CN107841484A - 一种体外卵母细胞培养体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卵母细胞体外成熟诱导体系及含有其的培养体系。具体地，所述诱导体系含有卵泡雌激素(FSH)0.075IU/ml(0.05‑0.10IU/ml)；促黄体生成素(LH)0.075IU/ml(0.05‑0.10IU/ml)；雌二醇1μg/ml(1E‑6至5E‑6mol/L,或者0.27‑1.36μg/ml)；人表皮生长因子(hEGF)1ng/ml(1E‑10mol/L至1E‑9mol/L；或者0.6‑6ng/ml)。可以有效地在体外促进卵母细胞的同步化成熟，而其诱导效果与体内复杂的内环境无高度相关性，而只需添加简单的相关激素即可。所获得的卵母细胞并不影响动物的后续生育潜能，对新生动物无显著影响。

Description

一种体外卵母细胞培养体系及其应用

技术领域

本发明属于生殖技术领域。具体地，本发明涉及一种新的体外卵母细胞培养体系及其应用。

背景技术、

哺乳类卵母细胞的发生在卵巢中，与周围的体细胞共同构成卵泡。卵母细胞的生长伴随其所在卵泡的发育而进行。以人为例，在胚胎5月龄时，原始生殖细胞通过有丝分裂形成大约600-700万卵原细胞，接下来卵原细胞通过减数分裂形成卵母细胞。出生时，卵母细胞数目大约为200万左右。卵泡发育经历复杂的过程，可以分成不同阶段。一般认为可以分成，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡阶段。在卵泡的发育过程中，99.9％的卵母细胞伴随卵泡闭锁而退化，妇女一生中大约排放400个成熟卵子。当然，卵泡闭锁的原因很复杂，有卵巢内微环境的因素，卵泡颗粒细胞及卵母细胞等内在的因素。但是，当达到青春期，卵巢内的卵泡中会依次得到募集，逐渐发育成为成熟卵泡，然后响应LH峰而发生排卵。如果卵泡发育障碍，比如在内分泌到等因素的影响下，导致卵泡生长到一定阶段，比如三级早期，不能够响应促性腺激素发生排卵和卵母细胞的适宜成熟。来自这样的卵泡的卵母细胞，需要给予人工诱导，以启动成熟过程。

在哺乳类，例如小鼠，在动情周期中，相应FSH刺激卵泡长大，卵母细胞发育，在LH峰诱导下，发生排卵和卵母细胞成熟，通常认为雌激素和孕激素在进化上不再作为介导促性腺激素对卵母细胞发育和成熟调节的必需步骤^[1,2]，而是主要通过反馈作用于垂体，通过调节FSH和LH的分泌而发挥其生理作用^[3-5]。然而，近期利用小鼠为模型的研究表明^[6-8]，一种利钠肽(natriuretic peptide precursor type C,NPPC)与其受体(NPPC receptor,NPR2)结合，增加卵泡颗粒细胞中cGMP水平，cGMP通过缝隙通道进入卵母细胞，抑制PDE3A酶活性以维持卵母细胞中高水平的cAMP，进而维持卵母细胞减数分裂G2/M相停滞，调节卵母细胞发育和成熟。另外，NPR2在颗粒细胞的表达受到雌激素的调节^[9]，可以断定雌激素可以直接通过影响卵泡的颗粒细胞而调节小鼠卵母细胞的发育和成熟。因此，雌激素和孕激素在卵母细胞发育过程中起到的作用远比先前知晓的复杂。

发明内容

本发明提供了一种含有雌二醇和人表皮生长因子的卵母细胞体外成熟诱导体系及其制备和应用。

本发明第一方面，提供了一种卵母细胞体外成熟诱导体系，所述诱导体系含有：

雌二醇 0.27-1.36μg/ml，和

人表皮生长因子(hEGF) 0.6-6ng/ml。

在另一优选例中，所述的诱导体系还含有以下一种或两种成分：

卵泡雌激素(FSH) 0.05-0.10IU/ml，

促黄体生成素(LH) 0.05-0.10IU/ml。

在另一优选例中，所述诱导体系含有：

在另一优选例中，所述的诱导体系还可含有基础培养液。

在另一优选例中，所述的基础培养液含有：

M199细胞培养基(购自Hyclone)或McCoy’s 5A细胞培养基(购自Sigma)

在另一优选例中，所述的基础培养液含有选自以下一种或多种的成分：

在另一优选例中，所述的基础培养液含有选自以下一种或多种的成分：

本发明第二方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养体系，所述培养体系含有基础培养液和本发明第一方面所述的诱导体系。

在另一优选例中，所述培养体系含有：

在另一优选例中，所述的培养体系含有：

M199细胞培养基或McCoy’s 5A细胞培养基。

本发明第三方面，提供了一种体外诱导卵母细胞成熟的方法，包括步骤：

(a)提供哺乳动物的卵母细胞；

(b)将(a)中所述的卵母细胞与本发明第二方面所述的培养体系共培养，从而体外诱导获得成熟的卵母细胞。

在另一优选例中，所述的成熟包括达到核分裂的减数第二次分裂中期，且所述细胞质达到与核分裂减数第二次分裂中期相对应的成熟阶段。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括牛、羊、小鼠、大鼠、或人。

在另一优选例中，步骤(a)中所述卵母细胞处于减数第二次分裂中期之前；

或细胞核成熟分裂已经达到中期II、细胞质未达到与核分裂减数第二次分裂中期相对应的成熟阶段。

在另一优选例中，所述的卵母细胞包括停滞于减数第一次分裂前期的成熟未启动卵母细胞与已经启动但未完成整个成熟过程的不同阶段。

在另一优选例中，步骤(b)中所述成熟的卵母细胞表现为细胞核处于减数第二次分裂中期，同时有第一极体形成。

本发明第四方面，提供了本发明第一方面所述诱导体系和/或本发明第二方面所述培养体系的用途，其特征在于，用于体外诱导哺乳动物卵母细胞的成熟。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括牛、羊、小鼠、大鼠、或人，优选地，为小鼠、大鼠或人。

本发明第四方面，提供了一种制备本发明第二方面所述培养体系的方法，包括步骤：

(i)提供0.27-1.36μg/ml的雌二醇和0.6-6ng/ml人表皮生长因子(hEGF)作为离体成熟诱导体系；提供M199或McCoy’s 5A细胞培养基作为基础培养液；

(ii)将一种或多种(i)中的成分进行混合，从而得到所述的培养体系。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了小鼠卵巢切片HE染色观察。选取最大切片，显示其中包括的卵泡多少，计数得出经雌激素处理导致卵巢中三级早期卵泡显著增多。

图2显示了SD大鼠卵母细胞在不同的离体成熟培养液中的成熟潜能比较。而经过离体成熟处理，获得了较好的成熟率。可见在McCoy-5A的培养基中添加颗粒细胞培养上清、垂体前叶(pit)或Δ-4雄烯二酮(andro)均提高卵母细胞的成熟率。利用M199培养基中添加FSH,LH,雌激素(Es)和重组的人表皮生长因子(hEGF)等培养液中同样得到理想的结果(本发明)，且成熟百分比更高。数据来自两次独立实验的结果的均值。

图3显示了E2、DES体内处理ICR小鼠，从单侧卵巢获得的卵母细胞，经过本发明成熟培养液体外处理后，E2、DES处理获得的成熟卵母细胞数量均明显多于对照组(Con)。数据来自2次独立的重复实验。

图4显示了E2、DES体内处理后，在经本发明成熟培养液体外处理所获得的ICR大鼠卵母细胞，在受精后发育成后代个体的能力。卵母细胞在离体条件下的完成正常成熟和受精，并发育至囊胚，然后接种于寄养鼠的子宫。柱状图表示能够继续发育为正常的后代胚胎的比率。说明经本发明成熟培养液处理后，DES处理对于受精后的胚胎后续发育没有影响。数据来自2次独立的重复实验。

图5显示了E2和DES同步化处理BALB/c小鼠获得的卵母细胞在经本发明培养液离体培养后的受精率。E2和DES处理获得的卵母细胞离体受精率均较对照更为理想。数据来自2次独立的重复实验。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，采用以雌二醇和表皮生长因子为主的特定诱导液，可以有效地在体外改善卵母细胞的细胞核与细胞质的同步化成熟，而其诱导效果与体内复杂的内环境无相关性，而只需添加简单的相关激素即可。而本发明成熟培养液也可以用于各种药物(例如雌二醇E2和DES)进行体内刺激处理获得的卵母细胞体外培养，所获得的卵母细胞并不影响动物的后续生育潜能，对新生动物无显著影响，是一种广谱、安全的成熟培养液。本方法可大批量产生和应用，简便易行，非常适合用于动物的育种和农畜牧业的高效生产。在此基础上，完成了本发明。

卵泡的分类与成熟

卵泡按形态可以分为五类：(1)原始卵泡(primodial follicles)：卵母细胞外围仅部分被扁平或立方形的颗粒细胞包绕。(2)Ⅰ级卵泡(Primary follicles)：较小的卵母细胞外围完整地被一层立方形颗粒细胞包绕。(3)Ⅱ级卵泡(Secondary follicles):大卵母细胞，外围包绕多于一层的颗粒细胞，经常有鞘膜细胞呈现。(3)三级卵泡(Tertiaryfollicles，or small antral follicles)：大小与Ⅱ级卵泡相似，但含小的卵泡腔。(5)腔室卵泡(Antral follicles)：为一些最大的卵泡，内部其中含大腔室。

伴随排卵，小鼠等哺乳类的卵母细胞同时发生成熟过程。卵母细胞在哺乳类卵巢内的发育和成熟，受到多种激素的调节。如果内分泌紊乱可能导致卵母细胞发育停滞，或者导致细胞核与细胞质的发育成熟过程不同步，进而导致获得的成熟卵母细胞受精率和囊胚形成率显著降低。对于脊椎动物来说，卵母细胞减数分裂成熟过程包括减数第一次分裂的恢复，也称为细胞核成熟启动。卵母细胞核成熟主要特征表现在细胞核的减数第一次分裂的恢复，包括生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)，染色体凝聚和纺锤体形成，以及同源染色体配对与分离等；减数分裂第一次过渡到第二次分裂，并在胞质静止因子的作用下停滞于减数第二次分裂中期。与此同时，细胞质发生一系列协同变化，称为细胞质成熟。这样，可以认为哺乳类的细胞成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟，二者响应卵巢因子而协同发生。生理状况下，在LH峰的诱导下，随着排卵过程，卵母细胞启动成熟过程。发育成熟至特定的状态，也就是达到适宜的成熟状态，在输卵管壶腹部接受精子而受精。如果卵母细胞成熟不足或者过度，均导致受精率和囊胚形成率降低。

然而，目前对于细胞成熟适宜程度的内在指标还不清楚，一般通过受精率和囊胚形成率间接评价卵母细胞发育和成熟的适宜度。

雌激素与DES

雌激素作为一种重要的类固醇激素，主要由卵泡的颗粒细胞产生。在卵泡发生过程中，在促性腺激素的作用下，雌激素(主要是17β-estradiol,E2)由卵泡鞘膜细胞合成雄激素扩散到颗粒细胞转化为雌激素，随着卵泡的生长逐渐增加，到排卵前卵泡雌激素分泌量达到最大。17-beta雌二醇(estradiol，E2)在体内是由卵巢、肾上腺分泌的，它是体内不可缺乏的一种雌性激素。雌激素在雌性生殖成熟方面有重要作用。雌激素可使雌性生殖器官发育成熟，如卵巢卵泡生长，子宫增大，输卵管上皮增生等。雌激素由卵泡产生，反过来通过自分泌调节模式，增加自身的分泌，以进一步促进卵泡发生。其中，E2在卵泡液中的水平是变化的。

雌激素除了自分泌和旁分泌作用，还有复杂的反馈调节作用，主要表现在通过降低GnRH(gonadotropin releasing hormone)的方式下调促性腺激素的分泌。在雌激素促进颗粒细胞生长与增殖的同时，通过促进颗粒细胞胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowth factor1)的合成和细胞间缝隙连接通道的形成而影响卵母细胞发育。

己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)为人工合成的二苯乙烯类雌激素样活性的药物，曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业，以促进动物生长，提高产量。和天然雌激素作用类似，DES可促进生殖器官的生长发育，对下丘脑-垂体-性腺内泌轴起正-负反馈调节作用。

诱导体系

如本文所用，术语“诱导液”、“诱导体系”可以互换使用，指的是含有0.27-1.36μg/ml的雌二醇(优选为1μg/ml)和0.6-6ng/ml的人表皮生长因子(hEGF，优选为1ng/ml)为主要活性成分的卵母细胞体外成熟诱导体系，优选为液体。其中，所述的诱导体系还可以含有其它激素或诱导因子，例如，卵泡雌激素(FSH)、促黄体生成素(LH)。其中，所述其它激素或诱导因子的浓度优选在以下范围内：卵泡雌激素(FSH)浓度为0.05-0.10IU/ml，优选为0.075IU/ml和促黄体生成素(LH)，浓度为0.05-0.10IU/ml，优选为0.075IU/ml。即

较优选地，所述诱导体系含有：

当所述的诱导体系中还额外含有基础培养液，则所述的诱导体系则被称为“卵母细胞体外成熟培养体系”。

卵母细胞体外成熟培养体系

本发明提供了一种含有本发明诱导液以及基础培养液的卵母细胞体外成熟培养体系。其中所述的培养体系含有M199细胞培养基(购自Hyclone)或McCoy’s 5A细胞培养基(购自Sigma)。

此外，所述的基础培养液还可以含有选自以下一种或多种的成分：

优选地，

本发明还提供了一种制备本发明第二方面所述培养体系的方法，包括步骤：

(i)提供0.27-1.36μg/ml的雌二醇和0.6-6ng/ml人表皮生长因子(hEGF)作为离体适宜成熟诱导体系；提供M199或McCoy’s 5A细胞培养基作为基础培养液；

(ii)将一种或多种(i)中的成分进行混合，从而得到所述的培养体系。

(ii)将一种或多种(i)中的成分进行混合，从而得到所述的培养体系。

优选地，所述方法包括：

在M199培养基(Hyclone)中添加丙酮酸钠(sigma，至终浓度10g/L)，谷氨酰胺(sigma，至终浓度1.5g/L)，青链霉素(sigma，终浓度10g/L)和10％(V/V)的胎牛血清(Hyclone)构成卵母细胞基础离体培养液。临用前在基础培养液加入FSH(Organon，终浓度0.075IU/ml)，LH(sigma，终浓度0.075IU/ml)，雌二醇(estradiol,Merck，终浓度1μg/ml)，hEGF(sigma，终浓度1ng/ml)构成为卵母细胞成熟培养液。

体外诱导卵母细胞成熟的方法

本发明还提供了一种体外诱导卵母细胞成熟的方法。具体地，本发明方法包括步骤：

(a)提供哺乳动物的卵母细胞；

(b)将(a)中所述的卵母细胞与所述的培养体系共培养，从而体外诱导获得适宜成熟的卵母细胞。

可用于本发明方法的卵母细胞来源于哺乳动物(尤其是非人哺乳动物)，所述的哺乳动物包括牛、羊、小鼠、大鼠。

本文所指卵母细胞的“成熟”指的是卵母细胞从减数第一次分裂前期(第一次核分裂停滞期)阶段达到减数第二次分裂中期阶段，显微镜下表现为生发泡破裂(germinalvesicle breakdown,GVBD)，以及同源染色体配对与分离，以及排除第一极体等现象。这里指的卵母细胞适宜成熟，是指接近生理状况的成熟状态，具有正常的受精和继续发育潜能。其中不仅核分裂进展至减数第二次分裂中期，而且细胞质具有相应的一系列变化，即与核分裂减数第二次分裂中期相对应的成熟阶段，通常已知的包括皮质颗粒的形成等。

因此，可采用本发明诱导体系或培养体系诱导哺乳动物卵母细胞的成熟。

本发明有益效果

本发明的诱导体系和培养体系是一种体外诱导卵母细胞成熟的培养液，通过添加特定浓度的雌激素以及其它诱导因子，能够有效地促进卵母细胞的细胞质与细胞核的同步成熟，且不影响卵母细胞的后续生育潜能，无致癌、促癌作用，可安全应用于动物育种或胚胎工程。

1.实验试剂和动物

苯甲酸雌激素，上海通用药业股份有限公司，2mg/ml；己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)注射液，上海通用药业股份有限公司，2mg/ml,批号050102。

20日龄小鼠和大鼠，均为SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK(沪)2008-0016。

2.卵巢石蜡切片和HE染色

手术取出卵巢组织，在Bouin’s固定液中4℃固定8～14h。然后用蒸馏水冲洗10min后，经过常规的水和乙醇梯度脱水，石蜡包埋。将包埋的组织块按5μm厚度连续切片，用水充分展片后，将连续的两张切片贴附于经过贴片剂处理的载玻片上，50℃烘片12h后，4℃密封保存。组织石蜡切片，经过常规的二甲苯脱蜡和水和乙醇梯度水化，然后进行常规HE染色，用中性树胶封片。

3.卵泡和卵母细胞的计数

参考已报导的方法，对卵巢中的各级卵泡进行分类并计数。

在4周龄的幼年鼠，卵巢每5张切片取一张，经HE染色后，计数三级早期卵泡和腔室卵泡的数量。为了避免重复，仅仅计数带有卵母细胞核的卵泡。对各张切片的上计数结果累加获得每个卵巢的卵泡数。自三级早期的卵泡和腔室卵泡手术获得卵母细胞用于离体培养，以获得适宜的成熟和继续发育潜能。

利用细胞穿刺手术，自三级早期和腔室卵泡获取的卵母细胞，在提示显微镜下观察并计数。

4.卵母细胞成熟培养液的配制

在M199培养基(Hyclone)中添加丙酮酸钠(sigma，至终浓度10g/L)，谷氨酰胺(sigma，至终浓度1.5g/L)，青链霉素(sigma，终浓度10g/L)和10％(V/V)的胎牛血清(Hyclone)构成卵母细胞基础离体培养液。临用前在基础培养液加入FSH(Organon，终浓度0.075IU/ml)，LH(sigma，终浓度0.075IU/ml)，雌二醇(estradiol,Merck，终浓度1μg/ml)，hEGF(sigma，终浓度1ng/ml)构成为卵母细胞成熟培养液。

5.卵母细胞的离体成熟

用移卵器把在卵泡清洗液中洗去卵母细胞表面残余的血液，然后卵母细胞转移于离体成熟培养液中。每一个500μl悬滴中，移入80粒卵母细胞，在三气培养箱(Binder)中，37℃、5％CO₂条件下培养18h，然后检查卵母细胞成熟情况。在提示显微镜下观察，发现在透明带下具有第一极体，卵母细胞无异常碎裂，判断为适宜成熟。

6.体外受精培养液滴的准备

在受精操作的前一天，配制受精液，即在HTF(第三代，quinn’s advantage)中添加10％(W/V)SPS(血清蛋白代用品，quinn’s advantage)。在35mm直径的培养皿中，制备500微升的受精液滴，覆盖石蜡油，受精条件下平衡过夜，供精子获能用。同样操作，制备15μl的受精液滴供受精用。

7.精子获能

将性成熟的同品系雄鼠(8-12周龄)处死，取其附睾尾。用24号针刺破附睾尾，使精子从附睾尾释放到获能液滴中，放入培养箱孵育1小时使精子获能。在体视显微镜下观察，取分散且呈单个游离状态，并前向游动良好精子用于受精。

8.体外受精

在15μ的受精液中，用移卵器移入50枚排出第一极体的成熟卵母细胞。取10μl精子，加入到受精液滴中，使精子终浓度约～10⁷左右。在37℃、5％CO₂条件下培养4～6h。受精4～6小时后，将卵母细胞从受精液滴中吸出，移入新鲜的受精液滴中，在受精条件下培养过夜，在体视显微镜下检查2-细胞胚胎的数量。

9.胚胎继续培养观察

卵裂液(quinn’s advantage)中添加10％SPS成为卵裂培养液。把2-细胞胚胎转移到卵裂培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养2～5d，观察胚胎发育情况。取生长至囊胚期的胚胎，进行冷冻保存。胚胎冷冻前用过夜平衡的添加10％SPS(W/V)的M2培养液(Sigma,M7167)洗涤3次，然后用冰冷的1mol/L DMSO洗过后，60个囊胚连带5μl 1mol/L DMSO移入冰冷的含100μl DAP123的冻存管中，直接投入液氮保存。其中DAP123由添加10％SPS(W/V)的M2培养液中添加2mol/L DMSO，1mol/L乙酰胺，3mol/L丙乙醇配制。

含有冻存胚胎的冻存管，从液氮中取出，室温放置30～90s，加入预热至37℃的0.25mol/L蔗糖(sigma)1ml，轻轻混匀，捡出胚胎置于过夜平衡的含10％SPS(W/V)的M2培养液，然后移植到假孕母鼠子宫，每个子宫角移植10粒胚胎。

10.数据统计学分析

统计获取的卵泡数和卵母细胞数，利用SPSS 18.0软件进行分析，数据结果以均值形式呈现，并绘制柱状图以形象表示之间的处理组和对照组之间的差异。

实施例1不同的成熟培养液处理卵母细胞诱导离体成熟的比较

同步化的卵泡多集中于三级卵泡早期，不能够自发排卵，也不能够响应人工超排处理而排卵，卵巢中卵泡情况如图1所示。于是，采用本发明的技术，将同步化处理大鼠卵巢，利用针刺手术获得的卵母细胞，在离体条件下培养，以达到适宜成熟。

不同的离体成熟培养液组成，可以影响到大鼠卵母细胞成熟率(图2)。本实验添加雌激素，以及hEGF，LH和FSH，替代垂体前叶素和颗粒细胞培养上清等不明成分的自然结构，仍然获得了理想的成熟率。大鼠和小鼠的卵母细胞和卵丘颗粒细胞复合体的离体状态存在明显差异，小鼠的卵母细胞周围的颗粒细胞容易脱离，而SD大鼠的颗粒细胞与卵母细胞结合比较牢固。本实施例说明，自大鼠卵巢分离的卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体，经过本发明提供的离体成熟培养，均可可以使得卵母细胞达到适宜的成熟。

实施例2本发明培养液用于ICR小鼠卵母细胞的离体成熟

利用ICR小鼠，采用E2和DES进行卵泡同步化处理操作，发现经过两种药物处理导致卵泡发育同步化的结果类似，再利用本发明的卵母细胞离体成熟技术，经过离体成熟达到的成熟细胞数(图3)显著优于对照组。说明经过人工雌激素或DES处理导致同步化发育的卵泡中的卵母细胞，经过本发明的成熟培养，均可以在离体情况下完成成熟过程。

分别通过D2和DES体内处理，卵巢的卵泡发育趋于同步化。获取卵母细胞，采用本发明成熟培养液离体成熟培养，人工受精，在体外培养至囊胚，置于液氮中冷冻2周。把复苏后囊胚接种于假孕4周龄的ICR小鼠子宫。至接种后17天，剖腹产，获取子鼠，计算接种胚胎发育至子代的比例。由图4看出，无论是E2还是DES同步化，经由本发明培养液体外处理卵母细胞来源的胚胎发育至子代的比率不比对照组(Con)低。

实施例3本发明培养液用于BALB/c小鼠卵母细胞的离体成熟

对BALB/c小鼠的实验结果表明，经过E2和DES处理获得卵母细胞，经本发明成熟培养液人工诱导成熟，受精率没有明显降低，这样来自人工同步化处理的卵母细胞，可以在离体情况下完成成熟和受精，说明本发明的离体成熟培养体系适用于BALB/c小鼠品系。

总之，本发明的离体成熟培养体系，可以使得人工方法处理导致卵泡同步化发育的卵母细胞，在离体情况下成熟，并能够继续发育。说明，本发明的离体细胞成熟诱导体系，可用于自发情况下不能够成熟的卵母细胞的成熟诱导。不仅可能用于动物繁育，而且对于卵母细胞成熟障碍的治疗提供参考。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种卵母细胞体外成熟诱导体系，其特征在于，所述诱导体系含有：

雌二醇 0.27-1.36μg/ml，和

人表皮生长因子(hEGF) 0.6-6ng/ml。

2.一种卵母细胞体外成熟培养体系，其特征在于，所述培养体系含有基础培养液和权利要求1所述的诱导体系。

3.如权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系含有：

4.一种体外诱导卵母细胞成熟的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供哺乳动物的卵母细胞；

(b)将(a)中所述的卵母细胞与权利要求2所述的培养体系共培养，从而体外诱导获得成熟的卵母细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的成熟包括达到核分裂的减数第二次分裂中期，且所述细胞质达到与核分裂减数第二次分裂中期相对应的成熟阶段。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的哺乳动物包括牛、羊、小鼠、大鼠、或人。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述卵母细胞处于减数第二次分裂中期之前；

或细胞核成熟分裂已经达到中期II、细胞质未达到与核分裂减数第二次分裂中期相对应的成熟阶段。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述成熟的卵母细胞表现为细胞核处于减数第二次分裂中期，同时有第一极体形成。

9.权利要求1所述诱导体系和/或权利要求2所述培养体系的用途，其特征在于，用于体外诱导哺乳动物卵母细胞的成熟。

10.一种制备权利要求2所述培养体系的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供0.27-1.36μg/ml的雌二醇和0.6-6ng/ml人表皮生长因子(hEGF)作为离体成熟诱导体系；提供M199或McCoy’s 5A细胞培养基作为基础培养液；

(ii)将一种或多种(i)中的成分进行混合，从而得到所述的培养体系。