CN107245529A - 血液病融合基因筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血液病融合基因筛查方法，包括以下步骤：提取人体血液RNA样本，得到RNA模板；使用具有多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液对RNA模板进行反转录，得到cDNA；将cDNA分组进行巢式PCR扩增；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到阳性分组；将阳性组的单管进行巢式PCR扩增；将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。本发明提供的基因筛查方法针对初诊血液病患者未经治疗，其融合基因的比例较高的特点，使用包括多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液分组对RNA模板进行反转，检测效率高，只需要一次PCR检测，检测工作量较小，检测准确度较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液病融合基因筛查方法，属于医药和生物技术领域。
背景技术
白血病是一种造血干/祖细胞发生恶性变的异质性造血系统肿瘤，以异常造血细胞的恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血细胞减少为特征。在人群中发病率是3/10万-4/10万人口，且有逐年上升趋势。白血病的发生是一个复杂而多步骤的过程，其中基因组异常在白血病发病中起关键作用，这些异常包括染色体易位、基因突变等。在急性白血病中约50％以上的患者可发现特征性的非随机染色体易位，大多数染色体易位累及在正常造血调控中起重要作用的基因如编码转录因子或酪氨酸激酶的基因。染色体易位可形成具有肿瘤特性的融合基因，也可使一些在细胞生长/凋亡调控过程中起重要作用的基因表达失控，从而干扰细胞增殖、分化、成熟与凋亡的正常调节途径。白血病分子生物学的研究，已成为当代白血病研究的中心与主题。原有白血病的单纯MIC(形态学、免疫学、细胞遗传学)分型，已存在着严重不足，对临床的化疗和预后判断具有一定的局限性，现已发展到在MIC分型的基础上引进了基因分型(M)，并随着白血病基因分型的进一步完善，对白血病诊断、制订合理的治疗方案及预后判断有重要的指导意义。2002年世界卫生组织(WHO)根据MICM(形态学、免疫分型、细胞遗传学和分子生物学)制定了新的分型标准，将白血病染色体结构畸变以及融合基因作为基本诊断标准之一。
目前融合基因的检测技术多种多样。在过去30年里，细胞遗传学分析已成为遗传学研究和恶性血液病临床诊断的重要方法,染色体核型分析仍是检测染色体畸变的常规方法。据报道已发现至少50多种与白血病相关类型特异的染色体易位。通过染色体核型分析很难识别如此众多的染色体易位，而且，白血病往往不易获得分散较好的容易分辨的核型，必须获得足够多的核型才能确切了解患者的染色体畸变情况。许多染色体易位和畸变即使有经验的染色体核型检测者，识别也十分困难，或根本不能用这种方法检出。近年来新的分子生物学技术大大提高了细胞遗传学分析的分辨率，聚合酶链反应(polymerase chainreaction PCR)是一种体外特定核苷酸序列扩增技术，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。巢式逆转录PCR(nestedreverse transcription polymerase chainreaction RT-PCR)技术，利用两套PCR引物(巢式引物)对逆转录合成的cDNA进行两轮PCR扩增反应。可以将普通PCR的敏感性再提高100倍。因此，PCR扩增染色体断裂点易位形成的融合基因的方法得到了广泛采用。由于使用上游、下游两对引物，行两次PCR反应，因而一致认为该种检测方法较细胞遗传学敏感，具有较高的灵敏度和特异性。目前灵敏度已达万分之一到十万分之一，是当今检测融合基因及MRD较灵敏手段。PCR方法虽然敏感和有效，但通常需要得知白血病是否有确切的染色体易位。在无法得知确切的染色体易位之前，只能对每个病例进行多次独立的PCR反应，不仅浪费大量时间和样本，工作量也大，却未必能获得确切结果。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种血液病融合基因筛查方法，解决了现有的融合基因检测，在无法得知确切的染色体易位之前，只能对每个病例进行多次独立的PCR反应，不仅浪费大量时间和样本，工作量也大，检测结果不准确的缺陷。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供的一种血液病融合基因筛查方法，包括以下步骤：
提取人体血液RNA样本，得到RNA模板；
使用包括多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液分组对RNA模板进行反转录，得到cDNA；
将cDNA分组进行巢式PCR扩增；
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到阳性分组；
将阳性组的单管进行巢式PCR扩增；
将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。
可选的，所述血液病融合基因为：
可选的，所述血液病融合基因的特异性反转录引物为：
可选的，所述巢式PCR扩增包括两轮扩增程序，分别为第一轮扩增程序和第二轮扩增程序，每轮分为12个组别，每条特异性反转录引物的浓度为2pmol/μl；其中第一轮特异性反转录引物及分组为：
；第二轮特异性反转录引物及分组为：
可选的，所述逆转录反应液包括：模板RNA(10-20)μl，血液病融合基因的特异性反转录引物(1-2)μl。
可选的，RNA模板进行反转录的步骤包括：
将逆转录反应液升温至65±1℃，保温(5-10)min；
然后冰浴至少2min
冰浴后，在逆转录反应液中加入5×PCR Buffer(4-8)μl、高效率逆转录酶(1-2)μl、双蒸水(4-8)μl进行混合，
将混合液置于PCR仪中反应，其PCR仪反应程序如下：第一阶段37℃、60min，第二阶段：98℃、5min。
可选的，所述第一轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
可选的，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25个循环，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
可选的，所述第二轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
可选的，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25轮，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
(三)有益效果
本发明提供的一种血液病融合基因筛查方法，其具有以下优点：
本发明提供的基因筛查方法针对初诊血液病患者未经治疗，其融合基因的比例较高的特点，使用包括多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液对RNA模板进行反转，检测效率高，只需要一次PCR检测，检测工作量较小，检测准确度较高。
附图说明
图1本发明的实施例1分组巢式PCR扩增电泳结果；
图2本发明的实施例1Z4单管验证PCR扩增电泳结果；
图3本发明的实施例2分组巢式PCR扩增电泳结果；
图4本发明的实施例2Z6单管验证PCR扩增电泳结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明涉及的专业术语：
PCR：聚合酶链式反应；
5×PCR Buffer:5倍的PCR缓冲液
2×Buffer:2倍的缓冲液；
dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate(脱氧核糖核苷三磷酸)；
ReverTra Ace：一种高效率逆转录酶；
Primer：引物；
LA-Taq酶：一种具有热稳定性的DNA聚合酶。
RNA的提取：
准备1.5ml EP管若干，分别做好对应的样本标记；每个已标记的EP管中加入1000ul红细胞裂解液；将EDTA抗凝全血样本颠倒混匀后，分别吸取500ul加入到相应标记的EP管中混匀，室温静置5Min，期间颠倒混匀数次；3500rpm离心5min，弃上清。观察沉淀量，要求大于5倍肉眼可见量；若沉淀量不足，则在此管中重复步骤“2-4”，直至有足够量沉淀；分别加入5000ul红细胞裂解液混匀，室温静置5Min，期间颠倒混匀数次；3500rpm离心5min，弃上清。吸弃残留红细胞碎片；分别加入1000ultrizol，吹打彻底混匀沉淀；分别加入200ul氯仿,彻底混匀，室温静置2min；12000rpm 4℃离心15min；准备1.5mlEP管若干，分别做好对应的样本标记，加入5000ul异丙醇冰冻保存；将上清小心吸出500ul，分别加入到已标记的有冰异丙醇EP管中混匀，冰上静置5min；12000rpm 4℃离心10min；弃上清，分别加入500ul75％冰乙醇，轻轻混匀；12000rpm 4℃离心10min；弃上清，风干数分钟至液体全部挥发；分别加入RNase-Free ddH2O 50ul；分别测定样本RNA纯度和浓度。
本发明提供的一种血液病融合基因筛查方法，包括以下步骤：
提取人体血液RNA样本，得到RNA模板；
使用包括多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液分组对RNA模板进行反转录，得到cDNA；
将cDNA分组进行巢式PCR扩增；
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到阳性分组；
将阳性组的单管进行巢式PCR扩增；
将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。
其中，所述血液病融合基因为：
其中，所述血液病融合基因的特异性反转录引物为：
需要说明的是，特异性反转录引物均为市面上可以采购的试剂，为常规试剂，例如深圳益生堂生物公司提供的反转录引物。
其中，所述巢式PCR扩增包括两轮扩增程序，分别为第一轮扩增程序和第二轮扩增程序，每轮分为12个组别，每条特异性反转录引物的浓度为2pmol/μl；其中第一轮特异性反转录引物及分组为：
；第二轮特异性反转录引物及分组为：
其中，所述逆转录反应液包括：模板RNA(10-20)μl，血液病融合基因的特异性反转录引物(1-2)μl。
其中，RNA模板进行反转录的步骤包括：
将逆转录反应液升温至65±1℃，保温(5-10)min；
然后冰浴至少2min
冰浴后，在逆转录反应液中加入5×PCR Buffer(4-8)μl、高效率逆转录酶(1-2)μl、双蒸水(4-8)μl进行混合，
将混合液置于PCR仪中反应，其PCR仪反应程序如下：第一阶段37℃、60min，第二阶段：98℃、5min。
其中，所述第一轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
其中，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25个循环，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
其中，所述第二轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
其中，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25轮，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
实施例1：
逆转录引物(primer mix)配制
按下列组份配制逆转录反应液(1人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| Template RNA | 10 |
| Primer mix | 1 |
上述混合液置于65℃，5min后，冰浴2min以上。
冰浴后加入以下试剂：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| 5×PCR Buffer | 4 |
| ReverTra Ace | 1 |
| ddH2O | 4 |
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
PCR反应
引物分组设置
包含两轮扩增程序，每轮分为12个组别，分组情况如下：
第一轮引物及分组：
第二轮引物及分组：
每组按照每条引物2pmol/ul配制。
第一轮PCR反应(使用第一轮分组引物)
按下列组份配制PCR反应体系(一人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| 2×Buffer | 10 |
| dNTP | 5 |
| LA-Taq酶 | 0.4 |
| 模板 | 2 |
| Primer mix(2pmol/ul) | 2.6 |
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
第二轮PCR反应(使用第二轮分组引物，模板使用第一轮PCR产物)
按下列组份配制PCR反应体系(一人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| 2×Buffer | 10 |
| dNTP | 5 |
| LA-Taq酶 | 0.4 |
| 模板(第一轮产物) | 2 |
| Primer mix | 2.6 |
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
电泳鉴定：
将反应管打开并取扩增产物3ul进行1％-2％琼脂糖凝胶电泳，每排凝胶必须带有一个Marker,100V恒压电泳15-30min，结束后将凝胶放入凝胶成像仪，在凝胶成像仪中对PCR结果进行判读,结果为Z4阳性(见附图1)。
结果判读：内参E2A片段大小671bp，如泳道中出现多条条带，表示有阳性结果。
单管验证，确认阳性分组。
单管PCR体系配制，每组检测融合基因类型如下：
阳性组的单管进行巢式PCR扩增；其配置体系和扩增程序与前段的巢式PCR扩增相同。
将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。电泳鉴定：
将反应管打开并取扩增产物3ul进行1％-2％琼脂糖凝胶电泳，每排凝胶必须带有一个Marker,100V恒压电泳15-30min，结束后将凝胶放入凝胶成像仪，在凝胶成像仪中对PCR结果进行判读，确定为AML-ETO融合基因阳性(见附图2)。
准确性验证：用实时荧光定量PCR的方法验证AML-ETO，发现融合比例为68.52％，符合实验结论。
实施例2：
逆转录引物(primer mix)配制
按下列组份配制逆转录反应液(1人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| Template RNA | 20 |
| Primer mix | 2 |
上述混合液置于65℃，5min后，冰浴2min以上。
冰浴后加入以下试剂：
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
PCR反应
引物分组设置
包含两轮扩增程序，每轮分为12个组别，分组情况如下：
每组按照每条引物2pmol/ul配制。
第一轮PCR反应(使用第一轮分组引物)
按下列组份配制PCR反应体系(一人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| 2×Buffer | 20 |
| dNTP | 10 |
| LA-Taq酶 | 0.8 |
| 模板 | 4 |
| Primer mix(2pmol/ul) | 5 |
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
第二轮PCR反应(使用第二轮分组引物，模板使用第一轮PCR产物)
按下列组份配制PCR反应体系(一人份)：
| 试剂名称 | 用量(ul) |
| 2×Buffer | 20 |
| dNTP | 10 |
| LA-Taq酶 | 0.8 |
| 模板(第一轮产物) | 4 |
| Primer mix | 5 |
将混合液置于PCR仪中，反应程序如下：
电泳鉴定：
将反应管打开并取扩增产物3ul进行1％-2％琼脂糖凝胶电泳，每排凝胶必须带有一个Marker,100V恒压电泳15-30min，结束后将凝胶放入凝胶成像仪，在凝胶成像仪中对PCR结果进行判读，结果为Z6阳性(附图3)。
结果判读：内参E2A片段大小671bp，如泳道中出现多条条带，表示有阳性结果。
单管验证，确认阳性分组
单管PCR体系配制，每组检测融合基因类型如下：
Z6组的单管进行巢式PCR扩增；其配置体系和扩增程序与前段的巢式PCR扩增相同。
将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。电泳鉴定：
将反应管打开并取扩增产物3ul进行1％-2％琼脂糖凝胶电泳，每排凝胶必须带有一个Marker,100V恒压电泳15-30min，结束后将凝胶放入凝胶成像仪，在凝胶成像仪中对PCR结果进行判读,结果为NUMA1-RARA融合基因阳性(附图4)。
准确性验证：用实时荧光定量PCR的方法验证NUMA1-RARA,发现融合比例为14.98％,符合实验结论。
实施例1和实施例2的数据中可以看出，本发明提供的基因筛查方法针对初诊血液病患者未经治疗，其融合基因的比例较高的特点，使用包括多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液对RNA模板进行反转，并分组进行多重巢式PCR反应。检测范围广，效率高，只需要一次PCR检测，检测工作量较小，检测准确度较高，完全符合实验结论。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此即限制本发明的专利保护范围，凡是运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种血液病融合基因筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：：
提取人体血液RNA样本，得到RNA模板；
使用具有多种的血液病融合基因的特异性反转录引物的逆转录反应液对RNA模板进行反转录，得到cDNA；
将cDNA分组进行巢式PCR扩增；
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到阳性分组；
将阳性组的单管进行巢式PCR扩增；
将阳性组的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定融合基因类型。
2.如权利要求1所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述血液病融合基因为：
3.如权利要求2所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述血液病融合基因的特异性反转录引物为：
4.如权利要求3所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述巢式PCR扩增包括两轮扩增程序，分别为第一轮扩增程序和第二轮扩增程序，每轮分为12个组别，每条特异性反转录引物的浓度为2pmol/μl；其中第一轮特异性反转录引物及分组为：
第二轮特异性反转录引物及分组为：
5.如权利要求4所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述逆转录反应液包括：模板RNA(10-20)μl，血液病融合基因的特异性反转录引物(1-2)μl。
6.如权利要求5所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，RNA模板进行反转录的步骤包括：
将逆转录反应液升温至65±1℃，保温(5-10)min；
然后冰浴至少2min
冰浴后，在逆转录反应液中加入5×PCR Buffer(4-8)μl、高效率逆转录酶(1-2)μl、双蒸水(4-8)μl进行混合，
将混合液置于PCR仪中反应，其PCR仪反应程序如下：第一阶段37℃、60min，第二阶段：98℃、5min。
7.如权利要求4所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述第一轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
8.如权利要求7所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25个循环，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
9.如权利要求4所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述第二轮扩增程序中，配制的PCR反应体系中包括：2×Buffer(10-20)μl，dNTP(5-10)μl，LA-Taq酶(0.4-0.8)μl，RNA模板(2-4)μl，特异性反转录引物(2.6-5)μl。
10.如权利要求9所述的血液病融合基因筛查方法，其特征在于，所述第一轮扩增程序的反应程序为第一阶段：95℃、5min；第二阶段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25轮，第三阶段：72℃、2min，4℃、∞。
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2017
- 2017-08-08 CN CN201710671180.XA patent/CN107245529A/zh active Pending
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