CN107802633B - 一种中药复方解热抗病毒活性部位及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药复方热毒宁注射液的解热抗病毒活性部位的制备方法及其在制备抗病毒药或者退热药中的应用。本发明公开的制备方法采用大孔吸附树脂柱色谱分离技术;并利用多种化学成分分离方法和现代光谱学分析手段对该活性部位进行化学成分分离及鉴定。本发明中的活性部位体内可显著延长甲型H1N1流感病毒FMI株感染应激小鼠生存时间,降低小鼠的死亡率,并对LPS诱发的内毒素休克小鼠发热有良好的解热效果。因此,热毒宁注射液及其活性部位具有良好的解热以及抗病毒作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域,尤其涉及一种中药复方热毒宁注射液的解热抗病毒活性部位及其制备方法和应用。
背景技术
在正常情况下,人体的产热和散热保持动态平衡。由于各种原因导致产热增加或散热减少,则出现发热。当各种病原体入侵和其他炎症刺激时,单核细胞和巨噬细胞释放白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和干扰诉-γ(IFN-γ)等炎症因子它们作用于视交叉附近的视周器,激活磷脂酶A2(PLA2),通过环氧酶(COX)途径,产生高水平的前列腺素E2(PGE2),刺激下丘脑前部和脑干负责体温调节的神经元。长时间发热对人体有极大的害处。
甲型流感病毒为常见流感病毒,甲型流感病毒最容易发生变异,,病毒基因变异后能够感染人类,感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等,多数伴有严重的肺炎,严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡,病死率很高。
热毒宁注射液具有有效成分复杂,副作用少,资源丰富,价格低廉且作用靶点多的优点,在解热和防治流感病毒方面具有独特的优势和广阔的发展前景。有研究表明热毒宁注射液对内生致热原性发热家兔、细菌内毒素性脂多糖(LPS)发热大鼠、细菌内毒素致家兔发热等有很好的解热效果;对ADV-3、RSV、HRV、人鼻病毒、轮状病毒、SARS病毒、EV71病毒、H5N1病毒及H1N1病毒均有不同程度的抑制或灭活作用。但热毒宁注射液针对具体病症有效成分不明确的特点给安全性也带来了一定隐患,由于现有技术的研究也仅限于对“热毒宁注射液”整体药效的评价,因此,有必要对热毒宁注射液做进一步研究,寻找出能发挥具体药效的活性部位/成分。
发明内容
本发明旨在对热毒宁注射液的解热以及抗病毒作用进一步研究,通过对热毒宁注射液进一步提取纯化,得到活性成分更为明确的具体有效部位。
有鉴于此,本发明提出了一种热毒宁注射液活性部位,其特征在于,以质量百分比计,所述活性部位包括2.0-5.2%的栀子苷,12.2-15.0%的异绿原酸B,15.7-18.8%的异绿原酸A,27.8-32.5%的异绿原酸C。
优选地,所述活性部位包括4.5%的栀子苷,14.0%的异绿原酸B,17.8%的异绿原酸A,30.5%的异绿原酸C。
本发明还提出了一种包括上述活性部位的药物组合物,其特征在于,该药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提出了一种热毒宁注射液活性部位的制备方法,包括如下步骤:
取热毒宁注射液成品减压干燥后得到成品浓缩液,混悬于水中,经大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得。
优选地,所述收集乙醇洗脱液为75%~100%的乙醇洗脱液。
进一步地,所述减压浓缩的温度小于60℃。
具体地,所述大孔吸附树脂柱色谱中的大孔吸附树脂选自D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、DM-301型大孔吸附树脂和AB-8型大孔吸附树脂中的一种或几种。
本发明还提出了热毒宁注射液活性部位在制备抗病毒药物中的应用。所述病毒的种类包括甲型H1N1流感病毒、RSV病毒、EV71病毒以及登革热病毒.,优选为抗甲型H1N1流感病毒。
本发明还提出了热毒宁注射液活性部位在制备退烧药物中的应用。所述退烧药物具体指通过抑制中枢前列腺素的生成和释放而发挥解热作用的药物。
退烧药物具有解热作用,相应的发热是指当人体受到病原体或相应毒素的入侵后,将释放一种内热原,它会使得中枢合成并且释放出更多的前列腺素,由于前列腺素将作用于人体体温的调节过程,调定点将因此提升,生成更多的热,散热却更加困难,最终导致发热。
本发明还提出了包括热毒宁注射液活性部位的药物组合物,所述药物组合物还包括利巴韦林或地塞米松。
本发明通过对热毒宁注射液进一步提取纯化研究,得到了能发挥具体药效的活性部位/成分。实验表明,含有该四个组分的活性部位会有较好的活性,和热毒宁注射液的浓缩物相比,该活性部位在更低的剂量下,也能实现近似的抗病毒效果,且该活性部位具有解热的作用。
附图说明
图1为本发明热毒宁活性部位的HPLC特征图谱。
图2为本发明热毒宁活性部位的色谱峰识别结果图。
具体实施方式
如前所述,本发明旨在提供一种中药复方解热抗病毒活性部位及其制备方法和应用。以下将结合实验例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是,针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者,均按照常规条件或制造商建议的条件进行,所用热毒宁注射液来自江苏康缘药业股份有限公司(批号:Z150812),所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
热毒宁活性部位制备
制备例1:
取热毒宁注射液成品加压干燥得到成品浓缩液1kg,混悬于7.5L水中,经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集75%~100%的乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得解热抗病毒活性部位108g。其中,以质量百分比计,活性部位中的栀子苷为4.5%,异绿原酸B为14.0%,异绿原酸A为18.8%,异绿原酸C为32.5%。
制备例2:
取热毒宁注射液成品加压干燥得到成品浓缩液1kg,混悬于7.5L水中,经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集75%~100%的乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得解热抗病毒活性部位120g。其中,以质量百分比计,活性部位中的栀子苷为5.2%,异绿原酸B为15.0%,异绿原酸A为16.0%,异绿原酸C为28.4%。
制备例3:
取热毒宁注射液成品加压干燥得到成品浓缩液1kg,混悬于7.5L水中,经DM301大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集75%~100%的乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得抗病毒活性部位112g。其中,以质量百分比计,活性部位种的栀子苷为2.0%,异绿原酸B为12.2%,异绿原酸A为15.7%,异绿原酸C为27.8%。
制备例4:
取热毒宁注射液成品加压干燥得到成品浓缩液1kg,混悬于7.5L水中,经D101大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集75%~100%的乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得抗病毒活性部位98g。其中,以质量百分比计,活性部位中的栀子苷为4.0%,异绿原酸B为13.1%,异绿原酸A为16.3%,异绿原酸C为28.6%。
热毒宁活性部位中主要活性物质的含量测定方法
一、热毒宁注射液活性部位的特征图谱的建立
取制备例1中的热毒宁注射液活性部位粉末10.6mg,加入1mL色谱甲醇溶解,14000r/min离心10分钟,取上清液作为供试品溶液。
经过不同的条件优化,最终确定该活性部位的特征图谱的HPLC条件如下:
色谱柱:Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm,5μm)
检测波长:210,254,280,320nm
洗脱条件:1mL/min,梯度如下:
活性部位的特征图谱的HPLC洗脱梯度
根据上述条件分析,比较紫外各波长的图谱,发现254nm检测波长下的图谱基线平稳,色谱峰较多,因此选择254nm波长下的图谱(见图1)。
二、热毒宁注射液活性部位的色谱峰识别
2.1实验材料及设备
Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司),质谱乙腈(默克),甲酸(色谱级),ABSciex API 4000+质谱仪,Agilent 1290infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),Agilent 6538Q-TOF质谱仪(美国安捷伦公司)。
2.2实验条件
2.2.1色谱条件
色谱柱:Agilet Extend-C18(4.6×250mm,5μm)
2.2.2质谱条件
ESI离子源,毛细管电压:-3500V;雾化气压力:60psi;干燥气流速:12L/min;加热毛细管温度:350℃;碎片电压:175V;去离子簇电压:65V;质量数扫描范围:100~1000m/z;碰撞能量:5~30V。实验结果如图2。
该图表明:热毒宁注射液解热抗病毒部位主要的色谱峰为栀子苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。
三、热毒宁注射液活性部位的含量测定
3.1仪器与样品
3.1.1仪器:Agilent 1100液相色谱仪(Agilent 1100四元泵;DAD检测器;自动进样器;Agilent 1100LC色谱工作站);色谱柱:Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm,5μm)(美国菲罗门);电子天平:METTLER XS 205分析天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司);流动相:乙腈(美国天地);其余试剂均为分析纯。
3.1.2样品:活性部位样品由实验室自制。
3.1.3对照品:栀子苷(上海永恒生物科技有限公司,批号:20121020);异绿原酸A(成都普菲德生物科技有限公司,批号:151028);异绿原酸B(成都普菲德生物科技有限公司,批号:16060708);异绿原酸C(成都普菲德生物科技有限公司,批号:140420)。
3.2实验结果
3.2.1目标成分检测方法:栀子苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 4种成分HPLC检测方法如下:
流动相:A相:0.5%甲酸水,B相:乙腈;梯度洗脱,流速:1mL/min;检测波长:210,254,280,320nm。
3.2.2含量测定结果
热毒宁注射液活性部位的抗病毒实验
1.材料
1.1毒株
H1N1亚型流感病毒鼠肺适应株(FM1);中科院武汉病毒所传代保存。
1.2动物模型
SPF级KM小鼠(4周龄,12~15g);购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物质量合格许可证号:SCXK(京)2012-0001。
1.3主要药物
热毒宁注射液冻干粉、热毒宁注射液不同部位冻干粉,由本课题组自制;利巴韦林注射液(Ribavirin,山东鲁抗辰欣药业有限公司,批号11092910411)采用DMSO配制成高浓度无菌母液,在体外活性评价时,采用生理盐水稀释至所需浓度。
1.4实验主要试剂
DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM,美国Hyclone公司),胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS,美国Gibco公司),MTS细胞增殖定量检测试剂盒,(Promega公司,批号0000064219),生理盐水(石家庄西药有限公司)。
1.5仪器
Sartorious-110S万分之一分析天平(德国Sartorious公司),纯水机(Milii-QBiocel EnSpire,美国Miliipore公司),超声设备(CH-300,北京创新德超声电子研究所)。
2.方法
90只KM小鼠随机分为9组,包括:(1)正常对照组(Normal):空白对照组;(2)病毒对照组(Virus):病毒组;(3)模型对照组(Model):拘束+病毒;(4)阳性药组(Ribavirin):拘束+病毒+地塞米松180mg/kg/d;(5)RDN:拘束+病毒+RDN 520mg/kg/d;(6)ZB1:拘束+病毒+ZB156mg/kg/d;(7)ZB2:拘束+病毒+ZB262mg/kg/d;(8)ZB3:拘束+病毒+ZB351mg/kg/d;(9)ZB4:拘束+病毒+ZB461mg/kg/d。
除正常和病毒对照组外,其余各组小鼠拘束应激18h(15:00pm一次日9:00am)。小鼠拘束装置为通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管,拘束期间小鼠禁水禁食,其他组小鼠同样禁水禁食。小鼠于拘束后一天开始腹腔注射给药,各组每日分两次给药。小鼠拘束负荷18h后恢复3天,在乙醚轻度麻醉下,用已稀释流感病毒液(2LD50)滴鼻感染,用100μL移液枪滴鼻,每鼠35μL,正常对照组小鼠滴鼻等体积的灭菌生理盐水。逐日观察动物发病与死亡数,连续观察3周,并记录小鼠体重、死亡数以及死亡时间。小鼠流感发病率为观察指标之一,以组内健康小鼠的百分率表示。小鼠的发病情况可以从小鼠体重的变化上判定:同一只小鼠与前一天相比,其体重减少大于1g(或者其体重减少量大于0.5g但第二天便死亡),便可判定为已发病。
实验结果见表1。
表1感染病毒后21天内各组小组生存率变化趋势
注:与空白组相比#P<0.05,##P<0.01;与病毒组相比@P<0.05,@@P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01
由表1中可以看出,与模型组相比,4种制备方法得到的热毒宁有效部位均可以延长生存时间并降低死亡率,其中制备1方法得到的馏分ZB1对甲型H1N1流感病毒FMI株感染应激小鼠的保护作用最为明显,故认为制备例1得到的活性部位抗病毒效果最好。
热毒宁注射液活性部位的解热实验
1.材料
1.1动物模型SPF级小鼠;购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物质量合格许可证号:SCXK(京)2012-0001
1.2实验药物
热毒宁注射液冻干粉、热毒宁注射液不同部位冻干粉,由本课题组自制;地塞米松(Dexamethasone,Dex,D4902,美国Sigma公司)采用DMSO配制成高浓度无菌母液,在体活性评价时,采用生理盐水稀释至所需浓度。
1.3实验主要试剂
DMEM培养基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM,美国Hyclone公司),胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS,美国Gibco公司),青霉素G(Penicillin G,齐鲁制药有限公司),链霉素(Streptomycin,齐鲁制药有限公司),PBS缓冲液(Phosphate bufferedsaline,PBS,美国Gibco公司),二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO,美国Sigma公司),Lipopolysaccharides(LPS,Escherichia coli:Serotype O55:B5,美国Sigma公司),生理盐水(石家庄西药有限公司)。
1.4实验仪器
Sartorious-110S万分之一分析天平(德国Sartorious公司),涡旋振荡仪(美国Scientific Instrument公司),台式高速冷冻离心机(Biofuge Stratos,德国Heraeus公司),纯水机(Milii-Q Biocel EnSpire,美国Miliipore公司),超声设备(CH-300,北京创新德超声电子研究所),EnSpire多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司),Envsion多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司),IncuCyte ZOOM(美国Essen Bioscience),玻璃毛细管(0.5mm/100mm,华西医科大学仪器厂),红外电子体温计(欧姆龙,MC-510)
2.方法
80只体温检测合格小鼠随机分为8组,包括:(1)正常对照组(Normal);(2)模型对照组(Model):0.5mg/kg LPS;(3)阳性药组(Dex):5.0mg/kg地塞米松;(4)RDN:300mg/kgRDN;(5)ZB1:32mg/kg;(6)ZB2:36mg/kg;(7)ZB3:30mg/kg;(8)ZB4:35mg/kg。小鼠称量体重,记录,并计算给药量:给药量=(给药剂量/药物配制浓度)×小鼠体重。
各药物组分别腹腔注射给予上述各药物相应剂量,正常对照组给予同等剂量生理盐水。1h后LPS组和各药物组小鼠分别腹腔注射给予0.5mg/kg LPS,对照组给予同等剂量生理盐水。给予LPS处理后0、3、6h时,各组小鼠分别进行体温检测(体温检测方法:令待测体温小鼠单只于鼠笼上自由爬行,采用红外电子体温计点触小鼠背部皮肤(为减少检测误差,尽量保证检测区域为每只小鼠背部同一区域,此处均检测小鼠背部左前区域),当红外电子体温计发出蜂鸣声,拿开体温计,即可于电子体温计屏幕上查看小鼠体温数值。并记录,观察小鼠状态。
实验结果见表2。
表2RDN及其不同部位对发热小鼠体温的影响(/℃)
注:与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05##P<0.01;mean±SD,n=5
由表2中可以看出,RDN对LPS诱导的内毒素休克小鼠发热具有缓解作用,4种制备方法得到的活性部位对LPS诱导的内毒素休克小鼠的发热也呈现出不同程度的缓解作用,其中制备例1方法得到的解热作用最强。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种热毒宁注射液活性部位,其特征在于,所述热毒宁注射液活性部位的制备方法,包括如下步骤:
取热毒宁注射液成品减压干燥后得到成品浓缩液,混悬于水中,经大孔吸附树脂柱色谱分离,依次以水、20%、30%、60%、75%、100%乙醇洗脱,收集75%~100%的乙醇洗脱液乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,冷冻干燥后即得;
所述减压浓缩的温度小于60℃;
所述大孔吸附树脂柱色谱中的大孔吸附树脂选自D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、DM-301型大孔吸附树脂和AB-8型大孔吸附树脂中的一种或几种;其中,
以质量百分比计,所述活性部位包括2.0-5.2%的栀子苷,12.2-15.0%的异绿原酸B,15.7-18.8%的异绿原酸A,27.8-32.5%的异绿原酸C。
2.如权利要求1所述活性部位,其特征在于,以质量百分比计,所述活性部位包括4.5%的栀子苷,14.0%的异绿原酸B,17.8%的异绿原酸A,30.5%的异绿原酸C。
3.一种包括权利要求1或2所述活性部位的药物组合物,其特征在于,该药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
4.如权利要求1或2所述活性部位在制备抗H1N1型流感病毒药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述活性部位在制备退烧药物中的应用。
6.一种包括权利要求1或2所述活性部位的药物组合物,所述药物组合物还包括利巴韦林或地塞米松。
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热毒宁注射液药效物质基础研究;李海波;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20140515;第12-13,16页 * |
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