CN105143456A - 用于转染的脂质纳米粒子和相关方法 - Google Patents

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R·J·泰勒
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Abstract

转染试剂组合物、从转染试剂组合物制备的脂质纳米粒子、包含转染试剂组合物的试剂盒，和用于产生和使用从转染试剂组合物制备的脂质纳米粒子的方法。在含水介质中分散时，脂质容易地形成脂质体，如单层小泡和多层小泡。脂质体已经成功地用于包封并向细胞递送广泛类型的化学物质，包括核酸、蛋白质和小分子药物。

Description

用于转染的脂质纳米粒子和相关方法
相关申请的交叉引用本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号61/798495的权益，所述文献通过引用的方式明确地完整并入本文。
关于序列表的声明
本申请附带的序列表以文本格式提供替代纸质副本并且因而通过引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是43935_Sequence_Final_2014-03-14.txt。该文本文件为748比特；创建于2014年3月14日；并且通过EFS网提交，同时提交本说明书。
背景技术
在含水介质中分散时，脂质容易地形成脂质体，如单层小泡和多层小泡。脂质体已经成功地用于包封并向细胞递送广泛类型的化学物质，包括核酸、蛋白质和小分子药物。
从阳离子脂质和磷脂的组合物制备的阳离子脂质体容易地与阴离子大分子如DNA和RNA形成聚集物。这些阳离子脂质体–核酸聚集物经常如此工程化，从而复合物的净电荷为正，据信这促进与阴离子性细胞表面相互作用，因而增强摄取包封的载货和后续细胞转染。常用于体外转染细胞的阳离子脂质组合物的例子是以1:1摩尔比与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)组合的N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
阳离子脂质体–核酸聚集物的大小和结构取决于脂质组成和制造方法。这些结构物可以具有数百纳米至微米的大小并且通过电子显微术可视化时，经常具有不均一的形态，包括经典的“意大利粉和肉丸”构象。
阳离子脂质体–核酸聚集物在原代细胞(即从活生物收获的细胞)中具有有限的有效性。认为这种是过多阳离子电荷所致毒性的结果。毒性外加大粒度还限制了阳离子脂质体–核酸聚集物用于体内转染的用途。
脂质纳米粒子(LNP)是临床上最先进的药物递送系统，7种基于LNP的药物已经收到监管批文。这些批准的药物含有小分子如抗癌药物并且与“游离药物”相比，显示有效性改进和/或毒性降低。LNP载体技术还已经用来递送“遗传”阴离子大分子如质粒用于蛋白质表达或小干扰性RNA(siRNA)寡核苷酸(OGN)用于基因沉默。
用来包封和递送基因药物的LNP技术和阳离子脂质的最新进展已经能够在静脉内(i.v.)注射之后产生这样的siRNA-LNP，其中已经显示所述siRNA-LNP克服阳离子脂质体-核酸聚集物的固有不稳定性并在难以转染的原代细胞和动物模型(包括非人灵长类)中介导治疗性相关靶基因的沉默。这些siRNA-LNP目前在几项临床试验中接收评价。
已经开发多种方法以配制含有基因药物的LNP系统。这些方法包括将预制LNP与OGN在乙醇存在下混合，或将溶解于乙醇中的脂质与含有OGN的含水介质混合，并产生直径100nm或更小及OGN包封效率为65-95％的LNP。这两种方法均依赖于阳离子脂质的存在以实现OGN包封并依赖聚(乙二醇))(PEG)脂质的存在以抑制聚集和庞大结构物的形成。所产生的LNP系统的特性，包括大小和OGN包封效率，对多种配制参数如离子强度、脂质和乙醇浓度、pH、OGN浓度和混合速率敏感。通常而言，使用当前配制方法时，参数如混合时的相对脂质浓度和OGN浓度以及混合速率难以控制，在制品内部和制品之间导致产生的LNP的特征变异。
微流体装置以纳升规模快速混合流体，同时精确控制温度、停留时间和溶质浓度。受控和快速的微流体混合先前已经应用于无机纳米粒子和微粒子的合成，并且可能在大规模生产纳米粒子优于大规模系统。微流体双相液滴技术已经用来产生用于药物递送的单分散体聚合性微粒子或用来产生用于包封细胞、蛋白质或其他生物分子的大型小泡。已经展示使用流体动力流速聚焦法(一项常见微流体技术)引起试剂快速混合，以产生大小受控的单分散体脂质体。还已经证明这项技术可用于其中获得更小更多单分散体粒子的聚合物纳米粒子生产，与大量生产方法相比，包封小分子更多。
尽管许多产品可用于细胞转染，但是需要在体外向难以转染的原代细胞以及在体内向靶细胞有效递送siRNAOGN和其他阴离子大分子的装置和方法。本发明寻求满足这种需求并提供其他相关优点以解决这样的主要问题，所述主要问题妨碍了验证通过病态细胞基因组测序鉴定的异常基因作为潜在的药物靶或生物标记物靶。
发明概述
在一个方面，本发明提供一种包含脂质和表面活性剂的转染试剂组合物。
在一个实施方案中，该转染试剂包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质和(c)一种或多种固醇；以及(d)一种或多种表面活性剂。
在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在某些实施方案中，粒子包含约30至约95摩尔％的阳离子脂质。
在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一个实施方案中，固醇是胆固醇。
在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚。在又一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。在某些实施方案中，粒子包含约0.1至约20摩尔％的表面活性剂。
在另一个实施方案中，脂质纳米粒子包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；以及(d)一种或多种表面活性剂；如本文定义。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚。
在另一个实施方案中，脂质纳米粒子包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；以及(d)一种或多种表面活性剂；如本文定义。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。
在其他方面，本发明提供一种包含转染试剂组合物和阴离子大分子的脂质纳米粒子，其中脂质纳米粒子包含基本上固态的核芯，如本文定义。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含转染试剂组合物和核酸的脂质纳米粒子。该核酸可以是DNA、RNA、锁核酸、核酸类似物或能够表达DNA或RNA的质粒。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含转染试剂组合物和反义寡核苷酸杂交探针的脂质纳米粒子。杂交探针可以是分子信标。
在另一个方面，本发明提供一种脂质纳米粒子，其包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；和(d)一种或多种表面活性剂和一种或多种如本文定义的核酸。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚。在一个实施方案中，核酸是siRNA。
在另一个方面，本发明提供一种脂质纳米粒子，其包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；和(d)一种或多种表面活性剂和一种或多种如本文定义的核酸。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。在一个实施方案中，核酸是siRNA。
在另一个方面，本发明提供一种脂质纳米粒子，其包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；和(d)一种或多种表面活性剂和一种或多种如本文定义的核酸。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚。在一个实施方案中，核酸是质粒DNA。
在另一个方面，本发明提供一种脂质纳米粒子，其包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质、(c)一种或多种固醇；和(d)一种或多种表面活性剂和一种或多种如本文定义的核酸。在一个实施方案中，阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯。在一个实施方案中，第二脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，固醇脂质是胆固醇。在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。在一个实施方案中，核酸是质粒DNA。
在一个实施方案中，本发明提供一种向受试者施用核酸的方法，所述方法包括施用本发明的脂质纳米粒子至有需求的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供一种向细胞中引入核酸的方法，所述方法包括使细胞与本发明的脂质纳米粒子接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种调节靶多核苷酸或多肽表达的方法，所述方法包括使细胞与本发明的脂质纳米粒子接触，其中核酸能够调节靶多核苷酸或多肽的表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗受试者中以多肽过量表达为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的脂质纳米粒子，其中核酸能够沉默或减少多肽的表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗受试者中以不存在多肽表达或多肽表达不足为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的脂质纳米粒子，其中核酸能够表达多肽或增加多肽的表达。
在其他方面中，本发明提供一种用于制造脂质纳米粒子的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种产生含有核酸的脂质纳米粒子的方法，所述方法包括：
(a)将包含处于第一溶剂中的核酸的第一流引入微流体装置中；其中装置具有适应于使得引入装置中的一股或多股流流动的第一区域和用于以微流体混合器混合一股或多股流的内容物的第二区域；
(b)将包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物的第二流引入微流体装置中，其中装置具有第一区域，所述第一区域适应于使得引入微流道中的一股或多股流流动并指引它们进入用于混合一股或多股流的内容物的第二区域，其中转染试剂组合物包含阳离子脂质，并且其中第一溶剂和第二溶剂不是相同的；
(c)使一股或多股第一流和一股或多股第二流从装置的第一区域流入装置的第二区域；并且
(d)将一股或多股第一流和一股或多股第二流的内容物在装置的第二区域中混合，以提供第三流，所述第三流包含具有包封核酸的脂质纳米粒子。
在另一个实施方案中，本发明提供一种产生含有核酸的脂质纳米粒子的方法，所述方法包括：
(a)将包含处于第一溶剂中的核酸的第一流引入流道中；其中装置具有适应于使得引入流道中的一股或多股流流动的第一区域和用于混合一股或多股流的内容物的第二区域；
(b)引入包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物的第二流；其中流道具有适应于使得引入该流道的一股或多股流流动的第一区域和用于混合一股或多股流的内容物的第二区域；
(c)使得一股或多股第一流和一股或多股第二流从流道的第一区域流入流道的第二区域，同时维持两股流的物理分离，其中一股或多股第一流和一股或多股第二流不混合直至抵达流道的第二区域处；并且
(d)将微流道的第二区域中流动的一股或多股第一流和一股或多股第二流的内容物混合，以提供第三流，所述第三流包含具有包封核酸的脂质纳米粒子。
在上文方法的某些实施方案中，混合一股或多股第一流和一股或多股第二流的内容物包括变动一股或多股第一流和一股或多股第二流的浓度或相对混合速率。
在上文方法的某些实施方案中，该方法还包括用水质缓冲液稀释第三流。在某些实施方案中，稀释第三流包括使第三流和水质缓冲液流入第二混合结构。
在上文方法的某些实施方案中，该方法还包括透析包含具有包封核酸的脂质纳米粒子的水质缓冲液以减少第二溶剂的量。
在上文方法的某些实施方案中，第一溶剂是水质缓冲液。在上文方法的某些实施方案中，第二溶剂是含水醇。
在上文方法的某些实施方案中，混合第一流和第二流的内容物包括混沌对流。在上文方法的某些实施方案中，混合第一流和第二流的内容物包括用微量混合器混合。
在上文方法的某些实施方案中，核酸包封效率是约80％至约100％。
在上文方法的某些实施方案中，通过屏障在第一区域中防止一股或多股第一流和一股或多股第二流的混合。在某些实施方案中，屏障是流道壁、鞘层流体或同心管路。
在本发明的另一个方面，提供用于产生脂质纳米粒子的装置。在一个实施方案中，本发明提供了用于产生包封核酸的脂质纳米粒子的装置，所述装置包含：
(a)用于接收第一溶液的第一入口，所述第一溶液包含处于第一溶剂中的核酸；
(b)与第一入口处于流体连通以提供第一流的第一入口微流道，所述第一流包含处于第一溶剂中的核酸；
(c)用于接收第二溶液的第二入口，所述第二溶液包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物；
(d)与第二入口处于流体连通以提供第二流的第二入口微流道，所述第二流包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物；和
(e)用于接收第一流和第二流的第三微流道，其中第三微流道具有适应于使得引入微流道中的第一流和第二流流动的第一区域和适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含具有包封核酸的脂质纳米粒子。
在一个实施方案中，该装置还包含用于稀释第三流以提供稀释流的手段，所述稀释流包含具有包封核酸的稳定化脂质纳米粒子。在某些实施方案中，用于稀释第三流的手段包括微量混合器。
在一个实施方案中，微流道具有约20至约300μm的流体动力直径。
在一个实施方案中，微流道的第二区域包含半浮雕结构。在一个实施方案中，微流道的第二区域具有主流动方向和一个或多个具有限定于其中的至少一条凹线(groove)或凸起部分的表面，所述凹线或凸起部分具有与主方向形成某个角度的取向。在一个实施方案中，第二区域包括微量混合器。
在某些实施方案中，该装置还包括用于变动第一流和第二流的流速的手段。
在某些实施方案中，该装置还包括在第一区域有效将一股或多股第一流与一股或多股第二流物理分隔的屏障。
附图简述
如同通过参考以下详细描述而本发明的前述方面和许多随之而来的优点变得更好理解，当结合附图理解时，本发明的前述方面和许多随之而来的优点将变更容易领会。
图1使用因子VII(FVII)小鼠模型来显示用不同表面活性剂(聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(MyrjS40)、聚氧乙烯(20)油基醚(Brij98)制备的siRNA-LNP的体内沉默活性。Brij35P-聚氧乙烯(23)月桂基醚(Brij35P))。使用微流体方法制造siRNA-LNP。将活性作为随siRNA-LNP制剂中所用表面活性剂的摩尔％(mol％)变化而变化的残余FVII蛋白质水平％计量。全部LNP均由以下脂质组合物根据下式组成：1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:表面活性剂(50％:10％:40％-表面活性剂％:表面活性剂％)。siRNA-LNP-对-脂质比是0.06重量/重量。通过尾静脉以等同于1mg/kgsiRNA的单次剂量注射小鼠(n＝3)。注射后24小时进行血液采集并且通过比色测定法测定FVII水平。数据表明在按siRNA剂量1mg/kg单次静脉内注射siRNA-LNP后24小时，与对照相比，血液中的FVII水平降低>95％。这个观察结果与所用的表面活性剂或掺入siRNA-LNP的mol％表面活性剂无关。
图2使用因子VII(FVII)小鼠模型来显示用表面活性剂聚氧乙烯(40)硬脂酸酯制备的siRNA-LNP的体内沉默活性。使用微流体方法制造siRNA-LNP。将活性作为随siRNA剂量和时间变化而变化的残余FVII蛋白质水平％计量。全部LNP均包含：1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:聚氧聚氧乙烯(40)硬脂酸酯(50:10:37.5:2.5mol％)。siRNA-LNP-对-脂质比是0.06重量/重量。通过尾静脉以等同于0.01、0.05、0.1、0.3、0.5和1mg/kgsiRNA的单次剂量注射小鼠(n＝3)。在注射后第1、7、14和21日进行血液采集并且通过比色测定法测定FVII水平。数据表明在按siRNA剂量1mg/kg单次静脉内注射siRNA-LNP后至少7天，与对照相比，血液中的FVII水平降低>95％。
图3使用因子VII(FVII)小鼠模型来显示用表面活性剂聚氧乙烯(20)油基醚制备的siRNA-LNP的体内沉默活性。使用微流体方法制造siRNA-LNP。将活性作为随siRNA剂量和时间变化而变化的残余FVII蛋白质水平％计量。全部LNP均包含：1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:聚氧乙烯(20)油基醚(50:10:38:2mol％)。siRNA-LNP-对-脂质比是0.06重量/重量。通过尾静脉以等同于0.01、0.05、0.1、0.3、0.5和1mg/kgsiRNA的单次剂量注射小鼠(n＝3)。在注射后第1、7、14和21日进行血液采集并且通过比色测定法测定FVII水平。数据表明在按siRNA剂量≥0.5mg/kg单次静脉内注射siRNA-LNP后至少7天，与对照相比，血液中的FVII水平降低>95％。
图4使用因子VII(FVII)小鼠模型来显示用表面活性剂聚氧乙烯(23)月桂基醚制备的siRNA-LNP的体内沉默活性。使用微流体方法制造siRNA-LNP。将活性作为随siRNA剂量和时间变化而变化的残余FVII蛋白质水平％计量。全部LNP包含：1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:聚氧乙烯(23)月桂基醚(50:10:38:2mol％)。siRNA-LNP-对-脂质比是0.06重量/重量。通过尾静脉以等同于0.01、0.05、0.1、0.3、0.5和1mg/kgsiRNA的单次剂量注射小鼠(n＝3)。在注射后第1、7、14和21日进行血液采集并且通过比色测定法测定FVII水平。数据表明在按siRNA剂量≥0.5mg/kg单次静脉内注射siRNA-LNP后至少7天，与对照相比，血液中的FVII水平降低>95％。
图5是用于制造脂质纳米粒子(LNP)的本发明代表性微流体(MF)方法的示意图：将脂质-乙醇和siRNA-水溶液泵送到微流体混合装置的入口中；装置中的人字形轮廓诱导流的混沌对流并造成脂质种类与水质流快速混合并形成脂质纳米粒子。混合流道宽300μm并且高130μm。人字形结构高40μm并且厚53μm。
图6是总结从本发明转染试剂组合物制备的代表性脂质纳米粒子的Z-Ave和PDI的表。
图7是总结从本发明转染试剂组合物制备的代表性脂质纳米粒子的核酸包封效率的表。
图8是按小体积制备粒子的本发明代表性装置和方法的示意图：一种使用输入和输出储器(孔)的组合控制流速和流动时程的装置。在这种装置中，输入孔用来含有输入流体。流道阻抗用来确定来自输入的各流动之间的相对流速。增加出口孔。在某些实施方案中，向输入施加压力之前，将回压或塞子施加至出口孔以因重量输入孔中流体或其他现象而停止来自输入的射流运动。在某些实施方案中，通过在添加流体至输入孔之前向出口孔添加流体实现回压。在这种情况下，最后添加表面张力最低的流体，因为这些流体是以最高速率穿过芯片移动的流体。随后将输入流体添加入输入储器并对输入加压以产生流体流动。不同流体的流速受从输入至混合器腔的流道阻抗控制。可以通过同时对输入孔加压，对各流体设定时间以按照相似的时间抵达混合器。在某些实施方案中，在纳米粒子制造之后，通过向输入施加流体(气体或液体)并使其流过混合器，吹扫出装置的剩余流体。
图9是图8示意图中所示代表性装置的例子。这种装置具有两个入口孔(一个入口孔用于水相和一个入口孔用于乙醇/脂质相)和一个出口孔。在实践中，将稀释缓冲液装入出口孔，这种缓冲液在装置的输出处添加回压并降低终产物的乙醇浓度，这使粒子稳定。将乙醇中水质试剂和脂质装入输入孔中，随后将多支管在入口孔上夹紧并使用注射器或其他机构加压。加压过程推动入口孔中的试剂穿过混合器(例如，交错式人字形混合器并进入出口孔。随后使用移液器回收制造的粒子。所示的装置设计成具有3份水质试剂对1份乙醇的流量比，这采用从输入孔延伸至其混合器的不同流道长度来实现。在这种情况下，使用2.5:1的比率并且这考虑了所需的流量比和各输入试剂之间的粘度差异。
图10是按小体积制备粒子的本发明代表性装置和方法的示意图：一种使第一溶剂流(输入孔1至n)流入出口储器(稀释孔)中所含的第二溶剂内的装置。第一流与出口储器的内容物混合可以通过各种机制进行，所示机制包括(i)通过将第一流引入储器中出现的对流流动和(ii)将第一流引入储器时主动混合合并的流体。
图11是图10示意图中所示代表性装置的例子。该装置具有用于脂质/乙醇溶液的单个输入孔和向其中添加水溶液的出口孔。该装置具有延伸入出口孔的众多微流道，与输入这些微流道的流道相比，微流道的阻抗高。对于流体的均匀分布，这是必需的。在加载试剂后，对入口孔加压。在入口孔中的流体流动穿过微流道并流入输出孔。流体通过对流并通过空气泡混合，流入出口孔。
图12是按小体积制备粒子的本发明代表性装置和方法的示意图：一种在入口或出口处使用阀门以设定向混合室中引入射流的时间的装置。
发明详述
本发明提供转染试剂组合物、含有阴离子大分子的脂质纳米粒子、使用该转染试剂组合物产生含有阴离子大分子的脂质纳米粒子的方法和装置以及使用脂质纳米粒子转染细胞的方法。
转染试剂组合物
在一个方面，本发明提供一种转染试剂组合物。该转染试剂组合物包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种第二脂质、一种或多种固醇和一种或多种表面活性剂。
脂质纳米粒子
在一个方面，本发明提供含有阴离子大分子的脂质纳米粒子。脂质纳米粒子包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种第二脂质和一种或多种核酸。
阳离子脂质
脂质纳米粒子包含阳离子脂质。如本文所用，术语“阳离子脂质”指这样的脂质，所述脂质随着pH降到脂质的可电离基团的pK以下呈阳离子或变成阳离子(质子化)，但是在较高pH值逐步呈更中性。在低于pK的pH值，脂质则能够与带负电荷的核酸(例如，寡核苷酸)结合。如本文所用，术语“阳离子脂质”包括在pH降低时具有正电荷的两性离子脂质。可用于本发明中的阳离子脂质不包括PEG-磷脂(例如，含有聚环氧乙烷的磷脂)。
术语“阳离子脂质”指在选择性pH如生理pH携带净正电荷的众多脂质种类的任一种。这类脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲氨基)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)；和N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。另外，可获得可以在本发明中使用的众多阳离子脂质商业制品。这些例如包括(包含DOTMA和1,2-二油酰-sn-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)的市售阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL，GrandIsland,N.Y.)；脂质转染胺(LIPOFECTAMINE)(包含N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺羰酰胺基)乙基)-N,N-二甲基-三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)的市售阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL)；和(乙醇中包含双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺(DOGS)的市售阳离子脂质，来自PromegaCorp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的并且在生理pH以下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(在此称作“阳离子脂质A”)。
在一个实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质(或其可药用盐(例如，盐酸盐))。可用于本发明中的合适氨基脂质包括在通过引用方式完整并入本文的WO2012/016184中描述的那些。代表性氨基脂质包括1,2-亚油氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-亚油氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰-2-亚油氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙烷(3-(N,N-dioleylamino)-1,2-propanediou,DOAP)、1,2-二亚油基氧-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2.2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烯(DLin-K-DMA)及其可药用盐(例如，盐酸盐盐)。
合适的氨基脂质包括具有下式的那些：
或其可药用盐(例如，盐酸盐)，
其中R1和R2相同或不同并且独立地是任选取代的C10-C24烷基、任选取代的C10-C24烯基、任选取代的C10-C24炔基或任选取代的C10-C24酰基；
R3和R4相同或不同并且独立地任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基，或R3和R4可以结合以形成任选取代的具有4至6个碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的杂环；
R5不存在或存在的并且当存在时是氢或C1-C6烷基；
m、n和p相同或不同并且独立地是0或1，条件是m、n和p不同时是0；
q是0、1、2、3或4；并且
Y和Z相同或不同并且独立地是O、S或NH。
在另一个实施方案中，阳离子脂质具有下式：
或其可药用盐(例如，盐酸盐)，其中：
R1和R2各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，
其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基每一者任选地由H；卤素；羟基；氰基；氧代；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基取代；
或R1和R2借助与它们二者连接的N原子结合在一起以形成3-8元杂芳基或杂环基；其中杂芳基和杂环基每一者任选由H；卤素、羟基、氰基；氧代；硝基；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基取代；
R3不存在、是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、或杂环基；
R4和R5各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基每一者任选地由H；卤素；羟基；氰基；氧代；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基取代；
X是-O-、-S-、-NR4-、-S、S-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)-、C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝S)O-、OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-CR4R5-；
Y和Z独立地是具有下式的C10至C30基团：L1–(CR6R7)α–[L2–(CR6R7)β]γ–L3–R8，其中
L1是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-或其组合；
R6和R7各自独立地是H；卤素；羟基、氰基；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
L2是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-、 或其组合，或具有下式
其中b、c和d各自独立地是0、1、2或3，条件是b、c和d总和是至少1并且不大于8；并且R9和R10各自独立地是R7，或毗邻的R9和R10，一并考虑时，任选地是键；
L3是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-、 或其组合，
R8独立地是H；卤素、羟基、氰基；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；或R8具有下式：
a是0、1、2、3或4；
α是0-6；
每个β独立地是0-6；
γ是0-6。
其他合适的阳离子脂质包括在生理pH附近携带净正电荷的阳离子脂质，此外还有上文特别描述的那些、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油基氧基)丙基-N,N--N-三乙基氯化物(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DOTAP·Cl)；3β-(N-(N',N'-二甲氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺羰酰胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)，双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺(DOGS)，1,2-二油酰-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。额外地，可以使用众多商业阳离子脂质制品，如，例如，LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE，从GIBCO/BRL可获得)和脂质转染胺(LIPOFECTAMINE)(包含DOSPA和DOPE，从GIBCO/BRL可获得)。
阳离子脂质以约30摩尔％至约95摩尔％的量存在于转染试剂组合物中。在一个实施方案中，阳离子脂质以约30摩尔％至约70摩尔％的量存在于转染试剂组合物中。在一个实施方案中，阳离子脂质以约40摩尔％至约60摩尔％的量存在于转染试剂组合物中。
中性脂质
在某些实施方案中，转染试剂组合物包含一种或多种中性脂质。
术语“脂质”指一组有机化合物，它们是脂肪酸的酯并特征在于不溶于水中，但可溶于许多有机溶剂中。脂质通常划分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”如类固醇。
术语“中性脂质”指在生理pH以不带电荷形式或中性两性离子形式存在的众多脂质种类中的任一种。可用于本发明中的中性脂质不包括PEG-磷脂(例如，含有聚环氧乙烷的磷脂)。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性脂质例如包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧化物(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺(反DOPE)。
在一个实施方案中，中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
固醇
在某些实施方案中，转染试剂组合物包含一种或多种固醇。
术语“固醇”指一个类固醇亚组，也称作甾体醇。固醇通常划分成两类：(1)植物固醇，也称作“植物甾醇”；和(2)动物固醇，也称作“动物甾醇”。
示例性固醇例如包括菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇和胆固醇。
在一个实施方案中，固醇是胆固醇。
表面活性剂
在某些实施方案中，转染试剂组合物包含一种或多种表面活性剂。
如本文所用，术语表面活性剂指含有疏水基团和亲水基团的非离子型两亲化合物。可用于本发明中的表面活性剂不包括PEG-磷脂(例如，含有聚环氧乙烷的磷脂)。
在一个实施方案中，表面活性剂由下式代表
其中
R1是H、C1-C6烷基；
X是-O-、-S-、-NR2-、-S－S-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NR2C(＝O)-、C(＝O)NR2-、-NR2C(＝O)O-、-OC(＝O)NR2-、-NR2C(＝O)NR2-、-NR2C(＝S)O-、OC(＝S)NR2-、-NR2C(＝S)NR2-、-CR2R3-；
R2和R3各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基每一者任选地由H；卤素；羟基；氰基；氧代；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基取代；
Y是具有下式的C10至C40基团：L1–(CR4R5)α–[L2–(CR4R5)β]γ–L3–R6，其中：
L1是键、–(CR4R5)-、-O-、-CO-、-NR2-、-S-或其组合；R4和R5各自独立地是H；卤素；羟基、氰基；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
L2和L3各自独立地是键、–(CR4R5)-、-O-、-CO-、-NR2-、-S-、或其组合；
R6是独立地H；卤素、羟基、氰基；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；或R6具有式：
a是2-100；
α是0-6；
每个β独立地是0-6；
γ是0-6。
在另一个实施方案中，表面活性剂由下式代表
其中：
x＝1至50；
y＝1至50；并且
z＝1至50。
在另一个实施方案中，表面活性剂由下式代表
其中：
x＝1至50；
y＝1至50；并且
z＝1至50。
在某些实施方案中，表面活性剂选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯、双嵌段聚氧乙烯烷基醚共聚物和三嵌段聚氧乙烯烷基醚共聚物。合适的表面活性剂包括聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚(丙二醇))11–嵌段-聚(乙二醇))16-嵌段–聚(丙二醇))11、聚(丙二醇))12–嵌段-聚(乙二醇))28-嵌段–聚(丙二醇))12。
在某些实施方案中，表面活性剂以约0.1至约20摩尔％的量存在于转染试剂组合物中。在一个实施方案中，表面活性剂以约0.5至约10摩尔％的量存在于转染试剂组合物中。在一个实施方案中，表面活性剂按约2摩尔％存在于脂质纳米粒子中。
在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚。
在一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。
在一个实施方案中，转染试剂组合物包含：
(a)作为氨基脂质或其可药用盐的阳离子脂质；
(b)作为磷脂的中性脂质；
(c)作为胆固醇的固醇；和
(d)选自聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的表面活性剂。
在另一个实施方案中，转染试剂组合物包含：
(a)作为1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯或其可药用盐的阳离子脂质；
(b)作为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)的中性脂质；
(c)作为胆固醇的固醇；和
(d)选自聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的表面活性剂。
在某些实施方案中，本发明的转染试剂组合物不包含PEG-磷脂(例如含有聚环氧乙烷的磷脂)。
阴离子大分子
本发明的脂质纳米粒子是可用于全身性或局部递送阴离子大分子。如本文所述，将转染试剂组合物与掺入所产生的脂质纳米粒子中的阴离子大分子混合。
如本文所用，术语“阴离子大分子”指这样的大分子，所述大分子随着pH降到该大分子的可电离基团的pK以上呈阴离子或变成阴离子(去质子化)，但是在较低pH值逐步呈更中性。在高于pK的pH值，则大分子能够与带正电荷的脂质(例如，阳离子脂质)结合。如本文所用，术语“阴离子大分子”包括在pH升高时带负电荷的两性离子大分子。
术语“阴离子大分子”指在选择性pH如生理pH携带净负电荷的众多种类的任一种。这类大分子包括但不限于核酸、蛋白质、肽和糖。
核酸
本发明的脂质纳米粒子是可用于全身性或局部递送核酸。如本文所述，将转染试剂组合物与掺入所产生的脂质纳米粒子中的核酸混合。
如本文所用，术语“核酸”意在包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有直至50个核苷酸的片段通常称作寡核苷酸，并且更长的片段称作多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸是20-50个核苷酸长度。在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”指由天然存在碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷酸或核苷单体聚合物或寡聚体。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括类似发挥功能的包含非天然存在单体的聚合物或寡聚体或其部分。此类修饰或取代的寡核苷酸因例如增强的细胞摄取和在核酸酶存在下增加的稳定性等特性而经常优选胜过其天然形式。寡核苷酸划分为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称作脱氧核糖的5碳糖在该糖5'和3'碳处共价连接至磷酸酯以形成交替不分枝的聚合物组成。核糖寡核苷酸由其中5碳糖是核糖的相似重复结构组成。存在于本发明脂质纳米粒子中的核酸包括任何形式的已知核酸。本文所用的核酸可以是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交分子。双链DNA的例子包括结构基因、包含控制区和终止区的基因和自我复制系统如病毒或质粒DNA。双链RNA的例子包括siRNA和其他RNA干扰试剂。单链核酸包含反义寡核苷酸、核酶、微RNA和形成三重体的寡核苷酸。
在一个实施方案中，多核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施方案中，核酸是反义核酸、核酶、tRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、miRNA、预缩合DNA或适配体。
术语“核酸”还指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸酯-糖-主链寡核苷酸、其他核苷酸、核苷酸类似物及其组合，并且可以是单链、双链或含有两条双链的部分和单链序列，如果适宜的话。
如本文所用，术语“核苷酸”类属涵盖下文限定的以下术语：核苷酸碱基、核苷、核苷酸类似物和通用核苷酸。
如本文所用，术语“核苷酸碱基”指取代或未取代的母芳环或母芳环类。在一些实施方案中，芳环或芳环类含有至少一个氮原子。在一些实施方案中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示例性核苷酸碱基和其类似物包括但不限于嘌呤如2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤(A)、桥亚乙烯基腺嘌呤、N6-2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-2-异戊烯基-2-甲基硫腺嘌呤(2ms6iA)、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤(G)、异鸟嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、2-硫嘧啶、6-硫鸟嘌呤(6sG)次黄嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤；7-去氮杂-嘌呤类如7-去氮杂腺嘌呤(7-去氮杂-A)和7-去氮杂鸟嘌呤(7-去氮杂-G)；嘧啶如胞嘧啶(C)、5-炔丙基胞嘧啶、异胞嘧啶、胸腺嘧啶(T)、4-硫胸腺嘧啶(4sT)、5,6-二氢胸腺嘧啶、O4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(U)、4-硫尿嘧啶(4sU)和5,6-二氢尿嘧啶(二氢尿嘧啶；D)；吲哚如硝基吲哚和4-甲基吲哚；吡咯如硝基吡咯；水粉蕈素(nebularine)；碱基(Y)；在一些实施方案中、核苷酸碱基是通用核苷酸碱基。额外的示例性核苷酸碱基可以在Fasman,1989,PracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology,第385-394页,CRCPress,BocaRaton,Fla.及其中引用的参考文献中找到。通用碱基的其他例子可以例如在Loakes,N.A.R.2001,29:2437-2447和SeelaN.A.R.2000,28:3224-3232中找到。
如本文所用，术语“核苷”指具有与接戊糖C-1'碳共价连的核苷酸碱基的化合物。在一些实施方案中，键借助杂芳环氮形成。常见的戊糖包括但不限于其中一个或多个碳原子各自独立地被一个或多个相同或不同-R、-OR、-NRR或卤基取代的那些戊糖，其中每个R独立地是氢、(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基。戊糖可以是饱和或不饱和的。示例性戊糖和其类似物包括但不限于核糖、2'-脱氧核糖、2'-(C1-C6)烷氧基核糖、2'-(C5-C14)芳氧基核糖、2',3'-双脱氧核糖、2',3'-双脱氢核糖、2'-脱氧-3'-卤代核糖、2'-脱氧-3'-氟核糖、2'-脱氧-3'-氯核糖、2'-脱氧-3'-氨基核糖、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷基核糖、2'-脱氧-3'-(C1-C6)烷氧基核糖和2'-脱氧-3'-(C5-C14)芳氧基核糖核糖。还参见例如2'-O-甲基、4'-α-异头核苷酸、1'-α-异头核苷酸(Asseline(1991)Nucl.AcidsRes.19:4067-74)、2'-4'-连接和3'-4'-连接以及其他“锁定”或“LNA”、双环糖修饰(WO98/22489；WO98/39352；WO99/14226)。“LNA”或“锁核酸”是一种DNA类似物，其在构象上如此锁定，从而核糖环受2'-氧和3'-碳或4'-碳之间的亚甲基键约束。由该键造成的构象限制经常增加对互补序列的结合亲和力并增加这类双链体的热稳定性。
糖包括在2'-位置或3'-位置处的修饰如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷和核苷酸包括天然D构型异构体(D-式)以及L构型异构体(L-式)(Beigelman，美国专利号6,251,666；Chu美国专利号5,753,789；Shudo,EP0540742；Garbesi(1993)Nucl.AcidsRes.21:4159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112:7435；Urata,(1993)NucleicAcidsSymposiumSer.No.29:69-70)。当核碱基是嘌呤例如A或G时，核糖与核碱基的N9-位置连接。当核碱基是嘧啶例如C、T或U时，戊糖与核碱基的N1-位置的连接(Kornberg和Baker,(1992)DNAReplication,第2版,Freeman,SanFrancisco,Calif.)。
核苷的一个或多个戊糖碳可以被磷酸酯取代。在一些实施方案中，磷酸酯与戊糖的3'-碳或5'碳连接。在一些实施方案中，核苷是其中核苷酸碱基是嘌呤、7-去氮杂嘌呤、嘧啶、通用核苷酸碱基、特定核苷酸碱基或其类似物的那些。
如本文所用，术语“核苷酸类似物”指其中核苷的戊糖和/或核苷酸碱基和/或一个或多个磷酸酯可以替换为其相应类似物的实施方案。在一些实施方案中，示例性戊糖类似物是上文描述的那些。在一些实施方案中，核苷酸类似物具有如上文所述的核苷酸碱基类似物。在一些实施方案中，示例性磷酸酯类似物包括但不限于烷基膦酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoroanilidate)、氨基磷酸酯、硼磷酸酯，并且可以包括结合的反离子。其他核酸类似物和碱基例如包括嵌入型核酸(INAs，如Christensen和Pedersen，2002中所述)和AEGIS碱基(Eragen，美国专利号5,432,272)。对各种核酸类似物的额外描述也可以例如在以下文献中找到(Beaucage等人,Tetrahedron49(10):1925(1993)及其中参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等人,Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等人,Nucl.AcidsRes.14:3487(1986)；Sawai等人,Chem.Lett.805(1984)；Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；和Pauwels等人,ChemicaScripta26:141(1986))，硫代磷酸酯(Mag等人,NucleicAcidsRes.19:1437(1991；和美国专利号5,644,048。其他胞核类似物包括二硫代磷酸酯(Briu等人,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基磷酰亚胺键(参见Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPresss)、具有阳性主链的那些(Denpcy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097(1995)；非离子型主链(美国专利号5,386,023；5,386,023；5637684；5602240；5,216,141；和4469863；Kiedrowshi等人,Angew.Chem.Intl.英语版30:423(1991)；Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等人,Nucleoside&Nucleotide13:1597(194):第2和第3章,ASCSymposiumSeries580,"CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,"编者Y.S.Sanghui和P.DanCook；Mesmaeker等人,Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等人,J.BiomolecularNMR34:17(1994)；TetrahedronLett.37:743(1996))和非核糖主链，包括在美国专利号5235033和5,034,506，和第6和第7章，ASCSymposiumSeries580,"CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,"编者Y.S.Sanghui和P.DanCook中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包含于核酸的定义范围内(参见Jenkins等人,Chem.Soc.Rev.(1995),第169-176页)。还在Rawls,C&ENews,Jun.2,1997,第35页中描述了几种核酸类似物。
如本文所用，术语“通用核苷酸碱基”或“通用碱基”指可以或可以不含有氮原子的芳环部分。在一些实施方案中，通用碱基可以共价连接至戊糖的C-1'碳以产生通用核苷酸。在一些实施方案中，通用核苷酸碱基不特异性与另一个核苷酸碱基成氢键。在一些实施方案中，通用核苷酸碱基与核苷酸碱基、直至并包含特定靶多核苷酸中的全部核苷酸碱基成氢键。在一些实施方案中，核苷酸碱基可以通过疏水性堆叠作用与相同核酸链上的毗邻核苷酸碱基相互作用。通用核苷酸包括但不限于脱氧-7-氮杂吲哚三磷酸(d7AITP)、脱氧异喹诺酮三磷酸(dICSTP)、脱氧丙炔基异喹诺酮三磷酸(dPICSTP)、脱氧甲基-7-氮杂吲哚三磷酸(dM7AITP)、脱氧mPy三磷酸(dImPyTP)、脱氧PP三磷酸(dPPTP)或脱氧丙炔基-7-氮杂吲哚三磷酸(dP7AITP)。这类通用碱基的其他例子尤其可以在公开的美国申请号10/290672和美国专利号6433134中找到。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”互换使用并且意指核苷酸单体的单链和双链聚合物，所述核苷酸单体包括由核苷酸间磷酸二酯键例如3'-5'和2'-5'倒转键、例如3'-3'和5'-5'分枝结构或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸具有结合的反离子，如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸组成、完全由核糖核苷酸或其嵌合组合物组成。多核苷酸可以由核苷酸间类似物、核碱基类似物和/或糖类似物组成。多核苷酸一般大小范围在数个单体单位(例如当本领域将它们更常见称作寡核苷酸时，3-40个单位)至几千个单体核苷酸单位。除非另外指出，当提到多核苷酸序列时，应当理解核苷酸从左至右处于5'至3'顺序，并且除非另外指出，否则“A”指脱氧腺苷，“C”指脱氧胞嘧啶(deoxycytosine)，“G”指脱氧鸟苷，并且“T”指胸苷。
如本文所用，“核碱基”意指那些天然存在的杂环部分和非天然存在的杂环部分，所述杂环部分是利用核酸技术或利用肽核酸技术以因而产生可以序列特异地结合核酸的聚合物的技术人员公知的。合适核碱基的非限制性例子包括：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-炔丙基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-去氮杂-鸟嘌呤)、N9-(7-去氮杂-8-氮杂-鸟嘌呤)和N8-(7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤)。合适核碱基的其他非限制性例子包括Buchardt等人(WO92/20702或WO92/20703)的图2(A)和图2(B)中所示的那些核碱基。
如本文所用，“核碱基序列”意指包含含有核碱基的亚基的聚合物的任何节段或两个或更多个节段的聚集物(例如，两个或更多个寡聚体嵌段的聚集物核碱基序列)。合适聚合物或聚合物节段的非限制性例子包含寡脱氧核苷酸(例如，DNA)、寡核糖核苷酸(例如，RNA)、肽核酸(PNA)、PNA嵌合体、PNA组合寡聚体、核酸类似物和/或核酸模拟物。
如本文所用，“多聚核碱基链”意指包含核碱基亚单位的完整单条聚合物链。例如，双链核酸的单条核酸链是多聚核碱基链。
如本文所用，“核酸”是具有从核苷酸形成的主链的含有核碱基序列的聚合物或聚合物节段或其类似物。
优选的核酸是DNA和RNA。
如本文所用，核酸还可以指“肽核酸”或者“PNA”，其意指包含两个或更多个PNA亚基(残基)、但不包含核酸亚单位(或其类似物)的任何寡聚体或聚合物节段(例如，嵌段寡聚体)，包括但不限于，在美国专利号5539082；5,527,675；5,623,049；5,714,331；5718262；5,736,336；5773571；5766855；5,786,461；5,837,459；5,891,625；5972610；5986053；和6107470中作为肽核酸提到或要求保护的任何寡聚体或聚合物节段；所述专利的每一篇通过引用的方式并入本文。术语“肽核酸”或“PNA”应当还适用于包含在以下出版物中描述的那些核酸模拟物的两个或更多个亚单位的任何寡聚体或聚合物节段：Lagriffoul等人,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,4:1081-1082(1994)；Petersen等人,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters6:793-796(1996)；Diderichsen等人,Tett.Lett.37:475-478(1996)；Fujii等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637-627(1997)；Jordan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687-690(1997)；Krotz等人,Tett.Lett.36:6941-6944(1995)；Lagriffoul等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1081-1082(1994)；Diederichsen,U.,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters7:1743-1746(1997)；Lowe等人,J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,(1997)1:539-546；Lowe等人,J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:547-554(1997)；Lowe等人,J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:555-560(1997)；Howarth等人,J.Org.Chem.62:5441-5450(1997)；Altmann,K.-H.,等人,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters7:1119-1122(1997)；Diederichsen,U.,Bioorganic&Med.Chem.Lett.8:165-168(1998)；Diederichsen等人,Angew.Chem.Int.Ed.37:302-305(1998)；Cantin等人,Tett.Lett.38:4211-4214(1997)；Ciapetti等人,Tetrahedron53:1167-1176(1997)；Lagriffoule等人,Chem.Eur.J.3:912-919(1997)；Kumar等人,OrganicLetters3(9):1269-1272(2001)；和如WO96/04000中公开的Shah等人的基于肽的核酸模拟物(PENAMS)。
本发明的脂质纳米粒子因其形态而不同于其他类似构成的材料并且表征为具有基本上固态的核芯。具有基本上固态核芯的脂质纳米粒子是这样的粒子，所述粒子在内部不具有扩展的含水区域并具有主要为脂质的内部。在一个实施方案中，扩展的区域是体积大于一半粒子体积的连续的含水区域。在第二实施方案中，扩展的含水区域占据超过25％的粒子体积。含水区域的范围可以通过电子显微术确定并且显示为低电子密度区域。进一步，因为固态核芯纳米粒子的内部主要是脂质，所以每份构成粒子的脂质的粒子含水容量(“截获体积(trappedvolume)”)小于对半径相同的单层双层脂质小泡所预期的含水容量。在一个实施方案中，截获体积小于50％对半径相同的单层双层脂质小泡所预期的含水容量。在一个实施方案中，截获体积小于25％对大小相同的单层双层脂质小泡所预期的含水容量。在第三实施方案中，截获体积占据小于20％的粒子总体积。在一个实施方案中，每份脂质的截获体积是小于2微升/微摩尔脂质。在另一个实施方案中，截获体积是小于1微升/微摩尔脂质。此外，尽管对于双层脂质小泡，每份脂质的截获体积随小泡的半径增加而大幅度增长，但是每份脂质的截获体积不随固态核芯纳米粒子的半径增加而大幅度增长。在一个实施方案中，随着平均大小从直径20nm增加到直径100nm，每份脂质的截获体积增长小于50％。在第二实施方案中，随着平均大小从直径20nm增加到直径100nm，每份脂质的截获体积增长小于20％。可以使用文献中描述的多种技术测量截获体积。因为固态核芯系统在粒子内部含有脂质，所以每摩尔脂质生成的具有给定半径的粒子的总数小于对双层小泡系统预期的总数。可以通过荧光技术连同其他技术测量每摩尔脂质生成的粒子的数目。
本发明的脂质纳米粒子也可以由电子显微术表征。具有基本上固态核芯的本发明粒子具有如通过电子显微术观察到的电子致密核芯。如此限定电子致密，从而固态核芯粒子的50％内部投影面积的面积平均电子密度(如2-D冷冻EM图像中所见)不少于粒子周界处最大电子密度的x％(x＝20％、40％、60％)。电子密度计算为目的区域内图像强度与不含纳米粒子的区域内背景强度的差异的绝对值。
包封效率
本发明的脂质纳米粒子可以通过包封效率而进一步区分。如下文描述，通过以下方法制备本发明的脂质纳米粒子，其中借助所述方法，成型工艺中所用的几乎100％(例如，80-100％)核酸包封于粒子中。在一个实施方案中，通过以下方法制备脂质纳米粒子，其中借助所述方法，成型工艺中所用的约90至约95％核酸包封于粒子中。
用于产生脂质纳米粒子的微流体方法
在一个方面，本发明提供一种使用脂质转染试剂组合物产生含有阴离子大分子的脂质纳米粒子的方法。在一个实施方案中，该方法包括：
(a)将包含处于第一溶剂中的阴离子大分子(例如，多聚核酸)的第一流引入微流道中；其中微流道具有适应于使得引入微流道中的一股或多股流流动的第一区域和用于混合一股或多股流的内容物的第二区域；
(b)在微流道中引入包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物的第二流以提供在装置中流动的第一流和第二流，其中转染试剂组合物包含可电离的阳离子脂质、中性脂质、固醇和表面活性剂并且其中第一溶剂和第二溶剂不是相同的；
(c)使一股或多股第一流和一股或多股第二流从微流道的第一区域流入微流道的第二区域；并且
(d)将微流道的第二区域中流动的一股或多股第一流和一股或多股第二流的内容物混合，以提供第三流，所述第三流包含具有包封阴离子大分子的脂质纳米粒子。
第一流和第二流的内容物可以通过混沌对流混合。在一个实施方案中，混合一股或多股第一流和一股或多股第二流的内容物包括变动一股或多股第一流和一股或多股第二流的浓度或相对混合速率。在以上实施方案中，不同于已知的方法，该方法不包括在混合后稀释。
为了进一步稳定化含有具有包封阴离子大分子的脂质纳米粒子的第三流，该方法可以包括，但不需要还包括，用水质缓冲液稀释第三流。在一个实施方案中，稀释第三流包括使第三流和水质缓冲液流入第二混合结构。在另一个实施方案中，将包含具有包封阴离子大分子的脂质纳米粒子的水质缓冲液透析以减少第二溶剂的量。
第一流包含处于第一溶剂中的阴离子大分子。合适的第一溶剂包含阴离子大分子可溶解于其中并且与第二溶剂可溶混的溶剂。合适的第一溶剂包括水质缓冲液。代表性第一溶剂包含柠檬酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液。
第二流包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物。合适的第二溶剂包含脂质和表面活性剂可溶解于其中并且与第一溶剂可溶混的溶剂。合适的第二溶剂包括1,4-二烷、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、酸和醇。代表性第二溶剂包括90％的含水乙醇。
本发明的方法在几个方面与其他微流体混合方法区分。尽管某些已知的方法需要相等或基本上相等比例的水质溶剂和有机溶剂(即，1:1)，本发明的方法通常利用超过1:1的水质溶剂对有机溶剂比。在某些实施方案中，水质溶剂对有机溶剂比是约2:1。在某些实施方案中，水质溶剂对有机溶剂比是约3:1。在某些实施方案中，水质溶剂对有机溶剂比是约4:1。在某些其他实施方案中，水质溶剂对有机溶剂比是约5:1、约10:1、约50:1、约100:1或更大。
本发明的脂质纳米粒子有利地在利用相对快速混合过程和高流速的微流体工艺中形成。快速混合过程提供了具有上文所示的有利特性的脂质纳米粒子，所述有利特性包括大小、均匀性、包封效率。在实施本发明方法中使用的混合速率是约100微秒至约10毫秒。代表性混合速率包含约1至约5毫秒。流体动力流速聚焦法在脂质体积相对低的情况下以相对低的流速(例如，5至100μL/分钟)运行，而本发明的方法以相对高的流速和相对高的脂质体积运行。在某些实施方案中，对于包含单混合区(即，混合器)的方法，流速是约10mL/分钟。对于利用混合器阵列(例如，10个混合器)的本发明方法，使用流速100mL/分钟(对于100个混合器，流速为1000mL/分钟)。因此，本发明的方法可以容易地放大以提供需要满足生产要求的脂质纳米粒子量。与实现的有利粒度和均匀性和包封效率一起，本发明的方法克服了用于生产脂质纳米粒子的已知微流体方法的缺点。产生脂质纳米粒子的本发明方法一个优点是这些方法是可放大的，这意味这些方法在放大时不改变并且在放大时存在优异的对应性。
用于产生脂质纳米粒子的微流体装置
在另一个方面，本发明提供了使用转染试剂组合物产生包封阴离子大分子的脂质纳米粒子的装置。在一个实施方案中，所述装置包括：
(a)用于接收第一溶液的第一入口，所述第一溶液包含处于第一溶剂中的核酸；
(b)与第一入口处于流体连通以提供第一流的第一入口微流道，所述第一流包含处于第一溶剂中的核酸；
(c)用于接收第二溶液的第二入口，所述第二溶液包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物；
(d)与第二入口处于流体连通以提供第二流的第二入口微流道，所述第二流包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物；和
(e)用于接收第一流和第二流的第三微流道，其中第三微流道具有适应于使得引入微流道中的第一流和第二流流动的第一区域和适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含具有包封核酸的脂质纳米粒子。
在一个实施方案中，该装置还包括用于稀释第三流以提供稀释流的手段，所述稀释流包含具有包封阴离子大分子的稳定化脂质纳米粒子。
本发明的装置是包括一条或多条微流道(即，其最大尺度小于1毫米的流道)的微流体装置。在一个实施方案中，微流道具有约20至约300μm的流体动力直径。如上文所示，微流道具有两个区域：用于接收至少两股流(例如，一股或多股第一流和一股或多股第二流)并使之流入该装置的第一区域。第一流和第二流的内容物在微流道的第二区域中混合。在一个实施方案中，微流道的第二区域具有主流动方向和一个或多个具有限定于其中的至少一条凹线或凸起部分的表面，所述凹线或凸起部分具有与主方向形成某个角度的取向(例如，交错式人字形混合器)，如美国申请公开号2004/0262223中所述，所述文献通过引用的方式明确地完整并入本文。在一个实施方案中，微流道的第二区域包含半浮雕结构。为了实现最大混合速率，有利的是在混合区域之前避开不必要的射流阻力。因此，本发明的一个实施方案是一种装置，其中具有大于1000微米尺度的微流体流道用来输送流体至单条混合流道。
在一个实施方案中，通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜产生微流体装置。该装置具有两个入口，各自用于上文制备的每种溶液的入口，和一个出口。通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜产生微流体装置。该装置特征在于一个300μm宽和大约130μm高的混合流道，所述混合流道具有在流道顶部由大约40μm高和75m厚轮廓形成的人字形结构。使用氧等离子体处理，将该装置密封至40x36x2mm玻璃载片，所述玻璃载片具有被钻出以匹配该装置入端口和出端口的三个1.5mm孔。
在第二实施方案中，微流体装置从硬质热塑性塑料如环状烯烃共聚物产生。使用CNC铣床加工阴模(negativetool)并且使用注塑法，将装置成形。在垂直面上增加范围1°和5°之间脱模角的情况下，保护流道尺度。使用多种技术，包括但不限于层压法、溶剂焊接、热压制及其组合，将模制的小片密封至空白基材。将结合的装置退火以消除来自生产工艺的残余应力。一旦成型，则按照与弹性体装置相同的方式在订制仪器中安装并使用该装置。
在本发明的其他方面，用其他微量混合器混合第一流和第二流。合适的微量混合器包括液滴混合器、T-混合器、之字形混合器、多层混合器或其他主动混合器。
也可以用变动第一流和第二流的浓度和相对流速的装置完成第一流和第二流的混合。
在另一个实施方案中，用于产生包封阴离子大分子的脂质纳米粒子的装置包括用于接收第一流和第二流的微流道，其中所述微流道具有适应于使得引入微流道中的第一流和第二流流动的第一区域和适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含具有包封阴离子大分子的脂质纳米粒子。在这个实施方案中，通过除如上文所示的第一和第二微流道之外的手段，将第一流和第二流引入该微流道中。
为了实现最大混合速率，有利的是在混合区域之前避开不必要的射流阻力。因此，本发明的一个实施方案是一种装置，其中具有大于1000微米尺度的微流体流道用来输送流体至单条混合流道。用于产生包封阴离子大分子的脂质纳米粒子的这种装置包括：
(a)单一入口微流道，其用于接收包含处于第一溶剂中的阴离子大分子第一溶液和包含处于第二溶剂中的转染试剂组合物的第二溶液；和
(b)适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含具有包封阴离子大分子的脂质纳米粒子。
在这种实施方案中，通过单一入口或通过一条或两条不具有微观尺度的流道，例如，具有大于1000μm(例如，1500μm或2000μm或更大)尺度的一条流道或多条流道，将第一流和第二流引入微流道中。可以使用毗邻或同心的宏观规格流道，将这些流道引入到入口微流道。
使用脂质纳米粒子递送阴离子大分子的方法
本发明的转染试剂组合物可以用来制备脂质纳米粒子以在体外或体内递送阴离子大分子至细胞。在具体的实施方案中，阴离子大分子是核酸，其中使用本发明的核酸-脂质纳米粒子输送所述核酸至细胞。所述方法和转染试剂组合物可以容易地适应于递送任何合适的阴离子大分子以治疗将从这种治疗获益的任何疾病或病症。
在某些实施方案中，本发明提供向细胞中引入核酸的方法。引入细胞中的优选核酸是siRNA、miRNA、免疫刺激性寡核苷酸、质粒、反义和核酶。这些方法可以通过使采用本发明的转染试剂组合物制备的脂质纳米粒子与细胞接触一段足够发生胞内递送的时间来实施。
常见应用包括使用提供胞内递送siRNA的熟知方法以敲减或沉默特定细胞靶。备选地，应用包括递送编码治疗上有用的多肽的DNA或mRNA序列。以这种方式，通过供应匮乏或缺少的基因产物，向遗传疾病提供疗法。本发明的方法可以在体外、离体或在体内实施。例如，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的组合物也可以用于体内递送核酸至细胞。
下文描述通过使用本发明的转染试剂组合物所制备的脂质纳米粒子递送siRNA和其在沉默基因表达方面的有效性。
对于体内施用，药物组合物优选地肠胃外(例如，关节内、静脉内、腹腔内、皮下或肌内)施用。在具体的实施方案中，通过快速浓注法静脉内或腹腔内施用药物组合物。其他施用途径包含局部(皮肤、眼、粘膜)、口服、肺部、鼻内、舌下、直肠和阴道途径。
在一个实施方案中，本发明提供调节靶多核苷酸或多肽表达的方法。这些方法通常包括使细胞与使用本发明转染试剂制备的脂质纳米粒子接触，其中所述脂质纳米粒子与能够调节靶多核苷酸或多肽表达的核酸结合。如本文所用，术语“调节”指改变靶多核苷酸或多肽的表达。调节可以意指增加或增强，或它可以意指减少或减弱。
在相关的实施方案中，本发明提供一种治疗受试者中以多肽过量表达为特征的疾病或病症的方法，所述方法包含向受试者提供本发明的药物组合物，其中阴离子大分子选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质质粒，并且其中所述siRNA、微RNA或反义RNA包含与编码该多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其互补物。
在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含使用本发明转染试剂所制备的脂质纳米粒子和可药用载体或稀释剂。代表性可药用载体或稀释剂包括静脉内注射用溶液(例如，盐水或右旋糖)。该组合物可以采取乳膏剂、油膏剂、凝胶剂、混悬剂或乳剂形式。
下文描述了代表性转染试剂组合物、脂质纳米粒子系统、使用转染试剂组合物产生脂质纳米粒子系统的装置和方法和使用LNP递送阴离子大分子的方法。
快速微流体混合允许生产单分散体脂质纳米粒子
通过在微流体混合器内部(图5)快速混合脂质-乙醇溶液与缓冲水溶液进行脂质纳米粒子的配制，其中所述微流体混合器设计成诱导混沌对流并且以中等体雷诺数(24<Re<240)提供受控的混合环境。微流体流道含有这样的人字形，所述人字形通过改变各个半循环之间人字形结构的取向产生混沌流，在局部旋流和拉伸流(extensionalflow)的中心造成周期性改变变化。
以下代表性转染试剂组合物包含可电离的阳离子脂质，具有表观pKa6.3的1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(阳离子脂质A)，所述表观pKa使得该脂质适于在低pH包封siRNA并在生理pH提供接近中性的阳离子表面电荷密度。使用该转染试剂组合物作为模型系统，确定在通过微流体混合形成LNP时表面活性剂和稳定剂mol％的选择。乙醇溶液含有转染试剂组合物。缓冲水溶液含有siRNA以产生siRNA/总脂质比0.06(wt/wt)，并且将形成的siRNA-LNP直接稀释至缓冲液中以降低乙醇含量到大约22vol％。siRNA-LNP粒度依赖于表面活性剂和在转染试剂组合物中存在的表面活性剂mol％的选择。随着转染试剂组合物中表面活性剂mol％增加，粒度降低。将转染试剂组合物中表面活性剂聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的比例从1mol％增加至10mol％使所得到的siRNA-LNP粒径从103.2nm降低至37.4nm(表1)。
微流体装置中的自装配可以产生具有几乎完全包封作用的LNP
从转染试剂组合物产生siRNA-LNP系统，稳健的工艺必然将提供高包封％的OGN产物。随着转染试剂组合物中表面活性剂和表面活性剂相关比例的选择的变化而评价siRNA包封。siRNA-LNP配制实现接近100％的包封％，与所用的表面活性剂和表面活性剂的相对比例无关(表2)。
使用转染试剂组合物通过微流体产生的siRNA-LNP系统可以是体 内高度有力的基因沉默剂
使用小鼠因子VII模型研究静脉内注射后siRNA-LNP系统在体内诱导基因沉默的能力。使用微流体法在siRNA-对-脂质比为0.06wt/wt情况下产生制剂1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:表面活性剂(50:10:40-％表面活性剂:％表面活性剂)通过尾静脉以等同于1mg/kgsiRNA的单次剂量注射小鼠(n＝3)。注射后24小时进行血液采集并且通过比色测定法测定FVII水平。数据(图1)表明在等同于siRNA剂量1mg/kg的单次静脉内注射后24小时，与对照相比，血液中的FVII水平降低>95％。
结果显示，含有交错式人字形混合器的微流体装置可以用来使用脂质组成变动的转染试剂组合物产生LNP，可以用来有效包封OGN如siRNA并且所产生的siRNA-LNP系统在体外和在体内均显示出优异的基因沉默能力。
本发明的微流体装置和系统允许使用转染试剂组合物以形成LNP，并且以形成大小100nm或更小的含有OGN的LNP并提供100％OGN包封。就形成LNP而言，混合速率和比率显然是重要的参数。乙醇-脂质溶液与缓冲水溶液的快速混合导致介质极性增加，这降低已溶解脂质的溶解度，引起它们从溶液析出并形成纳米粒子。快速混合造成溶液在整个混合体积各处迅速实现脂质单聚体的高度过饱和状态，导致快速和均匀的纳米粒子成核作用。增加的成核作用和纳米粒子生长耗尽游离脂质周围的液体，因而限制因游离脂质聚集所致的后续生长。
固态核芯LNP
LNP结构物显示出有限的大小，这表明可电离阳离子脂质在LNP内部中形成反胶束结构。阳离子脂质对电子致密性LNP核芯的贡献带来了这类LNP系统可能具有什么分子结构的问题。符合逻辑的是提出与反离子结合的阳离子脂质采取反转结构如反胶束，与含阴离子脂质的组合物中这些脂质形成反转结构物如六边形HII相的倾向性相符。转而，这种将表明由纯阳离子脂质组成的LNP系统应当显示直径在10nm范围内的受限大小，所述的受限大小是基本上包围直径2-3nm的反胶束内部的两个双层的厚度：HII相中针对磷脂酰乙醇胺存在的水性流道的直径是2.6nm。微流体配制过程为LNP系统提供了驱动受限大小系统生成的快速混合动力学。
该模型有助于理解在微流体混合配制过程期间可以如何实现接近100％的siRNA包封效率。这是双层系统中包封siRNA的主要问题，因为，假定阳离子脂质是同等地分布在双层的两侧上，则将预计最多内化50％的siRNA。该模型指出了其中可以容易调节siRNA-LNP大小、组成和表面电荷的方式。就大小而言，受限大小结构显然是每个粒子含有一个siRNA单体的一种结构，提示受限大小为大约15-20nm。使用本发明的微流体方法，容易实现这类siRNA-LNP粒子。由siRNA单体组成的受限大小siRNA-LNP系统可以潜在用作结构单元以使用微流体混合技术实现组合物和表面电荷变动的siRNA-LNP系统。预制的受限大小siRNA-LNP与含有带负电荷脂质的乙醇溶液快速混合例如可以预计导致与过量阳离子脂质的相互作用，以产生内部反胶束核结构和带负电荷的表面。
本文所述的本发明转染试剂组合物和脂质纳米粒子包括(即，包含)所述的组分。在某些实施方案中，本发明的转染试剂组合物和脂质纳米粒子包含所述的组分和不影响粒子特征的其他额外组分(即，转染试剂组合物和脂质纳米粒子基本上由列举的组分组成)。影响转染试剂组合物和脂质纳米粒子的特征的额外组分包括多种组分，如不利改变或影响治疗谱和粒子有效性的额外阴离子大分子、不利改变或影响粒子增容所列举阴离子大分子组分的能力的额外组分，和不利改变或影响粒子增加所述阴离子大分子组分的细胞摄取量或生物利用率的能力的额外组分。在其他实施方案中，本发明的转染试剂组合物和脂质纳米粒子仅包含所述的组分(即，由所述的组分组成)。
在另一个方面，本发明提供用于制备脂质纳米粒子的试剂盒。试剂盒包含本发明的转染试剂组合物。在某些实施方案中，试剂盒包括阴离子大分子(例如，核酸)。试剂盒任选地包括用于产生脂质纳米粒子的装置(例如，微流体混合器)。
用于试剂盒中的可用装置包括上文描述的装置和在WO2011/140627和WO2013/059922中描述的那些，所述文献的每一篇通过引用的方式明确地完整并入本文。
在某些实施方案中，可用于试剂盒中的装置是以小体积产生粒子的装置。如本文所用，术语“小体积”指小于2mL的体积，在某些实施方案中小于1mL的体积(例如，10微升)。
在一个实施方案中，所述装置包括：
(a)用于接收包含第一溶剂的第一溶液的第一孔；
(b)与第一孔处于流体连通的第一流道；
(c)用于接收包含第二溶剂的第二溶液的第二孔；
(d)与第二孔处于流体连通的第二流道；
(e)第三流道用于接收经第一和第二流道从第一和第二孔分别流出的第一流和第二流，其中第三流道具有适应于使得引入流道中第一流和第二流流动的第一区域和适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含粒子；和
(f)用于接收包含粒子的第三流的第三孔。
这个实施方案在图8、图9和图12中显示。
该装置可以包括一个或多个第一孔、一条或多条第一流道、一个或多个第二孔、一条或多条第二流道、一条或多条第三流道和一个或多个第三孔。
在一个实施方案中，该装置还包括用于稀释第三流以提供稀释流的手段，所述稀释流包含稳定化的粒子。
在另一个实施方案中，该装置包括：
(a)用于接收包含第一溶剂的第一溶液的第一孔；
(b)与第一孔处于流体连通的第一流道；和
(c)用于接收包含第二溶剂的第二溶液的第二孔，其中第二孔还接收经第一流道从第一孔流出的第一流，并且其中第二孔是适应于在第二孔中混合第一流和第二溶液的内容物以提供包含粒子的第三溶液。
这个实施方案在图10和图11中显示。
该装置可以包括一个或多个第一孔、一条或多条第一流道和一个或多个第二孔。
在某些实施方案中，该装置是宏流体或微流体装置。在某些实施方案中，第一流和第二流可以通过混沌对流、湍流混合、射流、涡旋混合法、空泡混合、微声流、搅拌或其他混合法混合。混合可以由主动混合装置或被动混合装置实现。混合可以按连续流模式或按限定体积模式进行。可以使用微流体混合器混合实现，所述微流体混合器包括人字形混合器、之字形混合器、微射流混合器或微涡旋混合混合器。可以使用宏混合器混合实现，所述宏混合器包括T-混合器、Y-混合器或W-混合器。
在某些实施方案中，装置是包括一条或多条微流道(即，其最大尺度小于1毫米的流道)的微流体装置。在一个实施方案中，微流道具有约20至约400μm的流体动力直径。在某些实施方案中，微流道具有两个区域：用于接收少两股流(例如，一股或多股第一流和一股或多股第二流)并使之流入该装置的第一区域。第一流和第二流的内容物在微流道的第二区域中混合。在一个实施方案中，微流道的第二区域具有主流动方向和一个或多个具有限定于其中的至少一条凹线或凸起部分的表面，所述凹线或凸起部分具有与主方向形成某个角度的取向(例如，交错式人字形混合器)，如美国专利申请公开号2004/0262223中所述，所述文献通过引用的方式明确地完整并入本文。在一个实施方案中，微流道的第二区域包含半浮雕结构。为了实现最大混合速率，有利的是在混合区域之前避开不必要的射流阻力。因此，本发明的一个实施方案是一种装置，其中具有大于1000微米尺度的微流体流道用来输送流体至单条混合流道。
在某些实施方案中，也可以用变动第一流和第二流的浓度和相对流速的装置完成第一流和第二流的混合。可以通过施加至第一流和第二流的对各流施加的差异压力、跨流道差异压降、差异流道阻抗或其组合，实现不同的流量比。因变动流道高度、宽度、长度或表面特性所致的流道差异阻抗可以用来实现不同的流速。可以使用或考虑一股或多股第一流和一股或多股第二流中各流的射流表面张力、粘度和其他表面特性以实现不同的流速。
在某些实施方案中，该装置还包括用于彻底或部分冲洗系统最大限度以减小废弃体积(wastevolume)的手段。在制造粒子后或制造粒子期间，装置能够使得流体或气体迫使一股或多股第一流和一股或多股第二流从流道的第一区域流入流道的第二区域以驱出第一流和第二流。可以在这种方法下充分吹扫或部分吹扫第一和第二流道。可以使用气体如空气、氮气、氩气或其他。可以使用多种液体，包括水、缓冲水溶液、乙醇、油或任何其他液体。
在某些实施方案中，装置能够施加回压以确保一股或多股第一流和一股或多股第二流从流道的第一区域流入第二区域是有限的直至实现初始的所需输入压力。这可以通过向出口流道施加压力、向输入流道施加负压实现。这可以通过用最终粒子溶液中可能需要或可能不需要的流体载入出口储器来实现。
在某些实施方案中，设计装置，从以最大限度减少流体废物的方式引入流体。这可以通过将流体抽入装置、从装置抽出、连接装置至注射器或其他方法来实现。
在某些实施方案中，装置是微流体装置并通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜来产生。该装置具有两个入口，各自用于上文制备的每种溶液的入口，和一个出口。通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜产生微流体装置。在一个例子中，该装置特征在于一个200μm宽和大约70μm高的混合流道，所述混合流道具有在流道顶部由大约25μm高和50μm厚轮廓形成的人字形结构。使用氧等离子体处理，将该装置密封至75x25x1.5mm玻璃载片。其他例子包括具有较小(120μm宽)或较大(300μm宽)宽度和相关相对尺度的装置。将输入端口和输出端口钻孔至装置中。
在其他实施方案中，该装置从硬质热塑性塑料如环状烯烃共聚物产生。使用CNC铣床加工阴模(negativetool)并且使用注塑法，将装置成形。在垂直面上增加范围1°和5°之间脱模角的情况下，保护流道尺度。使用多种技术，包括但不限于层压法、溶剂焊接、热压制及其组合，将模制的小片密封至空白基材。将结合的装置退火以消除来自生产工艺的残余应力。一旦成型，则按照与弹性体装置相同的方式在订制仪器中安装并使用该装置。
为了实现最大混合速率，有利的是在混合区域之前避开不必要的射流阻力。因此一个实施方案，装置具有用来输送流体单挑混合流道的非微流体流道，所述非微流体流道具有大于1000微米的尺度。这种用于产生粒子的装置包括：
(a)单一入口流道，其用于接收包含溶剂的第一溶液及不接受溶液或接受某些溶液以及包含处于第二溶剂中的粒子组分的第二溶液；和
(b)适应于混合第一流和第二流的内容物以提供第三流的第二区域，所述第三流包含粒子。
在这种实施方案中，通过单一入口或通过一条或两条不具有微观尺度的流道，例如，具有大于1000μm(例如，1500μm或2000μm或更大)尺度的一条流道或多条流道，将第一流和第二流引入流道中。可以使用毗邻或同心的宏观规格流道，将这些流道引入到入口流道。
出于说明目的提供以下实施例，而不限制要求保护的发明。
实施例
材料
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇从AvantiPolarLipids(Alabaster,Ala.)获得。4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、胆固醇和表面活性剂从Sigma(St.Louis，Mo.)(FairLawn,N.J.)获得。RNA酶A从AppliedBiosystems/Ambion(Austin，Tex.)获得。靶向因子VII(FVII)的siRNA和低GC阴性对照siRNA购自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)。因子VIIsiRNA：5'-GGAUCAUCUCAAGUCUUACTT-3'[SEQIDNO:1](FVII有义)和5'-GUAAGACUUGAGAUGAUCCTT-3'[SEQIDNO:2](FVII反义)。1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯由AlCanaTechnologies(Vancouver,BC)合成。
实施例1
LNP系统的制备
在本实施例中，描述了使用预制小泡法制备siRNA-LNP系统。
使用如N.Maurer,K.F.Wong,H.Stark,L.Louie,D.McIntosh,T.Wong,P.Scherrer,S.Semple和P.R.Cullis,"SpontaneousEntrapmentofPolynucleotidesUponElectrostaticInteractionWithEthanolDestabilizedCationicLiposomesFormationofSmallMultilamellarLiposomes,"Biophys.J.80:2310-2326(2001)中所述的预制小泡法，产生siRNA-LNP系统。将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质以适宜的摩尔比首先溶解于乙醇中。随后将脂质组合物逐滴添加至缓冲水溶液(柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液，pH4)，同时涡旋混合至乙醇和脂质终浓度30％(v/v)。随后在室温使用Lipex挤出器，将水合脂质穿过两个堆叠80nm孔径的滤器(Nuclepore)(NorthernLipids,Vancouver，加拿大)挤出5次。将siRNA(溶解于含有30％乙醇的相同水溶液)添加至小泡悬液，同时混合。通常使用目标siRNA/脂质比0.06(wt/wt)。将这种组合物在35℃温育30分钟以允许小泡再组织化和siRNA的包封。随后移除乙醇并通过透析(12-14kMW截值，Spectrum医疗仪器)如50mM柠檬酸盐缓冲液，pH4.0并且随后透析至PBS，pH7.4，将外部缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
实施例2
LNP系统的制备
在本实施例中，描述了用来利用微流体交错式人字形混合器制备本发明siRNA-LNP系统的代表性转染试剂组合物。
siRNA-LNP制备
在pH4.0的25mM乙酸盐缓冲液中制备寡核苷酸(siRNA)溶液。取决于所需的寡核苷酸-对-脂质比和配制浓度，以0.3mg/ml至1.9mg/ml总脂质的目标浓度制备溶液。在乙醇中制备以适宜摩尔比含有1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基4-(二甲氨基)丁酸酯、DSPC、胆固醇和表面活性剂的脂质溶液并用25mM乙酸盐缓冲液稀释以实现90％(v/v)乙醇浓度。图5是该实施例中使用的微流体装置的示意图。该装置具有两个入口，各自用于上文制备的每种溶液的入口，和一个出口。通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜产生微流体装置。该装置具有两个入口，各自用于上文制备的每种溶液的入口，和一个出口。通过柔性光刻即在弹性体中复制模塑微制造的掩膜产生微流体装置。该装置特征在于一个300μm宽和大约130μm高的混合流道，所述混合流道具有在流道顶部由大约40μm高和75μm厚轮廓形成的人字形结构。使用氧等离子体处理，将该装置密封至40x36x2mm玻璃载片，所述玻璃载片具有被钻出以匹配该装置入端口和出端口的三个1.5mm孔。结合的装置安装入订制仪器中，所述订制仪器具有顶板和后板，所述顶板具有密封该装置至仪器的o型环，所述后板具有在注射器中装载试剂的鲁尔接头。一旦装置和试剂加载，则该仪器作为注射泵发挥作用以按规定速率分配流体穿过该装置。每股流的流速从0.1ml/分钟变动至20ml/分钟。该仪器将两种溶液引入微流体装置中，其中它们在Y型三通处接触。不明显混合在层流下在这点处因扩散而出现，而两种溶液在它们沿人字形结构并围绕蛇形流道通过时混合。
混合在这些结构中因混沌对流而出现，造成层流的特征性分离日益变小，因而促进快速扩散。这种混合以毫秒时间尺度出现并且导致脂质转移至逐渐更含水的环境，从而降低其溶解度并导致LNP的自发形成。通过在转染试剂组合物中包含阳离子脂质，借助带正电荷的脂质头部基团和带负电荷的寡核苷酸缔合实现寡核苷酸种类的包埋。在微流体装置中混合后，通常将LNP组合物稀释于含有两体积搅拌的缓冲液的玻璃小瓶中。通过透析至50mM柠檬酸盐缓冲液pH4,0并且随后透析至PBS，pH7.4，最终移除乙醇。在缓冲溶液中缺少寡核苷酸的情况下，类似地产生空心小泡。
LNP表征
使用Nicomp370型亚微米粒度仪(ParticleSizingSystems,SantaBarbara,Calif.)，通过动态光散射法测定粒度。使用数目加权和强度加权的分布数据。使用来自美国WakoChemicals(Richmond，Va.)的胆固醇E酶测定法，通过测量总胆固醇验证脂质浓度。用VivaPureDMiniH柱(SartoriusStedimBiotechGmbH，哥廷根，德国)进行游离siRNA的移除。随后在75％乙醇中裂解洗脱物并通过在260nm测量吸光度定量siRNA。从移除游离寡核苷酸含量之前和之后的针对脂质含量归一化的寡核苷酸比率，确定包封效率。
针对FVII活性的siRNA-LNP的体内活性
6至8周龄雌性C57Bl/6小鼠从CharlesRiver实验室获得。将含有因子VIIsiRNA的siRNA-LNP经0.2μm滤器过滤并在使用前于无菌的磷酸盐缓冲盐水中稀释至要求的浓度。将制剂经外侧尾静脉以体积10ml/kg静脉内施用。在24小时后，用氯胺酮/赛拉嗪麻醉动物并且通过心脏穿刺法采集血液。将样品加工成血清(MicrotainerSerumSeparatorTubes；BectonDickinson,N.J.)并立即地测试或贮存在-70℃以便稍后分析血清因子VII水平。全部程序根据当地、州和联邦适用法规进行并且由研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。
使用比色BiophenVII分析试剂盒(Anaira)测定血清因子VII水平。将对照血清汇总并连续稀释(200％-3.125％)以产生用于计算处理动物中FVII水平的校正曲线。使用BiophenVII试剂盒根据制造商的说明，分析来自处理动物的适当稀释的血浆样品(每剂量n＝3)和盐水对照组(n＝4)。在96孔平底部无结合性聚苯乙烯分析平板(Corning，Corning,N.Y.)中进行分析并且在405nm测量吸光度。从采用连续稀释的对照血清产生的校正曲线测定处理的动物中的因子VII水平。
实施例3
使用转染试剂组合物制备代表性脂质纳米粒子及表征
在这个实施例中，描述了用来制备本发明代表性siRNA-LNP的本发明代表性转染试剂组合物。
在25mM乙酸盐缓冲液，pH4.0中以0.67mg/mL制备siRNA溶液。以乙醇中19.82mg/mL的浓度制备脂质溶液以含有1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯:DSPC:胆固醇:表面活性剂52(50:10:37.5:2.5mol％)。siRNA-脂质比是0.07(wt/wt)。将每种溶液以流速比3:1水:乙醇和总流速12mL/分钟输入微流体混合器中，产生乙醇终浓度25vol％。通过用MES柠檬酸盐pH6.7(1:500稀释)透析，移除乙醇。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4中进一步透析，制备最终siRNA-LNP。
使用MalvernZetasizerNanoZS(MalvernInstruments,Westborough,MA，美国)，通过动态光散射法测定粒度。样品测量在PBSpH7.4中进行并使用强度加权的分布数据。粒子具有平均粒径49.7nm，多分散性指数(PDI)＝0.06。
虽然已说明和描述了示意性实施方案，但是应当理解，可以在其中作出多种改变而不脱离本发明的精神和范围。

Claims (46)

  1. 如下定义其中要求保护排他性权利或权益的本发明实施方案：
    1.一种转染试剂组合物，其包含：
    (a)一种或多种阳离子脂质或其可药用盐；
    (b)一种或多种中性脂质；
    (c)一种或多种固醇；和
    (d)一种或多种表面活性剂。
  2. 2.根据权利要求所述1的组合物，其中阳离子脂质是氨基脂质或其可药用盐。
  3. 3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中阳离子脂质选自DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOTAP·Cl、DC-Chol、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DODMA、DODMA、DMRIE及其可药用盐。
  4. 4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质具有下式：
    或其可药用盐，其中：
    R1和R2相同或不同并且独立地是任选取代的C10-C24烷基，任选的取代的C10-C24烯基、任选取代的C10-C24炔基或任选取代的C10-C24酰基；
    R3和R4相同或不同并且独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基，或R3和R4可以结合以形成任选取代的具有4至6个碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的杂环；
    R5不存在或存在，并且当存在时是氢或C1-C6烷基；
    m、n和p相同或不同并且独立地是0或1，条件是m、n和p不同时是0；
    q是0、1、2、3或4；并且
    Y和Z相同或不同并且独立地是O、S或NH。
  5. 5.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质具有下式：
    或其可药用盐，其中：
    R1和R2各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基，
    其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基每一者任选地由以下取代：H、卤素、羟基、氰基、氧代、任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
    或R1和R2借助与它们二者连接的N原子结合在一起以形成3-8元杂芳基或杂环基；
    其中杂芳基和杂环基每一者任选地由以下取代：H、卤素、羟基、氰基、氧代、硝基、任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
    R3不存在、或者是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、或杂环基；
    R4和R5各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
    其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基每一者任选地由以下取代：H、卤素、羟基；氰基；氧代；任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
    X是O、S、-NR4-、-S–S-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-或-CR4R5-；
    Y和Z独立地是具有下式的C10至C30基团：L1–(CR6R7)α–[L2–(CR6R7)β]γ–L3–R8，其中：
    L1是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-或其组合；
    R6和R7各自独立地是H、卤素、羟基、氰基、任选由卤素、羟基或烷氧基取代的C1-C6烷基；
    L2是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-、 或其组合，或具有下式
    其中b、c和d各自独立地是0、1、2或3，条件是b、c和d总和是至少1并且不大于8；并且R9和R10各自独立地是R7，或毗邻的R9和R10一起任选地是键；
    L3是键、–(CR6R7)-、-O-、-CO-、-NR8-、-S-、 或其组合；
    R8独立地是H、卤素、羟基、氰基、烷氧基、芳基、杂芳基或任选由卤素、羟基或杂环基取代的C1-C6烷基，或R8具有下式：
    a是0、1、2、3或4；
    α是0-6；
    每个β独立地是0-6；并且
    γ是0-6。
  6. 6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯或其可药用盐。
  7. 7.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中中性脂质选自二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
  8. 8.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
  9. 9.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中固醇是胆固醇。
  10. 10.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中表面活性剂选自聚氧乙烯烷基醚、双嵌段聚氧乙烯醚共聚物、三嵌段聚氧乙烯烷基醚共聚物和两性支链型聚合物。
  11. 11.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中表面活性剂选自聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚(丙二醇)11–嵌段-聚(乙二醇))16-嵌段–聚(丙二醇)11、聚(丙二醇)12–嵌段-聚(乙二醇)28-嵌段–聚(丙二醇)12。
  12. 12.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中表面活性剂是聚氧乙烯(20)油基醚或聚氧乙烯(23)月桂基醚.
  13. 13.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。
  14. 14.根据权利要求所述1的组合物，其中：
    (a)阳离子脂质是氨基脂质或其可药用盐；
    (b)中性脂质是磷脂；
    (c)固醇是胆固醇；和
    (d)表面活性剂选自聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。
  15. 15.根据权利要求所述1的组合物，其中：
    (a)阳离子脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七碳-9-基-4-(二甲氨基)丁酸酯或其可药用盐；
    (b)中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
    (c)固醇是胆固醇；和
    (d)表面活性剂选自聚氧乙烯(20)油基醚、聚氧乙烯(23)月桂基醚或聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。
  16. 16.根据权利要求1-5、15或16中任一项所述的组合物，包含约20至约95摩尔％的阳离子脂质。
  17. 17.根据权利要求1-5、15或16中任一项所述的组合物，包含约0.1至约20摩尔％的表面活性剂。
  18. 18.脂质纳米粒子，包含根据权利要求1-17中任一项所述的组合物和阴离子大分子。
  19. 19.根据权利要求18所述的粒子，其中纳米粒子具有固态核芯。
  20. 20.根据权利要求18所述的粒子，其中阴离子大分子选自核酸、阴离子蛋白和阴离子肽。
  21. 21.根据权利要求18所述的粒子，其中阴离子大分子是核酸。
  22. 22.脂质纳米粒子，包含根据权利要求1-17中任一项所述的组合物和核酸。
  23. 23.根据权利要求22所述的粒子，其中纳米粒子具有固态核芯。
  24. 24.根据权利要求22或23所述的粒子，其中核酸是DNA、RNA、锁核酸、核酸类似物或能够表达DNA或RNA的质粒。
  25. 25.根据权利要求22或23所述的粒子，其中核酸是ssDNA或dsDNA。
  26. 26.根据权利要求22或23所述的粒子，其中核酸是ssRNA、siRNA、微RNA或mRNA。
  27. 27.根据权利要求22或23所述的粒子，其中核酸是反义寡核苷酸.
  28. 28.根据权利要求22或23所述的粒子，其中核酸是杂交探针。
  29. 29.根据权利要求28所述的粒子，其中杂交探针是分子信标。
  30. 30.向受试者施用核酸的方法，包括施用根据权利要求22-27中任一项所述的脂质纳米粒子至有需求的受试者。
  31. 31.治疗受试者中以多肽过量表达为特征的疾病或病症的方法，包括向受试者施用根据权利要求22-27中任一项所述的脂质纳米粒子，其中核酸能够沉默或减少多肽的表达。
  32. 32.治疗受试者中以多肽不足表达为特征的疾病或病症的方法，包括向受试者施用根据权利要求22-27中任一项所述的脂质纳米粒子，其中核酸能够表达多肽或增加多肽的表达。
  33. 33.向细胞中引入核酸的方法，包括使细胞与根据权利要求22-27中任一项所述的脂质纳米粒子接触。
  34. 34.调节靶多核苷酸或多肽表达的方法，包括使细胞与根据权利要求22-27中任一项所述的脂质纳米粒子接触，其中核酸能够调节靶多核苷酸或多肽的表达。
  35. 35.产生含有核酸的脂质纳米粒子的方法，包括
    (a)将包含处于第一溶剂中的核酸的第一流引入装置中；其中装置具有适应于使得引入装置中的一股或多股流流动的第一区域和用于以混合器混合一股或多股流的内容物的第二区域；
    (b)将包含处于第二溶剂中的根据权利要求1-17中任一项所述的组合物的第二流引入装置以提供第一流和第二流，其中转染试剂组合物包含阳离子脂质，并且其中第一溶剂和第二溶剂不是相同的；
    (c)使一股或多股第一流和一股或多股第二流从装置的第一区域流入装置的第二区域，其中第一流和第二流之间的体积比超过1.0；并且
    (d)将一股或多股第一流和一股或多股第二流在装置的第二区域中混合约100μs至约10ms的时间段，以提供第三流，所述第三流包含具有包封核酸的脂质纳米粒子。
  36. 36.根据权利要求35所述的方法，其中一股或多股第一流和一股或多股第二流以约1mL/分钟至约40mL/min的流速流动。
  37. 37.根据权利要求35所述的方法，其中转染试剂组合物的浓度是约10mM至约50mM。
  38. 38.根据权利要求35所述的方法，其中具有包封核酸的脂质纳米粒子具有约15nm至约300nm的直径。
  39. 39.根据权利要求35所述的方法，其中核酸以约80％至约100％的效率包封在脂质纳米粒子中。
  40. 40.根据权利要求35所述的方法，其中混合物具有尺度小于约1000μm的特征。
  41. 41.根据权利要求35所述的方法，其中混合物是微流体混合物。
  42. 42.制备脂质纳米粒子的试剂盒，所述脂质纳米粒子包含根据权利要求1-17中任一项所述的转染试剂组合物。
  43. 43.根据权利要求42所述的试剂盒，还包含阴离子大分子。
  44. 44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中阴离子大分子是核酸。
  45. 45.根据权利要求42-44所述的试剂盒，其进一步包括微流体混合器。
  46. 46.一种制备根据权利要求18-29任一项的脂质纳米粒子的方法，其使用权利要求42-45任一项的试剂盒。
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