％。由此可见，用BsB更长时间处理NOD小鼠似乎保护了这些动物免于发生自身免疫性糖尿病。
在研究结束时(当小鼠为35周龄时)，处死小鼠，采集它们的胰腺用于组织病理学分析。将相邻的系列切片用H&E染色以进行胰岛整体评估，用抗胰岛素抗体探查所述切片以检测β-细胞中胰岛素的存在，并用抗CD3和抗Foxp3 抗体对所述切片双染色以定位T细胞和Treg。由于NOD小鼠的遗传异质性，未处理的动物中有少数在35周龄时未发生疾病。对这些非糖尿病动物(来自盐水处理组的)的胰岛的分析显示β-细胞完整，没有淋巴细胞浸润或胰岛炎的明显证据(图12B，小图a-c)。在这些小鼠的胰岛中存在少量Foxp3+ Treg细胞 (小图c中的箭头)。与之相对的是，来自糖尿病NOD小鼠(来自盐水处理组的) 的胰岛显示出侵袭性胰岛炎的存在(图12B，小图d)和β-细胞的完全破坏(小图 e)。除了CD3+ T细胞和Foxp3+Treg之外，还明显有大量的非T细胞淋巴细胞 (图12B，小图f)。对于相应的经BsB处理的、在研究结束时保持无疾病或者在研究过程中发生了T1D的小鼠，发现了相似的组织病理学结果。有趣的是，在～50％的经BsB处理而保持无糖尿病的NOD小鼠的胰岛中发现了胰岛周围炎的证据(图12B，小图g)；然而，β-细胞得到完好保持(图12B，小图h)。抗体染色提示，这些胰岛周围的细胞主要包含CD3+ T细胞和Treg(图12B，小图 i)。将图像的一部分放大(图12B，小图i中的红色方框)清楚显示了许多Foxp3+ Treg的存在(图12B，小图j中的黄色箭头)，其间散布有非Foxp3+但CD3+的T 细胞(图12B，小图j中的黑色箭头)，以及非T细胞的单核细胞(蓝色细胞核)。在年幼的(4-10周龄)NOD小鼠中(Anderson and Bluestone,2005)，以及在经过其他有效治疗剂处理而延迟或逆转了NOD小鼠中新发病T1D的更年长小鼠中(Chatenoud et al.,1994；Daniel et al.,2011；Simon et al.,2008；Vergani et al.,2010)已经观察到胰岛周围炎的发生。因此，用BsB更长期地处理NOD小鼠保护了这些动物免于发生侵袭性胰岛炎和显性T1D。不拘于特定理论，这至少部分是由胰岛抗原特异性的Treg的从头(并且可能是原位)诱导所介导的。
使用新的双特异性融合蛋白(BsB)藉由MHCII交联CTLA-4和TCR，高效地诱导了抗原特异性Treg的产生，以及抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的产生。先前的研究显示，Treg对于赋予免疫耐受是关键的，且抗原特异性Treg在自身免疫性疾病的动物模型中更有效。在自身免疫性疾病如T1D的动物模型中进一步对BsB进行了评价。不拘于特定理论，提出这样的假说，即如果在NOD 小鼠中BsB在自身反应性T细胞活化的早期促进了抗原特异性Treg的诱导，则它能够通过将正在经历活化的自身反应性T细胞转化成Treg而延迟疾病的发病或者阻止疾病的进展。
虽然BsB显示的效力有限(由于其对MHC-II和TCR的亲和力不高)，且循环半寿期短(这限制了它的暴露)，但对幼龄NOD小鼠(4-6周龄)和年龄更大的 NOD小鼠(9-12周龄)进行短期处理，可重复地延迟了这些NOD小鼠中T1D的发病。但观察到的有益效果是有限的，而且不能持续。用BsB更长期地(10 周)处理NOD小鼠(4-13周龄)显著延迟了疾病发病，并减少了动物中T1D的发生率。不拘于特定理论，该有益效果是诱导Treg的从头生成所带来的，这些诱导Treg或是局部产生的(例如在胰腺中或在胰腺引流淋巴结中)，或者是远位产生后被募集到胰腺的，用来保护胰岛免受自身反应性T细胞或其他非T 细胞的白细胞的破坏。对于用BsB处理后保持无糖尿病的35周龄小鼠的胰腺组织切片的免疫组化染色清楚地表明在胰岛的周围有Foxp3+ Treg数目的增加。直观上，它们似乎在防止CD3+ T细胞和非T细胞的淋巴细胞进入胰岛。在经BSB处理后在研究结束时保持无糖尿病的NOD小鼠的胰岛中有～50％观察到了该现象，但对照组中糖尿病动物的胰岛中无一观察到该现象。在对照组中少数无糖尿病小鼠的胰岛保持没有淋巴细胞浸润且无胰岛炎。已知由于 NOD小鼠的遗传异质性，在如此大小的组中，总是有少数动物在该时间范围内不会发生糖尿病。在BsB处理组中其余的～50％的无糖尿病动物中，胰岛也没有淋巴细胞浸润且无胰岛炎。这些小鼠的无病状态的可能原因包括BsB处理以及遗传背景。
与组织病理学所见一致的是，与未处理的对照相比，在BsB处理的动物 (在9-12周龄处理)的血液中检测到了Foxp3+ Treg数目的较小但统计学显著的增加。在更小的年龄(4周龄)开始处理的小鼠中，该增加不明显。不拘于特定理论，这可能是因为9周龄小鼠中经历活化的自身反应性T细胞比4周龄小鼠中更多。4周龄小鼠中自身反应性T细胞的低水平可能导致无法检出对现存的 Treg环境中的诱导Treg之外的诱导Treg。Treg的增加也是瞬时性的。由于在接受抗CD3治疗的动物中也观察到类似的现象(Nishio et al.,2010)，可能是诱导的Treg不稳定，丧失了Foxp3的表达。更可能的是，Treg从循环中被募集到了受影响的靶组织。与之对比的是，用CTLA-4Ig处理的NOD小鼠显示循环 Treg数目显著减少。处理还加重了疾病，表现在疾病发病加快，且显示显性疾病的动物的发生率更高。与该结果一致的是，先前报道显示，Treg内稳态牵涉共刺激途径，且共刺激的缺乏可减少Treg的产生。在NOD小鼠中阻断或敲除CD80或CD86也导致T1D更早发病(Salomon et al.,2000；Tang et al.,2003)。
通常在4-9周龄的NOD小鼠的胰腺中观察到胰岛周围炎的出现。如果不加控制，继而发生侵袭性胰岛炎，导致β-细胞完全破坏，在12-35周龄发生显性糖尿病。已用BsB处理10周，并在35周龄进行分析的无糖尿病NOD小鼠的胰腺显示出胰岛周围炎的进展似乎已被阻止的证据。未见侵袭性胰岛炎或产胰岛素的β-细胞被过度破坏的征象。有其他报道描述了在NOD小鼠中类似地延迟或防止疾病的不同治疗介入(Shoda et al.,2005)。这里的结果与Lee et al. (2010)报道的结果最为类似，后者显示，与施用含有CD4+CD25+ Treg的总 CD4+T细胞的雌性NOD/SCID小鼠相比，将致糖尿病性的耗竭了CD4+CD25+ Treg的CD4+CD25-BDC2.5 T细胞转移到雌性NOD/SCID小鼠中加速了侵袭性胰岛炎的发生。侵袭性胰岛炎大体上主要是树突细胞(DC)、而非BDC2.5 T 本身的浸润。作者基于其研究推测，Treg通过调节(至少部分地调节)DC响应于胰岛分泌的趋化因子CCL19和CCL21的趋化性来调控DC向胰岛中的侵袭性。在BsB处理的无糖尿病NOD小鼠的胰腺切片中见到的Foxp3+ Treg、CD3+ T细胞和非T细胞白细胞的免疫组化染色模式与他们的发现相一致(图12B)。不拘于特定理论，NOD小鼠中响应于BsB而产生的Treg可能发挥作用以阻止自身反应性T细胞和非T细胞淋巴细胞向胰岛中迁移。用BsB进行的更长期处理更为有效，因为该处理生成了更稳健、持续的Treg诱导。该观点得到了下述事实的支持：在细胞培养物中用BsB连续刺激诱导的Treg延长了Treg中 Foxp3+的表达(Karman et al.,2012)。
在自身免疫性疾病或器官移植动物模型中使用新鲜分离的、离体扩增的或体外诱导的Treg进行的细胞疗法已经显示，Treg过继性转移能够恢复Treg 对效应T细胞的平衡，从而控制与这些疾病相关的高度自身免疫(Allan et al., 2008；Jiang et al.,2006；Riley et al.,2009；Tang et al.,2012)。但是，使用过继性转移作为治疗策略在临床应用上还面临若干难题。首先，能够从人受试者的外周血分离的自体Treg的数量有限。因此往往需要进行大量的Treg离体扩增，这可能改变Treg的功能性和纯度。其次，由于分离的Treg是多克隆的，它们可能对非目标的效应T细胞产生泛免疫抑制作用。第三，也是最重要的，Treg的可塑性(plasticity)是不容忽视的挑战(Bluestone et al.,2009；Zhou et al.,2009a)。已经证明，过继转移的Treg可丧失Foxp3表达并重新分化为Th17细胞 (Koenen etal.,2008)或致病性记忆T细胞(Zhou et al.,2009b)，这会提高加重自身免疫或炎症的风险。因此，能够在原位以抗原特异性方式诱导Treg生成的治疗手段比过继性Treg细胞疗法更为有利。本文中提供的结果展示了这样的一种可在小鼠T1D模型的背景下将CTLA-4与MHCII交联的作用剂(BsB)的实用性和有效性。响应于BsB处理共同显示IL-10、TGF-β和Treg的产生，以及在T1D的NOD小鼠模型中的功效，有可能提供一种新的治疗构思。相比于其他免疫调节剂BsB还提供其他优势，因为其不影响静息T细胞(resting T cells) 或其他淋巴细胞。在我们的所有研究中，外周中的CD4+ T细胞和CD19+B细胞的数目和百分比保持不变。不拘于特定理论，该手段能够有效地延迟或者阻止疾病进展。更强力且具有更有利的药动学规律的BsB变体的开发应能验证这些研究。因此，该构思可能也可应用于其他免疫介导的疾病的管理。
除非另有说明，本文中报道的结果是使用下述方法和材料获得的。
动物.雌性野生型C57BL/6(H-2b),BALB/c(H-2d),在C57BL/6遗传背景下表达对鸡卵清蛋白323-339(Ova323-339)特异性的小鼠α-链和β-链T细胞受体的转基因OT-II小鼠，以及雌性非肥胖糖尿病(NOD/LtJ)小鼠购自The Jackson Laboratory。动物维持在无病原体设施中，依照美国卫生部颁布的指南(NIH Publication No 86-23)和Genzyme的内设动物照看和使用委员会颁布的指南进行研究。
抗体和试剂.功能级或荧光标记的抗小鼠CD3(克隆145-2C11)、CD25、胰岛素和Foxp3+抗体购自eBioscience或BD Biosciences。小鼠CTLA-4-Fc和人 CTLA-4Ig(Orencia)分别购自R&D Systems,Inc.和Bristol-Myers Squibb。小鼠 IgG2a同种型对照获自BioXCell Inc.。CFSE、超低Ig胎牛血清(FBS)、以及其他细胞培养基来自Invitrogen。鸡Ova323-339肽获自New England Peptide。
双特异性融合蛋白BsB的构建和产生.如前人所述(Karman et al.,2012) 构建和表达双特异性融合蛋白(BsB)，其包含CD80w88a和LAG-3的胞外域，以及小鼠IgG2a的Fc(CD80wa-LAG-3-Fc,BsB)。
Biacore测定和单糖组成分析.利用Biacore来比较BsB和mIgG2a的对小鼠新生儿Fc受体(FcRn)的结合。简而言之，利用胺化学将～1430RU的小鼠 FcRn-HPC4固定化于CM5芯片。每个样品在PBSP(含0.005％表面活性剂P-20 的PBS),pH 6.0中1:2系列稀释到最终浓度为200-6.25nM，然后一式二份用时 3min注射，再用解离缓冲液洗涤3min。用10mM硼酸钠和1M NaCl,pH 8.5 再生表面。根据Zhou等人描述的规程(Zhou et al.,2011)分析BsB的碳水化合物单糖组成(carbohydrate monosaccharide composition)。
幼稚T细胞的分离.来自8-12周龄雌性BALB/c或OT-II小鼠的脾脏和淋巴结的幼稚T细胞通过磁力分离后续荧光激活细胞分选来加以纯化。细胞首先通过磁力细胞分离(Miltenyi Biotech)进行负选择，然后作为 CD4+CD25-CD62L高CD44低细胞加以分选，至纯度高于98％。
抗原特异性Treg诱导测定.在同种异体MLR环境中的测定如前人报道 (Karman etal.,2012)那样实施。对于抗原特异性T细胞活化，在圆底96孔平板中将105个幼稚OT-II T细胞与105个经辐射的同基因APC在0.5μg/ml的 Ova323-329和1μg/ml的可溶性抗-CD28(克隆37.51，eBioscience)的存在下混合。以饱和浓度100μg/ml向培养细胞中加入测试构建体、小鼠IgG2a或小鼠 CTLA-4Ig。将细胞培养5天以诱导Treg的产生，并通过流式细胞术分析。收集培养基，使用ELISA试剂盒根据制造商的说明分析IL-2、IL-10和TGF-β。为了评估T细胞增殖，用5μM CFSE将纯化的幼稚OT-II T细胞在37℃标记5 min。然后洗涤它们以去除未结合的CFSE，并如上所述地将它们用于Treg诱导测定。将细胞培养5天以让它们分裂，然后通过流式细胞术分析。为了检测T细胞中的Foxp3+，如上所述对细胞进行表面标志物染色，然后用Fix/Perm 缓冲液(eBioscience)透化，并用缀合有PE-Cy7的抗Foxp3抗体(克隆FJK-16s, eBioscience)染色。
BsB在小鼠中的药动学测量.测定了8周龄C57BL/6小鼠中BsB的药动学。通过腹膜内注射将20mg/kg的BsB施用到小鼠中。在施用后1小时、5小时、24小时、48小时和72小时通过隐静脉取血收集血液。利用ELISA测定测量每个时间点的BsB水平。简而言之，将100μl溶于PBS的抗小鼠CD80抗体 (1μg/ml)包被到96孔平板上，并在4℃温育过夜。用5％胎牛血清将平板封闭1 h，然后用PBS洗涤4次。然后向孔中加入100μl不同稀释度的血样。将平板在轻柔震荡下室温温育2小时，并用PBS洗涤4次。加入生物素化的抗小鼠 LAG-3抗体(1μg/ml)并温育2小时。用PBS将平板洗涤4次，然后加入链亲和素-HRP。30min后，用PBS将平板洗涤6次，再对平板显色以进行比色测量。使用在测定稀释剂中稀释到不同浓度的纯化BsB作为标准物。
用BsB处理NOD小鼠.在短期处理中，将4周龄的雌性NOD小鼠用盐水、 20mg/kgBsB、20mg/kg小鼠IgG2a、或10mg/kg人CTLA-4Ig(Orencia)通过腹膜内注射每周处理3次，历时2.5周。对于晚期预防模型，将9-12周龄NOD小鼠用盐水或20mg/kg BsB如上所述地处理4周。对于更长期的处理，将NOD 小鼠从4周龄到13周龄用BsB或盐水如上所述地处理10周。从8周龄开始每周监测非空腹血液葡萄糖水平。当小鼠的葡萄糖读数连续3次读数均高于300mg/dL时则认为小鼠有糖尿病。在处理2周之后通过流式细胞术检查外周血中的Foxp3+Treg。简而言之，将50μl全血用未标记的抗-FcγRIIb和FcgRIII(克隆93,eBioscience)封闭20min。然后用荧光标记的抗CD4抗体将细胞染色30 min，然后洗涤。使用FACS裂解溶液(BD Biosciences)裂解红细胞5min。洗涤之后，将细胞固定、透化，并用FITC标记的抗-Foxp3抗体如上所述地染色 30min。将胰腺切为两半，一半在中性缓冲液福尔马林中固定，另一半置于 OCT化合物上然后在干冰上冷冻。
统计学分析.利用Prism 5(Graphpad,city and state)中的秩和(Cox-Mantel)检验比较用BsB或对照处理之后表现T1D和高血糖的NOD小鼠的累积发生率。认为p<0.05是统计学显著的。
组织病理学分析.对于中性缓冲液福尔马林固定的胰腺，使用自动化处理器进行CD3、Foxp3+细胞染色。组织切片用二甲苯-乙醇脱蜡，在柠檬酸缓冲液中温育25min修复抗原，然后用血清封闭。将玻片与抗-CD3抗体温育45 min，然后与山羊抗兔辣根过氧化物酶聚合物温育20min。通过与3,3’-二氨基联苯胺四盐酸温育2-4min获得CD3的生色团可视化。为了监测Foxp3+，用血清再次封闭切片，然后暴露于抗-Foxp3抗体45min。然后将玻片与兔抗大鼠IgG抗体温育30min，然后与山羊抗兔碱性磷酸酶聚合物温育。用Fast Red 10 min实现生色团可视化。组织切片用苏木精复染2min，在步骤之间用0.05％ Tween-20/Tris缓冲盐水洗涤3次。用抗胰岛素抗体如上所述地对邻近的系列切片染色。使用附带有DiagnosticInc.产的数字照相机的Nikon Eclipse E800 荧光显微镜拍照，并使用Spot Advanced软件捕捉图像。
序列
图例
CD80w88a＝CTLA-4配体
IgG2a＝IgG2Fc区
G9＝Gly 9
Lag-3＝MHC配体
H6＝His 6
SEQ ID NO.1:
CTLA-4BsB(基因1)＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474)- G9-Lag-3(aa25-260)-H6
小鼠替身构建体(基因1)的核苷酸序列:
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTC CATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAA GTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAG GTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAG ACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTG CTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCG GGGCACATACAGCTGTGTCGTFCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATG AAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTC TACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAG GATTACCTGCTTTGCTFCCGGGGGITTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGT TGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGG ATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACG ACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATFAAATATGGAGATGCTCACG TGTCAGAGGACTTCACCTGGGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCC TGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCG TCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAG CCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGA TGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTACTCACAGCTCA GACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAG TGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAA ATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCA TCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGC CTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGC ATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAAC AACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGA CTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAA GAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTA AAGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGGTGGGCCTGGGAAAGAGCT CCCCGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGAGCTCCCGTCCATCTTCCCTGCAG CCTCAAATCCCCCAACCTGGATCCTAACTTTCTACGAAGAGGAGGGGT TATCTGGCAACATCAACCAGACAGTGGCCAACCCACTCCCATCCCGGC CCTTGACCTTCACCAGGGGATGCCCTCGCCTAGACAACCCGCACCCGG TCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGCTCCAGGAGGCCTGCGCAGCGGGA GGCAGCCCCTGCATCCCCACGTGCAGCTGGAGGAGCGCGGCCTCCAG CGCGGGGACTTCTCTCTGTGGTTGCGCCCAGCTCTGCGCACCGATGCG GGCGAGTACCACGCCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGCCCTCTCCTGC AGTCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGATGATTGCTAGTCCCTCA GGAGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTTTGAACTGCTCCTTCAGCC GTCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACTGGTTCCAGGGCCAGAACCGAG TGCCTGTCTACAACTCACCGCGTCATTTTTTAGCTGAAACTTTCCTGTT ACTGCCCCAAGTCAGCCCCCTGGACTCTGGGACCTGGGGCTGTGTCCT CACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCACGTACAACCTCAAGGTT CTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCACCATCACCATCATCACTGA
SEQ ID NO.2:
CTLA-4BsB(基因1)＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474)- G9-Lag-3(aa25-260)-H6
小鼠替身构建体(基因1)的翻译的蛋白序列:
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKV LLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNT TYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNIT ESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTIS SQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLL GGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLT AQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTI SKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNG KTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLH NHHTTKSFSRTPGKGGGGGGGGGGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSP NLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLS VAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVR LPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHW FQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSIT YNLKVLGLEPVAHHHHHH
SEQ ID NO.3:
CTLA-4BsB(基因2)＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-G9-Lag-3(aa25-260)- IgG2a(aa241-474)
小鼠替身构建体(基因2)核苷酸序列:
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTC CATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAA GTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAG GTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAG ACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTG CTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCG GGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATG AAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTC TACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAG GATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGG TTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAG GATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATAC GACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCAC GTGTCAGAGGACTTCACCTGGGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGGCGG TGGGCCTGGGAAAGAGCTCCCCGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGAGCTC CCGTCCATCTTCCCTGCAGCCTCAAATCCCCCAACCTGGATCCTAACTT TCTACGAAGAGGAGGGGTTATCTGGCAACATCAACCAGACAGTGGCCA ACCCACTCCCATCCCGGCCCTTGACCTTCACCAGGGGATGCCCTCGCCT AGACAACCCGCACCCGGTCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGCTCCAGG AGGCCTGCGCAGCGGGAGGCAGCCCCTGCATCCCCACGTGCAGCTGG AGGAGCGCGGCCTCCAGCGCGGGGACTTCTCTCTGTGGTTGCGCCCAG CTCTGCGCACCGATGCGGGCGAGTACCACGCCACCGTGCGCCTCCCGAACCGCGCCCTCTCCTGCAGTCTCCGCCTGCGCGTCGGCCAGGCCTCGA TGATTGCTAGTCCCTCAGGAGTCCTCAAGCTGTCTGATTGGGTCCTTTT GAACTGCTCCTTCAGCCGTCCTGACCGCCCAGTCTCTGTGCACTGGTT CCAGGGCCAGAACCGAGTGCCTGTCTACAACTCACCGCGTCATTTTTT AGCTGAAACTTTCCTGTTACTGCCCCAAGTCAGCCCCCTGGACTCTGG GACCTGGGGCTGTGTCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATC ACGTACAACCTCAAGGTTCTGGGTCTGGAGCCCGTAGCCCCCAGAGGG CCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCT TGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACT CATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGC GAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGAACAACGTGGAA GTACTCACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACT CTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGT GGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAGCGCC CATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCAC AGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGG TCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTG AACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAG AGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGCTCAG TGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCC GGACTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.4:
CTLA-4BsB(基因2)＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-G9-Lag-3(aa25-260)- IgG2a(aa241-474)
小鼠替身构建体(基因2)的翻译的蛋白序列:
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKV LLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVAPEYKNRTLYDNT TYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNIT ESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTIS SQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWGGGGGGGGGGPGKELPVV WAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQ GMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWL RPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVL LNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGT WGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGP SVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVLTAQT QTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKP KGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTE LNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHH TTKSFSRTPGK
SEQ ID NO.5:
CTLA-4BsB人构建体野生型核苷酸序列＝(人CD80(aa1-234)- G9-Lag-3(aa27-262-IgGla(aa240-471)
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCA TACCTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTG TTCAGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGTCCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCA TCTACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGG ACATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCAC TAATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGC ACATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGG GAACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACA CCTAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAAT TTGCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGA AAATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTTCCCAAGATCC TGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACA ACCAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGA ATCAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGT GGCGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGC TCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAG CCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTG GCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACC CGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCCGCCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAG CCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTC GCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCG CCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGC GCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAG CCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCC AGCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGT CCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCC CCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTA CAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGT CTGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA
SEQ ID NO.6:
CTLA-4BsB人构建体野生型翻译的蛋白序列＝(人CD80(aa1- 234)-G9-Lag-3(aa27-262-IgGla(aa240-471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNL SIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSK LDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPW WAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAP GPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDF SLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA SDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQ VSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.7:
CTLA-4BsB人构建体变体核苷酸序列1＝(人 CD80W84A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgGlaN596/297Q (aa240-471)
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATAC CTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTC AGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGT CCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCT ACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGAC ATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTA ATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCAC ATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGA ACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACC TAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTT GCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAA ATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTG AAACTGAGCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAAC CAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAAT CAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGG CGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTC CTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCC TTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGC CCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCG GCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGC CCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCG CTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCC GCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGC CTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCA GCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTC CGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCC CAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTAC AGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTC TGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA
SEQ ID NO.8:
CTLA-4BsB人构建体变体翻译的蛋白序列1＝(人 CD80W84A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgGlaN596/297Q (aa240-471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKNRTIFDITNNL SIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVSSK LDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVV WAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAP GPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDF SLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA SDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQV SPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPS PAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.9:
CTLA-4BsB人构建体变体核苷酸序列2＝(人 CD80W84A/S190AS201A(aal-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-
IgGlaN596/297Q(aa240-471)
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATAC CTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTC AGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGT CCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCT ACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGAC ATGAATATAGCCCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTA ATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCAC ATACGAGTGTGTTGTICTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGA ACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACC TAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTT GCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAA ATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTG AAACTGAGCTCTATGCTGTTGCCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAAC CAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAAT CAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGG CGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTC CTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCC TTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGC CCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCG GCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGC CCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCG CTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCC GCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGC CTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCA GCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTC CGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCC CAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTAC AGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTC TGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA
SEQ ID NO.10:
CTLA-4BsB人构建体变体翻译的蛋白序列2＝(人 CD80W84A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN59 6/297Q(aa240-471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIAPEYKNRTIFDITNNL SIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETELYAVASK LDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVV WAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAP GPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDF SLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA SDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQV SPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPS PAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.11:
CTLA-4BsB人构建体变体核苷酸序列3＝(人 CD80E196A/5190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN596/297 Q(aa240-471)
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATAC CTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTC AGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGT CCTGTGGTCACAATGTTTCTGTTGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCT ACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGAC ATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTA ATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCAC ATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGA ACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACC TAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTT GCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAA ATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTG AAACTGCCCTCTATGCTGTTAGCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAAC CAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAAT CAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGG CGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTC CTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCC TTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGC CCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCG GCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGC CCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCG CTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCC GCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGC CTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCA GCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTC CGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCC CAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTAC AGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTC TGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA
SEQ ID NO.12:
CTLA-4BsB人构建体变体翻译的蛋白序列3＝(人 CD80E196A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1
aN596/297Q(aa240-471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNL SIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVSSK LDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVV WAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAP GPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDF SLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA SDVVVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQ VSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSP PSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.13:
CTLA-4BsB人构建体变体核苷酸序列4＝(人 CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1a
N596/297Q(aa240-471)
ATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACCATCCAAGTGTCCATAC CTCAATTTCTTTCAGCTCTTGGTGCTGGCTGGTCTTTCTCACTTCTGTTC AGGTGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAAGTGGCAACGCTGT CCTGTGGTCACAATGTTTCTGYFGAAGAGCTGGCACAAACTCGCATCT ACTGGCAAAAGGAGAAGAAAATGGTGCTGACTATGATGTCTGGGGAC ATGAATATATGGCCCGAGTACAAGAACCGGACCATCTTTGATATCACTA ATAACCTCTCCATTGTGATCCTGGCTCTGCGCCCATCTGACGAGGGCAC ATACGAGTGTGTTGTTCTGAAGTATGAAAAAGACGCTTTCAAGCGGGA ACACCTGGCTGAAGTGACGTTATCAGTCAAAGCTGACTTCCCTACACC TAGTATATCTGACTTTGAAATTCCAACTTCTAATATTAGAAGGATAATTT GCTCAACCTCTGGAGGTTTTCCAGAGCCTCACCTCTCCTGGTTGGAAA ATGGAGAAGAATTAAATGCCATCAACACAACAGTTGCCCAAGATCCTG AAACTGCCCTCTATGCTGTTGCCAGCAAACTGGATTTCAATATGACAAC CAACCACAGCTTCATGTGTCTCATCAAGTATGGACATTTAAGAGTGAAT CAGACCTTCAACTGGAATACAACCGGCGGTGGCGGCGGAGGCGGTGG CGGTTCCGGAGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTC CTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCC TTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGC CCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCG GCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCGAGCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGC CCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCG CTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCC GCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGC CTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCC TCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCA GCCTCTGTGCATTGGTTTCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTC CGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCC CAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTAC AGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTC TGCTGGTGCCCCGGGGCTCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CAAGCCCACCGAGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCCTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCTCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTATACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA
SEQ ID NO.14:
CTLA-4BsB人构建体变体翻译的蛋白序列4＝(人 CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN59 6/297Q(aa240-471)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNL SIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDF EIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVAQDPETALYAVASK LDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTGGGGGGGGGSGAEVPVV WAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTINQHQPDSGPPAAAPGHPLAP GPHPAAPSSWGPRPERYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDF SLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRA SDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQV SPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLLVPRGSEPKSCDKTHTSPPS PAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.15
人CD80
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREHLAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAVSSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPRCRERRRNERL RRESVRPV
SEQ ID NO.16
BsBΔ(CD80wa-Fc)DNA＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474)
小鼠替身构建体的核苷酸序列(BsBΔ；CD80wa-Fc):
atggcttgcaattgtcagttgatgcaggatacaccactcctcaagtttccatgtccaaggctcattcttctctttgtgctgc tgattcgtctttcacaagtgtcttcagatgttgatgaacaactgtccaagtcagtgaaagataaggtattgctgccttgcc gttacaactctcctcatgaagatgagtctgaagaccgaatctactggcaaaaacatgacaaagtggtgctgtctgtcat tgctgggaaactaaaagtggcgcccgagtataagaaccggactttatatgacaacactacctactctcttatcatcctg ggcctggtcctttcagaccggggcacatacagctgtgtcgttcaaaagaaggaaagaggaacgtatgaagttaaac acttggctttagtaaagttgtccatcaaagctgacttctctacccccaacataactgagtctggaaacccatctgcagac actaaaaggattacctgctttgcttccgggggtttcccaaagcctcgcttctcttggttggaaaatggaagagaattacc tggcatcaatacgacaatttcccaggatcctgaatctgaattgtacaccattagtagccaactagatttcaatacgactc gcaaccacaccattaagtgtctcattaaatatggagatgctcacgtgtcagaggacttcacctgggagcccagaggg cccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctc caaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatggtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgac ccagatgtccagatcagctggttcgtgaacaacgtggaagtactcacagctcagacacaaacccatagagaggatt acaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatg caaggtcaacaacaaagccctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctcc acaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagactt catgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagt cctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagct actcctgctcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaagg cggtggcggcggaggcggtggcggtgggcctgggaaagagctgggtctggagcccgtagcccaccatcaccat catcactga
SEQ ID NO.17
BsBΔ(CD80wa-Fc)蛋白＝小鼠CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474)
小鼠替身构建体的翻译蛋白序列(BsBΔ；CD80wa-Fc):
macncqlmqdtpllkfpcprlillfvllirlsqvssdvdeqlsksvkdkvllpcrynsphedesedriywqkhdk vvlsviagklkvapeyknrtlydnttysliilglvlsdrgtyscvvqkkergtyevkhlalvklsikadfstpnitesg npsadtkritcfasggfpkprfswlengrelpginttisqdpeselytissqldfnttrnhtikclikygdahvsedft weprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspmvtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevl taqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkalpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeem tkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvhe glhnhhttksfsrtpgkggggggggggpgkelglepvahhhhhh
其他实施方案
从前面的描述容易看出，可以对本申请中描述的发明进行变化和修改，以将其适用于不同的用途和条件。这样的实施方案也落入随附的权利要求的范围。
本申请中对变量的任何定义中记载的要素列表均包括将该变量限定为该要素列表中的任何单一要素或要素的组合(或子组合)。本文中对某个实施方案的记载均包括该实施方案作为单一实施方案或者与任何其他实施方案或其他实施方案的部分的组合。
本申请通过援引并入本说明书中提到的所有专利和出版物，其程度如同具体地通过援引一一并入每个单独的专利和出版物。
参考文献
本文引证了下述文件。
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序列表
<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)
ZHU, Yunxiang
KARMAN, Jozsef
WEI, Ronnie
JIANG, Canwen
CHEN, Seng
<120> T细胞活化的抑制剂
<130> 20868US(300232)
<150> US 61/503,282
<151> 2011-06-30
<150> PCT/US2012/045017
<151> 2012-06-29
<160> 17
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠替身构建体(基因1)的核苷酸序列
<400> 1
atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg 60
ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa 120
caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctcctcat 180
gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc 240
attgctggga aactaaaagt ggcgcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact 300
acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc 360
gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc 420
atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact 480
aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa 540
aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg 600
tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc 660
attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggagcccag agggcccaca 720
atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 780
ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catggtcaca 840
tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gttcgtgaac 900
aacgtggaag tactcacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 960
cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020
tgcaaggtca acaacaaagc cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 1080
gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 1140
aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 1200
tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 1260
gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 1320
aatagctact cctgctcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1380
ttctcccgga ctccgggtaa aggcggtggc ggcggaggcg gtggcggtgg gcctgggaaa 1440
gagctccccg tggtgtgggc ccaggaggga gctcccgtcc atcttccctg cagcctcaaa 1500
tcccccaacc tggatcctaa ctttctacga agaggagggg ttatctggca acatcaacca 1560
gacagtggcc aacccactcc catcccggcc cttgaccttc accaggggat gccctcgcct 1620
agacaacccg cacccggtcg ctacacggtg ctgagcgtgg ctccaggagg cctgcgcagc 1680
gggaggcagc ccctgcatcc ccacgtgcag ctggaggagc gcggcctcca gcgcggggac 1740
ttctctctgt ggttgcgccc agctctgcgc accgatgcgg gcgagtacca cgccaccgtg 1800
cgcctcccga accgcgccct ctcctgcagt ctccgcctgc gcgtcggcca ggcctcgatg 1860
attgctagtc cctcaggagt cctcaagctg tctgattggg tccttttgaa ctgctccttc 1920
agccgtcctg accgcccagt ctctgtgcac tggttccagg gccagaaccg agtgcctgtc 1980
tacaactcac cgcgtcattt tttagctgaa actttcctgt tactgcccca agtcagcccc 2040
ctggactctg ggacctgggg ctgtgtcctc acctacagag atggcttcaa tgtctccatc 2100
acgtacaacc tcaaggttct gggtctggag cccgtagccc accatcacca tcatcactga 2160
<210> 2
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠替身构建体(基因1)的翻译的蛋白序列
<400> 2
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe
1 5 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser
20 25 30
Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp
35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val
65 70 75 80
Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Ala Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser
100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr
115 120 125
Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp
130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr
145 150 155 160
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe
165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile
180 185 190
Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp
195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225 230 235 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
260 265 270
Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
275 280 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
290 295 300
Leu Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
370 375 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385 390 395 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
420 425 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
435 440 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Lys
465 470 475 480
Glu Leu Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Val His Leu Pro
485 490 495
Cys Ser Leu Lys Ser Pro Asn Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Arg Gly
500 505 510
Gly Val Ile Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Gln Pro Thr Pro Ile
515 520 525
Pro Ala Leu Asp Leu His Gln Gly Met Pro Ser Pro Arg Gln Pro Ala
530 535 540
Pro Gly Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ser
545 550 555 560
Gly Arg Gln Pro Leu His Pro His Val Gln Leu Glu Glu Arg Gly Leu
565 570 575
Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Leu Arg Thr Asp
580 585 590
Ala Gly Glu Tyr His Ala Thr Val Arg Leu Pro Asn Arg Ala Leu Ser
595 600 605
Cys Ser Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ser Met Ile Ala Ser Pro
610 615 620
Ser Gly Val Leu Lys Leu Ser Asp Trp Val Leu Leu Asn Cys Ser Phe
625 630 635 640
Ser Arg Pro Asp Arg Pro Val Ser Val His Trp Phe Gln Gly Gln Asn
645 650 655
Arg Val Pro Val Tyr Asn Ser Pro Arg His Phe Leu Ala Glu Thr Phe
660 665 670
Leu Leu Leu Pro Gln Val Ser Pro Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly Cys
675 680 685
Val Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn Leu
690 695 700
Lys Val Leu Gly Leu Glu Pro Val Ala His His His His His His
705 710 715
<210> 3
<211> 2139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠替身构建体(基因2)核苷酸序列
<400> 3
atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg 60
ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa 120
caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctcctcat 180
gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc 240
attgctggga aactaaaagt ggcgcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact 300
acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc 360
gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc 420
atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact 480
aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa 540
aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg 600
tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc 660
attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct ggggcggtgg cggcggaggc 720
ggtggcggtg ggcctgggaa agagctcccc gtggtgtggg cccaggaggg agctcccgtc 780
catcttccct gcagcctcaa atcccccaac ctggatccta actttctacg aagaggaggg 840
gttatctggc aacatcaacc agacagtggc caacccactc ccatcccggc ccttgacctt 900
caccagggga tgccctcgcc tagacaaccc gcacccggtc gctacacggt gctgagcgtg 960
gctccaggag gcctgcgcag cgggaggcag cccctgcatc cccacgtgca gctggaggag 1020
cgcggcctcc agcgcgggga cttctctctg tggttgcgcc cagctctgcg caccgatgcg 1080
ggcgagtacc acgccaccgt gcgcctcccg aaccgcgccc tctcctgcag tctccgcctg 1140
cgcgtcggcc aggcctcgat gattgctagt ccctcaggag tcctcaagct gtctgattgg 1200
gtccttttga actgctcctt cagccgtcct gaccgcccag tctctgtgca ctggttccag 1260
ggccagaacc gagtgcctgt ctacaactca ccgcgtcatt ttttagctga aactttcctg 1320
ttactgcccc aagtcagccc cctggactct gggacctggg gctgtgtcct cacctacaga 1380
gatggcttca atgtctccat cacgtacaac ctcaaggttc tgggtctgga gcccgtagcc 1440
cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 1500
ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 1560
agccccatgg tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 1620
agctggttcg tgaacaacgt ggaagtactc acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 1680
tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 1740
ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagccctcc cagcgcccat cgagagaacc 1800
atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 1860
gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 1920
gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 1980
ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 2040
aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgc tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 2100
cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaatga 2139
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<212> PRT
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<223> CTLA-4 BsB人构建体野生型翻译的蛋白序列
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Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly
245 250 255
Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg
260 265 270
Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
275 280 285
<210> 16
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BsBdelta (CD80wa-Fc) DNA
<400> 16
atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg 60
ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa 120
caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctcctcat 180
gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc 240
attgctggga aactaaaagt ggcgcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact 300
acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc 360
gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc 420
atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact 480
aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa 540
aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg 600
tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc 660
attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggagcccag agggcccaca 720
atcaagccct gtcctccatg caaatgccca gcacctaacc tcttgggtgg accatccgtc 780
ttcatcttcc ctccaaagat caaggatgta ctcatgatct ccctgagccc catggtcaca 840
tgtgtggtgg tggatgtgag cgaggatgac ccagatgtcc agatcagctg gttcgtgaac 900
aacgtggaag tactcacagc tcagacacaa acccatagag aggattacaa cagtactctc 960
cgggtggtca gtgccctccc catccagcac caggactgga tgagtggcaa ggagttcaaa 1020
tgcaaggtca acaacaaagc cctcccagcg cccatcgaga gaaccatctc aaaacccaaa 1080
gggtcagtaa gagctccaca ggtatatgtc ttgcctccac cagaagaaga gatgactaag 1140
aaacaggtca ctctgacctg catggtcaca gacttcatgc ctgaagacat ttacgtggag 1200
tggaccaaca acgggaaaac agagctaaac tacaagaaca ctgaaccagt cctggactct 1260
gatggttctt acttcatgta cagcaagctg agagtggaaa agaagaactg ggtggaaaga 1320
aatagctact cctgctcagt ggtccacgag ggtctgcaca atcaccacac gactaagagc 1380
ttctcccgga ctccgggtaa aggcggtggc ggcggaggcg gtggcggtgg gcctgggaaa 1440
gagctgggtc tggagcccgt agcccaccat caccatcatc actga 1485
<210> 17
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BsBdelta (CD80wa-Fc)蛋白
<400> 17
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe
1 5 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser
20 25 30
Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp
35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val
65 70 75 80
Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Ala Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser
100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr
115 120 125
Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp
130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr
145 150 155 160
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe
165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile
180 185 190
Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp
195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Pro Arg Gly Pro Thr
225 230 235 240
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
260 265 270
Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
275 280 285
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
290 295 300
Leu Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
370 375 380
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
385 390 395 400
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
420 425 430
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
435 440 445
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
450 455 460
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Lys
465 470 475 480
Glu Leu Gly Leu Glu Pro Val Ala His His His His His His
485 490

Claims (16)

1.一种双特异性融合蛋白，其包含对CTLA-4特异性的配体和对肽-II类主要组织相容性复合物pMHCII特异性的配体，其中 所述对CTLA-4特异性的配体选自由CD80 (B7-1)和CD86 (B7-2)组成的组，且 所述对pMHCII特异性的配体是LAG-3，IgG Fc域置于LAG-3的C端。
2.根据权利要求1的双特异性融合蛋白，其中所述对CTLA-4特异性的配体和所述对pMHCII特异性的配体被接头分隔开来。
3.根据权利要求2的双特异性融合蛋白，其中所述接头是聚氨基酸序列和抗体Fc域中的一种或多种。
4.根据权利要求3的双特异性融合蛋白，其中所述聚氨基酸序列是G9 (Gly-9)。
5.根据权利要求1的双特异性融合蛋白，其中所述对CTLA-4特异性的配体是CD80。
6.根据权利要求5的双特异性融合蛋白，其中所述CD80被突变而增加了对CTLA-4的特异性。
7.根据权利要求6的双特异性融合蛋白，其中所述CD80是包含选自由下述组成的组的至少一个突变的人CD80：W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A,S201A, R63A, M81A, N97A和E196A。
8.根据权利要求7的双特异性融合蛋白，其中所述突变是W84A或E196A。
9.根据权利要求1的双特异性融合蛋白，其中所述LAG-3被突变而增加了对pMHCII的特异性。
10.根据权利要求9的双特异性融合蛋白，其中所述LAG-3是包含选自由下述组成的组的至少一个突变的人LAG-3：R73E, R75A, R75E和R76E。
11.根据权利要求10的双特异性融合蛋白，其中所述突变是R75A或R75E。
12.根据权利要求1-11中任一项的双特异性融合蛋白制备用于使T细胞对抗原耐受化的药物的用途，其中使所述T细胞与所述双特异性融合蛋白及抗原呈递细胞接触，所述抗原呈递细胞呈递有与MHCII分子复合的衍生自所述抗原的肽。
13.根据权利要求1-11中任一项的双特异性融合蛋白制备用于治疗自身免疫性疾病或移植排斥的药物的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中所述双特异性融合蛋白与其他免疫抑制剂或调节剂组合施用。
15.根据权利要求13或权利要求14的用途，其中所述自身免疫性疾病选自：1型糖尿病(T1D)，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、多发性硬化(MS)、硬皮病、寻常型天疱疮(PV)、银屑病、特应性皮炎、乳糜泻、慢性阻塞性肺病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、舍格伦综合征、格林-巴利综合征、古德帕斯彻综合征、阿狄森氏病、韦格纳肉芽肿、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、雷诺氏现象、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、贝切特氏病、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、风湿热、强直性脊柱炎、肾小球性肾炎、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃、和白癜风。
16.根据权利要求15的用途，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病(T1D)。
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