CN105866220A - 一种高效蛋白转膜缓冲液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效蛋白转膜缓冲液，其包括以下各组分：Tris的浓度为10mM‑100mM；牛磺酸的浓度为10mM‑200mM。本发明的高效转膜缓冲液相对于目前常用的传统转膜缓冲液相比，使用了缓冲能力更强的牛磺酸成分，提高了缓冲液在电泳时的缓冲能力，对分子量范围宽泛的蛋白质分子都有很高的转膜效率，可以缩短蛋白转膜的时间，同时，该缓冲液在电泳时产生的热量较低，不需要借助冰袋等来降温，简化了转膜时的操作，且需要的甲醇浓度更低，在10％的浓度就可以实现较好的转膜效果。

Description

一种高效蛋白转膜缓冲液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效蛋白转膜缓冲液及其制备方法。

背景技术

蛋白质印迹法即Western Blot，是分子生物学，免疫遗传学和生物化学中常见的一种实验方法，是将电泳分离后的细胞或组织蛋白质从凝胶转移到固相支撑物上，如硝酸纤维素膜(NC膜)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，再用特异性抗体检测特定抗原的一种蛋白质检测技术。如今已广泛应用于抗体活性检测、疾病早期诊断和蛋白质水平表达研究等多个方面。转膜是蛋白质印迹实验中一个重要的步骤，经过聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离后的蛋白质需要经过转膜步骤，即从PAGE胶转移到固相支持物上，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色。

转膜过程通常是在半液体或液体环境中进行的，转膜缓冲液可以给电场提供介质，让蛋白在电场力的作用下从负极向正极泳动，因此转膜缓冲液在蛋白质转移效率中起重要的作用。目前常用的转膜缓冲液都是基于Tris-Glycine，，构成一个转膜缓冲液系统。用该转膜缓冲液系统转移蛋白时，电泳液温度会随时间延长显著增加，高温会降低转膜的效果，还会使得PAGE胶和固相支撑物发生位移，蛋白条带发生变形等情况发生，因此常需要加入冰袋或者在冰上转膜来降低转膜时产生的高温。此外，Tris-Glycine转膜缓冲液对高分子量的蛋白质转移效果较低，只能让部分大分子蛋白从PAGE胶转移至固相支撑物上。该体系还需加入20％的甲醇、SDS等物质，其中甲醇被大众所熟知的，是一种具有毒性的物质，高浓度的甲醇对人体会造成强的伤害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高效的蛋白质转移缓冲液及其制备方法。在该体系中，加入了一种亲水性很强的极性氨基酸，即牛磺酸，能为电泳缓冲液提供很强的缓冲能力。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明一种高效蛋白转膜缓冲液，其包括以下各组分：

Tris的浓度为10mM-100mM；牛磺酸的浓度为10mM-200mM。

进一步地，包括以下各组分：Tris的浓度为10mM；牛磺酸的浓度为10mM。

进一步地，包括以下各组分：Tris的浓度为100mM；牛磺酸的浓度为200mM。

进一步地，包括以下各组分：Tris的浓度为40mM；牛磺酸的浓度为70mM。

进一步地，还包括以下组分：甲醇的体积分数为5-10％和/或SDS的质量分数为0.01-0.05％。

本发明的另一个方面公开了一种高效蛋白质转移缓冲液的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：

Tris 10-100mM；牛磺酸10-200mM；SDS 0.1-0.5g；

(2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌混匀；

(3)加入50-100ml的甲醇,加去离子水将溶液定容至1000ml后室温保存。

本发明的另一个方面公开了一种高效蛋白质转移缓冲液的使用方法，具体包括以下步骤：

a.将PAGE凝胶浸于转膜缓冲液中平衡10分钟；

b.根据凝胶的大小裁剪膜和滤纸，放入转膜缓冲液中平衡10分钟，如果使用PVDF膜需要用甲醇浸泡饱和5-10秒钟；

c.装配转移三明治转膜体系：依次装配海绵、3层滤纸、凝胶、3层滤纸、海绵；每层放好后，将气泡赶去；

d.将转膜槽置于冰浴中，放入三明治转膜结构，加入转移缓冲液，插上电极，开始设置0.3A的恒流电泳。

牛磺酸(Taurine)又称β-氨基乙磺酸，为无色或白色斜状晶体，其化学性质稳定，该分子中同时具有很强的酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，是一种极性氨基酸，具有很强的缓冲能力。Tris又称三羟甲基丙烷，一种白色结晶或粉末，为弱碱性。常用作生物缓冲液，是常见的蛋白质电泳缓冲液、转膜液等主要成分之一。还可以在转膜缓冲液中包含甲醇、SDS等成分，协同蛋白质从PAGE转移到固相支撑物上。

本发明的转膜缓冲液至少包含两种成分，即Tris和牛磺酸的水溶液。每种成分在转膜缓冲液中的浓度分别在10-100mM和10-200mM之间。实验中，使用本发明的转膜缓冲液，在从PAGE凝胶向印迹膜(如PVDF膜、NC膜)转移分子量范围宽泛(如180KD-10KD)蛋白时，与常规的缓冲液相比(Tris-Glycine体系)，该缓冲液显示更高的转移能力，可高效地完成蛋白质转移，不论大分子量和小分子量的蛋白质，缩短蛋白质转膜的时间。常规的转膜缓冲液在电泳时，会产生大量的热，使得电泳槽内缓冲液温度快速的升高，而本发明的转膜液在电泳时，产生的热量较小，完全可以不用借助于冰袋等来降温。

本发明所达到的有益效果是：

本发明的高效转膜缓冲液相对于目前常用的传统转膜缓冲液相比，使用了缓冲能力更强的牛磺酸成分，提高了缓冲液在电泳时的缓冲能力，对分子量范围宽泛的蛋白质分子都有很高的转膜效率，可以缩短蛋白转膜的时间，同时，该缓冲液在电泳时产生的热量较低，不需要借助冰袋等来降温，简化了转膜时的操作，且需要的甲醇浓度更低，在10％的浓度就可以实现较好的转膜效果。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明转膜缓冲液在0.3A恒流，20分钟转移至PVDF膜的效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：

Tris 4g；牛磺酸0.07mol；SDS 0.15g；

(2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌混匀；

(3)加入50-100ml的甲醇,加去离子水将溶液定容至1000ml后室温保存。

实施例2

(1)称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：

Tris 0.01mol；牛磺酸0.01mol；SDS 0.1g；

(2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌混匀；

(3)加入50-100ml的甲醇,加去离子水将溶液定容至1000ml后室温保存。

实施例3

(1)称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：

Tris0.1mol；牛磺酸0.2mol；SDS 0.5g；

(2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌混匀；

(3)加入50-100ml的甲醇，加去离子水将溶液定容至1000ml后室温保存。

(一)使用实施例1～3制备的转膜缓冲液检测对PAGE凝胶转移至PVDF膜的效果，取5ul的PageRuler^TM Prestained Protein Ladder样品加入到PAGE凝胶孔中，电泳完毕之后，按上述方法经行转膜实验。转膜条件为0.3A恒流，时间为20分钟，停止电泳，取出样品经行观察，如图1所示，不同分子量的蛋白都完全转移到PVDF膜上，PAGE凝胶上已观察不出还有蛋白的残留。

(二)常规的转膜多采用以下两种配方，分别为：

对照案例1：Tris 5.8g，甘氨酸2.9g，SDS 0.376g，20％甲醇

对照案例2：Tris 3.05g，甘氨酸14.4g，20％甲醇

将上述的对照案例1，对照案例2的转膜缓冲液和本发明的高效转膜缓冲液电泳经行检测比较，取5ul的PageRuler^TM Prestained Protein Ladder样品及HEK293细胞的裂解物加入到PAGE凝胶孔中，电泳完毕之后，按上述方法经行转膜实验，电流设定为恒流0.3A，不同时间段观察电压的变化及温度的变化。本发明的转膜缓冲液的电压一直维持在70V左右，而对照案例缓冲液电压都超了100V以上，具体变化见下表:

由上表可以看出，同时使用本发明的转膜液产生的热量和对照案例的产生的热量要小，温度上升不明显，维持在一个温和的环境下完成电泳的过程。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种高效蛋白转膜缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：

Tris的浓度为10mM-100mM；牛磺酸的浓度为10mM-200mM。

2.根据权利要求1所述的高效蛋白转膜缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：Tris的浓度为10mM；牛磺酸的浓度为10mM。

3.根据权利要求1所述的高效蛋白转膜缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：Tris的浓度为100mM；牛磺酸的浓度为200mM。

4.根据权利要求1所述的高效蛋白转膜缓冲液，其特征在于，包括以下各组分：Tris的浓度为40mM；牛磺酸的浓度为70mM。

5.根据权利要求1～4任一所述的高效蛋白转膜缓冲液，其特征在于，还包括以下组分：甲醇的体积分数为5-10％和/或SDS的质量分数为0.01-0.05％。

6.一种高效蛋白质转移缓冲液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)称量下列试剂，置于1000ml烧杯中：

Tris 10-100mM；牛磺酸10-200mM；SDS 0.1-0.5g；

(2)向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌混匀；

(3)加入50-100ml的甲醇,加去离子水将溶液定容至1000ml后室温保存。

7.一种高效蛋白质转移缓冲液的使用方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a.将PAGE凝胶浸于转膜缓冲液中平衡10分钟；

b.根据凝胶的大小裁剪膜和滤纸，放入转膜缓冲液中平衡10分钟，如果使用PVDF膜需要用甲醇浸泡饱和5-10秒钟；

c.装配转移三明治转膜体系：依次装配海绵、3层滤纸、凝胶、3层滤纸、海绵；每层放好后，将气泡赶去；

d.将转膜槽置于冰浴中，放入三明治转膜结构，加入转移缓冲液，插上电极，开始设置0.3A的恒流电泳。