CN105331725A - 转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列及其应用。本发明同时公开了CC-2特异性检测引物对1和引物对2，该引物对由CC-2转化体插入序列及其旁侧序列设计获得，所述引物对1中的上游引物根据序列5的第1-500位设计获得，下游引物根据序列5的第501-1000位设计获得；所述引物对2中的上游引物根据序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列6的第501-1000位设计获得。利用旁侧序列开发的引物对可以用于CC-2转基因玉米的检测，检测为阳性的玉米材料可以用于培育抗除草剂转基因玉米。实验证明，利用插入片段和侧翼序列设计的引物对通过PCR的方法可检测待测玉米是否为抗除草剂玉米CC-2，且该方法准确率高、特异性强，灵敏度高。

Description

转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列及其应用。
背景技术
玉米是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居三大粮食(玉米、小麦、水稻)之首。我国是玉米生产和消费大国，播种面积、总产量、消费量仅次于美国，均居世界第二位。近年来，虽然我国玉米发展势头良好，但仍需大量进口，且进口量逐年快速递增。随着工业化、城镇化快速发展和人民生活水平不断提高，我国已进入玉米消费快速增长阶段。从未来发展看，玉米将是我国需求增长最快、也将是增产潜力最大的粮食作物。抓好玉米生产，就抓住了粮食持续稳定发展的关键。挖掘生产潜力、降低生产成本、保持玉米能够基本自给，是确保国家粮食安全的关键。
在我国玉米种植分布极为广泛，而杂草种类及危害也十分复杂，有调查表明:不论是人工除草地块还是出苗前封闭除草地块，100％的田块都有杂草危害，危害严重的杂草有禾本科、苹科、大戟科、寥科和鸭趾草科杂草。农田杂草给玉米生产带来极大的困扰及危害。由于杂草比农作物具有更粗壮的根系；生长能力很强，繁殖快，密度大，数量多，与作物争光、争肥、争水，因此，严重影响作物的产量和质量；许多杂草是农作物病虫害的中间寄主，病菌，害虫因为杂草的存在而繁殖、传播。如稗草、狗尾草、芦苇是稻飞虱、稻瘟病、水稻纹枯病的寄主。据保守估计，我国每年玉米草害面积达667万公顷，严重危害的占20％，每年玉米因杂草危害而减产的损失率达10％以上。同时。杂草还带来了其它方面的危害，如妨碍农事操作，影响人畜健康状况，造成灌溉麻烦，增加生产费用和劳动力等。人工锄草是一种原始而有效的方法，但是效率低且辛苦繁重。在世界上许多地区，特别是发展中国家，防治杂草是农业生产中用工量最多的工作。为了除草，要进行大量的耕、翻、耙、锄、粉等作业，结果加大土壤通透性，使腐殖质减少，并导致土壤冲刷与水土流失。转aroA、igrA、Bar、Gat等抗除草剂基因玉米不但能有效的防治杂草，而且对环境、有益昆虫及人畜等均无不良影响。
近年来，生物技术的迅速发展大大地推动了植物育种研究手段的革新与研究水平的不断提高，植物抗除草剂生物技术育种已开始进入实用化阶段。利用生物技术手段将外源抗除草剂基因导入植物基因组内，打破了植物种属甚至物种之间难以杂交的天然屏障，实现了抗除草剂基因的转移，从而使植物迅速地、定向地获得抗除草剂特性，同时又能保留原有的良好农艺性状。由于草甘膦的广谱灭生性，因此使用草甘膦除草较人工除草防治效果要好且稳定，还能够节省人力和物力，有效的节约社会资源。因此，培育和推广抗草甘膦玉米品种在我国有着广阔的应用前景，将为玉米生产和农民增收提供保障。
转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2是中国农业大学将CP4EPSPS基因按照玉米密码子特征进行优化，获得了适合在玉米中高表达的EPSPS基因，优化的基因拥有自主知识产权(ZL201210406176.8)，同时克隆了高粱EPSPS基因的叶绿体信号肽(赵海铭等,《农业生物技术学报》,2013,21(9):1009-1018)，将其与优化的EPSPS基因连接，命名为maroACC。通过基因枪共转化的方法把maroACC基因转入到具有高转化效率的玉米自交系HiIIA和HiIIB的杂交组合中，用草甘膦进行筛选，获得了500余个maroACC蛋白阳性的转化体，通过拷贝数检测及表达量筛选获得的一个优良转化体。在栽培地环境中，转基因玉米CC-2与其对应的非转基因玉米在生育期、株高、产量等方面均一致，可正常生长；在荒地环境中，转基因玉米CC-2及其对应的非转基因玉米与杂草相比不具竞争优势，无杂草化风险(宋新元等.转基因抗除草剂玉米CC-2生存竞争能力研究.作物杂志,2014年06期)。
如今转基因成分检测受到越来越广泛的关注，根据转基因插入片段的旁侧序列设计转化体特异的检测引物是最为有效的检测方法。目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如：彭于发等人于2007年利用基因步移和LD-PCR方法分析了水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因水稻科丰6号的品系特异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的引物对或引物对组。
本发明所提供的引物对具体为引物对1或引物对2。
本发明所提供引物对组具体由所述引物对1和所述引物对2组成。
所述引物对1中的上游引物根据序列表中序列5的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列5的第501-1000位设计获得，序列5中1-500bp为插入序列5’端侧翼的玉米基因组序列，501-1000bp为插入序列的组成部分；所述引物对2中的上游引物根据序列表中序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列6的第501-1000位设计获得，序列6中1-500bp为插入序列的组成部分，501-1000bp为插入序列3’端侧翼的玉米基因组序列。
更加具体的，所述引物对1为如下(1)-(3)所示引物对中的任一种；所述引物对2为如下(4)-(6)所示引物对中的任一种：
(1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(2)由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(3)由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(4)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(5)由序列表中序列12和序列13所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(6)由序列表中序列14和序列15所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
在本发明中，所述引物对中两个单链DNA分子既可以单独包装，也可以等摩尔混合包装。所述引物对组中每个引物对的两个单链DNA分子既可以单独包装，也可以等摩尔混合包装。
所述引物对或所述引物对组在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，具体包含有所述引物对或所述引物对组。
所述试剂盒中还可含有PCR反应所需的常规试剂，如DNA聚合酶、dNTP等。
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法，可为如下(a1)或(a2)：
(a1)包括如下步骤：将所述引物对中的两条单链DNA分子分别单独包装；
(a2)包括如下步骤：将所述引物对组中每个引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。
所述引物对或所述引物对组，或所述试剂盒，在检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的方法，可为如下(A)或(B)：
(A)包括如下步骤：
(a1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用所述引物对1进行PCR扩增，获得PCR产物；
(a2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；
所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为292bp的DNA片段；若所述引物对1为由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；则所述预期大小的DNA片段为251bp的DNA片段；若所述引物对1为由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为326bp的DNA片段；
(B)包括如下步骤：
(b1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用所述引物对2进行PCR扩增，获得PCR产物；
(b2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；
所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为380bp的DNA片段；若所述引物对2为由序列表中序列12和序列13所示的两条单链DNA分子组成的引物对；则所述预期大小的DNA片段为193bp的DNA片段；若所述引物对2为由序列表中序列14和序列15所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为232bp的DNA片段。
在上述方法中，所述292bp的DNA片段具体为序列表中序列5的第263-554位所示DNA片段；所述251bp的DNA片段具体为序列表中序列5的第291-541位所示DNA片段；所述326bp的DNA片段具体为序列表中序列5的第483-763位所示DNA片段。
在上述方法中，所述大小为380bp的DNA片段具体为序列表中序列6的第313-692位所示DNA片段；所述大小为193bp的DNA片段具体为序列表中序列6的第351-543位所示DNA片段；所述大小为232bp的DNA片段具体为序列表中序列6的第359-590位所示DNA片段。
在上述方法中，以所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为59℃；以所述引物对2进行PCR扩增的退火温度为58℃。
更加具体的，以所述引物对1进行PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min；4℃保持。以所述引物对2进行PCR扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min；4℃保持。
另外，以所述引物对1或所述引物对2进行PCR扩增时，所述引物对1和所述引物对2中上下游引物均为等摩尔使用(如上下游引物在反应体系中的终浓度均为0.25μM)。
本发明的还一个目的是提供转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2外源插入片段的侧翼序列。
本发明所提供提供的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2外源插入片段的侧翼序列，可为如下(I)或(II)或(III)：
(I)5’侧翼序列；
(II)3’侧翼序列；
(III)由所述5’侧翼序列和所述3’侧翼序列组成；
其中，所述5’侧翼序列的核苷酸序列为序列表中序列5；所述3’侧翼序列为序列表中序列6。
所述侧翼序列在检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2中的应用也属于本发明的保护范围。
所述引物对1和引物对2由CC-2插入序列和旁侧基因组序列设计获得，所述引物对1和引物对2只是利用CC-2插入序列和旁侧基因组序列设计获得的2个范例，专业人士利用本发明公布的序列5和序列6可以设计出多种引物序列，用于特异性的检测CC-2转化体，利用本发明公布的序列5和序列6设计的引物对也属于本发明的保护范围。
转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的外源插入序列也属于本发明的保护范围。
所述外源插入序列的核苷酸序列为序列表中序列7的第5297-13931位。
所述外源插入序列的如下用途也属于本发明的保护范围：所述用途为将含有所述外源插入序列的玉米通过玉米间杂交将所述外源插入序列导入非转基因玉米中，从而获得抗除草剂玉米的应用。
利用所述引物对检测的阳性植株在培育抗除草剂转基因玉米的应用也属于本发明的保护范围。
所述除草剂具体可为草甘膦。
本发明根据转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列设计得到引物对1以及引物对2。实验证明，利用所设计的引物对通过PCR的方法可检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高。
附图说明
图1为NotI酶切检测转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的BAC质粒DNA。其中，泳道M为DNA分子量标准；其余泳道为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的BAC质粒DNA。
图2为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的BAC混池的筛选。其中，泳道1-12、14-37、39-62、64-76、78-87、89-112、114-123、125-127、129-137、139-142、144-149为阴性BAC混池DNA；泳道77、128为阳性BAC混池DNA；泳道150为非转基因植株DNA阴性对照；泳道143为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的基因组DNA阳性对照；泳道13、38、63、88、113、138为DL2000DNA标准分子量。
图3为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的阳性BAC混池中单克隆的筛选。其中，箭头标记处的泳道为阳性BAC单克隆DNA；其余泳道为阴性BAC单克隆DNA和DL2000DNA标准分子量。阴性及阳性对照结果未列出。
图4为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的阳性BAC克隆亚克隆的筛选。除了DNA分子量标注泳道外的所有泳道均为阳性BAC质粒的亚克隆。
图5为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的全长插入序列示意图。
图6为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5’端特异性PCR检测结果。其中，泳道1-3分别为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的T3、T6、T9代玉米样品DNA；泳道4-6为转入maroACC基因的非CC-2转基因玉米株系；泳道7为阴性对照；泳道M为标准分子量DL2000plus。
图7为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3’端特异性PCR检测结果。其中，泳道1-3分别为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的T3、T6、T9代玉米样品DNA；泳道4-6为转入maroACC基因的非CC-2转基因玉米株系；泳道7为阴性对照；泳道M为标准分子量DL2000。
图8为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5’端特异性PCR检测结果。其中，泳道1-5为其他转基因玉米的样品DNA(依次为MON810、MON89034、Bt11、NK603、TC1507)；泳道6为非转基因玉米；泳道7为空白对照(以水为模板扩增结果)；泳道8为CC-2转基因玉米DNA扩增结果；泳道M为2Kplusmarker。
图9为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3’端特异性PCR检测结果。其中，泳道1-5为其他转基因玉米的样品DNA(依次为MON810、MON89034、Bt11、NK603、TC1507)；泳道6为非转基因玉米；泳道7为空白对照(以水为模板扩增结果)；泳道8为CC-2转基因玉米DNA扩增结果；泳道M为2Kplusmarker。
图10为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5’端灵敏度PCR检测结果。其中，泳道1-7分别为含有100％，10％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0％的CC-2DNA；泳道M为2Kplusmarker。
图11为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3’端灵敏度PCR检测结果。其中，泳道1-7分别为含有100％，10％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0％的CC-2DNA；泳道M为2Kmarker。
图12为利用引物对1和引物对2进行PCR检测为阳性的植株的抗草甘膦性鉴定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2：即记载于“宋新元等.转基因抗除草剂玉米CC-2生存竞争能力研究.作物杂志,2014年06期”一文中的“转基因抗除草剂玉米CC-2”，公众可从中国农业大学获得。虽然maroACC基因能够授予转化玉米对除草剂产生抗性，但不同的转化体抗性会有明显差异，一些转化体在喷施200ml/亩浓度的草甘膦生长便会受到抑制。经过多年多代抗性试验筛选获得的优良转化体CC-2在喷施1800ml/亩浓度的草甘膦时，较未喷施对照转化体生长不会受到影响。
转基因玉米MON810、MON89034、Bt11、NK603、TC1507：记载于“吕霞等，转基因抗虫玉米研究及应用，作物杂志2013，2:7-12”和“尹祥佳等，玉米转基因技术研究及其应用，作物杂志2010，6:1-9”，公众可从中国农业大学获得，仅限用于重复本发明相关实验。
非转基因玉米郑58：记载于“李凤海等，不同熟期玉米杂交种及其亲本子粒脱水速率的比较研究，玉米科学2012，20(6)：17～20”一文，公众可从中国农业大学获得，仅限用于重复本发明相关实验。
实施例1、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列的克隆
一、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的BAC文库构建
样品：转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2。
BAC载体：Epicentre公司生产的plndigoBAC5。
大肠杆菌感受态：Invitrogen公司的DHl0B。
1、大片段DNA的制备
取50g转基因玉米CC-2白化苗叶片样品，用液氮快速研磨成细粉，将粉末加到500mL预冷的抽提缓冲液(含0.25％TritonX-100)，缓慢搅拌15min，充分混匀。液态先用l层医用纱布，再加2层滤布过滤至烧杯中，将滤液分装在离心管中，在3500r/min、4℃条件下低速离心20min，吸干上清液，在每个离心管中加入1mL洗涤缓冲液(抽提缓冲液中加入0.25％TritonX-100)，用高温灭菌的毛笔轻轻刷新沉淀的细胞核，使其充分悬浮，加洗涤缓冲液至约80mL，在3500r/min、4℃下低速离心20min，重新沉淀细胞核。加入约lmL抽提缓冲液，用移液器悬浮沉淀的细胞核。细胞核悬浮液在45℃水浴锅中平衡5min。接着加入相同体积预热的1.5％低熔点琼脂糖，充分混匀后，用移液器将其分装于胶块模子中，凝固30min。将凝固好的胶块放在50℃消化液(1％SLS，1％EDTA，5mg/ml蛋白酶K，pH9.0)中消化24h，消化好的胶块清洗后，在4℃冰箱中保存。
2、大片段DNA的酶切和二次回收
用限制性内切酶HindIII对步骤1的大片段DNA进行酶切。具体如下：将步骤1消化好的胶块用50mLTE(含1mmol/LPMSF)溶液清洗3次，每次各1h。再用不含PMSF的TE溶液清洗3次，每次各lh。把洗好的胶块分成大小相等的8份，分装在加入lmLl×HindIIIbuffer的1.5mL离心管中，浸泡3h，期间每1h换1次ll×HindIIIbuffer，然后加入4.0UHindIII，37℃条件下酶切反应30min。用脉冲场电泳仪检测酶切结果，切割分子量大小在200-400kb之间胶块，将胶块重新嵌入到新配制的胶中进行第2次脉冲场电泳，切割分子量约100-200kb之间的胶条，将胶条放入透析管中，重新脉冲场电泳。
3、连接、转化体系的建立
参考BAC载体说明书，将BAC载体和插入片段(步骤2所得)的摩尔比设为l：l、5：1、10：1共3个处理进行连接。吸取1μl的连接产物至20μl的DHl0B电转化感受态细胞中，充分混匀，冰上冷却30min，在电压1.8kV，电阻200欧，电容25mF的条件下用Bio-radgenepulserXceII电击仪进行转化。转化后快速吸取1mLSOC培养基至电击杯中，混匀后移至玻璃管中，在恒温摇床中225r/min，37℃复苏培养lh。培养好的菌液涂于LB(含有12.5pg/mL氯霉素，20μg/mLIPTG和60g/mLX-gal)固体培养板上，在生化培养箱中37℃培养20h，用灭菌的牙签挑选阳性克隆保存在384孔培养板，在80℃超低温冰箱中保存。
二、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的插入片段阳性BAC的筛选
从步骤一中挑取白色克隆，利用Qiagen公司的BAC质粒提取试剂盒提取BAC质粒DNA，利用NotI酶切DNA，鉴定插入片段的大小，结果表明白色克隆均有DNA片段的插入，插入片段大小为100kb左右，如图1所示。
用灭菌的牙签挑选白色克隆保存在384孔培养板，利用384孔复制器将384孔板中克隆复制到LB平板上，并对平板序列进行标记，37℃培育12h后，在平板中加入2mlLB液体培养基，用涂布器将每个LB平板的384个克隆洗脱到2ml离心管中，取300μl提质粒PCR检测，具体如下：
引物序列：
CC686F：5'-CCTTACCGTGGAGACCGATGC-3'；
CC686R：5'-CCGCCATGAGGTCCATGAACT-3'。
目的片段大小约为686bp。
反应体系组成：DNA模板2μl；10μMCC686F0.5μl；10μMCC686R0.5μl；Taq0.3μl；10×buffer2μl；dNTP1.6μl，ddH2O补足至20μl。
反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应完成之后，取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％，使用的电极缓冲液是含有0.5μg/ml溴化乙锭的1×TAE，在5V/cm电压下电泳30分钟。上样时取5μl北京全式金生物技术有限公司产品“DL2000plus”作为分子量标准。
通过对280个384孔板筛选，获得了2个阳性BAC混池，如图2泳道77和128所示(未列出所有280个混池的筛选结果)。
进一步对阳性混池的384×2个克隆进行筛选，取2μl菌液作为模板DNA，对mCry1Ac基因进行检测，引物和方法见前文。获得了1个阳性的BAC克隆，如图3(未列出所有384个混池的筛选结果)。
三、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的插入片段阳性BAC亚克隆文库的构建
利用QiagenBAC质粒提取试剂盒提取步骤二鉴定得到的阳性BAC克隆质粒，通过超声破碎仪将BAC克隆打断，回收1.5-2kb区域的DNA片段，末端补平加A后与T载体连接转化大肠杆菌，利用M13引物检测插入片段，见图4(未列出所有克隆检测结果)，挑取插入片段大于1kb的的克隆进行测序，共挑取了1000个克隆。
四、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的插入片段全长的拼接
利用seqMAN软件对步骤三获得的1000个阳性克隆测序结果进行拼接，拼接结果如图5所示，拼接所得序列为序列表中序列7所示。
结果表明：目标基因插入在玉米9号染色体114Mb的位置。转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的插入子中有2个maroACC完整表达元件的插入，除此之外还有1个35spolyA片段，插入片段中不含有抗生素抗性基因片段。
序列7中包含整合入基因组序列全长8635bp，及插入序列5’端旁侧序列1889bp，插入序列3’端旁侧序列5296bp，共计15820bp，下面以下从5’至3’来说明15820bp序列的具体信息，见表1。
表1插入序列信息介绍
注：对应基因组参考位置比对结果参考B73RefGen_v39，由于玉米B73基因组在不断更新，参考位置会有变动。
五、转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的侧翼序列的确定
根据步骤四的测序后拼接结果，确定转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5’端侧翼序列如序列表中序列5所示(对应序列7的第1390-2389位)。其中，序列5的第1-500位为玉米基因组序列，第501-1000位为来自于外源插入基因maroACC所在载体的序列。
根据步骤四的测序后拼接结果，确定转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3’端侧翼序列如序列表中序列6所示(对应序列7的第10025-11024位)。其中，序列6的第1-500位为来自于外源插入基因maroACC所在载体的序列，第501-1000位为玉米基因组序列。
实施例2、检测转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的引物对的设计合成
根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5'端侧翼序列(序列5)，设计筛选特异性的引物对1；根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3'端侧翼序列(序列6)，设计筛选特异性的引物对2。
针对5'端侧翼序列(序列5)设计的引物对1：
CC-25'aF：5'-AGGCTTTATCCTGTGCAATGCG-3'(序列1)；
CC-25'aR：5'-ATTGAGTATCCGTTTCCCTCCTTTT-3'(序列2)。
目的片段大小：292bp。
理论上，采用该特异引物对(CC-25'aF/CC-25'aR)对转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的基因组DNA进行PCR扩增会得到大小为292bp的目的条带，即得到序列表中序列5的第263-554位所示DNA片段。
针对3'端侧翼序列(序列6)设计的引物对2：
CC-23'aF：5'-TCCAGTCGGGAAACCTGTCGT-3'(序列3)；
CC-23'aR：5'-TTGGCAGAGCTTCGCTCCAT-3'(序列4)。
目的片段大小：380bp。
理论上，采用该特异引物对(CC-23'aF/CC-23'aR)对转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的基因组DNA进行PCR扩增会得到大小为380bp的目的条带，即得到序列表中序列6的第313-692位所示DNA片段。
上述的2个引物对仅是利用CC-2的侧翼序列和插入序列设计的两个范例，根据侧翼序列和插入序列可以设计出多种不同的引物对，因此，利用CC-2的侧翼序列和插入序列设计的其他引物也应在本专利的保护范围内。
实施例3、实施例2引物对的特异性检测
一、特异性检测(一)
供试样本：转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2(T3、T6、T9代)、转入maroACC基因的非CC-2转基因玉米株系。
1、玉米基因组DNA的提取
(1)取CTAB溶液，预先65℃水浴；
(2)取约0.1g新鲜供试玉米叶片，剪成碎块，放在预冷的研钵当中，在液氮中迅速研磨成粉末状并立即转入预冷的2mlEP管中(一般不超过1/2管体积)；
(3)迅速向EP管中加入0.8ml65℃温浴的CTAB缓冲液，轻轻摇荡均匀，65℃水浴30min，并不时轻摇；
(4)放置于通风橱约15min，冷却至室温；
(5)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)，混匀，轻微振荡15min；
(6)室温下，12000rpm离心8min；
(7)吸取上清液至新的1.5mlEP管；
(8)加入等体积预冷的异丙醇(4℃预冷)；
(9)室温下，12000rpm离心8min；
(10)弃上清，用力加入75％乙醇1ml，混匀，弃上清(乙醇沉淀)；
(11)在通风橱放置直至乙醇完全挥发(1～2h)；
(12)用300μl的TEBuffer溶解DNA，4℃过夜备用。
2、PCR检测
用实施例2得到的特异性引物对1和引物对2分别对各供试样本进行检测，以验证特异引物对的特异性。每个样品采用相同的检测方法，包具体如下：
以步骤一从供试样本中提取的基因组DNA为模板，采用引物对1和引物对2分别进行PCR扩增。
引物对1反应体系组成：
引物对1反应条件如下：
琼脂糖凝聚电泳：
PCR反应完成之后，取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％，使用的电极缓冲液是含有0.5μg/ml溴化乙锭的1×TAE，在5V/cm电压下电泳20分钟。上样时取5μl北京全式金生物技术有限公司产品“DL2000“做为分子量标准。
引物对2反应体系组成：
引物对2反应条件如下：
琼脂糖凝聚电泳：
PCR反应完成之后，取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1％，使用的电极缓冲液是含有0.5μg/ml溴化乙锭的1×TAE，在5V/cm电压下电泳20分钟。上样时取5μl北京全式金生物技术有限公司产品“DL2000”做为分子量标准。
实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照。
结果显示：
采用引物对1进行PCR扩增，所有转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2(T3、T6、T9代)DNA样品有一条292bp产物条带，而在转入maroACC基因的非CC-2转基因玉米株系和阴性对照中均没有扩增到目的条带，具体如图6所示。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为292bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明292bp的目的条带确实如序列表中序列5的第263-554位所示。
采用引物对2进行PCR扩增，所有转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2(T3、T6、T9代)DNA样品都有一条380bp产物条带，而在转入maroACC基因的非CC-2转基因玉米株系和阴性对照中均没有扩增到目的条带，具体如图7所示。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为380bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明380bp的目的条带确实如序列表中序列6的第313-692位所示。
二、特异性检测(二)
供试样本：转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2、其他转基因玉米(MON810、MON89034、Bt11、NK603、TC1507)、非转基因玉米(郑58)。
1、玉米基因组DNA的提取
参照步骤一1进行。
2、PCR检测
参照步骤一2进行。
实验同时设置以水代替模板DNA的空白对照。
结果显示：
采用引物对1进行PCR扩增，转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2DNA样品有一条292bp产物条带，而在其他转基因玉米株系、非转基因玉米和阴性对照中均没有扩增到目的条带，具体如图8所示。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为292bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明292bp的目的条带确实如序列表中序列5的第263-554位所示。
采用引物对2进行PCR扩增，转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2DNA样品都有一条380bp产物条带，而在其他转基因玉米株系、非转基因玉米和阴性对照中均没有扩增到目的条带，具体如图9所示。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为380bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明380bp的目的条带确实如序列表中序列6的第313-692位所示。
目前不同研发人员进行转基因操作时，往往构建的载体不一致，因此不同人员获得的转化体也不一致，即使利用相同的载体，在转化时，目标基因会随机插入到受体基因组中，因此获得的转化体插入位点也会不同，根据各个转化体插入位点的不同可以确定不同的边界序列，利用边界序列和插入序列可以设计出转化体特异性的检测方法。上述实验结果表明，本发明公布的CC-2转化体检测引物对1和引物对2便具有较强的特异性。
实施例4、实施例2引物对的灵敏度检测
提取转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的基因组DNA，将CC-2DNA按照100％，10％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0％进行稀释(各百分数对应的DNA样品的具体浓度依次为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl，0.1ng/μl，0.05ng/μl，0ng/μl)，作为灵敏度检测的模板使用。
分别以如上系列拷贝数的基因组DNA样品作为模板，采用实施例2得到的引物对1和引物对2分别进行PCR扩增。
反应体系和反应程序参照实施例3。
实验同时设置以水代替模板DNA的阴性对照。
结果显示：
采用引物对1进行PCR扩增，0.5％的基因组DNA样品(0.5ng/μl)即可扩增出大小为292bp的目的条带(如图10所示)。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为292bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明292bp的目的条带确实如序列表中序列5的第263-554位所示。
采用引物对2进行PCR扩增，0.5％的基因组DNA样品(0.5ng/μl)即可扩增出大小为380bp的目的条带(如图11所示)。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为380bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明380bp的目的条带确实如序列表中序列6的第313-692位所示。
以上结果表明实施例2得到的引物对1和引物对2具有较强的灵敏度。
实施例5、实施例2引物对阳性植株抗草甘膦鉴定
对引物对1和引物对2检测为PCR阳性的植株(具体检测方法参见实施例3)进行抗性鉴定，结果表明不论是引物对1还是引物对2检测为阳性的植株，均对草甘膦有较好的抗性，如图12所示。而利用阳性植株与不具有草甘膦抗性的植株杂交，获得的后代中阳性植株同样对草甘膦螟具有抗性。因此，利用引物对1或引物对2检测为阳性的植株可以用于培育抗草甘膦转基因玉米。
实施例6、根据5’侧翼序列和3’侧翼序列设计的其他引物对的实验效果
1、根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5'端侧翼序列(序列5)，设计筛选特异性的引物对3，具体序列如下：
CC-25bF：5'-GCTCAGGCGGAGACCCGAT-3'(序列8)；
CC-25bR：5'-TTCCCTCCTTTTCCCGCAGA-3'(序列9)。
扩增条带大小为251bp。
所述引物对3中的上游引物根据序列表中序列5的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列5的第501-1000位设计获得。该引物对扩增序列5的第291-541bp。
采用该引物对，进行实施例3和实施例4的相关实验，反应体系、反应条件同引物对1。
结果显示特异性和灵敏度结果同引物对1。
2、根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的5'端侧翼序列(序列5)，设计筛选特异性的引物对4，具体序列如下：
CC-25cF：5'-TGTGCCGCCTCAACATTTATT-3'(序列10)；
CC-25cR：5'-TGGCGTTACCCAACTTAATCG-3'(序列11)。
扩增条带大小为326bp。
所述引物对4中的上游引物根据序列表中序列5的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列5的第501-1000位设计获得。该引物对扩增序列5的第438-763bp。
采用该引物对，进行实施例3和实施例4的相关实验，反应体系、反应条件同引物对1。
结果显示特异性和灵敏度结果同引物对1。
3、根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3'端侧翼序列(序列6)，设计筛选特异性的引物对5，具体序列如下：
CC-23bF：5'-GGATGTGCTGCAAGGCGATTA-3'(序列12)；
CC-23bR：5'-TTGTGCAATGGGCCAGATCTAGT-3'(序列13)。
扩增条带大小为193bp。
所述引物对5中的上游引物根据序列表中序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列6的第501-1000位设计获得。该引物对扩增序列6的第351-543bp。
采用该引物对，进行实施例3和实施例4的相关实验，反应体系、反应条件同引物对2。
结果显示特异性和灵敏度结果同引物对2。
4、根据实施例1获得的转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的3'端侧翼序列(序列6)，设计筛选特异性的引物对6，具体序列如下：
CC-23cF：5'-TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA-3'(序列14)；
CC-23cR：5'-TCCCGTTTAGGGTTTATGGTTCTC-3'(序列15)。
扩增条带大小为232bp。所述引物对6中的上游引物根据序列表中序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列6的第501-1000位设计获得。该引物对扩增序列6的第359-590bp。
采用该引物对，进行实施例3和实施例4的相关实验，反应体系、反应条件同引物对2。
结果显示特异性和灵敏度结果同引物对2。

Claims (10)

1.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的引物对或引物对组；
所述引物对为引物对1或引物对2；
所述引物对组由所述引物对1和所述引物对2组成；
所述引物对1中的上游引物根据序列表中序列5的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列5的第501-1000位设计获得；
所述引物对2中的上游引物根据序列表中序列6的第1-500位设计获得，下游引物根据序列表中序列6的第501-1000位设计获得；
具体的，所述引物对1为如下(1)-(3)所示引物对中的任一种；所述引物对2为如下(4)-(6)所示引物对中的任一种：
(1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(2)由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(3)由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(4)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(5)由序列表中序列12和序列13所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
(6)由序列表中序列14和序列15所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
2.权利要求1所述的引物对或引物对组在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒中的应用。
3.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的试剂盒，包含有权利要求1所述的引物对或引物对组。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，为如下(a1)或(a2)：
(a1)包括如下步骤：将所述引物对中的两条单链DNA分子分别单独包装；
(a2)包括如下步骤：将所述引物对组中每个引物对的两条单链DNA分子分别单独包装。
5.权利要求1所述引物对或引物对组，或权利要求3所述试剂盒在检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2中的应用。
6.检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的方法，为如下(A)或(B)：
(A)包括如下步骤：
(a1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述引物对1进行PCR扩增，获得PCR产物；
(a2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；
所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为292bp的DNA片段；若所述引物对1为由序列表中序列8和序列9所示的两条单链DNA分子组成的引物对；则所述预期大小的DNA片段为251bp的DNA片段；若所述引物对1为由序列表中序列10和序列11所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为326bp的DNA片段；
(B)包括如下步骤：
(b1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述引物对2进行PCR扩增，获得PCR产物；
(b2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2；
所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为380bp的DNA片段；若所述引物对2为由序列表中序列12和序列13所示的两条单链DNA分子组成的引物对；则所述预期大小的DNA片段为193bp的DNA片段；若所述引物对2为由序列表中序列14和序列15所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为232bp的DNA片段。
7.转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2外源插入片段的侧翼序列，为如下(I)或(II)或(III)：
(I)5’侧翼序列；
(II)3’侧翼序列；
(III)由所述5’侧翼序列和所述3’侧翼序列组成；
所述5’侧翼序列的核苷酸序列为序列表中序列5；所述3’侧翼序列为序列表中序列6。
8.权利要求7所述侧翼序列在检测或辅助检测待测玉米是否为转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2中的应用。
9.转maroACC基因抗除草剂玉米CC-2的外源插入序列，其特征在于：所述外源插入序列的核苷酸序列为序列表中序列7的第1890-10524位；或
所述外源插入序列的用途，其特征在于：所述用途为将含有所述外源插入序列的玉米通过玉米间杂交将所述外源插入序列导入非转基因玉米中，从而获得抗除草剂玉米的应用。
10.利用权利要求1所述引物对检测的阳性植株在培育抗除草剂转基因玉米的应用。
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