CN105219729B - 一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法，包括血液中单个核细胞的提取、血液中单个核细胞的扩增、非整合性质粒电转染、神经干细胞培养的步骤。本发明将人外周血中单个核细胞重编程为神经干细胞，可在体外扩增60代以上，表达神经干细胞相关基因，能分化出神经元，星形胶质细胞及少突胶质细胞，其分化的神经元能具有电生理特点，且操作简单，创伤性极小。

Description

一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及神经干细胞技术领域，具体涉及一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法及其用途。

背景技术

干细胞为许多神经系统疾病治疗带来希望，如帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、老年性痴呆及脊髓外伤性疾病等。研究表明，使用胚胎干细胞治疗帕金森病、脊髓损伤及糖尿病有一定作用，但胚胎干细胞的致瘤性，异体移植的免疫排斥以及伦理学争议限制其应用，进而研究由人成纤维细胞获得诱导多能干细胞(iPSCs)，并成功建立了治疗相关疾病的细胞模型及动物模型。然而研究发现，iPSCs用于临床治疗还面临很多问题，如致瘤性，定向分化效率低，安全性问题。神经干细胞(NSCs)是指一类具有自我复制更新能力、高度增殖和多种分化潜能的细胞，在研究神经系统发育、分化以及治疗神经系统疾病中具有重要的作用，因此，将体细胞直接重编程为诱导神经干细胞(induced neural stem cellsiNSCs)，而不经过iPSCs阶段，从而减少其致瘤性、提高分化效率，成为现在干细胞研究领域中的研究热点。

在诱导神经干细胞(iNSCs)的研究中，Kim等使用Dox调控的慢病毒载体系统在小鼠成纤维细胞中转入Oct4,Sox2,Klf4,C-myc基因，在含有LIF的MEF上培养3-6天后继续在神经干细胞培养基中培养8-9天，将会有表达PLZF，PAX6等神经干细胞标志的克隆出现，这种“类似神经干”细胞，可以继续分化出星形胶质细胞，神经元，但是此种干细胞在体外只能扩增3-5代。裴端卿等使用非整合质粒载体oriP/EBNA携带Oct4,Sox2,Sv40LT,Klf4和microRNA302-367电转入人尿液中提取的活细胞，然后在神经干细胞培养基中加入CHIR99021，PD0325901，A83-01,Thiazoviv,DMH1，电转后12天可见神经干细胞克隆出现，且能表Sox1,Sox2,Pax6等神经干细胞标志性基因，诱导的神经干细胞能分化成星形胶质细胞，多巴胺能神经元，谷氨酸能神经元，但是不能自然分化为少突胶质细胞，只有在加用PDGF-AA，NT3等小分子刺激后，才可以分化出少突胶质细胞。张素春等利用仙台病毒携带外源Oct4,Sox2,Klf4,C-myc基因，转染人成纤维细胞后在含有LIF，SB431541，CHIR99021，的神经干细胞培养基中培养13天后有神经干细胞克隆出现，这种诱导的神经干细胞可以分化出神经元，星形细胞，少突胶质细胞。但是，从人体获取成纤维细胞是有创伤的操作，而且成纤维细胞在转染前需在体外培养较长时间。而且，老年患者成纤维细胞不容易转染成功。

由此可见，现有技术中采用病毒载体或质粒载体诱导小鼠成纤维细胞或尿液中提取的细胞时，细胞来源容易受到污染，如从尿液中获取细胞在操作过程中容易污染，特别是从病房获得尿液，更加容易污染，操作过程并不简单，使得神经干细胞诱导的成功率降低，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变；此外，诱导得到的神经干细胞体外扩增代数少、且无法自然分化为少突胶质细胞，在移植后无法维持自我更新及多向分化的能力，无法体外快速扩增，体细胞转分化的周期长、转分化效率低，数量上无法满足临床需求，而不适用于脑神经损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，数量能够满足临床需求。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中诱导的神经干细胞无法体外快速扩增、体细胞转分化的周期长、转分化效率低的缺陷，从而提供一种可以体外快速扩增、体细胞转分化的周期短、转分化效率高的神经干细胞的诱导方法。

本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中的缺乏有效治疗脑神经损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病的方法的缺陷，从而提供一种使用所述方法诱导得到的神经干细胞用于治疗神经细胞病变疾病中的用途。

为此，本发明提供了一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法，具体包括：外周血中单个核细胞的提取、外周血中单个核细胞的扩增、非整合性质粒电转染、神经干细胞培养的步骤，其中非整合性质粒为oriP/EBNA-1，携带基因为OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,c-MYC,KLF-4 and SV40LT。

上述诱导方法中优选所述单个核细胞为外周血中使用Ficoll密度梯度离心法所得的中间云雾状的细胞层中所含的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞以及极少量的CD34+造血干细胞。

上述诱导方法中优选外周血中单个核细胞的提取方法为：静脉采血，使用PBS将血液稀释后，密度梯度离心法收集单个核细胞，将离心得到的中间云雾状细胞转移至离心管，加入PBS离心，吸去上清后将细胞重悬于PBS中离心，反复3-6次离心，去上清后将细胞重悬于PBS中计数；优选离心时温度4℃、时间为10分钟。

上述诱导方法中优选外周血中单个核细胞的扩增方法为：将离心所得单个核细胞重悬于培养基中，孵育2天后去上清更换培养基；隔天更换培养基至14天为止；优选培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5％CO2。

上述诱导方法中优选非整合性质粒电转染方法为：将扩增后的细胞离心，计数，重悬于人CD34+细胞转染液中，加入质粒后转移至电转染杯中进行转染，转让后置于含有培养基的12孔板中孵育；优选培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5％CO2。

所述单个核细胞培养基配方是基础培养基：49％(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)IMDM，48％Ham’s F-12，1％胰岛素-转铁蛋白-硒Insulin-transferrin-selenium-X supplement，1％chemically defined lipid concentrate，1％L-谷氨酰胺，0.05mg ml^-1左旋维生素C，5mg ml^-1牛血清蛋白BSA，0.018ul ml^-1 1-硫代甘油1-thioglycero；加入的化学小分子为：100ng ml^-1重组人干细胞因子，10ng ml^–1重组人白细胞介素3，2U ml^-1促红细胞生成素，40ng ml^-1胰岛素样生长因子1IGF-1，1μM地塞米松，100μg ml^-1全铁转铁蛋白holo-transferrin)，上述诱导方法中优选神经干细胞培养方法为：电转染后的细胞在单个核细胞培养基中培养2天，然后将其离心，去上清，再将细胞重悬在神经干细胞培养基中，接种在事先层粘蛋白包被过夜的12孔板上，密度为4×10⁵/孔，每隔2天更换一次培养基，注意观察细胞变化，大概在转染后10天左右，皿中会出现神经干细胞克隆，待干细胞继续扩增，在转染后20-30天左右，等到克隆足够大时，先使用Accutase将神经干细胞消化后，使用移液枪将克隆挑出，转移到已经用多聚赖氨酸包被过夜的96孔板上，进行干细胞扩增。

所述神经干细胞的培养基配方为1.基础培养基：DMEM/F12:neurobasal(1:1),1×N2,1×B27,1％GlutaMAX(Life Technologies,Carlsbad,USA)，2.需加入的化学小分子为：10ng/ml重组人白血病抑制因子recombinant human leukemia inhibitory factor(LIF,Millpore,Billerica,美国)，3μM CHIR99021，2μM SB431542(Gene Operation,Michigan,美国)。

上述所述神经细胞病变疾病为脑神经损伤、脊髓损伤、帕金森病、老年痴呆症、肌萎缩性侧索硬化症、糖尿病、多发性硬化，脑卒中。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，首次将从外周血中提取的细胞诱导成神经干细胞，外周血采集方便、取材方便、创伤小，受到操作条件的影响小而不易受到污染。

2.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，利用非整合性质粒载体将外周血单个核细胞重编程得到的神经干细胞体外扩增代数多，可以扩增到60代以上，在体外可以快速扩增。

3.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，诱导分化周期短、转分化效率高。

4.本发明提供的诱导神经干细胞的方法，可以在没有滋养层细胞的情况下获得神经干细胞，避免外来细胞的污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1将外周血经Ficoll密度梯度离心后中间云雾状的细胞层；

图2将外周血单个核细胞在体外扩增14天后形态；

图3转染后10天后神经干细胞；

图4转染后30天后神经干细胞；

图5神经干细胞单层平铺培养时形态；

图6诱导神经干细胞表达神经干细胞蛋白Nestin；

图7诱导神经干细胞表达神经干细胞标志Sox2蛋白；

图8诱导神经干细胞表达神经干细胞标志Sox1蛋白；

图9诱导神经干细胞具有正常的核型；

图10诱导神经干细胞分化出成熟神经元；

图11诱导神经干细胞分化出星形胶质细胞；

图12诱导神经干细胞分化出TH阳性的多巴胺能神经元；

图13诱导神经干细胞分化出运动神经元；

图14诱导神经干细胞分化为少突胶质细胞；

图15神经电生理检查。

具体实施方式

实施例1

步骤一：分离血液中单个核细胞。

1.室温下，成人外周静脉采血5-10ml,储存在含有肝素的抗凝管中，上下颠倒混匀5次。

2.采用密度梯度离心法收集单个核细胞，具体操作为：将外周血按1:2使用PBS稀释，室温，存放在50ml离心管中，稀释后的血液若不够35ml，则用PBS补齐，使得最终稀释后血液量为35ml。

3.另取50ml离心管盛15ml Ficoll-Paque Premium,然后倾斜45度，将稀释的血液缓慢流入到盛Ficoll-Paque Premium管中。

4. 25度，离心30分钟，离心速度为750g，离心时，离心机制动需关闭。

5.离心后在离心管中上层为血浆样物，中间云雾状细胞即为我们所需要的单个核细胞层，如图1所示。

6.巴斯特管吸去上层，然后使用移液管将中间的云雾状细胞层移至另外50ml离心管中。

7.在获得的细胞层中加入30mlPBS，350g，4度，离心10分钟，此时离心机制动要打开。

8.吸去上清，将细胞重悬在25ml PBS中。4度，300g，离心10分钟。

9.吸去上清，将细胞重悬在25ml PBS中。4度，300g，离心10分钟。(重复第8步)。

10.去上清，将细胞重悬在5ml PBS中，计数。

步骤二：扩增血液中单个核细胞。

1.Day-14将离心所得的单个核细胞以2×10⁶/ml重悬在单个核细胞培养基中，37度，5％CO2，2天。

2.Day-11收集细胞，离心，200g,去上清，将细胞按1×10⁶/ml重悬在单个核细胞培养基中。孵箱孵育3天。

3.Day-8收集细胞，离心，200g,去上清，将细胞按1×10⁶/ml重悬在单个核细胞培养基中。孵箱孵育4天。

4.Day-4收集细胞，离心，200g,去上清，将细胞按1×10⁶/ml重悬在单个核细胞培养基中，孵箱孵育4天。

步骤三：转染

1.Day 0收集细胞，计数，离心，去上清，将2×10⁶单个核细胞重悬在5mlPBS中，室温，离心5分钟，200g，去上清，如图2所示。

2.将以上细胞重悬在100ul的人CD34+细胞转染液。

3.在以上混合液中加入3种质粒，每种质粒各2ug。

4.使用LONZA试剂盒中配的移液管将以上混合液转移至电转染杯中。

5.将电转杯放置在电转仪中，使用T-160程序。

6.电转程序结束后，使用LONZA试剂盒配的移液管将电转后的悬液移至事先在12孔板的一个孔中放置的2ml单个核细胞培养基中，放置在孵箱中37度，5％CO2 2天。

步骤四：神经干细胞的培养

1.准备：在6孔板中放入1ml 50ug/ml PDL2小时,之后吸去PDL，加入5ug/mllaminin 1ml,孵箱过夜,备用。

2.将电转染后2天的单个核细胞离心，去上清，可见部分细胞电转后死亡，将细胞重悬在神经干细胞培养基中，以(2-4)×10⁵/孔接种在6孔板上。隔天换液。在第十天左右，可见干细胞克隆出现如图3所示。继续换液，使其继续扩增。

3.第20-30天左右，克隆增大，使用移液枪将细胞吹下后转移至PDL-Laminin包被的96孔板中，继续扩增，如图4所示，光镜下诱导神经干细胞具有类似神经干细胞的形态如图5所示。

4.扩增后，进行进一步鉴定，分化以及后续电生理检查验证。

实验例1诱导神经干细胞表达神经干细胞标志蛋白

将诱导神经干细胞按5×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养48小时后进行染色，具体步骤是1.吸去培养基，使用PBS洗两遍，然后加入4％多聚甲醛固定10分钟。2.吸去多聚甲醛，加入0.3％PBST 1ml，重复3次，每次间隔5分钟。3.加入3％驴血清封闭1小时，室温下。4.1小时后，加入一抗，分别将抗体如Nestin(1:500Mouse BD bioscience),Sox1(1:200Goat BD bioscience),Sox2(1:1000GoateBioscience),按比例加入1％驴血清中，然后孵育细胞，4度，过夜。4.吸去一抗，加入对应的二抗。驴抗鼠FITC按1:200对应Nestin，驴抗山羊cy3按1:400对应Sox1，Sox2。室温，避光放置2小时。5.吸去二抗，PBS洗三遍，避光.然后。然后加入DAPI(1：1000Sigma-Aldrich)，孵育10分钟。6.封片，激光共聚焦拍照，所见干细胞表达Nestin，Sox1，Sox2蛋白，如图6、7、8所示。将处于增殖期的诱导神经干细胞进行裂解，核型分析所示，诱导神经干细胞具有正常核型，如图9所示。

实验例2神经干细胞分化为成熟的神经元。

将神经干细胞以2×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化培养基，其成分为DMEM:F12，1％N2，1％B27，1％谷胺酰胺Glutamine，1％非必须氨基酸NEAA(Life Technologies)，隔天换液，6周后将细胞固定，免疫细胞化学染色。具体为MAP2(1:200 Mouse Sigma)，Neun(1:400Rabbit Millpore)，GFAP(1:500 Rabbit Dako)，如图10、图11所示。所示诱导神经干细胞能分化出成熟神经元，表达成熟神经元蛋白Map2Neun,诱导神经干细胞能分化出星形胶质细胞，表达GFAP。

实验例3神经干细胞分化为多巴胺能神经元

将神经干细胞以2×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化基础培养基，其成分为DMEM:F12，1％N2，1％B27，1％谷氨酰胺Glutamine，1％非必须氨基酸NEAA，该培养基中加入化学小分子1uM SAG1(Enzo)，100ng/ml Fgf8(PeproTech),培养2周后将培养基更换为分化基础培养基，其内加入10ng/ml胰岛素样生长因子IGF-1，10ng/ml神经营养因子3NT3，1mM环磷酸腺苷cAMP。继续培养4周后进行细胞免疫化学染色。其中一抗TH(1:500 Sheep Millpore)。如图12所示，诱导神经干细胞能分化出TH阳性的多巴胺能神经元。

实验例4神经干细胞分化为运动神经元

将神经干细胞以2×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化培养基，其成分为DMEM:F12，1％N2，1％B27，1％谷氨酰胺Glutamine，1％非必须氨基酸NEAA(Life Technologies)，在培养基中加入化学小分子1uM反维甲酸RA(Sigma-Aldrich),1uM SAG1(Enzo)，隔天换液，2周后将培养基更换为基础分化培养基，4周进行免疫细胞化学染色。HB9(1:50 Mouse DSHB)。如图13所示，所示诱导神经干细胞能分化出运动神经元，标志蛋白为HB9，Bar等于50um。

实验例5神经干细胞分化为少突胶质细胞

将神经干细胞以2×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化基础培养基，其内加入以下小分子:1uM反维甲酸RA(Sigma-Aldrich)，20ng PDGF-AB(PeproTech)，10ng/ml bFGF(PeproTech)，SAG1(Enzo)；2周后将培养基改为神经元分化基础培养基，其内加以下小分子:20ngPDGF-AB(PeproTech)，SAG1(Enzo)，60ng/ml甲状腺素T3(Sigma-Aldrich)，1mM环磷酸腺苷(Signa-Aldrich)，10ng/ml胰岛素样生长因子IGF-1(PeproTech)，10ng/ml神经营养因子3NT3(PeproTech)，继续培养6周后，将细胞进行细胞化学染色，一抗为O1(1:300 MouseeBioscience)。如图14所示，诱导神经干细胞能分化出少突胶质细胞，标志蛋白为O1，Bar等于50um。

实验例6神经电生理检查

将神经干细胞以1×10⁴接种在多聚赖氨酸与层黏蛋白包被的12mm玻片上，神经干细胞培养基培养24小时后，将培养基更换为神经元分化培养基，其成分为DMEM:F12，1％N2，1％B27，1％Glutamine，1％NEAA(Life Technologies)，在培养基中加入化学小分子:1mM环磷酸腺苷cAMP(Signa-Aldrich)，10ng/ml BDNF(PeproTech)，10ng/ml GDNF(PeproTech)，10ng/ml胰岛素样生长因子IGF-1(PeproTech)，10ng/ml神经生长因子3NT3(PeproTech)。培养6周，进行膜片钳检查电生理。

如图15所示，诱导神经干细胞在输入电流后能产生动作电位，存在神经电生理活性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种利用非整合质粒载体诱导神经干细胞的方法，其特征在于，包括：外周血中单个核细胞的提取、外周血中单个核细胞的扩增、非整合性质粒电转染、神经干细胞培养的步骤，其中非整合性质粒为oriP/EBNA-1，携带基因为OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,c-MYC,KLF-4和SV40LT。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞为使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血所得的中间云雾状的细胞层中所含的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞以及极少量的CD34+造血干细胞。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，外周血中单个核细胞的提取方法为：静脉采血，使用PBS将血液稀释后，密度梯度离心法收集单个核细胞，将离心得到的中间云雾状细胞转移至离心管，加入PBS离心，吸去上清后将细胞重悬于PBS中离心，反复3-6次离心，去上清后将细胞重悬于PBS中计数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中的温度为4℃、离心时间为10分钟。

5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，外周血中单个核细胞的扩增方法为：将离心所得单个核细胞重悬于培养基中，孵育2天后去上清更换培养基；隔天更换培养基至培养14天为止。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5％CO₂。

7.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，非整合性质粒电转染方法为：将扩增后的细胞离心，计数，重悬于人CD34+细胞转染液中，加入质粒后转移至电转染杯中进行转染，转染后置于含有培养基的12孔板中孵育。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基为单个核细胞培养基，孵育条件为37度，5％CO₂。

9.根据权利要求1或2或4或6或8所述的方法，其特征在于，神经干细胞培养方法为：将电转染后的细胞在单个核细胞培养基中培养2天，然后将其离心，去上清，再将细胞重悬在神经干细胞培养基中，接种在事先用层粘蛋白包被过夜的12孔板上，密度为4×10⁵/孔，每隔2天更换一次培养基，观察细胞变化，大概在转染后10天左右，皿中会出现神经干细胞克隆，待干细胞继续扩增，在转染后20-30天左右，先使用Accutase将神经干细胞消化后，使用移液枪将克隆挑出，转移到已经用多聚赖氨酸包被过夜的96孔板上，进行干细胞扩增。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞培养基，其配方是基础培养基：49％(Iscove’s modified Dulbecco’s medium) IMDM，48％Ham’s F-12，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，1％chemically defined lipid concentrate，1％L-谷氨酰胺，0.05 mg ·ml^-1 左旋维生素C，5mg·ml^-1牛血清蛋白BSA，0.018μl·ml^-1 1-硫代甘油；加入的化学小分子为：100ng·ml^-1重组人干细胞因子，10ng·ml^–1重组人白细胞介素3，2U·ml^-1促红细胞生成素，40ng·ml^-1胰岛素样生长因子1IGF-1，1μM地塞米松，100μg·ml^-1全铁转铁蛋白。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述神经干细胞培养基配方为：基础培养基：DMEM/F12和neurobasal以1:1比例混合的培养液,1×N2,1×B27,1％GlutaMAX；加入的化学小分子为：10ng/ml重组人白血病抑制因子；3μM CHIR99021；2μM SB431542。

12.根据权利要求1-11任一项所述方法得到的神经干细胞用于制备治疗神经细胞病变疾病的 药物或制剂中的用途，其特征在于，所述神经细胞病变疾病为脑神经损伤、脊髓损伤、老年痴呆症、肌萎缩性侧索硬化症、糖尿病、多发性硬化或脑卒中。