CN105483079A - 基于体外受精的小鼠微生物净化方法 - Google Patents

基于体外受精的小鼠微生物净化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将取自刚刚死亡的成年雄性鼠的精子溶液置于取自刚刚死亡的成年无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠的卵团中得受精液，二氧化碳条件下恒温放置受精得受精卵；继续培养受精卵得胚胎用于移植；其中，所述雄性鼠与所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠属于同一品系。本发明将体外受精技术应用于小鼠的辅助生殖，对目的小鼠进行微生物学净化，得到SPF级的小鼠品系。突破了待净化小鼠自然交配障碍，也可用于濒危动物资源的种质保存和快速建群。为净化种群的快速建立提供了捷径。

Description

基于体外受精的小鼠微生物净化方法
技术领域
本发明属于实验动物学领域，涉及一种基于体外受精的小鼠微生物净化方法。
背景技术
由于基因修饰技术的发展，基因修饰小鼠在世界各地实验室中进行交流成为常态，为了保证外来小鼠的微生物学等级符合目的动物房的要求，微生物净化技术是实验动物种群微生物与寄生虫质量控制的关键技术。经典技术为剖腹产技术，即通过剖腹方法取得乳鼠以同种无菌动物或SPF动物代乳，获得SPF子代种群。后来发展了胚胎移植技术，即从妊娠初期的小鼠输卵管或子宫中取得胚胎，将其移入无菌级或SPF级代孕母鼠的输卵管或子宫中，获得SPF子代种群。
上述现有技术都是通过小鼠的自然交配或超数排卵基础上的适时交配后，获得受精卵，进而发育成胚胎乃至个体。但以上方法获得的胚胎数量有限，每只雄鼠每次一般为6-15个后代，一旦雄鼠由于遗传、年老、生殖器损伤或肥胖等因素造成不能进行自然交配或自然交配屡次不成功，无法获得子代个体或胚胎，从而无法获得子代种群。使得目标品系小鼠无法完成净化，还将面临品系灭绝的危险。
外受精技术尽管已经广泛应用于人类和动物的辅助生殖，但很少见到应用于小鼠的微生物学净化，原因是在净化前需要将雄性小鼠处死，取其附睾，分离精子，尽管一次性可获得较大数量的精子，但需要以雄性动物的死亡为代价。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本申请提供一种基于体外受精的小鼠微生物净化方法，旨在发现雄性小鼠健康状况不佳时，密切观察，发现死亡立即解剖取其附睾及输卵管用于释放精子进行体外受精。以此方法来避免品系的灭绝。
本发明提供一种基于体外受精的小鼠微生物净化方法，所述方法包括如下步骤：将取自刚刚死亡的成年雄性鼠的精子溶液置于取自刚刚死亡的成年无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠的卵团中得受精液，二氧化碳条件下恒温放置受精得受精卵；继续培养受精卵得胚胎用于移植；
其中，所述雄性鼠与所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠属于同一品系。
优选地，所述品系包括ALb-cre转基因小鼠、GFP转基因小鼠、Lepr基因敲除小鼠。
优选地，所述精子溶液的获得包括如下步骤：
无菌条件下，取出刚刚死亡的成年雄性鼠的雄性生殖器官，放入酒精中浸泡；然后漂洗，去除睾丸、附睾头和输精管，在附睾尾上剪出3-4个小孔，浸入预热的HTF溶液中，用矿物油覆盖，二氧化碳条件恒温放置，待精子从附睾尾中游出，形成精子溶液。
优选地，所述成年雄性鼠为10-12周龄鼠。
优选地，所述浸泡具体指采用75％的酒精中浸泡15分钟。
优选地，所述精子溶液的获得过程在操作之前，还包括将刚刚死亡的成年雄性鼠放入75％的酒精中浸泡15-20分钟。
优选地，所述剪切采用眼科剪。
优选地，所述预热的温度为37℃，该温度为小鼠体温。
优选地，所述恒温放置的温度为37℃，二氧化碳的体积含量为5％(模拟体内CO2含量)。
优选地，所述卵团的获得包括如下步骤：打开刚刚死亡的无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠的腹腔，分离输卵管，取出卵团，5-10只小鼠卵团浸入100ul-200ul预热的HTF溶液中，并用预热的HTF洗涤2-3次，用矿物油覆盖，二氧化碳条件恒温放置，即得。
优选地，所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠为5-6周鼠。
优选地，所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠在死亡前3天注射过PMSG(孕妈血清激素)5-7.5IU，然后并于24小时后注射过HCG(人绒毛膜促性腺激素)7.5IU，于第二次注射14-16小时后死亡。
优选地，所述预热的温度为37℃。
优选地，所述恒温放置的温度为37℃，二氧化碳的体积含量为5％。
优选地，基于体外受精的小鼠微生物净化方法中，恒温放置的温度为37℃，二氧化碳的体积含量为5％。
优选地，所述继续培养受精卵前还对受精卵进行了筛选；所述筛选是在所述恒温放置受精后6-7小时后进行的；
所述筛选具体包括：将受精液滴置于显微镜下挑选，挑取发育原核、观察到第二极体和精子头已经进入透明带的受精卵移入矿物油覆盖的预热KSOM培养液滴中，继续培养；所述培养液为100ul、预热温度为37℃；其中，每滴KSOM培养液的大小为25-50微升，每微升KSOM培养液中培养25-50个受精卵。
优选地，所述移植是在所述继续培养受精卵14-16小时后进行的；
所述移植具体指将发育至2-4细胞期的胚胎，移植入假孕0.5天的SPF级ICR雌性鼠的输卵管中，待产。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
一般情况下，当稀有品系的小鼠面临死亡或生殖器官缺陷时，人们往往对其进行施救，希望在保存其生命的情况下，恢复其生殖功能，然后进行剖腹产或胚胎移植进行保存该品系，但施救不成功或生殖功能不能恢复的情况下，只能任由该品系小鼠丢失。通过采用体外受精技术，将刚刚死亡的雄性小鼠解剖，取其附睾及输卵管，释放其中的精子，经过处理后进行体外受精后，再进行胚胎移植，最终即保存了该品系的后代又实现了微生物学净化的目的。
本发明将体外受精技术应用于小鼠的辅助生殖，对目的小鼠进行微生物学净化，得到SPF级的小鼠品系。突破了待净化小鼠自然交配障碍，也可用于濒危动物资源的种质保存和快速建群。为净化种群的快速建立提供了捷径。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：ALb-cre转基因小鼠的净化
(1)、精子的获得：ALb-cre转基因小鼠杂合子10-12周龄雄性小鼠脱臼处死，放入75％的酒精中浸泡15-20分钟，在超净工作台中无菌取出雄性生殖器官，放入75％的酒精中浸泡3-5分钟，用PBS充分漂洗，去除睾丸、附睾头和输精管，在附睾尾上用眼科剪剪出3-4个小孔，浸入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，待精子从附睾尾中游出备用。
(2)卵子的准备：取5-6周与ALb-cre转基因小鼠同品系的无菌或SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)5-7.5IU，24小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)5-7.5IU，14-16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，并洗涤2-3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。
(3)、受精过程：取步骤(2)获得的精子液10-15ul置于(3)中的卵团中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，进行受精。
(4)受精卵的挑选：6-7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，挑取发育原核、观察到第二极体和精子头已经进入透明带的卵移入矿物油覆盖的100-150ul预热至37℃的KSOM培养液中，继续培养。
(5)胚胎移植：14-16小时后，将发育至2-4细胞期胚胎，移植入假孕0.5天的SPF级ICR雌鼠的输卵管中，待产。
(6)子鼠鉴定：子鼠出生后5-10取子鼠样品，进行实验室鉴定。
实施例2：GFP转基因小鼠的净化
(1)、精子的获得：GFP转基因小鼠杂合子10-12周龄雄性小鼠脱臼处死，放入75％的酒精中浸泡15-20分钟，在超净工作台中无菌取出雄性生殖器官，放入75％的酒精中浸泡3-5分钟，用PBS充分漂洗，去除睾丸、附睾头和输精管，在附睾尾上用眼科剪剪出3-4个小孔，浸入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，待精子从附睾尾中游出备用。
(2)、卵子的准备：取5-6周与GFP转基因小鼠同品系的无菌或SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)5-7.5IU，24小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)5-7.5IU，14小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，并洗涤2-3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。
(3)、受精过程：取步骤(2)获得的精子液10-15ul置于(3)中的卵团中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，进行受精。
(4)受精卵的挑选：6-7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，挑取发育原核、观察到第二极体和精子头已经进入透明带的卵移入矿物油覆盖的100-150ul预热至37℃的KSOM培养液中，继续培养。
(5)胚胎移植：14-16小时后，将发育至2-4细胞期胚胎，移植入假孕0.5天的SPF级ICR雌鼠的输卵管中，待产。
(6)子鼠鉴定：子鼠出生根据皮肤颜色可确定阳性小鼠。
实施例3：Lepr基因敲除小鼠的净化
(1)、精子的获得：Lepr基因敲除小鼠杂合子10-12周龄雄性小鼠脱臼处死，放入75％的酒精中浸泡15-20分钟，在超净工作台中无菌取出雄性生殖器官，放入75％的酒精中浸泡3-5分钟，用PBS充分漂洗，去除睾丸、附睾头和输精管，在附睾尾上用眼科剪剪出3-4个小孔，浸入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，待精子从附睾尾中游出备用。
(2)、卵子的准备：取5-6周与Lepr基因敲除小鼠同品系的无菌或SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)5-7.5IU，24小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)5-7.5IU，14-16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃HTF溶液中，并洗涤2-3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。
(3)、受精过程：取步骤(2)获得的精子液10-15ul置于(3)中的卵团中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，进行受精。
(4)受精卵的挑选：6-7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，挑取发育原核、观察到第二极体和精子头已经进入透明带的卵移入矿物油覆盖的100-150ul预热至37℃的KSOM培养液中，继续培养。
(5)胚胎移植：14-16小时后，将发育至2-4细胞期胚胎，移植入假孕0.5天的SPF级ICR雌鼠的输卵管中，待产。
(6)子鼠鉴定：子鼠出生后5-10取子鼠样品，进行实验室鉴定。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将取自刚刚死亡的成年雄性鼠的精子溶液置于取自刚刚死亡的成年无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠的卵团中得受精液，将其二氧化碳条件下恒温放置受精得受精卵；继续培养受精卵得胚胎用于移植；
其中，所述雄性鼠与所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠属于同一品系。
2.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述品系包括ALb-cre转基因小鼠、GFP转基因小鼠或Lepr基因敲除小鼠。
3.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述精子溶液的获得包括如下步骤：
无菌条件下，取出刚刚死亡的成年雄性鼠的雄性生殖器官，放入酒精中浸泡；然后漂洗，去除睾丸、附睾头和输精管，在附睾尾上剪出3-4个小孔，浸入100-200ul预热的HTF溶液中，用矿物油覆盖，二氧化碳条件恒温放置，待精子从附睾尾中游出，形成精子溶液。
4.根据权利要求3所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述浸泡具体指采用75％的酒精中浸泡15分钟；
所述精子溶液的获得过程在操作之前，还包括将刚刚死亡的成年雄性鼠放入75％的酒精中浸泡15-20分钟。
5.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述卵团的获得包括如下步骤：打开刚刚死亡的无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠的腹腔，分离输卵管，取出卵团，5-10只所述雌性鼠的卵团浸入预热的100-200ul的HTF溶液中，并用预热的HTP洗涤2-3次，用矿物油覆盖，二氧化碳条件恒温放置，即得。
6.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述无菌雌性鼠或SPF级雌性鼠在死亡前3天注射过PMSG5-7.5IU，然后并于24小时后注射过HCG7.5IU，于第二次注射14-16小时后死亡。
7.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述继续培养受精卵前还对受精卵进行了筛选；
所述筛选是在所述恒温放置受精后6-7小时后进行的。
8.根据权利要求7所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述筛选具体包括：将受精液滴置于显微镜下挑选，挑取发育原核、观察到第二极体和精子头已经进入透明带的受精卵移入矿物油覆盖的预热KSOM培养液滴中，继续培养。
9.根据权利要求1所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，所述移植是在所述继续培养受精卵14-16小时后进行的；
所述移植具体指将发育至2-4细胞期的胚胎，移植入假孕0.5天的SPF级ICR雌性鼠的输卵管中，待产。
10.根据权利要求1、3、5、7或8任一项所述的基于体外受精的小鼠微生物净化方法，其特征在于，
所述预热的温度为37℃；
所述恒温放置的温度为37℃，二氧化碳的体积含量为5％。
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