CN107941763B - 一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法，包括步骤：1)激发光和损耗光合束后，调制为线偏振光并调整线偏振方向；2)利用空间光调制器加载的0‑2π涡旋位相板和0‑π位相板同时对激发光和损耗光进行两次调制；损耗光一部分光调制成为横向的空心光斑，另一部分调制成为轴向的空心光斑；3)将激发光偏振调成圆偏光且旋向和涡旋位相板的旋向相反，损耗光偏振态转化为圆偏光且旋向与涡旋位相板的旋向相同；4)利用激发光和损耗光聚焦至样品上，激发光为实心光斑，损耗光为空心光斑，并分别激发和损耗样品发出的信号光；5)收集信号光，得到对应到样品扫描点的显微图像。本发明还公开一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置。

Description

一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

超分辨荧光显微成像技术在过去十几年里已经取得了显著的进步，并被广泛应用于生命科学等研究领域。超分辨荧光显微镜常被用于获取某个单独样品的高分辨率结构，如单细胞、单个荧光颗粒等，同时也被用于观察不同样品之间的相对空间位置分布和相互作用过程。但与此同时，超分辨率荧光成像在生物医学研究领域的应用中也面临很多实验挑战，因为荧光标记过程和成像光束可能会改变成像样品的结构。

作为第一种突破远场衍射极限的超分辨荧光显微成像技术，受激辐射损耗(STED)显微技术的发展最为迅速，它的实验装置都是基于激光扫描共聚焦显微镜，在原本的实心激发光束的基础上只需再额外添加一束损耗光束。损耗光束在经过一定的相位和偏振调制后会聚焦成一个空心光斑，这个空心光斑通过高光强对荧光分子的刺激逼迫周围被空心光斑激发的荧光分子发生受激辐射而无法产生荧光，而由于中心区域并没有收到损耗光斑的影响，荧光分子正常发生自发辐射产生荧光。由此可见，通过损耗光的损耗效应，可以等效于产生一个横向方向半径远小于正常艾里斑大小的激发光斑，这样就大大提高了其分辨能力。在这样的物理机制下，STED技术的分辨率取决于损耗光斑边缘的损耗效率，也就取决于损耗光束的强度，强度越强，STED技术的等效有效点扩散函数(PSF)越小。有效PSF的半高全宽(FWHM)可以近似表示为：

其中I是损耗光强度，Is是对应于将荧光强度损耗掉一半时的损耗光阈值光强。

STED系统所具有的超高分辨能力是大家有目共睹的，但是STED系统在搭建方面的难度也是大家公认的。STED技术需要两路光，两路光在聚焦后需要横向轴向都尽可能完美重合才能有较好的分辨率，同时两路光对光路中像差的校正也有着更高的要求。德国的Hell组提出了共路STED，通过设计一种特殊双折射材料的波片来保证只对STED光进行调制而不对激发光进行调制，从而实现在共路的条件下同时生成亮斑和暗斑，但是这种方法只能实现横向分辨率的提高，对轴向分辨率的提高并没有太大作用，因此导致其横向分辨率(～20-40nm)和轴向分辨率(～900nm)的相当大的差异。当对二维样品进行成像时，这不会产生影响。但是当对沿着光轴延伸的三维生物样品进行成像时，由于过低的轴向分辨率，图像质量将受到严重影响。在提高轴向分辨率方面，已有报道通过结合4Pi技术和STED技术(isoSTED)实现了双色3D超分辨成像，其三维分辨率最高可达到40-45nm。但是isoSTED中的4Pi成像系统比较复杂，光路调节要求非常高，需要使用到双物镜的相干叠加，因此在实用性上非常有限。也有报道在原本涡旋位相板产生横向空心光斑之外，再通过0-pi相位板来产生轴向的空心光斑，从而实现轴向的损耗来提高STED的轴向分辨率，从而满足三维超分辨成像。这种方法虽然比isoSTED系统简单，但是其三维空心光斑的调节是在两路光路实现的，更容易产生额外的像差，成像质量变差，同时两路损耗光也造成成像系统较为复杂，调节难度仍然相对较大。

发明内容

本发明提供了一种基于双振镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置。本装置结构紧凑简单，方便调节；实现了共轴3DSTED，系统简单，像差小，成像质量高；通过一个空间光调制器实现了三维空心光斑调节，节约成本；特别适用于对荧光样品进行三维超分辨成像。

本发明提供了一种简单易调的基于共轴的三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，包括光源、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜，所述光源与显微物镜之间依次设有：

用于将两束激光合束的二色镜；

用于将经保偏光纤单模输出的激光光源准直扩束的准直镜；

用于将两束激光改变的线偏光的起偏器和调整线偏振方向的1/2波片；

用于相位调制两束激光的空间光调制器(SLM)；

用于是偏振方向旋转90度的1/4波片和透镜；

用于将激发光的偏振态由线偏光转换为与SLM所调制的涡旋相位旋向相反的圆偏光的1/4波片；

用于将STED光的偏振态由线偏光转换为与SLM所调制的涡旋相位旋向相同的圆偏光的1/4波片和1/2波片；

用于将偏振相位调制后的两束激光进行光路偏转实现对样品的快速扫描的双振镜4f扫描系统；

用于实现振镜与物镜入瞳共轭的4f系统，包括扫描镜和场镜；

用于将激发光聚焦到样品上的显微物镜；

并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

探测系统包括：

用于反射激光光束和透射荧光信号的二色镜；

用于滤去分束镜出射的荧光中的杂散光和部分激光的窄带滤波片；

用于将滤光后的荧光光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；

所述空间光调制器液晶屏幕在左右两侧同时加载0-π相位调制图案和0-2π涡旋相位调制图案；

优选的，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

本发明还提供一种基于共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法，包括步骤：

1)将激发光激光器和损耗光激光器发出的激光光束经过二色镜合束后，会聚耦合进入保偏光纤；

2)从保偏光纤出来的两束光具有相同的偏振状态，经过准直后，再经过一个起偏器和1/2波片，来调整进入空间光调制器(SLM)之前光束的线偏振方向，线偏振方向将决定最终生成的光斑的质量；

3)对于损耗光路(STED光路)，调制1/2波片使偏振方向与SLM可调节偏振方向成α角。损耗激光束经过1/2波片的调制后进入SLM的左半部分，此时SLM的左半部分加载的是0-2π涡旋位相板，将一部分光调制成为横向的空心光斑；

4)经SLM出左半部分反射出来的STED光经过一个1/4波片后被透镜聚焦在反射镜上，然后反射回来后再经过透镜变为平行光，二次经过1/4波片后，此时激光束的偏振方向偏转了90度，射入到SLM的右半部分，此时右半部分加载的是0-π位相板，将前次经过SLM左半部分未经过调制的光调制成为轴向的空心光斑；

5)而对于与STED光同时进入SLM的激发光，同样会经过SLM左右两个部分的调制，但是由于SLM的灰度设定是根据STED光的调制要求设定的，因此对于激发光而言，虽然同样是一个近似的暗斑，但是暗斑并不能完全暗到底。随后激发光经过反射镜反射后再经过属于激发光波长的1/4波片将激发光偏振调成圆偏光并且旋向和涡旋位相板的旋向相反，这样在物镜聚焦后会产生一个实心光斑；

6)而同样经过反射镜反射出来的STED光在受到激发光波长的1/4波片的轻微影响后，经过属于STED光波长的1/2波片和1/4波片将偏振态转化为圆偏光，此时可以保证在物镜聚焦后能够产生一个STED暗斑，同时虽然波片对激发光也产生一定的影响，但依然能够产生一个实心光斑，能够符合STED成像系统的要求；

7)经二色镜反射后的两束激光同时进入双振镜4f系统，振镜在聚焦面上的扫描位置与其绕轴偏折的角度成正比，而本发明采用的4f振镜系统可以解决普通双振镜系统在大视场扫描下容易产生畸变的问题，利用振镜系统与入瞳面的共轭关系来抑制扫描过程中的畸变问题。经过振镜扫描后的光束再经过物镜系统，与平台轴向移动相结合从而完成对样品的三维扫描；

8)在三维扫描过程中，激发光斑激发样品产生荧光，而STED空心光斑会将激发光斑范围内的周围区域损耗掉从而无法激发出荧光，从而实现成像系统有效点扩散函数(PSF)减小，分辨率的提高。物镜实时收集被测样品各点被激发反射出来的信号光，再次经过振镜系统和二色镜，在通过滤光片滤去杂散光，被探测器前的会聚透镜收集至多模光纤输入口，经光纤将光信号传递到探测其中。

本发明的原理如下：

根据经典的衍射理论，在任何一个光学成像系统中对一束平行光进行聚焦都无法产生一个理想的点，而是一个弥散光斑，我们称之为艾里光斑或者艾里斑。艾里斑的大小则意味着每一次光斑所激发的范围，因而在一个艾里斑范围以内的细节无法分辨，因此成像系统的分辨率受到了艾里斑大小的限制，我们称之为衍射极限。本发明用以提高三维成像分辨率的核心原因在于通过光学方法缩小了成像系统的艾里光斑，实现了衍射极限的突破。

在普通的共聚焦点扫描系统中，荧光样品被入射激发光聚焦激发，荧光分子从基态被激发至激发态，随后自发辐射回到基态从而产生荧光，荧光被物镜收集被探测器接收，因此每次被激发的荧光的面积则由激发光的会聚艾里斑面积决定，因此分辨率取决于上述的衍射极限。本发明基于STED成像技术的理论，在原本的激发光激发的基础上，又添加了一束损耗光即STED光，STED光由于具有高光强，会逼迫激发态的荧光分子发生受激辐射回到基态，从而无法如之前所述发生自发辐射产生荧光。因此将STED激光设计成为一个空心光斑，从而能够使激发光的激发范围的外围部分的荧光分子发生受激辐射，无法产生荧光，使得产生荧光的面积小于激发面积，突破衍射极限。而在常规的STED系统中，由于两个光斑的重合以及像差问题，导致STED系统具有很大的搭建和维护难度，虽然提出了共路STED系统，将激发光和STED光并到同一光路中，但是由于所用特殊材料的缘故导致而无法实现三维超分辨成像，限制了其应用范围。

在本发明中，利用单个空间光调制器(SLM)来产生三维空心光斑，在SLM的左半部分加载0-2π涡旋相位调制图案，右半部分加载0-π相位调制图案，根据矢量光场衍射理论，由狄拜积分可知经上述两个相位调制图案调制的光斑在物镜的会聚下会产生横向的空心光斑和轴向的空心光斑。STED光首先入射到SLM的左侧，此时SLM左侧加载的0-2π相位图案只会对光束水平方向的分量进行调制，垂直分量未被调制。当光束经偏振旋转90度后，再次入射到SLM上右侧时，之前的水平分量变为垂直分量，其不会被再次调制，之前的垂直分量变为水平分量，在SLM右侧被加载的0-π涡旋相位图案调制。这样，两个方向的分量被不同的调制图案进行调制，在经过后续的1/2波片和1/4波片将偏振转换为圆偏光且旋向与涡旋位相板旋向相同时，此时光束经显微物镜聚焦到焦面时，上述两种空间光场由于偏振状态不同，进行非相干叠加，在焦面附近得到近似的空心椭球体光场分布，长轴延光轴方向。同时激发光也被相同的方式调制，但有所不同的是激发光在离开SLM后被1/4波片调制成为与涡旋位相板旋向相反的圆偏光，又由于SLM的灰度与激发光的位相调制不完全匹配的原因，物镜聚焦后产生的是一个暗不到底的实心光斑。通过这样的方式在同一光路中产生三维亮斑和三维暗斑，再通过之前所提的STED技术损耗的原理，实现三维成像分辨率的提高。

相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)采用单个空间光调制器实现三维暗斑的形成，节约了成本；

(2)激发光与STED光进行共路激发，降低了搭建难度，同时也抑制了系统的像差，易于调校。

附图说明

图1为利用透镜和反射镜实现共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像系统装置示意图；

图2为空间光调制器(SLM)左半部分的相位调制图案(0-2π涡旋位相板)，和单独经过其调制后的光束STED光经物镜聚焦后在焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图；其中，图2(a)为SLM左半部分相位调制灰度图，图2(b)为经过(a)的单独调制后，STED光经物镜聚焦后的光斑横向截面图，图2(c)为相应的轴向截面图。

图3为单独被SLM左半部分(0-2π涡旋位相板)调制后的激发光经物镜聚焦后，在焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图；其中，图3(a)为激发光聚焦后焦点附近光场横向截面图；图3(b)为轴向截面示意图。

图4为SLM右半部分的相位调制图案(0-π位相板)，和单独经过其调制后的STED光经物镜聚焦后，在焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图；其中图4(a)为SLM右半部分相位调制灰度图，图4(b)为经过(a)的单独调制后，STED光经物镜聚焦后的光斑横向截面图，图4(c)为相应的轴向截面图。

图5为单独被SLM左半部分(0-π位相板)调制后的激发光经物镜聚焦后，在焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图，其中，图5(a)激发光聚焦后焦点附近光场横向截面图；图5(b)为轴向截面示意图。

图6为本发明中STED光经SLM两次调制后在物镜焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图；其中，图6(a)为横向截面图；图6(b)为轴向截面示意图。

图7为本发明中激发光光经SLM两次调制后在物镜焦点附近的光场分布的横向截面和轴向截面示意图，其中，图7(a)为横向截面图；图7(b)为轴向截面示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种基于利用透镜和反射镜实现共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像系统装置示意图，包括：激发光激光器1，STED光激光器2，二色镜3，会聚透镜4a、会聚透镜4b和会聚透镜4c，单模保偏光纤5，准直透镜6，起偏器7，反射镜8a、反射镜8b和反射镜8c，消色差1/2波片9，D型反射镜10，空间光调制器(SLM)11，消色差1/4波片12，激发光波长1/4波片13，STED光波长1/2波片14，STED光波长1/4波片15，双振镜4f扫描系统16，扫描镜17，场镜18，高数值孔径物镜19，样品台20，窄带滤波片21，多模光纤22，探测器23。

其中，激光器发出的激发光和STED光被二色镜合束后耦合进入到同一根单模保偏光纤5中，准直透镜6，起偏器7和反射镜8a在单模光纤出射的光轴上，起偏器7的透光轴方向应使得透射后的光强最大。

消色差1/2波片9和D型反射镜10位于经反射镜转折后的光轴上行，其中1/2波片用来调整入射光的偏振方向，而D型反射镜用来将光束反射到空间光调制器(SLM)11的左侧。

消色差1/4波片12，会聚透镜4b和反射镜8b在经SLM左侧反射后的光轴上，反射镜8b同时位于会聚透镜4b的焦点位置，这样光束在经过反射镜反射后再次经过SLM的右侧，被SLM的右侧反射至反射镜8c处。

激发光波长1/4波片13，STED光1/2波片14，STED光1/4波片15和二色镜3b位于反射镜8c反射之后的光轴上，光束被二色镜反射后进入双振镜4f扫描扫描系统16中。而扫描镜17，场镜18，高数值孔径物镜19和样品台20位于扫描振镜系统出射光束的光轴上，电动样品台位于物镜的焦点处。

窄带滤波片21，会聚透镜4c和多模光纤22位于信号光光轴上，多模光纤将信号光收集至探测器22中。

激发光激光器1、STED光激光器2、空间光调制器11、双振镜4f扫描系统16、样品台20和探测器23同时与PC机控制器相连，通过电脑来控制激光器的开关，控制SLM产生不同的位相调制图案来实现三维暗斑的产生，同时控制双振镜4f扫描系统16和样品台20完成三维空间的逐点扫描，并控制探测器记录各点信号，最终得到最终的成像结果。

上述装置中，显微物镜19的数值孔径NA＝1.4；所用多模光纤的光纤端口大小为0.8个艾里斑大小，探测器22为雪崩光电二极管(APD)。

采用图1所示装置实现三维超分辨的过程如下：

激发光激光器1和STED光激光器2分别发出激发光和STED光两束光，经过二色镜3a合束后被会聚透镜4a会聚耦合进入单模保偏光纤，出射光束经过准直镜扩束准直后为平行光，并且双光路合并为单光路。两束光经过起偏器7后两束光均转换为线偏振光，并经过反射镜8a，消色差1/2波片9和D形反射镜10入射到空间光调制器11左侧。其中，调节1/2波片快轴，使得光束的偏振方向与水平方向夹角为35.5度。此时空间光调制器11左侧加载0-2π涡旋相位调制图案，如图2(a)所示。0-2π涡旋相位调制的调制函数可以用极坐标表示为，

此时，STED光偏振方向与水平方向成35.5度的光束的水平分量被上述0-2π涡旋相位调制函数调制。其在转化成与涡旋方向相同的圆偏光后，经物镜聚焦后的焦面附近处光场分布如图2(b)-(c)所示。而激发光束的水平分量同样被相同的相位调制函数调制，但激发光束在被SLM调制后会通过激发光1/4波片13转化成涡旋方向相反的圆偏光，同时由于波长所对应的灰度值差异，经物镜聚焦后的光场分布如图3(a)和图3(b)所示，是一个中心暗不到底的实心光斑。两束光被SLM反射后，经过消色差1/4波片12和透镜4b，被反射镜8b反射后，再次经过透镜4b和1/4波片12，回到SLM右侧。反射镜8b位于会聚透镜4b的焦点上，使得反射镜的面形对光束波前的影响降到最低。调节1/4波片12的快轴，使得入射偏振光束两次经过1/4波片9后，偏振方向转过90度入射到SLM右侧。空间光调制器右侧加载0-π相位调制图案，如图4(a)所示，其相位调制函数可以写成：

此时，之前被SLM左侧图案调制的水平分量变为垂直分量，无法被调制。之前未被调制的垂直分量变为水平分量，即被SLM右侧加载的0-π相位调制图案调制。STED光束该分量转化为圆偏光后，经物镜聚焦后的焦面附近处光场分布如图4(b)-(c)所示。同理，激发光束该分量转化为旋向相反的圆偏光后，经物镜聚焦后的焦面附近外光场分布如图5(a)和图5(b)所示。

两束光经过SLM右侧调制后，被反射镜8c反射，经过激发光波长1/4波片13将激发光的偏振方向转化为与SLM左侧涡旋方向相反的圆偏光，再经过STED光波长的1/2波片14和1/4波片15将STED光偏振方向转化为SLM左侧涡旋方向相同的圆偏光。随后两束光被二色镜3b反射进入到双振镜4f扫描系统16中，扫描系统利用两个凹面镜构成反射式4f系统，在大大节省了系统空间的前提下，能够确保振镜系统与入瞳面的共轭关系来抑制扫描过程中的畸变问题。然后两束光再经过扫描镜17和场镜18，被高数值孔径显微物镜19聚焦至样品台20上，此时STED光和激发光在物镜焦点附近的三维光场分布如图6(a)和图6(b)以及7(a)和图7(b)所示，分别为一个空心光斑和一个实心光斑。样品被上述光斑激发和损耗后，产生的有效信号光再经过物镜19，场镜18，扫描镜17，4f振镜系统16，二色镜3b后，通过窄带滤波片21滤去杂散光后，被会聚透镜4c聚焦进入多模光纤22中，经过多模光纤将光信号收集至探测器23中，再通过PC机进行显示成像。PC机通过控制双振镜4f扫描系统16和样品台20完成三维空间的逐点扫描，并控制探测器记录各点信号，最终得到最终的成像结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像方法，其特征在于，包括步骤：

1)激发光和损耗光合束后，调制为线偏振光并调整线偏振方向；

2)利用空间光调制器加载的0-2π涡旋位相板和0-π位相板同时对激发光和损耗光进行两次调制；所述的损耗光一部分光调制成为横向的空心光斑，另一部分调制成为轴向的空心光斑；

在步骤2)中，在空间光调制器的左半部分加载0-2π涡旋相位调制图案，右半部分加载0-π相位调制图案，损耗光首先入射到空间光调制器的左侧，空间光调制器加载的0-2π相位图案只会对光束水平方向的分量进行调制，垂直分量未被调制；当光束经偏振旋转90度后，再次入射到空间光调制器上右侧时，之前的水平分量变为垂直分量，其不会被再次调制，之前的垂直分量变为水平分量，在空间光调制器右侧被加载的0-π涡旋相位图案调制；

3)将所述的激发光偏振调成圆偏光且旋向和涡旋位相板的旋向相反，所述的损耗光偏振态转化为圆偏光且旋向与涡旋位相板的旋向相同；

4)利用所述的激发光和损耗光聚焦至样品上，激发光为实心光斑，损耗光为空心光斑，并分别激发和损耗样品发出的信号光；

5)收集所述的信号光，得到对应到样品扫描点的显微图像。

2.一种共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，包括激发光光源、损耗光光源和将光束聚焦至样品上的显微物镜，其特征在于，两光源与显微物镜之间依次设有：

用于将两束激光合束的第一二色镜，

用于将两束激光改变为线偏光的起偏器和调整线偏振方向的第一1/2波片，

用于相位调制两束激光的空间光调制器，同时加载0-π相位调制图案和0-2π涡旋相位调制图案，对激发光和损耗光进行两次调制；所述空间光调制器的左半部分加载0-2π涡旋相位调制图案，右半部分加载0-π相位调制图案，损耗光首先入射到空间光调制器的左侧，空间光调制器加载的0-2π相位图案只会对光束水平方向的分量进行调制，垂直分量未被调制；当光束经偏振旋转90度后，再次入射到空间光调制器上右侧时，之前的水平分量变为垂直分量，其不会被再次调制，之前的垂直分量变为水平分量，在空间光调制器右侧被加载的0-π涡旋相位图案调制；

用于将激发光的偏振态由线偏光转换为与0-2π涡旋相位旋向相反的圆偏光的第一1/4波片，

用于将损耗光的偏振态由线偏光转换为与0-2π涡旋相位旋向相同的圆偏光且依次布置的第二1/2波片和第二1/4波片；

还包括采集样品发出的信号光的探测系统。

3.如权利要求2所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的第二1/4波片与显微物镜间设置用于将偏振相位调制后的两束激光进行光路偏转对样品进行扫描的双振镜4f扫描系统。

4.如权利要求3所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的探测系统包括沿所述双振镜4f扫描系统的信号光出射方向依次布置的：

用于反射激光光束和透射荧光信号的第二二色镜；

用于滤去分束镜出射的荧光中的杂散光和部分激光的窄带滤波片；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器；

和用于探测信号光束的光强信号的探测器。

5.如权利要求4所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述探测器选用光电倍增管或雪崩光电二极管。

6.如权利要求4所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的空间滤波器为针孔或多模光纤。

7.如权利要求6所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，多模光纤的光纤端口大小为0.8个艾里斑大小。

8.如权利要求7所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，还包括与所述探测器、双振镜4f扫描系统和放置样品的电动样品台连接的计算机，用于控制所述双振镜4f扫描系统和电动样品台以对样品进行三维扫描。

9.如权利要求2所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述空间光调制器的反射光路上依次设置有第三1/4波片和反射镜，所述的第三1/4波片用于将光束的偏振方向旋转90度，所述的反射镜用于将空间光调制器一次调制后的光束发射进行二次调制。

10.如权利要求2所述的共轴三维受激辐射损耗超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

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