CN106814187A - 外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用 - Google Patents

外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用，肿瘤患者的外周血中的游离外泌体的特异性标志物CD9的表达水平明显高于对照组健康个体中的外泌体CD9的水平，其作为肿瘤诊断标志物的特异性和敏感性高。本发明还提供了用于肿瘤诊断的试剂盒，包含检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂：(1)用于从外周血中分离总外泌体的总外泌体分离试剂；(2)用于从所述总外泌体中提纯肿瘤来源外泌体的EpCAM分离磁珠；(3)用于检测所述肿瘤来源外泌体中特异性标志物表达的Elisa检测试剂。该试剂盒可以用于进行肿瘤诊断与监控，尤其是进行肿瘤高危人群的筛查、早期无创诊断或患者的预后评估。

Description

外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学及生物检测领域，具体涉及外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害我国人民生命健康的第一大疾病。随着我国现代化建设不断加快和日益严重的环境污染，癌症的发病率还呈明显上升趋势。
活检术是临床用来对可疑肿块进行病理学确诊的最常用方法，然而从原位肿瘤不同部位及转移灶的穿刺组织的基因组学研究发现肿瘤存在显著的异质性，而该技术仅可以向患者提供疾病进展单一方面的信息。而且，肿瘤组织活检方法是侵入性的，会对患者造成侵入性创伤，对患者而言非常疼痛且费用昂贵。至于CT、B超等常规影像学检查，更加只能从肿瘤大小与性质上进行判别。显然，目前的检查方式无法满足更精准的个体化治疗需求。因此，开发研究新的、能早期的、方便的、能监控的肿瘤无创诊断新方法在我国有重大需求。
液态活检是一种非侵入式的无创血液测试，能监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)，循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片或者外泌体，是检测肿瘤、辅助治疗的突破性技术。
其中，体液活检检测循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)或循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是目前被评价最有前景临床转化的肿瘤监测方法。但是，由于外周血中CTCs数量稀少，且具有异质性和易聚集成团等特 点，目前的体液活检CTCs检测方法存在假阳性或假阴性较高的问题亟待解决。同样，由于血液中多数循环DNA并非起源于肿瘤，外周血中ctDNA的数量也非常少，而用于痕量DNA分子的检测和定量分析的现代DNA测序技术的敏感性极高，从而增加了检测的非特异性。而且，目前最灵敏的ctDNA检测技术，比如BEAMing等技术，依赖的都是已经非常明确的待测突变，但是这些突变信息还是只能通过组织活检的方法才能够获得。也就是说，我们只能先进行组织活检，对标本进行测序，发现突变位点信息之后，根据这些突变信息设计出特异性的探针，然后才能够进行ctDNA液体活检。不过也可以像Rosenfeld等人那样进行全外显子组测序。这就不需要预先知道突变信息，但是目前进行这种测序的成本非常高，还不太现实。此外，ctDNA数量变异度非常大(早期和晚期肿瘤释放的ctDNA数量差异非常大)，并且有非常大的个体差异，ctDNA检测技术对于早期肿瘤患者的检测效果并不太好。因此，ctDNA检测技术目前仍不太适合应用于临床。
癌细胞在生殖和转移过程中会分泌外泌体(Exosome)。外泌体是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在体液如血清、血浆、尿液中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，因此提取细胞外的外泌体用于疾病、肿瘤等的诊断、监控有巨大的应用潜能。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供外周游离外泌体在制备液态活检肿瘤诊断试剂中的应用，具体为外周血中的游离外泌体的特异性标志物在制备肿瘤诊断试剂中的应用，利用肿瘤诊断试剂，提取血浆或血清中的总游离外泌体、分选纯化出肿瘤相关外泌体、再检测外泌体的特异性标志物的表达，来进行肿瘤诊断与监控，尤其是进行肿瘤高危人群的筛查、早期诊断或患者的预后评估。
本发明的以上目的通过以下技术方案实现：
本发明的一个方面在于提供外周血中的游离外泌体的特异性标志物在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
就本发明的上述应用，所述特异性标志物优选为CD9。
就本发明的上述应用，所述诊断试剂通过检测被试者外周血中游离外泌体的特异性标志物CD9表达，并与健康对照组的平均水平相比较，以此来判断被试者的肿瘤患病风险。
就本发明的上述应用，所述肿瘤诊断试剂包括：用于肿瘤高危人群的筛查的试剂、用于肿瘤早期诊断的试剂、或者用于肿瘤患者的预后评估的试剂。
本发明的另一个方面在于提供一种用于肿瘤诊断的试剂盒，包括：用于肿瘤高危人群的筛查的试剂盒、用于肿瘤早期诊断的试剂盒、或者用于肿瘤患者的预后评估的试剂盒，其包含检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂。
就本发明的上述试剂盒，所述特异性标志物优选为CD9。
在本发明上述试剂盒的一些实施方案中，所述检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂包括：
(1)用于从外周血中分离总外泌体的总外泌体分离试剂；
(2)用于从所述总外泌体中提纯肿瘤来源外泌体的上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗体标记分离磁珠(简称为EpCAM分离磁珠)；
(3)用于检测所述肿瘤来源外泌体中特异性标志物表达的Elisa检测试剂。
在本发明上述试剂盒的一些实施方案中，所述Elisa检测试剂包括能够结合、吸附和/或偶联所述特异性标志物的抗体。
在本发明上述试剂盒的一些实施方案中，所述Elisa检测试剂包括：CD9一抗和HRP酶标二抗。
在本发明上述试剂盒的一些实施方案中，所述Elisa检测试剂还包括用于Elisa检测的常规试剂。
在本发明上述试剂盒的一些实施方案中，所述用于Elisa检测的常规试剂包括：酶标板、封闭液、TMB显色液、终止溶液。通常，所述用于Elisa检测的常规试剂还包括有适量的PBS溶液和PBST溶液。其中，所述酶标板优选高结合力酶标板。所述封闭液优选含5％脱脂牛奶的PBST溶液。
在本发明上述试剂盒的一些具体的实施方案中，所述Elisa检测试剂中，所述CD9一抗的浓度为0.0000373～0.0003733μg/μl，所述HRP酶标二抗的浓度为0.0004～0.00004μg/μl。
在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述癌症是肾癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌或卵巢癌等。在一个实施方案中，优选肾癌，包括原发性肾癌、肾透明细胞癌、转移性肾癌、或继发性肾癌。
本发明中，以肾癌为例，首先，使用总外泌体分离试剂从血浆样本中提取外泌体，并且使用EpCAM分离磁珠选择性地提纯出上皮细胞粘附分子阳性的肿瘤来源外泌体；然后，使用Elisa检测试剂测定CD9在肿瘤来源外泌体以及对照中的表达水平，发现：肾透明细胞癌患者中的外泌体CD9的表达水平明显高于对照组健康个体中的外泌体CD9的水平(P<0.001)；ROC曲线分析显示使用外周游离exosome CD9来区别肾透明细胞癌患者和对照组健康人的敏感性为93％，特异性为97％。因此，外周游离exosome CD9，作为肾透明细胞癌中的潜在的生物标记物，可作为一种临床检测肿瘤的有效工具。因此，本发明可以检测各人群外周游离外泌体中CD9的表达水平，从而诊断肾癌患者的患病风险，筛查高危人群，并对肾癌患者做出早期、快速的无创性诊断。本发明对肾癌诊断特异性好，操作简单，不仅可用于肾癌的早期诊断，而且可以用于肾癌患者的大规模筛查和患病风险的预测，为肾癌的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
同样的实验以及结果在肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌患者中进行和证实。由于肿瘤细胞在其发生发展中能释放大量的外泌体，而且释放的量高于正常细胞，所以检测肿瘤的外泌体能够先于检测其他方法如CTC。通过EpCAM抗体的磁珠筛选方法，能很好的从总外泌体中筛出与肿瘤相关的外泌体，再通过检查肿瘤相关的外泌体中CD9的表达，可以进一步提高诊断特异性。因此，本发明可以检测各人群外周游离外泌体中CD9的表达水平，从而诊断肿瘤患者的患病风险，筛查高危人群，并对肿瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。本发明对肿瘤诊断特异性好，操作简单，不仅可用于肿瘤的早期诊断，而且可以用于肿瘤患者的大规模筛查和患病风险的预测，为肿瘤的早期诊断和预测提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)由于肿瘤细胞释放的外泌体在数量上远多于CTC，更易获取和富集；在形式上能够有效保护核酸类物质，克服了ctDNA在血液中容易降解的问题，因此，本发明中的外周游离外泌体中CD9作为一种新型生物标记物，不仅非侵入性、易于检测，而且稳定、定量精确，大大提高疾病诊断试剂的敏感性和特异性。
(2)肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到周围环境中去，外泌体可以保存更长时间，并且肿瘤相关外泌体中CD9足够稳定，通过在血液中分离肿瘤相关外泌体并根据其中CD9表达来进行诊断，克服了直接利用血液提取分子进行诊断时血液中非检测物质的影响，而且，采用EpCAM分离磁珠获得上皮细胞粘附因子阳性的外泌体，准确性和特异性非常高，并在一定程度上避免非上皮细胞源性的二次干扰，检验结果更加真实、精确，从而有助于肿瘤的早期诊断和预后判断。
(3)并非所有在组织或外周血中过表达的CD9都能被装载到分泌的肿瘤相关外泌体中，本发明中的诊断试剂通过总游离外泌体的提取、肿瘤相关外泌体的分选纯化、外泌体的特异性标志物CD9表达的检测，完成对外周血中肿瘤来源的外泌体中CD9表达的检测，敏感性高、特异性好。
(4)本发明中，通过检测外周血外泌体来源的CD9的表达来诊断肿瘤是否发生的试剂盒，是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，将其用于肿瘤患者的辅助诊断，不但能更好的对肿瘤患者进行诊断，提早治疗，而且使得检验结果更加灵敏，特异，还有助于反映肿瘤患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
附图说明
图1是本发明实施例2的步骤(一)所得产物的电子显微镜照片。
图2a是本发明实施例2的步骤(一)所得产物在明场图；图2b是对本发明实施例2的步骤(一)所得产物进行的荧光图。
图3a和图3b是对本发明实施例2的步骤(一)所得产物中EpCAM表达进行流式细胞仪分析的检测结果。
图4是对本发明实施例2的步骤(一)所得产物中的蛋白Hsp70、Tsg101表达的免疫印迹(Western Blot)检测结果。
图5是30例肾癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
图6是采用ROC曲线分析来评价使用外周游离exosome CD9检测来作为检测肾透明细胞癌的诊断工具的可行性。
图7是30例肺癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
图8是30例食管癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
图9是30例乳腺癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
图10是30例胃癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
图11是30例卵巢癌患者和正常中外周游离exosome的CD9检测的比较与统计分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。
下列实施例中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源，仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
实施例1制备检测试剂盒
以1m l的血浆为对象：
(1)200μl总外泌体分离试剂(Total Exosome Isolation,Invitrogen)；
(2)20μl EpCAM分离磁珠(EpCAM beads,Invitrogen)、3ml的1×PBS；
(3)Elisa检测试剂盒，包括：
100μl 1:5000稀释的CD9一抗(proteintech)(原始浓度56μg/150μl，1:5000稀释后浓度为0.0000746μg/μl)；
100μl 1:10000稀释的HRP酶标二抗(sigma)(原始浓度0.4μg/μl，1:10000稀释后浓度为0.00004μg/μl)；
高结合力酶标板；200μl含5％脱脂牛奶的PBST做封闭液；100μl TMB显色液；100μl终止溶液；200μl的1×PBS；12*200μl的1×PBST。
其中，PBS是指磷酸缓冲盐溶液，PBST是在PBS中含有Tween-20，Tween-20在整个PBST溶液中的质量百分比为0.05％。
实施例2采用实施例1的试剂盒检测肾癌患者外周游离外泌体的CD9表达
(一)肿瘤外泌体的提取与纯化
①得到患者知情及伦理的同意下，收集肿瘤患者病人(病理活检已经确认为肾透明细胞癌)术前的血液标本10ml于采血管中，在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，分离以去除血液中的细胞，然后得到1ml上层血浆。
②将血浆在4℃、10000g的离心条件下离心30分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液。
③将上清液移入新的离心管中，并向其中加入200μl exosome抽提液(TotalExosome Isolation,Invitrogen)混合，震荡均匀后，4℃孵育过夜(6～16小时均可)，然后，将孵育后的混合液在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的血浆总外泌体(exosome)。
④用0.5ml的1×PBS将③所得血浆总外泌体进行重悬，得到总外泌体的重悬液。
⑤将20μl抗体磁珠(EpCAM beads,Invitrogen)和1ml的1×PBS在另一新的离心管中混匀后上磁力架吸附2分钟，移除管内液体，这样在该离心管中吸附有EpCAM抗体标记磁珠。
⑥将上述④所得的0.5ml总外泌体的重悬液加入到上述⑤所得的吸附有EpCAM抗体标记磁珠的离心管中，4℃孵育过夜(6～16小时均可)。
⑦将⑥中的离心管置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体。
⑧再向上述⑦中的离心管中加入1ml的1×PBS，置于磁力架，吸附2分钟，移除管内液体；重复一次；获得磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。
(二)外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测
①将上述步骤(一)获得的肿瘤外泌体用200μl 1×PBS将其重悬，100μl/孔加至高结合力酶标板包被。4℃过夜(6～16小时均可)孵化后弃孔内液体，200μl 1×PBST(1×PBS含0.05％Tween)洗板3次，每次浸泡1-2min，200μl/孔。移除上清液体。
②将200μl含5％脱脂牛奶的PBST加入孔内，37℃孵化2h进行封闭后，移除上清液体。并用200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液体。
③用100μl的1:5000稀释CD9一抗(proteintech)加入孔中，37℃孵化1h后移除上清。200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液体。
④用100μl的1:10000稀释HRP酶标二抗(sigma)加入孔中，37℃孵化1h后移除上清。200μl 1×PBST洗板3次，每次浸泡1-2min，移除上清液体。
⑤将100μl TMB显色液加入孔中，避光显色15-20min，若颜色偏淡，可放在37℃显色，不超过30min。
⑥将100μl终止溶液加入孔中，液体颜色由蓝色变为黄色。立即把酶标版放入酶联仪中，在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
(三)产物的表征和鉴定
1、将上述步骤(一)获得的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml低pH(pH值为5-6)的TE缓冲液洗脱磁珠上结合的细胞，并使用电子显微镜观察。电子显微镜观察到的照片如图1所示，可以发现：从磁珠上洗脱下的细胞为50-100nm大小的双分子层膜结构泡体，形态学和其他文献报道的外泌体一致。
2、免疫印迹(Western Blot)检测蛋白Hsp70、Tsg101的存在
具体检测步骤如下：
(1)将上述步骤(一)获得的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，加入1ml裂解液，提取总蛋白。
(2)制作BSA标准曲线，加入1ml的考马斯蓝，化学分光仪上检测exosome蛋白含量。
(3)制作10％及4％的梯度胶，加入足够的缓冲液，每孔上样50ug的exosome总蛋白。
(4)在电压40V～60V进行4～5h的电泳。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
(5)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(P0023C)中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。后加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
(6)封闭结束后，立即加入稀释好的一抗(Hsp70,Tsg101)。4℃缓慢摇动孵育过夜后，回收一抗，Western洗涤液洗涤3次。
(7)按照适当比例用Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP) 标记的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收二抗，Western洗涤液洗涤3次。
(8)膜上蛋白面加入ECL液进行显影。
检测结果如图4所示，可以发现：在实施例2步骤(一)所得产物中检测到了exosome表面特有的蛋白Hsp90、Tsg101的表达，因此，从分子特性上说明了实施例2步骤(一)所得产物为exosome。
3、免疫荧光检测蛋白CD9的存在
将上述步骤(一)获得的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，加入CD9一抗和Alexa二抗进行4℃闭关孵育1小时后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，20μl滴入载玻片进行荧光观察。
免疫荧光检测结果如图2b所示，为方便对照，一并附上上述步骤(一)获得的产物在明场(未加荧光)的图2a。图2a中显示信号和背景均为黄色，图2b中显示信号为红色，显示背景为蓝色。由图2a和图2b对对照，可以发现：图2b中，在与图2a中所示的磁珠复合物所在位置相对应的位置，发出红色荧光，这意味着磁珠复合物与荧光CD9抗体标记物结合并发出红色荧光，从而证实磁珠复合物，也即是上述步骤(一)获得的产物，中存在蛋白CD9的表达。这同时也能说明上述步骤(一)获得的产物为exosome。免疫荧光检测结果也说明上述产物中外泌体与磁珠偶联成功。
4、流式细胞仪检测EpCAM表达
将上述步骤(一)获得的产物(即，磁珠结合的肿瘤细胞来源的exosome)用1ml的1×PBS重悬，得到肿瘤exosome重悬液，分别加入Epcam-FITC和Igm-FITC抗体进行4℃闭关孵育1小时后，磁力架上用1ml的1×PBS清洗3次后，加入500μl的1×PBS上流式细胞仪进行检测。
上流式细胞仪检测结果如图3所示，可以发现：在上述步骤(一)所得产物(如图3a)中检测到了Epcam蛋白表达，且荧光强度明显强于同型对照组(如图3b)。由此可见，该产物为Epcam阳性的外泌体，这说明了上述步骤(一)获得的产物为肿瘤细胞来源的exosome。
(四)作为诊断生物标志物的统计分析
1、外周游离exosome的CD9检测在30例肾癌患者和正常中的比较与统计分 析
以肾透明细胞癌患者(n＝30)和健康人(n＝30)中的血液标本为对象，按照上述步骤(一)和步骤(二)的方法，检测血浆外泌体CD9的表达水平，并通过散点图来分析和比较。散点图如图5所示，Elisa检测结果显示：肾透明细胞癌患者中的外泌体CD9的表达水平明显高于对照组(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(P<0.001)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
2、外周游离exosome的CD9检测作为肾透明细胞癌患者的诊断工具的可行性分析
采用ROC曲线分析来评价使用血浆exosome CD9检测来作为检测肾透明细胞癌的诊断工具的可行性。在区别肾透明细胞癌患者和对照组方面，exosomal CD9在ROC曲线以下的面积(AUC)为0.97(95％CI：0.9263-1.014)，其敏感性为93％，特异性为97％(图6)。可见，ROC曲线分析显示血浆外泌体中CD9能够区别肾透明细胞癌患者和健康人。
由此可见，可以将外周游离exosome中的CD9检测作为肾透明细胞癌中潜在生物标记物，并用于肾癌诊断：检测肾透明细胞癌患者与健康对照组的血浆外泌体中CD9的表达水平的差异，当检测结果显示外周游离exosome CD9水平高于对照组中的水平，则提示所述对象肾癌患病风险。
实施例3采用实施例1的试剂盒检测肺癌患者外周游离外泌体的CD9表达
采用与实施例2中步骤(一)基本相同的方法，对于收集到的30例肺癌患者病人血浆(1ml)与30例健康人血浆(1ml)进行肿瘤外泌体的提取与纯化，获得磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。即：(一)中血浆样本为肺癌患者病人术前的血浆标本，其它步骤与实施例2中完全相同。血浆样本的获得方法也与实施例2中步骤(一)①相同。
采用与实施例2中步骤(二)基本相同的方法，进行外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测。对实施例3上述所得的各Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome进行CD9表达检测，并通过散点图来分析和比较。散点图如图7所示，Elisa检测结果显示：本实施例中，肺癌患者病人的外周游离血中提取的肿瘤细胞来源的exosome中CD9的表达水平高于正常对照(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(OD平均值：0.46vs 0.23,P<0.01)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
实施例4采用实施例1的试剂盒检测食管癌患者外周游离外泌体的CD9表达
采用与实施例2中步骤(一)基本相同的方法，对于收集到的30例食管癌患者病人血浆(1ml)与30例健康人血浆(1ml)进行肿瘤外泌体的提取与纯化，获得磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。即：(一)中血浆样本为食管癌患者病人术前的血浆标本，其它步骤与实施例2中完全相同。血浆样本的获得方法也与实施例2中步骤(一)①相同。
采用与实施例2中步骤(二)基本相同的方法，进行外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测。对实施例4上述所得的各Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome进行CD9表达检测，并通过散点图来分析和比较。散点图如图8所示，Elisa检测结果显示：本实施例中，食管癌患者病人的外周游离血中提取的肿瘤细胞来源的exosome中CD9的表达水平高于正常对照(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(OD平均值：0.42vs 0.18,P<0.01)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
实施例5采用实施例1的试剂盒检测乳腺癌患者外周游离外泌体的CD9表达
采用与实施例2中步骤(一)基本相同的方法，对于收集到的30例乳腺癌患者病人血浆(1ml)与30例健康人血浆(1ml)进行肿瘤外泌体的提取与纯化，获得磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。即：(一)中血浆样本为乳腺癌患者病人术前的血浆标本，其它步骤与实施例2中完全相同。血浆样本的获得方法也与实施例2中步骤(一)①相同。
采用与实施例2中步骤(二)基本相同的方法，进行外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测。对实施例5上述所得的各Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome进行CD9表达检测，并通过散点图来分析和比较。散点图如图9所示，Elisa检测结果显示：本实施例中，乳腺癌患者病人的外周游离血中提取的肿瘤细胞来源的exosome中CD9的表达水平高于正常对照(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(OD平均值：0.32vs 0.21,P<0.03)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
实施例6采用实施例1的试剂盒检测胃癌患者外周游离外泌体的CD9表达
采用与实施例2中步骤(一)基本相同的方法，对于收集到的30例胃癌患者病人血浆(1ml)与30例健康人血浆(1ml)进行肿瘤外泌体的提取与纯化，获得 磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。即：(一)中血浆样本为胃癌患者病人术前的血浆标本，其它步骤与实施例2中完全相同。血浆样本的获得方法也与实施例2中步骤(一)①相同。
采用与实施例2中步骤(二)基本相同的方法，进行外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测。对实施例6上述所得的各Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome进行CD9表达检测，并通过散点图来分析和比较。散点图如图10所示，Elisa检测结果显示：本实施例中，胃癌患者病人的外周游离血中提取的肿瘤细胞来源的exosome中CD9的表达水平高于正常对照(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(OD平均值：0.39vs 0.17,P<0.01)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
实施例7采用实施例1的试剂盒检测卵巢癌患者外周游离外泌体的CD9表达
采用与实施例2中步骤(一)基本相同的方法，对于收集到的30例卵巢癌患者病人血浆(1ml)与30例健康人血浆(1ml)进行肿瘤外泌体的提取与纯化，获得磁珠结合的Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome。即：(一)中血浆样本为卵巢癌患者病人术前的血浆标本，其它步骤与实施例2中完全相同。血浆样本的获得方法也与实施例2中步骤(一)①相同。
采用与实施例2中步骤(二)基本相同的方法，进行外周游离肿瘤外泌体的ELisa检测。对实施例7上述所得的各Epcam阳性(肿瘤细胞来源)的exosome进行CD9表达检测，并通过散点图来分析和比较。散点图如图11所示，Elisa检测结果显示：本实施例中，卵巢癌患者病人的外周游离血中提取的肿瘤细胞来源的exosome中CD9的表达水平高于正常对照(健康人)中的外泌体CD9的表达水平(OD平均值：0.40vs 0.20,P<0.01)。图中黑色横线代表中位值。采用Mann-Whitney U检验来计算统计学差异。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (10)

1.外周血中的游离外泌体的特异性标志物在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性标志物为CD9。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂通过检测被试者外周血中游离外泌体的特异性标志物CD9表达，并与健康对照组的平均水平相比较，以此来判断被试者的肿瘤患病风险。
4.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂包括：用于肿瘤高危人群的筛查的试剂、用于肿瘤早期诊断的试剂、或者用于肿瘤患者的预后评估的试剂。
5.一种用于肿瘤诊断的试剂盒，包括：用于肿瘤高危人群的筛查的试剂盒、用于肿瘤早期诊断的试剂盒、或者用于肿瘤患者的预后评估的试剂盒，其特征在于，包含检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性标志物为CD9。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测外周血中的游离外泌体的特异性标志物的试剂包括：
(1)用于从外周血中分离总外泌体的总外泌体分离试剂；
(2)用于从所述总外泌体中提纯肿瘤来源外泌体的上皮细胞粘附分子抗体标记分离磁珠；
(3)用于检测所述肿瘤来源外泌体中特异性标志物表达的Elisa检测试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Elisa检测试剂包括能够结合、吸附和/或偶联所述特异性标志物的抗体。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Elisa检测试剂包括：CD9一抗和HRP酶标二抗。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Elisa检测试剂还包括用于Elisa检测的常规试剂。
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