CN105557503A - 利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法 - Google Patents

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李正东
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US Department of Agriculture USDA
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Abstract

本申请公开了在FAD2-1A和FAD2-1B中具有突变的大豆植物。此外，本公开涉及来自所述植物的单饱和脂肪与多不饱和脂肪的比发生改变的种子。具体而言，本公开涉及表现出升高的油酸水平的植物。

Description

利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年7月8日提交的美国临时申请系列第61/223,942号的权益。
序列表
本申请附有纸版和计算机可读形式的序列表，其精确复制了本文所述的序列。
背景
植物油在多种应用中使用。需要新的植物油组合物以及改进的从生物合成或天然植物来源获得油组合物的方法。根据油的预期用途，需要多种不同的脂肪酸组合物。植物，尤其是种子中合成大量油的物种，是食用和工业用油的重要来源。
油酸是在多种动植物来源中发现的单不饱和ω-9脂肪酸。油酸被认为是饮食中较为健康的脂肪来源之一，并且通常可用于替代饱和脂肪含量较高的脂肪来源。
脂肪消耗中油酸含量较高的饮食被证实降低胆固醇、动脉硬化和心血管疾病的总水平。特别地，油酸已被证实能提高被称为“好胆固醇”的高密度脂蛋白(HDL)的水平，同时降低还被称为“坏”胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)。因此，需要开发包含更为健康的脂肪酸形式的新且廉价的食物来源。
植物通过称为脂肪酸合成酶(FAS)途径的共有代谢途径合成脂肪酸。β-酮脂酰-ACP(酰基载体蛋白部分)合酶是植物细胞FAS中重要的限速酶，并且以数种形式存在。β-酮脂酰-ACP合酶I催化链延长至棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮脂酰-ACP合酶II催化链延长至硬脂酰-ACP(C18:0)。β-酮脂酰-ACP合酶IV是β-酮脂酰-ACP合酶II的变体，且也能催化链延长至18:0-ACP。在大豆中，FAS的主要产物是16:0-ACP和18:0-ACP。18:0-ACP去饱和形成18:1-ACP由定位于质体的可溶的Δ-9去饱和酶(也称为“硬脂酰-ACP去饱和酶”)催化。
质体FAS和Δ-9去饱和酶的产物16:0-ACP、18:0-ACP和18:1-ACP由特定的硫酯酶(FAT)水解。基于序列同源性和底物偏爱性可以将植物硫酯酶分成两个基因家族。第一家族FATA包括主要活性在18:1-ACP上的长链酰基-ACP硫酯酶。第二家族的酶FATB通常利用16:0-ACP(棕榈酰-ACP)、18:0-ACP(硬脂酰-ACP)和18:1-ACP(油酰-ACP)。在植物从头生物合成脂肪酸的过程中，这类硫酯酶在决定碳链长度上具有重要作用，并且因而这些酶可用于提供脂酰基组合物的各种修饰，尤其关于种子贮存油中所存在的各种脂酰基的相对比例。
FATA和FATB反应的产物，游离脂肪酸，离开质体并被转化成其各自的酰基辅酶A酯。酰基辅酶A是定位于内质网(ER)的脂质生物合成途径(Kennedy途径)的底物。该途径负责膜脂形成以及三酰甘油的生物合成，三酰甘油构成种子油。在ER中，有其它的膜结合去饱和酶，它们还能使18:1去饱和为多不饱和脂肪酸。
大豆基因组具有Δ-12去饱和酶FAD2的两种种子特异的同种型，称为FAD2-1A和FAD2-1B，它们仅在24个氨基酸残基上不同。大豆基因组序列上编码FAD2-1A和FAD2-1B的基因分别称为LinkageGroupO上的Glyma10g42470和LinkageGroupI上的Glyma20g24530(Glyma1.0，大豆基因组计划，DoEJointGenomeInstitute)。FAD2-1A和FAD2-1B见于ER中，在那里它们能使油酸进一步去饱和为多不饱和的脂肪酸。Δ-12去饱和酶催化向油酸(18:1)中插入双键，形成亚油酸(18:2)，这导致由此引起的油酸水平的降低。Δ-15去饱和酶(FAD3)催化向亚油酸(18:2)中插入双键，形成亚麻酸(18:3)。
表1.主要脂肪酸的特征
名称(18:2),(18:1),(18:3)等是指脂肪酸链中的碳原子数以及其中的双键数，表1。本文所用的，该名称有时代替相应的脂肪酸俗名。例如，油酸(18:1)含有18个碳原子和1个双键，并且有时就简单地称为“18:1”。
尽管之前的研究已经证实FAD2-1A基因用于提高油酸的重要作用，但是还没有报道证实FAD2-1B基因对油酸累积的直接影响。大豆是经济作物，其提供了美国饮食中脂肪和油的主要部分。大豆被认为是含油种子，其通常含有约20％的油酸，为种子油中脂肪酸特征的一部分。
大豆油被食品工业用于各种食品中，包括食用油、色拉酱、三明治酱、人造黄油、面包、蛋黄酱、无乳咖啡伴侣和点心。大豆油还用于工业市场如生物柴油和生物润滑油市场。
对于很多油的应用，需要具有低饱和脂肪酸水平。饱和脂肪酸具有高熔点，这在很多应用中是不想要的。当用作原料或燃料时，饱和脂肪酸在低温导致混浊，并且为燃料赋予较差的冷流特性如倾点和冷滤点。含有低饱和脂肪酸水平的油产品可能是消费者和食品工业所优选的，因为它们被认为更加健康和/或根据FDA指导方针被标为“饱和脂肪较低”。此外，低饱和油降低或消除了使如色拉油的用于食品应用的油防冻的需要。在生物柴油和润滑油应用中，具有低饱和脂肪酸水平的油赋予改善的冷流特性，并且在低温时不混浊。
用于在大豆植物中产生中至高油酸水平的各种技术是已知的。例如，美国专利公开号2007/0214516公开了用于获得具有中等提高水平的油酸的大豆植物的方法。然而，该项技术需要通过转基因技术引入转基因而对大豆植物进行基因修饰。
尽管已产生的转基因大豆品系能产生中至高水平油酸的大豆油，但是仍需要能产生中至高油酸含量种子的非基因修饰的(非-GMO)大豆植物品系。
发明概述
本公开方法通过提供产生和选择在大豆种子油中含有大于约20％且高达约85％油酸(高达商品大豆所产生水平的4倍以上)的传统非-GMO大豆品系的方法而克服上文概括的问题并使得现有技术得到发展。本文所述的方法证实了，在无需传统大豆育种中所用的昂贵测试和评价的情况下，将提高的油质量性状有效并入大豆植物优良品种中的能力。
本公开方法证实了，单独的AD2-1B基因突变导致油酸水平有很小的提高。然而，FAD2-1A和FAD2-1B基因突变的组合导致种子油的油酸水平显著提高。
在一实施方案中，大豆植物在FAD2-1A和FAD2-1B基因中具有一个或多个突变，其中来自所述植物的种子具有约75％至约85％的油酸含量。
在一实施方案中，表达突变FAD2-1B基因，并且表达突变FAD2-1A基因或表达M23突变体的大豆植物具有脂肪酸组成得到改善(即具有约75％至约85％油酸)的种子，所述突变FAD2-1B基因由与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多核苷酸所编码，所述突变FAD2-1A基因由与SEQIDNO:7序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多核苷酸所编码，所述M23突变体的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因。
在一实施方案中，描述了选择种子具有约65％至约85％油酸含量的大豆植物的方法，所述方法包括：将在SEQIDNO:9所示的第一多核苷酸序列中具有一个或多个突变的第一大豆植物与在SEQIDNO:11所示的第二多核苷酸序列中具有一个或多个突变的第二大豆植物杂交。
在一实施方案中，描述了编码突变形式的FAD2-1B的核酸，其包含：编码SEQIDNO:12或其片段的至少72个核苷酸(24个氨基酸)的序列长度，其中所述序列包括至少一个选自以下的突变：a.在第137位氨基酸处的非保守型氨基酸取代，和b.在第143位氨基酸处的非保守型氨基酸取代。
在一实施方案中，表达突变FAD2-1B基因的大豆植物具有脂肪酸组成得到改善(即具有约22％至约41％油酸)的种子，所述突变FAD2-1B基因由与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多核苷酸所编码。
在一实施方案中，表达导致FAD2-1B活性降低的突变FAD2-1B基因的大豆植物具有油酸水平大于约20％的脂肪酸组成得到改善的种子。
在一实施方案中，表达FAD2-1B显性失活形式的转基因大豆植物具有油酸水平大于20％的脂肪酸组成得到改善的种子，所述油酸水平优选约20％至60％，且最优选约60％至85％。
附图说明
图1A和1B是展示了脂肪酸去饱和酶的氨基酸保守性的weblogo输出。
图2是说明相对脂肪酸水平作为来自M23×PI283327重组自交系的子代的总脂肪酸函数的直方图。
图3是说明油酸含量作为亲本和来自M23×PI283327重组自交系的亲本和子代的总脂肪酸函数的直方图。
图4是说明油酸含量作为来自17D×PI283327F2种子的子代的总脂肪酸函数的直方图。
图5是说明油酸水平作为来自M23×PI567189A重组自交系的子代的总脂肪酸函数的直方图。
图6是说明油酸水平作为来自Jake×PI283327重组自交系的子代的总脂肪酸函数的直方图。
图7是用于确定多种FAD2等位基因基因型的熔解曲线分析的图形表示。
图8是说明油酸水平作为群1的总脂肪酸函数的直方图。
图9是说明油酸水平作为群2的总脂肪酸函数的直方图。
图10是说明油酸水平作为群3的总脂肪酸函数的直方图。
发明的详细描述
本文所用的“等位基因”是指基因座的一个或多个可选形式中的任一个，所有的等位基因均涉及性状或特征。在二倍体细胞或有机体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体的对应基因座。
本文所用的“FAD2”是指能催化向羧基末端数第12位的脂酰基部分插入双键的基因或所编码的蛋白。FAD2蛋白也被称为“Δ-12去饱和酶”或“ω-6去饱和酶”。术语“FAD2-1A”用于指Glyma1.0全基因组序列(http://www.phytozome.net/soybean)中Glyma10g42470.1所限定的FAD2基因或蛋白，其以特定的方式在种子组织中天然表达，术语“FAD2-1B”用来指Glyma1.0全基因组序列(http://www.phytozome.net/soybean)中Glyma20g24530.1所限定的FAD2基因或蛋白，其是(a)不同于FAD2-1A基因或蛋白的基因，并且其(b)在多种组织中天然表达，包括种子。
本文所用的“基因”是指包含与基因产物表达相关的5'启动子区、任何内含子和外显子区以及与基因产物表达相关的3'或5'非翻译区的核酸序列。
本文所用的“基因型”指细胞或有机体的基因组成。
本文所用的“表现型”指细胞或有机体的可检测的特征，该特征是基因表达的表现。
本文所用的非基因修饰的(非-GMO)表示能在自然界中合理存在的。如果有机体没有通过添加如转基因的外源或重组核酸进行基因工程改造，从而改变该有机体的基因组成，则该有机体被认为是非-GMO的。
本文所用的“杂交”指两种亲本植物的交配。
本文所用的“F1”指两种植物杂交的第一代子代。
本文所用的“F2”指两种植物杂交的第二代子代。
本文所用的“F3”指两种植物杂交的第三代子代。
本文所用的“F4”指两种植物杂交的第四代子代。
本文所用的“F5”指两种植物杂交的第五代子代。
本文所用的“F6”指两种植物杂交的第六代子代。
本文所用的“F7”指两种植物杂交的第七代子代。
本文所用的“F8”指两种植物杂交的第八代子代。
如本文所用的，所产生的重组自交系(RIL)形成永久且稳定的数量性状基因座(QTL)图谱资源。在RIL开发的第一步中，使两个亲本自交系杂交(交配)，以形成统一的杂合F1代。F1自交(或自体受精)形成F2代；F2中的大多数个体将含有由每个F1植物中所存在的两个纯亲本染色体间交换而产生的重组染色体。认为亲本等位基因在F2代中分离，因为在给定的F2植物中有机会正好产生亲本等位基因的三种组合。然后，来自分离的F2代的许多个体作为相应RIL的创立者。给定RIL的每个后代由上一代自体受精和利用单粒传法来形成。以这种方式，几代后每个RIL将含有每一染色体的两个相同拷贝，而两个拷贝中的大多数都是重组的。每个个体RIL将含有重组和亲本染色体的不同组合，具有一组独特的跨越基因组的重组断点单元。作为一个整体，RIL组形成隔离的QTL谱群，其可以通过单粒传法年复一年地稳定再生。
本文所用的基因型名称如下：
AABB–纯合野生型FAD2-1A和纯合野生型FAD2-1B；
aaBB–纯合突变体FAD2-1A(mFAD2-1A)和纯合野生型FAD2-1B；
AAbb-纯合野生型FAD2-1A和纯合突变体FAD2-1B(mFAD2-1B)；
aabb-纯合mFAD2-1A和纯合mFAD2-1B
如本文所用的，称为“Jake”和“Williams82”(W82)的大豆植物品系是具有野生型油酸水平和FAD2-1A和FAD2-1B的野生型等位基因的常规大豆品种。
本文所用的植物引种(PI)或植物引种品系是假定自交多代的大豆品系，使得其子代稳定遗传了其所含有的所有基因。植物引种品系可以是本地的地方品种、栽培品种、变种、本地适应品系的田地收集物、从任何这些品系的选择物或已经自交并具有稳定基因组的高级育种系。国家植物种质资源系统(NationalPlantGermplasmSystem)维持称为植物引种的大豆品系的收集。
本文所用的成熟组是基于其所适应的地区(主要根据日长和纬度)而达成的品种组产业分支。它们由非常长的日长品种(组000,00,0)和扩展至非常短的日长品种(组VII,VIII,IX,X)组成。
“脂肪酸”是通常具有长的无分支的脂肪族碳链的羧酸。名称(18:2),(18:1),(18:3)等是指脂肪酸链中的碳原子数和其中的双键数。例如，油酸(18:1)含有18个碳原子和1个双键。示例性的脂肪酸包括：
ω-3脂肪酸如：
α-亚麻酸(CH3(CH2CH＝CH)3(CH2)7COOH)
ω-6脂肪酸如：
亚油酸(CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH)
ω-9脂肪酸如：
油酸(CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7COOH)
以及饱和脂肪酸如：
棕榈酸(CH3(CH2)14COOH)
硬脂酸(CH3(CH2)8COOH)。
本文所用的分离的核酸表示不含与自然环境中所存在的核酸或多肽相关的污染物中的至少一些并且具有可编码基因的序列的核酸。
此外，分离的核酸还可以被定义为核酸的片段或一部分，例如来自核酸的至少所要求长度的短碱基序列，或者由核酸所编码的蛋白或多肽的截短形式、修饰形式或同种型的编码核酸等。分离的核酸可以包括去除内含子的DNA。分离的核酸可以受外源启动子的调控。
本文所用的突变可以是多核苷酸序列中一个或多个核苷酸的缺失、取代或插入。突变可以是错义、无义、移码、插入或缺失中的一种或多种。
本文所用的错义突变是其中基因序列中的单个核苷酸发生改变，导致对应氨基酸中的氨基酸发生改变的点突变。错义突变可能导致基因所编码的蛋白的活性降低，或者可能导致非功能性的蛋白。
本文所用的无义突变是DNA序列中导致所转录的mRNA中产生提前的终止密码子或无义密码子，并且可能会导致截短的蛋白产物的突变。无义突变可能导致基因所编码的蛋白的活性降低，或者可能导致非功能性的蛋白。
本文所用的移码突变是多核苷酸序列中由不能被3整除的多个核苷酸的插入或缺失所导致的基因突变。由于基因表达利用密码子的三联体性质，插入或缺失能破坏读码框或密码子组，导致产生与原来的非突变基因不同的翻译蛋白产物。移码突变可能导致基因所编码的蛋白的活性降低，或者可能导致非功能性的蛋白。
本文所用的缺失导致丧失任何数量的核苷酸，例如从单个碱基至整个基因以及周围的多核苷酸序列。缺失突变可能导致基因所编码的蛋白的活性降低，或者可能导致非功能性的蛋白。
本文所用的插入导致添加任何数量的核苷酸。例如从单个碱基至数千个碱基。插入突变可能导致基因所编码的蛋白的活性降低，或者可能导致非功能性的蛋白。
本文所用的丧失功能突变是致使蛋白不能实施其生物功能的突变。
可以通过本领域内已知的技术在分离的核酸中进行突变，例如但不限于定点诱变。
突变可以由X-射线、γ射线或快中子辐射诱导，以及用化学诱变剂如烷化剂乙基-甲磺酸酯(EMS)或N-亚硝基-N-甲脲(NMU)处理。此外，天然基因变异可以来自植物基因组DNA复制过程中发生的随机DNA聚合酶错误所产生的突变。植物中的天然基因变异也可以由暴露于天然来源的电离或非电离辐射后DNA修复机制的激活所致。
可以通过自然或机械技术使大豆植物杂交。大豆中通过自花授粉或天然的异花授粉(其通常由授粉有机体辅助)发生自然授粉。在天然或人工杂交中，开花和花期是重要因素。大豆是短日植物，但是对光周期的敏感度存在大量的基因变异。对开花起决定性作用的日长的范围为从对于适应于热带纬度的基因型为大约13小时至对于生长在更高纬度的光周期不敏感的基因型为24小时。大豆在出土以后9天似乎对日长不敏感。需要7-26天的短于决定性日长的光周期来完成花诱导。
直至花冠开放时，大豆花通常是自花授粉的。柱头在开花前大约1天可接受花粉，并且如果花瓣没有脱落的话，在开花后2天仍是可授的。9根雄蕊的花丝融合，最接近基座的一根花丝是单独的。雄蕊在柱头以下形成环，直到开花前大约1天，然后它们的花丝开始快速伸长，并将花药升高至柱头周围。花药在开花时裂开，花粉粒落在柱头上，并且在10小时内，花粉管到达子房并完成受精。大豆中自花授粉自然发生，不受花的控制。对于两株大豆植物的杂交，尽管不是必须，但是通常优选利用人工杂交。在人工杂交中，在花的花粉成熟之前，通过手动使在杂交中用作雌性的花异花授粉，从而防止自花受精，或者可选地，利用本领域内已知的技术去除花的雄性部分。去除大豆花雄性部分的技术包括例如，物理去除雄性部分、使用赋予雄性不育的遗传因子以及对雄性部分施加化学杀配子剂。
在去除或不去除雌花的情况下，可以通过用手术钳从雄性亲本的花移出雄蕊和雌蕊，并将花药轻触雌花的柱头来实现手工授粉。通过去除前面的萼片和龙骨瓣，或通过用闭合的手术钳刺穿龙骨瓣并允许它们打开以推开花瓣来实现雄蕊进入。用花药轻触柱头使得花药破裂，当花粉在柱头上清晰可见时，获得最高百分比的成功杂交。在轻触柱头之前，可以通过打开花药来检验花粉脱落。当条件不适宜时，可能必须使用数个雄花以获得合适的花粉脱落，或者具有良好花粉脱落的同一雄性可用于为数朵花传粉。
可以使用本发明植物的整体或一部分。优选的植物部分包括生殖部分或储存部分。本文所用的术语“植物部分”包括但不限于，种子、胚乳、胚珠、花粉、根、块茎、茎、叶、叶柄、果实、浆果、果仁、树皮、豆荚、种子和花。在本发明的一实施方案中，所述植物部分是种子。
一方面，分离的多核苷酸可以包含PI283327mFAD2-1B(SEQIDNO:1)的核苷酸序列或其片段。可选地，多核苷酸可以与SEQIDNO:1具有基本的序列相似性，例如，与SEQIDNO:1序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。另一方面，多核苷酸可以与PI567189AmFAD2-1B的核苷酸序列(SEQIDNO:3)具有基本的序列相似性，例如，与SEQIDNO:3序列具有至少70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
蛋白的表达通常由称为启动子的基因非编码区调控。当启动子调控基因转录时，还可以说成是该基因(或所编码的蛋白)的表达受启动子驱动。当启动子置于编码序列附近时，使得编码序列的转录受启动子的调控，可以说成是编码序列序列与启动子可操作地连接。正常与基因不相关的启动子称为异源启动子。
在一实施方案中，由SEQIDNO:1、或SEQIDNO:3、或SEQIDNO:7单独或联合编码的Δ-12去饱和酶蛋白的表达，或由特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因的多核苷酸序列编码的突变体Δ-12去饱和酶蛋白的表达，可以作为“显性失活”蛋白突变。当基因产物对同一细胞内的正常的野生型基因产物产生不利影响时，显性失活或反效等位基因突变发生。如果产物仍能与野生型产物相同的元件相互作用，但是会阻断其功能的某些方面，则通常就发生了这种情况。这类蛋白可以是正常蛋白功能的竞争性抑制剂。
由本公开的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:7所编码的肽，或由本公开的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因的多核苷酸序列编码的肽可以通过本领域技术人员已知的化学合成制备。还可以利用具有编码所选肽的核苷酸序列的表达载体产生肽。核苷酸序列可以与合适的启动子、增强子、终止子或能调控编码肽表达的其它序列可操作地连接。核苷酸序列还可以与其它功能序列可操作地连接。一方面，这类功能序列可以是能编码纯化标签，以促进肽的表达和纯化的序列。另一方面，这类功能序列可以编码赋予核心肽各种对其治疗功能有利特性的辅助肽，例如，通过提高核心肽的稳定性或通过促进核心肽向其体内治疗靶组织或器官的递送。
术语“蛋白”、“多肽”、“肽”和“酶”在本公开中可以互换使用，所有的都指氨基酸的聚合物。除了本文明确公开的肽之外，可以在这些肽上进行某些“保守”取代，而基本不会改变肽的功能。
如同本领域内通常所理解的，直系同源蛋白中保守的氨基酸残基是维持生物学功能和/或折叠蛋白的进化压力的结果。一组直系同源基因中保守的氨基酸位置可以参与结构和功能的许多方面。不变的位置或展现出某些残基特性(例如，电荷、疏水性等)保守的那些位置可能比蛋白家族允许突变成更多种类氨基酸的那些位置耐受较少的突变。基于数据库序列存储的位置氨基酸序列保守，例如可用于确定对蛋白折叠和/或生物学功能具有不利影响的氨基酸取代。
计算机算法的序列比对程序可用于基于序列同源性和氨基酸的物理性质预测氨基酸取代是否影响蛋白功能。例如但不限于SIFT、PolyPhen、SNPs3D、PANTHERPSEC、PMUT和TopoSNP的氨基酸取代预测方法可用于预测氨基酸取代对蛋白功能的影响。这类预测方法可用于确定可能会导致FAD2-1A和/或FAD2-1B基因功能丧失或活性降低的氨基酸取代。
通常将保守型氨基酸取代定义为用能维持蛋白结构和功能特性的不同的氨基酸替代一个或多个氨基酸。
一个氨基酸对另一个氨基酸的“非保守型”取代是取代具有不同结构和/或化学特性的氨基酸，并且通常基于所涉及的残基的极性、电荷、疏水性、亲水性和/或两性性质上的差异。所取代的氨基酸可以包括天然存在的氨基酸以及天然蛋白中通常不存在的那些氨基酸。
以下实施例阐明了本发明。所提供的这些实施例仅为说明的目的，并非意图限制。作为典型组分或反应物而提供的化学制剂和其它成分以及各种修改都可以鉴于本发明范围内的上述公开而得到。
实施例1
高油酸含量大豆植物品系的分离和表征
选择了约40种具有提高油酸含量的大豆品系。三个育种系，包括专利登录品系M23(美国专利号7,326,547)被指定为具有不同的影响油酸浓度的基因。M23的油酸含量为其总脂肪酸谱的约40％-50％。如上文所述的，脂肪酸谱表示为总种子脂肪酸含量的百分比。M23具有一个隐性基因，指定为用于较高油酸含量的ol(Takagi,Y.&Rahman,S.M.InheritanceofhigholeicacidcontentintheseedoilofsoybeanmutantM23.(大豆突变体M23的种子油中高油酸含量的遗传特征)TheoreticalAppliedGenetics92,179-182(1996))。近期研究揭示，M23中的ol是FAD2-1A基因座缺失的结果(Sandhuetal.,2007)。另两个育种系是基于GermplasmResourcesInformationNetwork(GRIN)的脂肪酸数据的具有提高的油酸含量的植物引种(PI)。GRIN表明，植株PI283327和PI567189A每种分别含有约41％和38％的油酸含量。然而，在密苏里大学德塔中心2005-2007间跨越6个环境的PortagevilleMO实地试验中，植株PI283327和PI567189A平均具有约30％的油酸，在那里作为农民常种植的核对栽培品种平均具有约22％的油酸含量。这两种PI后来被发现在FAD2-1B基因座具有突变，这导致较高的种子油酸含量。
选择和杂交
从(RIL)群1(Jake×PI283327的F6RIL)、2(M23×PI283327的F2:6和F2:7RIL)和3(M23×PI567189A的F2:5和F2:7RIL)同时产生重组自交系。2005年夏季，在德塔研究中心密苏里州波蒂奇维尔进行三次杂交，包括Jake×PI283327、M23×PI283327和M23×PI567189A。PI283327和PI567189A分别是成熟期组V和IV的两种提高油酸的品系(GRINUSDA)，而Jake是含有典型油酸含量的组V的传统高产大豆(Shannon,J.G.etal.Registrationof'Jake'Soybean.JournalofPlantRegistration129-30(2007))。在对栽培品种Bay诱变之后，选择具有提高油酸的M23(Takagi,Y.&Rahman,S.M.InheritanceofhigholeicacidcontentintheseedoilofsoybeanmutantM23.(大豆突变体M23的种子油中高油酸含量的遗传特征)TheoreticalAppliedGenetics92,179-182(1996))。在2005年和2006年早期，在哥斯达黎加使F1种子产生F2代。从2006至2007年，追踪除了群1之外的单个F2植物的每个RIL，也在哥斯达黎加产生F5种子。在2007年，分析一批来自每群中每个RIL的5颗种子，以获得哥斯达黎加的脂肪酸谱。将群1种植于密苏里州波蒂奇维尔，以产生F7种子。将群2种植于密苏里州波蒂奇维尔，以产生F6种子，然后大于60％油酸的大豆RIL产生F7代。在群3中，选择仅产生大于60％油酸的F5RIL，以在密苏里州波蒂奇维尔产生下一代的F7种子。
在上段中，系统名F2:6表示来源于F2的F6，这意味着该品系的最后共同祖先在F1。F2植物开始单粒传法至F6代。群2的由至少2500个种子组成的代表性样品已经根据布达佩斯条约的条款于2010年6月16日置于保藏单位美国典型培养物保藏中心其位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯，用于在授予专利权时有条件地分发种子。该保藏单位指定为PTA11061。
在2008年，将群1和2种植于密苏里州波蒂奇维尔，以产生图8和9中用于分析脂肪酸的种子。图10的数据来自哥斯达黎加所产生的群3的F5种子。此外，在2009年，将来自群2和3的具有最高油酸含量的5个品系种植于密苏里州哥伦比亚。在2009年，将群4(17D×(PI283327×Jake)]种植于密苏里州哥伦比亚，以产生图5中用于进行脂肪酸分析的种子。同样，将来自群4的纯合FAD2-1A和FAD2-1B基因的四种组合中每一种的4至11个品系种植于密苏里州哥伦比亚，并在2009年将从群4选择的品系种植于密苏里州波蒂奇维尔。
在2008年夏季，在密苏里州波蒂奇维尔开始群5。大豆品系KB07-1#123与来自群2的大豆品系#93杂交。对大豆品系#93(>80％油酸)进行基因型分析以含有来自M23的FAD2-1AΔ等位基因和来自PI283327的FAD2-1BP137R等位基因。KB07-1#123是谱系为[W82×(M23×10-73)]的大豆品系。该大豆品系经选择以含有三个影响脂肪酸谱的突变等位基因，包括来自M23的FAD2-1AΔ等位基因、以及来自大豆品系10-73的突变FAD3A和FAD3C等位基因(Dierking,E.&Bilyeu,K.NewsourcesofsoybeanseedmealandoilcompositiontraitsidentifiedthroughTILLING(通过TILLING鉴定的大豆种子粗粉和油组成性状的新来源).BMCPlantBiology9,89(2009)；Bilyeu,K.,Palavalli,L.,Sleper,D.&Beuselinck,P.Mutationsinsoybeanmicrosomalomega-3fattyaciddesaturasegenesreducelinolenicacidconcentrationinsoybeanseeds(大豆微粒体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的突变降低大豆种子中的亚麻酸含量).CropScience45,1830-1836(2005)。F1种子经基因型分析以证实杂合性，然后在2009年夏季，在密苏里州哥伦比亚的BradfordResearchandExtensionCenter继续获得F2种子。
所需性状的选择可以发生在任何分离世代(F2及以上)。通过将群种植于所需性状最大化表达且可以鉴定具有所述性状的个体或品系的环境中对该群施加选择压力。例如，当将植物或品系种植于天然的或人工诱导的疾病环境中时，可以进行疾病抗性的选择，并且育种员仅选择很少有疾病或没有疾病的那些个体，因而它们呈现为抗性的。
双突变的(即mFAD2-1A和mFAD2-1B)大豆植物品系取决于环境可以在油酸含量上发生改变，然而，油酸含量(通常高达约80％-85％的油酸含量)总是高于野生型或单个mFAD1A或mFAD2-1B突变的大豆植物品系。
M23与PI283327或PI567189A的杂交导致子代具有显著高于任一亲本(约20％-50％)的油酸水平(分别为约85％和约65％)。这很可能是来源于M23的FAD2-1A和来源于PI283327或PI567189A的FAD2-1B的突变等位基因组合的结果。
当不同的FAD2-1A基因组合时，还鉴定出来自品系17D(17D具有突变的FAD2-1AS117N等位基因和35％的油酸，由Williams82种子诱变发育而来)×PI283327的80％油酸的品系。不管两个基因的来源，两个突变的FAD2-1A和FAD2-1B基因遗传入单个基因型导致油酸含量为任一亲本的至少两倍。
FAD2-1A和FAD2-1B突变的基因表征
对于来自多个种质系的FAD2-1A和FAD2-1B等位基因的最初表征，通过PCR扩增FAD2-1A和FAD2-1B基因，并进行测序。利用DNeasyPlantMini试剂盒(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)从大约30mg研碎的种子分离基因组DNA。每次PCR反应使用5-50ng的基因组DNA。利用ExTaq按照生产商的推荐(Takara,Otsu,Shiga,Japan)在PTC-200热循环仪(MJResearch/Bio-Rad,Hercules,CA)中进行PCR。FAD2-1A的正向引物是5’-ACTGCATCGAATAATACAAGCC-3’(SEQIDNO:13)；反向引物是5’-TGATATTGTCCCGTGCAGC-3’(SEQIDNO:14)。FAD2-1B的正向引物是5’-CCCGCTGTCCCTTTTAAACT-3’(SEQIDNO:15)；反向引物是5’-TTACATTATAGCCATGGATCGCTAC-3’(SEQIDNO:16)。PCR条件是：95℃5分钟，随后为95℃30秒、60℃30秒、72℃1分30秒，34个循环。通过在Flashgel上运行5分钟来检验PCR产物的大小。然后用QiaprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen,Inc.)分离PCR产物，并利FAD2-1A和FAD2-1B的正向引物和反向引物在密苏里大学的DNA中心设备上进行测序。将序列数据与参照“野生型”Williams82序列(W82)进行FAD2-1A和FAD2-1B基因的比较。所有受试品系的比较性序列分析如表2所示。
如表2所示，“S>F”代表丝氨酸至苯丙氨酸的氨基酸取代。“M>V”代表蛋氨酸至缬氨酸的氨基酸取代。“P>R”代表脯氨酸至精氨酸的氨基酸取代。“I>T”代表异亮氨酸至苏氨酸的氨基酸取代。
表2.FAD2-1B突变体的DNA序列中的变体
DNA序列分析揭示，PI283327被发现在FAD2-1B编码序列(mRNA)的410位核苷酸含有C至G的核苷酸取代，导致在137位氨基酸发生脯氨酸至精氨酸的氨基酸取代错义突变(P137R)。相比之下，发现PI567189A在FAD2-1B编码序列的428位核苷酸含有T至C的核苷酸取代，导致在143位氨基酸发生异亮氨酸至苏氨酸的错义突变(I143T)。其它单核苷酸多态性存在于等位基因中，但是或者没有改变氨基酸序列(沉默突变)、含有取代相似氨基酸的错义突变(例如，第126位氨基酸的蛋氨酸至缬氨酸(M126V))或含有蛋白非保守区的错义突变(例如，第86位氨基酸的丝氨酸至苯丙氨酸(S86F))。
之前，用这种突变对不同种质资源中S86F突变的研究与油酸含量的提高不相关联，即使在来自M23的FAD2-1A缺失等位基因的情况下。FAD2-1BP137R突变位于蛋白的非常保守的位置中，而I143T突变位于较不保守的位置中(图1B)。继这些发现之后，PI210179被发现含有与PI283327相同的FAD2-1B等位基因。PI578451被发现含有与PI567189A相同的FAD2-1B等位基因。还通过测序发现了含有变体FAD2-1A和FAD2-1B等位基因的其它种质资源。
图1B表明，FAD2基因序列的氨基酸135-150位中氨基酸取代的相对频率提供于美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)序列数据库中。Weblogo输出由所比对的脂肪酸去饱和酶的氨基酸保守性确定，作为NCBI用GI号197111724表示的BLINK的一部分。蛋白内的氨基酸位置列于X轴。各种氨基酸柱堆积的总高度表示在那个位置的序列保守性，而柱堆积内单字母氨基酸符号的高度表示那个位置中每种氨基酸的相对频率[CrooksGE,HonG,ChandoniaJM,BrennerSEWebLogo:Asequencelogogenerator,GenomeResearch,14:1188-1190,(2004)]。白色和黑色的箭头分别表示PI283327和PI567189A中突变的P137R和I143T位置。
图1A是从DierkingandBilyeu,2009,BMCPlantBiology9:89复制的，表明FAD2基因的氨基酸104-123位的氨基酸取代/氨基酸保守性的相对频率的Weblogo输出。蛋白内的氨基酸位置列于X轴。各种氨基酸柱堆积的总高度表示在那个位置的序列保守性，而柱堆积内单字母氨基酸符号的高度表示那个位置中每种氨基酸的相对频率。箭头表示品系17D中突变的FAD2-1AS117N位置。
利用M23FAD2-1A基因进行了很多工作，但是利用17D品系的最初结果提示，用FAD2-1A突变联合FAD2-1B突变来源能够产生具有80％油酸的大豆品系(如下文所述)。
高油酸表现型在生长于交替环境中的植物中是稳定的
本研究培育的一些高油酸大豆品系证明了当生长于不同的环境中时高油酸性状的稳定性(表3)。在三种环境中，哥斯达黎加在种子发育期间通常具有最温暖的温度，接下来是密苏里州波蒂奇维尔环境；在种子发育期间，密苏里州哥伦比亚环境是三种环境中最凉爽的。当存在FAD2-1BP137R等位基因时，环境之间油酸含量的差异是最小的。群2和4的具有基因型aabb的大豆品系在哥斯达黎加和密苏里州波蒂奇维尔环境中产生多于80％的油酸含量，而当生长在密苏里州哥伦比亚环境下时，油酸水平平均低2-4％。应当注意的是，在所有环境下，表现型变化是狭窄的。相比之下，群3的含有FAD2-1BI143T等位基因的aabb大豆品系在较凉爽的环境下具有较低且更加多变的油酸含量，并且在密苏里州哥伦比亚或密苏里州波蒂奇维尔环境下不能产生高油酸表现型。
表3.在三种环境下产生的具有突变体FAD2-1A和突变体FAD2-1B的不同组合的大豆品系的油酸含量和种子产生
1研究地在哥斯达黎加。群2和3的F5代的种子在2006-2007年冬季产生，而群4的F2种子在2008-2009年冬季产生。2植物生长在德塔研究中心，群2和3的F7代的种子在2008年夏季产生，群4的F3代在2009年夏季产生。3所有植物均生长于2009年夏季密苏里州哥伦比亚的BradfordResearch&ExtensionCenter。
表4表明，高油酸表现型在多种生长环境中是稳定的，所述环境包括密苏里州波蒂奇维尔、密苏里州哥伦比亚、密西西比州斯通维尔和田纳西州诺克斯维尔。遗传aabb基因型的大豆植物的油酸含量范围为72.3-83.2。
品系S08-14692、S08-14709、S08-14705、S08-14700、S08-14702和S08-14717是选自M23×PI283327杂交品系的大豆品系，其从M23遗传了突变体FAD2-1A等位基因(aa)，并从PI283327遗传了FAD2-1BP137R等位基因(bb)，基因型为aabb。品系Anand和5002T是对于FAD2-1A等位基因(AA)和FAD2-1B等位基因(BB)为野生型的大豆品系，基因型为AABB。品系N98-4445A是含有提高的油酸含量并携带至少6个决定高油酸表现型的基因(QTL)的大豆品系。
脂肪酸含量的测定
通过Olivaetal.(2006)所描述的气相色谱法(GC)测定每种环境下每种基因型的脂肪酸谱，表示为总油的百分比。在大多数情况下，从各植株和杂交系随机选择5粒个体种子用于脂肪酸分析。然而，如图2所示的脂肪酸谱使用5或10粒种子用于测量。将每5或10粒种子的样品放置于纸信封中，然后用锤子手动压碎。通过将压碎的种子置于5mL氯仿:己烷:甲醇(8:5:2,v/v/v)中过夜提取油。通过将100μL提取物转移至小瓶中并添加75μL烷化剂(0.25M甲醇钠甲醇盐:石油醚:乙醚，1:5:2v/v/v)进行衍生。添加己烷使样品达到大约1mL。使用配备了火焰电离探测器(275℃)的Agilent(PaloAlto,CA)系列6890毛细管气相色谱仪与AT-Silar毛细管柱(AlltechAss℃iates,Deerfield,IL)。标准脂肪酸混合物(动物和植物油参照混合物6,AOACS)用作校准参照标准品。
如图2-4所示，“A”表示“野生型”或非突变的FAD2-1A等位基因如参照品系W82所携带的。“a”表示突变的FAD2-1A(mFAD2-1A)等位基因，如品系M23所携带的。“B”表示“野生型”或非突变的FAD2-1B等位基因。“b”表示突变的FAD2-1B(mFAD2-1B)等位基因如品系PI283327和PI567189A所携带的。因此，“AA”表示纯合的FAD2-1A基因型，“aa”表示纯合的mFAD2-1A基因型，“BB”表示纯合的FAD2-1B基因型，“bb”表示纯合的mFAD2-1B基因型，Aa表示杂合的FAD2-1A/mFAD2-1A基因型，以及Bb表示杂合的FAD2-1B/mFAD2-1B基因型。
图2是展示来源于M23×PI283327重组自交系(RIL)的F7子代的各种等位基因变体中脂肪酸组分16:0、18:0、18:1、18:2和18:3的相对脂肪酸含量的直方图。如图2所示，对于野生型FAD2-1A和FAD2-1B(AABB)的纯合的子代具有的油酸水平与自然界中通常所见的水平一致，即为约20％。油酸去饱和的对应副产物即亚油酸的水平为大约55％。单独FAD2-1B的突变(AAbb)显示出，油酸含量仅有非常小的提高，范围为约25％至约30％。显然，具有mFAD2-1A和mFAD2-1B(aabb)等位基因的子代的油酸水平为大约80％，对应的亚油酸水平低于5％。
如图3所示，进一步表征油酸含量，并与亲本品系M23和PI283327进行比较。与图2的结果一致，具有野生型等位基因(AABB)的种的油酸水平为大约20％。具有aaBB或AAbb基因型的种子的油酸水平分别为大约40％或大约25％。如图2所示，尽管单独FAD2-1B的突变(AAbb)显示出油酸含量仅有非常小的提高，但是具有mFAD2-1A和mFAD2-1B(aabb)等位基因的双突变种子的油酸水平为大约80％。M23和PI283327种子的油酸水平分别为大约42％和25％。
与植株M23相似，17D是在FAD2-1A基因中具有突变的大豆植株。如图4示，对于该突变为纯合的F2种子(在2009年早期在在哥斯达黎加产生)显示出，油酸水平从大约20％小幅提高到大约25％。当植株17D与来源于PI283327的品系杂交时，含有mFAD2-1A和mFAD2-1B(aabb)纯合基因的F2种子具有大约80％的油酸含量。图4还展示了，各种杂合基因型具有不同水平的油酸，这表明通过FAD2-1A和FAD2-1B等位基因组合的改变可以获得不同程度的油酸水平。例如，17DmFAD2-1A的杂合遗传特征(Aa)和mFAD2-1B的纯合遗传特征(bb)导致种子具有大约45％的油酸水平。
对来自群4(FAD2-1AS117N×FAD2-1BP137杂交)的F2种子中的FAD2-1基因型和脂肪酸表现型的最初研究表明突变等位基因的上位性质联合作用，并且结果揭示，只有突变FAD2-1A和FAD2-1B的纯合组合能产生高油酸表现型。在200粒进行表现型分析的F2种子中，有12粒个体F2种子具有基因型FAD2-1aabb，且它们的平均油酸含量为81％，油酸范围为75.2％至83.9％(图4)。在小组中次高的油酸表现型为48.8％，且种子具有FAD2-1Aabb基因型。对于两个隐性基因模型，1/6的个体应该遗传该表现型；12个个体具有高油酸表现型的发现满足了这种经卡方检验在0.05概率水平的期望。
具有一个FAD2-1A或FAD2-1B野生型版本和三个突变FAD2-1等位基因(Aabb或aaBb)的个体含有大约40％的油酸。来自其它FAD2-1基因型的种子没有一个含有超过种子油49％的油酸水平。具有两个或更多个野生型FAD2-1等位基因的个体含有的油酸含量范围为种子油的18-47％。
高油酸表现型需要纯合FAD2-1A和FAD2-1B突变体组合的必要性在田间生产的F2种子的FAD2-1基因型和脂肪酸表现型的单独分析中得到证实，所述F2种子含有纯合的FAD2-1AΔ等位基因，但是对于FAD2-1BP137R等位基因是分离的(群5)。尽管具有aabb基因型的那些种子的平均油酸水平为82.5％，但是aaBb种子平均为55.4％；aaBB种子的油酸平均为种子油的43.4％。FAD2-1B等位基因的单个野生型版本的存在也阻止了种子油中的高油酸含量，尽管来自群4的F2种子的差异幅度更大。
表5展示了在2006-2007和2007-2008年间来源于M23×PI283327的14种大豆植物品系的相对油酸含量。如表3中所指出的，“MT”代表成熟日期在8月1日以后的天数，即MT为68表示该品系在10月8日成熟。14种F6品系的每一种对于mFAD2-1A和mFAD2-1B都是纯合隐性的。此外，14种品系的每一种被追踪至分离的F2植物，并且是F2:6重组自交系。这些结果来自生长于哥斯达黎加的种子。来自2006-2007年的样品是F5代，而来自2007-2008年的样品是F6代。油酸含量通常接近或高于80％，范围为约79％至约86％。
表5.来源于生长在哥斯达黎加的M23×PI283327的14种大豆植物品系的以总脂肪酸百分比表示的油酸含量
表6显示了于2008年进行的来源于M23×PI283327的14种大豆植物品系的脂肪酸谱。14种F6品系的每一种对于mFAD2-1A和mFAD2-1B都是纯合隐性的。此外，14种品系的每一种都追踪至分离的F2植物，并且是F2:6重组自交系。来自14种品系的种子被种植于密苏里州波蒂奇维尔。油酸含量通常接近或高于80％，范围为约79％至约85％。
表6.来源于生长在密苏里州波蒂奇维尔的M23×PI283327的14种F7大豆植物品系的脂肪酸谱
表7显示了在2008年对来源于17D×S08-14788(Jake×PI283327)的12种F2大豆植物品系进行分析的脂肪酸谱。油酸水平的范围为约75％至约84％。
表7.来源于17D×S08-14788(Jake×PI283327)的12种F2大豆品系的脂肪酸谱
还分析了来源于M23和PI567189A杂交(M23×PI567189A)的种子(在2008年生长在密苏里州波蒂奇维尔)，以确定油酸的相对量。图5表示对遗传FAD2-1A基因的野生型(AA)或缺失版本(aa)以及遗传来源于PI567189A的FAD2-1B的野生型(BB)或I143T突变等位基因(bb)的植物的基因型和表现型分析，所述I143T突变等位基因(bb)不同于PI283327中存在的mFAD2-1B等位基因(上文所述)。如图5所示，PI567189A等位基因比PI283327的mFAD2-1B等位基因“弱”。但是遗传了PI283327和M23纯合等位基因的大豆植物总是具有约80％的油酸水平，遗传了纯合突变的来自PI567189A和M23的FAD2-1A和FAD2-1B等位基因的大豆植物具有约65％的油酸含量。
还分析了来源于Jake和PI283327杂交(Jake×PI283327)的种子，以确定其脂肪酸谱。图6表示对遗传FAD2-1A基因的野生型(AA)版本以及遗传来源于PI283327的FAD2-1B的野生型(BB)或P137R突变等位基因(bb)的植物的基因型和表现型分析，所述P137R突变等位基因(bb)不同于PI567189A中存在的mFAD2-1B等位基因(上文所述)。如图6所示，野生型Jake背景(AAbb)上的PI283327mFAD2-1B等位基因对油酸水平具有中等影响。但是遗传了AABB基因型的种子具有约20％的油酸水平，遗传了AAbb基因型的种子仅使油酸水平略微提高到约28％。
综合考虑这些数据表明，遗传了FAD2-1A基因和FAD2-1B基因的功能丧失或活性降低突变的植物产生的种子具有高水平的油酸含量，范围为约75％至约85％。
本项研究中由群2、3和4产生的对照FAD2-基因型类别的种子的全脂肪酸谱揭示棕榈酸、亚油酸和亚麻酸含量中的其它改变(表6)。如同所预料的种子中表达的FAD2酶活性的大量降低导致油酸积累，FAD2反应产物亚油酸和亚麻酸在高油FAD2-1A和FAD2-1B纯合突变体品系(这时FAD2-1A突变与FAD2-1BP137R或I143T等位基因同时存在)中显著降低。
表8.显示通过将携带不同来源的突变FAD2-1A等位基因的大豆品系与不同来源的突变FAD2-1B等位基因的大豆品系杂交而培育出的四种分离群中不同纯合FAD2-1基因型的脂肪酸谱。
表8.多种基因型的脂肪酸谱
脂肪酸
*AA＝野生型FAD2-1A等位基因，aa＝来源于M23或17D的突变FAD2-1A等位基因，BB＝野生型FAD2-1B等位基因，bb＝来源于PI283327或PI567189A的突变FAD2-1B等位基因。
通过评价从成熟种子提取的油中所存在的油酸、亚油酸和亚麻酸的比例，确定来自每一群的对照纯合FAD2-1基因型的发育种子的相对FAD2和FAD3去饱和酶活性。群2、群3和群4的FAD2-1AABB基因型分别含有76％、76％和74％的FAD2去饱和酶活性(最终的油酸含量除以最终的油酸、亚油酸和亚麻酸含量的总和)。群2、群3和群4的FAD2-1aabb基因型分别含有7％、10％和14％的FAD2去饱和酶活性。还应当注意的是，对于FAD2-1aabb突变体品系而言，亚麻酸的积累按照与FAD2-1AABB品系不同的模式，FAD2-1突变体品系具有增加的FAD3去饱和酶活性(最终的亚麻酸含量除以最终的亚油酸和亚麻酸含量的总和)。
尽管在对照FAD2-1基因型中没有观察到硬脂酸水平上的显著差异，但是aabb突变体品系产生的棕榈酸水平总是低于AABB基因型的品系。改变最显著的是群2。在那种情况下，与AABB品系12.3％的棕榈酸含量相比，aabb突变体品系的棕榈酸含量为7.9％。
由于担心脂肪酸谱的改善可能会对种子的总油和蛋白谱产生负面影响，我们还评价了从群4田间生产的F2:3种子的蛋白和油含量。在不同的纯合FAD2基因型中，或者将那些品系与Williams82或17D亲本品系相比，在蛋白或油含量上没有显著差异。FAD2-1BP137R等位基因供体亲本品系在平均油含量上有较小的降低，并且在所检验的所有品系中具有最高的平均蛋白含量。
基因型分型区别高油酸含量大豆品系PI283327和PI567189AFAD2-1B等位基因与野生型FAD2-1B等位基因
设计基因型分型测定以区别PI283327和PI567189AFAD2-1B等位基因与野生型等位基因。在荧光标记的SimpleProbe(RoCheAppliedSciences)的存在下，通过在围绕c410g和t428c单核苷酸多态性(SNPs)的FAD2-1B区中对基因组DNA进行不对称的基因-特异性实时PCR扩增来完成基因型分型测定工作。扩增后，将PCR产物进行熔解曲线分析，其追踪SimpleProbe从靶DNA的解离动力学。SimpleProbe对纯合野生型、杂合和纯合突变等位基因具有特征熔解曲线。
设计SimpleProbe、GmFAD2-1B来检测野生型、杂合和纯合突变等位基因。GmFAD2-1BSimpleProbe由5'-SPC(简单的探针化学)-AGTCCCTTATTTCTCATGGAAAATAAGC-磷酸盐-3'(SEQIDNO17)组成：C至G的突变和T至C的突变用下划线指出。基因型分型反应用5:2不对称的引物混合物进行(5’-ACTGCATCGAATAATACAAGCC-3’(SEQIDNO:18)；以2μM的终浓度和5’-TGATATTGTCCCGTCCAGC-3’(SEQIDNO:19)；以5μM的终浓度)。以20μl进行反应；含有模板、引物、0.2μM终浓度的SimpleProbe和0.2XTitaniumTaq聚合酶(BDBiosciences,PaloAlto,CA)。利用Lightcycler480II实时PCR仪器(RoChe)，用以下PCR参数进行基因型分型反应：95℃5分钟，随后为95℃20秒、60℃20秒、72℃20秒，40个循环，然后为从55℃至70℃的熔解曲线。当用基因特异性引物从PI283327和PI567189A扩增出DNA，并用在利用SimpleProbe的熔解曲线分析中时，Simpleprobe和扩增子之间的错配导致解离动力学改变。如通过荧光信号消失的负第一衍生物的Tm所测量的，每种基因型产生了特征熔解曲线。PI283327以及具有相似FAD2-1B基因型的所有大豆品系都具有56.7℃的特征峰，而PI567189A产生的特征峰在60.2℃。M23和Jake(对FAD2-1B为野生型)具有的峰位于62.5℃。杂合的个体基因型显示出两个峰，在56.7℃或60.2℃以及62.5℃。
用所述的SimpleProbe测定进行三个群Jake×PI283327、M23×PI283327、M23×PI567189A的基因型分型。图7通过图表展示了熔解曲线分析，和与FAD2-1B和mFAD2-1B基因的纯合突变体(bb)、野生型(BB)和杂合(Bb)等位基因对应的峰。
温度对油酸含量的影响
尽管有证据证明温度对大豆种子油酸含量的影响，但是我们的三种高油酸大豆基因型中的两种被证明能在三种环境下产生高且稳定的油酸含量。此外，在所评价的高油酸大豆品系中，油和蛋白含量没有下降。具有来自群3的FAD2-1AΔ和FAD2-1BI143T等位基因组合的大豆品系当在非热带环境下生长时，不能产生高油酸表现型。一种可能的解释是PI567189AFAD2-1B等位基因的突变编码了至少很少的酶功能。这种解释得到以下事实的支持：I143T取代与P137R取代相比处于FAD2酶较不保守的氨基酸内。除了这以外，高油酸大豆品系当生长在较凉爽的环境中时，在油酸含量上具有较小的变化，显示出至多4％的降低。测试这些高油酸大豆品系在处于较北纬度的主要北美洲大豆生长地的表现是必要的。对于那些待进行的实验，必须将突变FAD2-1A和FAD2-1B等位基因在具有合适成熟期的大豆品系中组合。然而，基于到目前为止我们已经观察到的性状的稳定性，由环境引起的油酸含量的任何降低可能都是极小的，因为在突变FAD2-1A和FAD2-1B品系的发育种子中很少残留有FAD2酶活性。其他因素在于最终用途市场还没有足够成熟以确定不同油用途所需的精确油酸含量。应被提出的另一问题是该性状是否会影响产量或其他农艺性状。据报道FAD2-1基因被沉默的转基因大豆品系没有表现出任何产量障碍或异常生理学特征。
上文概括的方法和植株用来产生含有油酸油高的提高营养油谱性状的传统大豆品种。目前的年需求量或油酸是约四百万吨高油酸油并且在不断增加。该数字转化成年产量是二百万英亩高油酸大豆以满足了目前的需求。具有提高油谱性状的大豆的可供量可以影响市场并增加需求，尤其是如果本国生物燃料生产能力提高的话。
如上文所概括的，不再需要转基因技术，因此消除了对昂贵且耗时的调整过程的需要。开发的完善的分子标志物和大豆种质提供了将这些所需的性状快速整合入其他商业大豆品系的有效方式。
产业还没有具有高油酸性状的非转基因优良大豆品种进入市场。高油酸大豆油可能会在食品产业中提供用于食品配制的之前使用的部分氢化植物油的替代物。目前，低亚麻酸大豆油能够满足对反式脂肪(含有部分氢化植物油)替代物的一些需求。高油酸大豆油通过在很多产品中改善大豆油的功能性而增添了价值，如提高生物柴油的冷流；更好的润滑剂以经受高温以及在食品、药品和其他产品中更广泛的用途。
实施例2
利用标准育种方法产生高油酸含量的大豆种子
如上所述，分析大豆植物植株中导致FAD2-1A或FAD2-1B基因功能丧失或生物学活性降低的突变。如通过油酸含量表现型所测量的，使表现出FAD2-1A或FAD2-1B活性削弱的大豆植物品系杂交(mFAD2-1A×mFAD2-1B)，以产生携带FAD2-1A突变和FAD2-1B突变的子代。这些突变是稳定遗传的，并协同作用以产生具有高水平油酸的种子。利用气相色谱法分析来源于亲本杂交的大豆品系种子的脂肪酸组成。转化植物的种子表现出约65％至约85％的高水平油酸。
实施例3
具有其他所需性状的高油酸大豆品系的选择
在某些实施方案中，可取的是，选择具有高油酸含量的种子以及具有其他具有各种农艺目的表现型的所需性状的大豆植物。其他所需性状的实例可以是但不限于，疾病抗性、害虫抗性、杀虫剂抗性、加速的生长速率、高种子产量、在不同环境下生长的能力等。
将具有FAD2-1A和FAD2-1B功能丧失或活性降低突变的大豆植物与具有一种或多种所需性状的大豆植物杂交。分析杂交子代中来源于FAD2-1A/FAD2-1B双突变体和具有其他所需性状的大豆植物的所需基因型和表现型特征的存在。
实施例4
显性失活FAD2转基因植物的产生
将与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的序列，或编码M23突变体的序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的大豆核苷酸序列克隆入表达载体，所述M23突变体的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因。使用下文所述的基因枪方法利用得到的表达构建体转化大豆。
表达载体可以具有起表达mFAD2-1B的显性失活形式作用的启动子，该表达的水平高于用内源性或野生型启动子表达所见的水平。
通过McCabeetal.(1988),Bio/Technology,6:923-926的粒子轰击方法或通过与根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株ABI的共培养(Martinell,美国专利号6,384,310)，将含有用于mFAD2-1B去饱和酶基因显性失活表达的表达构建体的线性DNA片段稳定地导入大豆(Asgrow种类A3244或A4922A32)。通过上文所述的基因型分型测定鉴定转化的大豆植物。
利用气相色谱法分析转化有显性失活表达构建体的大豆品系的种子的脂肪酸组成。
实施例5
高油酸含量大豆种子的产生
如上所述，分析大豆植物种子中导致油酸升高表现型的自发突变。如通过油酸含量表现型所测量的，将表现出FAD2-1A或FAD2-1B活性削弱的大豆植物品系杂交(即mFAD2-1A×mFAD2-1B)，以产生携带FAD2-1A突变和FAD2-1B突变的子代。这些突变是稳定遗传的，并协同作用以产生具有高水平油酸的种子。利用气相色谱法分析来源于亲本杂交的大豆品系种子的脂肪酸组成。转化植物的种子表现出高水平油酸(超过80％)。
具体实施方案的描述揭示了上位概念，没有脱离该上位概念的其他方面可以修改和/或使之适应多种应用或用途。因此，这类适应和修改应当并且意图包括在所公开实施方案等同物的实质和范围内。应当理解的是，本文所用的措辞或专门术语是为了说明而非限制的目的。具有大写字母或小写字母的某些术语，无论是单数还是复数形式在本公开中都可以互换使用。
本申请所提到的所有参考文献通过引用并入本文至如同完全复制的程度。

Claims (21)

1.选择种子具有约65％至约85％油酸含量的大豆植物的方法，所述方法包括：
(1)将具有编码mFAD2-1A的第一多核苷酸序列的第一大豆植物与具有编码mFAD2-1B的第二多核苷酸序列的第二大豆植物杂交，其中
所述第一多核苷酸序列选自：(a)编码包含至少一个突变的FAD2-1A突变体的多核苷酸序列，所述突变包括在SEQIDNO:10的117位氨基酸处的非保守型氨基酸取代；和(b)编码M23突变体的多核苷酸，所述M23突变体的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因；其中所述FAD2-1A突变体为非功能性的或与野生型FAD2-1A相比具有降低的活性；以及
所述第二多核苷酸序列选自：(a)编码包含至少一个突变的FAD2-1B突变体的多核苷酸序列，所述突变包括在SEQIDNO:12的137位氨基酸处的非保守型氨基酸取代；和(b)编码包含至少一个突变的FAD2-1B突变体的多核苷酸序列，所述突变包括在SEQIDNO:12的143位氨基酸处的非保守型氨基酸取代；其中所述FAD2-1B突变体为非功能性的或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性；
(2)选择稳定繁殖所述第一多核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的大豆植物群体，使得所述群体的种子的油具有约65％至约85％的油酸含量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1A突变体或与野生型FAD2-1A相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1A突变体，所述突变包括在SEQIDNO:10的117位氨基酸处的非保守型氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码包括在SEQIDNO:10的117位从丝氨酸至天冬酰胺的氨基酸取代(S117N)的FAD2-1A突变体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列为SEQIDNO:7。
5.如权利要求1所述的方法，所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的137位的极性氨基酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列编码包括在SEQIDNO:12的137位从脯氨酸至精氨酸的氨基酸取代(P137R)的FAD2-1B突变体。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列为SEQIDNO:1。
9.如权利要求1所述的方法，所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的143位的极性氨基酸。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列编码包括在SEQIDNO:12的143位从异亮氨酸至苏氨酸的氨基酸取代(I143T)的FAD2-1B突变体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列为SEQIDNO:3。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码M23突变体，所述M23突变体的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因，并且其中所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的137位的极性氨基酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码M23突变体，所述M23突变体的特征为缺失具有SEQIDNO:5所示序列的FAD2-1A基因，并且其中所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的143位的极性氨基酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1A突变体或与野生型FAD2-1A相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1A突变体，所述突变包括在SEQIDNO:10的117位氨基酸处的非保守型氨基酸取代，并且其中所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的137位的极性氨基酸。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1A突变体或与野生型FAD2-1A相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1A突变体，所述突变包括在SEQIDNO:10的117位氨基酸处的非保守型氨基酸取代，并且其中所述第二多核苷酸序列编码非功能性的FAD2-1B突变体或与野生型FAD2-1B相比具有降低的活性的包含至少一个突变的FAD2-1B突变体，所述突变包括在SEQIDNO:12的143位的极性氨基酸。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述极性氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸。
21.从通过权利要求1-20中任一项所述的方法选择的大豆植物的种子制成的油，其中所述油包含可检测量的所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列并且具有约65％至约85％的油酸含量。
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