CN106551944A - 四环素类衍生物作为par-1抑制剂的用途 - Google Patents

四环素类衍生物作为par-1抑制剂的用途 Download PDF

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孙涛
周红刚
肖婷
刘慧娟
刘艳荣
梁彩莉
于恒恒
张强
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Abstract

本发明属于药物化学领域，涉及四环素衍生物作为PAR-1抑制剂在制备治疗与PAR-1相关的疾病的药物中的用途。其中，四环素衍生物包括：多西环素、四环素、金霉素、土霉素、青哌环素、美他环素、替加环素和米诺环素，与PAR-1相关的疾病包括肿瘤、血栓性疾病和心血管疾病等。

Description

四环素类衍生物作为PAR-1抑制剂的用途
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及四环素类衍生物作为PAR-1抑制剂在制备治疗与PAR-1相关的疾病的药物中的用途。
背景技术
四环素类衍生物主要作用于细菌核蛋白体30S亚基，干扰氨基酸tRNA与30S亚基上的作用位点结合，阻断氨基酰tRNA与核糖体-mRNA复合体结合，抑制蛋白质合成，同时也可以改变细胞膜的通透性，使胞内重要物质核苷酸等外露，抑制DNA合成，从而达到抑菌的效果。
PAR-1是蛋白酶激活受体家族(PARs)中的一员，为G蛋白偶联受体。近年来对PAR-1在肿瘤发生发展过程中的作用研究成为研究热点。PAR-1的重要作用几乎贯穿整个肿瘤的发生发展过程。研究表明，PAR-1可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及黏附，也在肿瘤血管新生过程中发挥重要作用。PAR-1作为凝血酶受体在血栓形成、血管活性、血管增生性疾病、炎症反应以及免疫系统功能等过程中具有重要作用。研究表明PAR1抑制剂可以作为抗肿瘤侵袭转移及生长的药物用于临床上肿瘤的治疗(Curr Med Chem，2010，17(2)：109-128.)，同时PAR1抑制剂也可以作为抗血小板药物用于治疗血栓性疾病。
PAR-1在肿瘤的增殖，转移，侵袭过程中均具有重要的作用，因此，开发PAR-1抑制剂对肿瘤及心血管病的治疗将具有一定治疗的效果。
发明内容
本发明的目的是提供四环素类衍生物作为PAR-1抑制剂在制备治疗与PAR-1相关的疾病的药物中的用途。
在上述用途中，其中，四环素类衍生物包括多西环素、四环素、金霉素、土霉素、青哌环素、美他环素、替加环素和米诺环素。
在上述用途中，其中，四环素类衍生物抑制PAR-1的活性，从而治疗与PAR-1相关的疾病。
在上述用途中，其中，与PAR-1蛋白相关的疾病包括肿瘤、血栓性疾病和心血管疾病。
在上述用途中，其中，治疗与PAR-1相关的疾病的药物包含多西环素、四环素、金霉素、土霉素、青哌环素、美他环素、替加环素、米诺环素或它们的组合；或它们在药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯；以及辅料。
在上述用途中，其中，药物制备成片剂、胶囊、乳液、注射液。
四环素类化合物可以作为PAR-1抑制剂用于治疗与PAR-1相关的疾病。由于其已在临床上应用于抗感染，故具有其它新药不可比拟的优势，患者易于接受且便于了解患者对药物的反应，有明确的给药途径。该类化合物合成方便，生产工艺成熟，可快速地投入生产并获得高效制剂。
附图说明
图1示出了稳转细胞系293-PAR1的PAR1表达水平的western blot检测图。
图2示出了通过钙流检测的PAR-1配体(Thrombin酶)的EC80浓度。
图3示出了钙流检测多西环素对PAR-1受体的抑制作用的IC50曲线。
图4示出了钙流检测金霉素对PAR-1受体的抑制作用的IC50曲线。
图5示出了钙流检测四环素对PAR-1受体的抑制作用的IC50曲线。
图6示出了钙流检测土霉素对PAR-1受体的抑制作用的IC50曲线。
图7示出了钙流检测替加环素对PAR-1受体的抑制作用的钙流信号强度ΔF(ΔF＝Fmax-Fmin)。
图8示出了钙流检测美他环素对PAR-1受体的抑制作用的钙流信号强度ΔF(ΔF＝Fmax-Fmin)。
图9示出了钙流检测青哌环素对PAR-1受体的抑制作用的钙流信号强度ΔF(ΔF＝Fmax-Fmin)。
图10示出了钙流检测米诺环素对PAR-1受体的抑制作用的钙流信号强度ΔF(ΔF＝Fmax-Fmin)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过具体的实验研究证实，四环素类衍生物可以作为PAR-1的抑制剂。具体实施方式如下：
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
1.细胞系
HEK 293(人胚肾细胞)。
培养基：DMEM高糖培养基，含10％胎牛血清。
2.主要实验药物与试剂
FLIPR@Calcium 5Assay Kit(Molecular devices)。
Thrombin酶(Sigma公司)。
本发明所使用的多西环素为多西环素盐酸盐，黄色粉末，由开封制药(集团)有限公司提供，批号：201301011，纯度：91.0％(符合中国药典2010年版二部)。多西环素盐酸盐的化学结构式为：
本发明所使用的金霉素为金霉素盐酸盐，金黄色结晶粉末，由上海华南药业有限公司提供，纯度：98.0％。金霉素盐酸盐的化学结构式为：
本发明所使用的四环素为四环素盐酸盐，淡黄色结晶粉末，由广州侨光药业有限公司提供，纯度：98.0％。四环素盐酸盐的化学结构式为：
本发明所使用的土霉素为土霉素盐酸盐，淡黄色粉末，由诺伟康生物科技有限公司提供，纯度：98.0％。土霉素盐酸盐的化学结构式为：
本发明所使用的替加环素，为淡黄色粉末，由新疆天康畜牧生物技术有限公司提供，纯度：98.0％。替加环素的化学结构式为：
本发明所使用的美他环素为美他环素盐酸盐，黄色粉末，由上海诺华动物保健有限公司提供，纯度：930IU。美他环素盐酸盐的化学结构式为：
本发明所使用的青哌环素，为淡黄色粉末，由sigma公司提供，纯度：98.0％。青哌环素的化学结构式为：
本发明所使用的米诺环素，为淡黄色粉末，由大连容海生物科技有限公司提供，纯度：98.0％。米诺环素的化学结构式为：
其余试剂均为进口分析纯试剂。
3.主要仪器
生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A。
CO2培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：STIK IL-161HI。
倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。
钙流检测仪器：FlexStation 3(SMP 500-19897-MILX)。
四环素类衍生物对PAR-1受体的抑制作用
实验方法
1、稳定表达PAR-1受体细胞系的构建
(1)将PAR-1目的基因构建到pcDNA3.1(+)质粒上，转入DH5α感受态扩增，用去内毒素大提质粒试剂盒(天根)提取重组质粒。
(2)使用lip2000转染试剂将PAR1-pcDNA3.1(+)转入293细胞系，次日加700μg/ml的G418筛选，每隔一天换一次液，待对照组细胞全部死亡时终止(约14天)。
(3)将筛选过的细胞铺96孔板，密度1个每孔，进行单克隆化，待单个细胞长至1/2孔以上时消化传代至48孔板，细胞长满后依次传代到12孔板、6孔板、60mm2培养皿。
(4)Western Blot鉴定稳定表达细胞系的PAR1表达量(见图1)。
2、钙流检测四环素类衍生物对PAR-1的抑制作用
(1)细胞接种：检测前一天铺板，96孔板20,000～80,000个细胞/孔，384孔板5,000～20,000个细胞/孔；
(2)配置丙磺舒：丙磺舒用1M的NaOH配成500mM的储液浓度，用FLIPR@Calcium 5Assay Kit中组分B稀释成250mM，使用终浓度为每孔2.5mM。
(3)loading配置：取10mL组分B溶解组分A，充分混匀。
(4)96孔板每孔加入100μl配制好的loading，将孔板置于37度培养箱中继续培养2h后室温孵育15min。
(5)配体(Thrombin酶)EC80浓度的确定：配制不同浓度的Thrombin酶。设置仪器程序(FlexStation 3(SMP 500-19897-MILX))，向孔板中加入不同浓度的配体进行钙流检测。计算出配体的EC80浓度。
(6)药物检测：准备相应浓度的配体(每孔加入量应保证其终浓度达到其EC80的浓度)，配置不同浓度的药物，其中，多西环素最高浓度为16.625μΜ，依次二倍稀释，至最低浓度0.003815μΜ；金霉素最高浓度为1.5mΜ，依次二倍稀释，至最低浓度0.01144μΜ；四环素最高浓度为3.0mΜ，依次二倍稀释，至最低浓度0.02289μΜ；土霉素最高浓度为12.0mΜ，依次二倍稀释，至最低浓度0.09155μΜ；替加环素、美他环素、青哌环素、米诺环素分别配置0μΜ、1μΜ、10μΜ、50μΜ、100μΜ的浓度待仪器检测使用。设置仪器程序，进行钙流检测，分别计算出多西环素、金霉素、四环素和土霉素药物的IC50，对于替加环素、美他环素、青哌环素和米诺环素计算出各药物浓度下的钙流信号ΔF(ΔF＝Fmax-Fmin)。
二、实验结果
1、如图1所示，western blot检测稳转细胞系293-PAR1的PAR1表达水平显著增加。
2、如图2所示，通过钙流检测，得到Thrombin酶配体的EC80浓度为13.98nM。选择此浓度，进行下面的抑制剂筛选实验。
3、如图3所示，通过钙流检测测得，多西环素对PAR-1的半数抑制浓度(IC50)为0.188μM，说明多西环素可以明显抑制PAR-1的活性。
4、如图4、5、6所示，通过钙流检测测得，金霉素对PAR-1的半数抑制浓度(IC50)为2.949μM(图4)，四环素对PAR-1的半数抑制浓度(IC50)为5.299μM(图5)，土霉素对PAR-1的半数抑制浓度(IC50)为24.12μM(图6)，说明金霉素、四环素和土霉素均能在一定程度上抑制PAR-1的活性，且金霉素和四环素对PAR-1的抑制作用相对较好，土霉素对PAR-1的抑制作用相对最差。
5、如图7、8、9、10所示，钙流检测结果表明，替加环素、美他环素、青哌环素和米诺环素均能在一定程度上抑制PAR-1的活性，且随药物浓度的增加对PAR-1活性的抑制作用增强。
以上实验结果表明，四环素类衍生物药物可以抑制PAR-1受体的活性，可以作为PAR-1的抑制剂。

Claims (6)

1.四环素类衍生物作为PAR-1抑制剂在制备治疗与PAR-1相关的疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述四环素类衍生物包括多西环素、四环素、金霉素、土霉素、青哌环素、美他环素、替加环素和米诺环素。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述四环素类衍生物抑制PAR-1的活性，从而治疗与PAR-1蛋白相关的疾病。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，与PAR-1相关的所述疾病包括肿瘤、血栓性疾病和心血管疾病。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，治疗与PAR-1相关的所述疾病的所述药物包含多西环素、四环素、金霉素、土霉素、青哌环素、美他环素、替加环素、米诺环素或它们在药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯；以及辅料。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物制备成片剂、胶囊、乳液、注射液。
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