CN104382853A - 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物。具体而言，本发明提供了通过使活性剂的含水溶液与处于有机溶剂中的含有一种或多种DILA2氨基酸化合物或脂质的脂质体形成组分的溶液接触以形成撞击流体而制备的治疗物的脂质体递送的方法和组合物。可以收集所述撞击流体并温育以制备包裹所述活性剂的脂质体制剂。所述组合物可以用缓冲液淬火并通过切向流和渗滤以及用于形成药物组合物的其它方式过滤。本发明提供了递送药物负载的有效性。组合物可以包含含有一种或多种载体颗粒的脂质体，其中每一种载体颗粒均具有活性剂和肽，其中所述肽的质量和脂质体的质量之和与所述活性剂质量之比小于约15。

Description

基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物
本申请是申请号为200980148321.3，申请日为2009年10月16日，发明名称为“基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明整体上涉及用于递送生物活性剂和药物试剂的方法、组合物和应用。本发明的方法和组合物可用于将治疗剂递送至所选的细胞、组织、器官或受治疗者。本发明的实施方式可以提供包括核酸试剂在内的药物和治疗剂的递送以及制备物质并利用其进行药物递送的方法。特别地，本发明涉及方法和包含脂质体或层状囊泡的组合物，和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及治疗方法和这些递送物质的应用。
序列表
本申请包含在此通过EFS-Web作为2009年10月14日创建的名为MD-08-16PCT.txt的ASCII文件提交的序列表，其大小为99,662字节，通过引用整体并入本文。
背景技术
治疗性化合物向受治疗者的递送会因为受限于化合物到达靶细胞或组织的能力或受限于细胞内化合物的进入或通行而受到阻碍。治疗性物质的递送通常受限于细胞膜。针对递送的这些屏障和限制可能导致需要使用比实现预期结果更高的化合物浓度，这样就带来了毒性作用和副作用的风险。
某些治疗性化合物的递送的再一个制约是需要保护化合物在运输过程中免受降解。特别地，通过血液循环的全身递送可使所述化合物经受多种蛋白、酶以及免疫学成分和因子。
一种递送策略是利用天然或合成的亲脂性载体分子或聚合物载体分子来改善化合物向细胞内的运输。这些物质可以充分利用为选择性进入细胞同时仍排除外源分子(如核酸和蛋白)而存在的机制。例如，阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并与细胞膜接触。还可以将某些天然的和合成的亲脂性分子并入(organize)作为药物试剂载体的脂质体或颗粒。纳米或亚微尺寸的脂质体可以充分利用为选择性进入细胞而存在的机制，例如细胞内吞作用。脂质体药物载体可以保护药物分子免受降解，同时改善细胞对其的摄取。而且，脂质体药物载体可以通过静电和其它相互作用包裹或结合某些化合物，并可以与带负电荷的细胞膜相互作用以启动跨膜运输。
脂质体的缺点是治疗性脂质体制剂的生物学活性通常依赖于进入脂质体中的活性剂荷载程度。通常，期望高程度的荷载以提供高的治疗活性。此外，脂质体的荷载还需要保持在制剂内的额外的载体分子。
脂质体用于药物试剂递送的另一个制约在于使用脂质体增加了递送制剂的质量。治疗性制剂的生物学活性及其相对毒性将受到诸如用于制备制剂的亲脂性分子和载体之类的其它组分的性质和质量的影响。用于递送活性剂的常规基于脂质的脂质体制剂可具有脂质分子的质量与活性剂的质量比值高10至15倍率。通常，脂质或载体与活性剂的较低比率更有效并被人所期望。对于用于核酸试剂的此脂质体制剂，每个脂质体可以包含不高于数百拷贝的核酸试剂分子。
其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi)、RNAi治疗、RNA药物、反义治疗和基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有效手段的需求。通常，核酸在细胞或血浆内仅保持稳定有限的时间。但是，基于核酸的试剂能够在随后可以被分散以用于细胞递送的组合物和制剂中保持稳定。
需要用于全身和局部递送药物和生物学活性分子的方法、组合物和应用。其中，需要用于制备并使用提高了生物活性治疗分子的递送效率的递送结构和载体(包括脂质体形式)的方法。期望利用数量降低的载体物质，尤其对于脂质体制剂、基因沉默治疗剂和其它制剂，产生高效递送和高生物活性。
发明内容
本发明提供了用于细胞内和体内递送最终作为治疗剂的药物试剂的新型方法、组合物和制剂，其通常维持细胞保护作用且相对低毒。本发明的方法和组合物可用于将药物试剂递送至所选的细胞、组织和器官。
在一些方面，本发明提供了向细胞递送活性核酸试剂或分子的过程、组合物和方法。所述活性剂可以或者通过药物作用或者通过产生RNA干扰或反义或核酶作用的应答，而产生治疗或药理作用。本发明的活性剂可用于调节基因表达或用于基因治疗。
本发明的实施方式提供了用于制备包括含有一种或多种活性剂的脂质体组合物在内的组合物的多种方法，所述方法通过提供包含活性剂的含水缓冲溶液的第一流体，提供包含处于有机溶剂中的一种或多种脂质体形成化合物的非水溶液的第二流体，使第一流体与第二流体撞击，由此形成所述有机溶剂浓度为约20％至约50％v/v的撞击流体(impingingstream)。所述撞击流体的pH可以为约6至约7.4。所述撞击流体可以在收集容器中于约20℃至约35℃的温度下温育约0.5小时至约8小时，由此形成含有脂质体的温育物。
在某些实施方式中，用于制备包含一种或多种活性剂的组合物的方法可以包括，通过向所述温育物中加入足以使所述有机溶剂的浓度小于约20％v/v的缓冲剂而使所述温育物淬火。
在一些方面，本发明的脂质体形成化合物可以为一种或多种DILA2氨基酸化合物。DILA2氨基酸化合物是含有可以形成脂质体的氨基酸基团的合成有机化合物。DILA2氨基酸化合物可以在所述氨基酸基团的N-末端或C-末端或上述两端含有递送增强尾或亲脂性尾。
在一些变式中，用于制备含有一种或多种活性剂的组合物的方法可以进一步包括使含有所述活性剂的第一流体的体积流率是含有脂质体形成分子的第二流体的体积流率的两倍或更高。在某些变式中，第一流体的体积流率是第二流体的体积流率的三倍或更高，或者是第二流体的体积流率的五倍或更高。
本发明的活性剂可以是UsiRNA、含核酸的试剂、基因沉默剂、基因调节剂、反义试剂、肽核酸试剂、核酶试剂、RNA试剂或DNA试剂。在一些实施方式中，所述活性剂可以是药物化合物或小分子药物。
用于制备含有一种或多种活性剂的脂质体组合物的方法可以进一步包括向收集容器中加入缓冲剂以调节所述有机溶剂的浓度。所述撞击流体的pH经调节可以为约3至约6。所述温育步骤可以在pH为约3至约6下进行。
在某些方面，所述活性剂可以以大于约50％、或大于约70％的水平被包裹在脂质体中。
在一些方面，本发明可以提供在45℃的温度下保持基因沉默活性达7天的脂质体组合物。在某些方面，所述脂质体组合物可以在45℃的温度下保持包裹活性剂达7天。
本发明的方法可以包括通过切向流过滤和渗滤而过滤所述温育物。在切向流过滤后，所述脂质体尺寸均一，其直径可以小于约160nm，或者平均直径可以为约40nm至约160nm，或约80nm至约150nm。在进一步的实施方式中，所述温育物可以经灭菌，且所述有机溶剂可以用不同的药学上可接受的缓冲剂交换。
在本发明的某些方法中，可以通过切向过滤和渗滤而对温育物进行过滤。在某些实施方式中，所述温育物可以经过灭菌。
本发明的方法可以包括向第一流体中加入有机溶剂使其浓度为约1％至约40％v/v。
所述有机溶剂可以为(C1-6)烷醇浓度为约40％至约99％v/v或约70％至约95％的无菌注射水溶液。
本发明的方法的温育时长可以为约1小时至约4小时。
本发明进一步涉及通过本发明方法的任一变式制备的药物组合物。
总的来说，本发明包括用于向生物细胞递送治疗性核酸的方法。
在一些实施方式中，本发明提供了通过根据本发明方法制备组合物并用所述组合物处理细胞而抑制生物细胞中的基因表达的方法。
本文公开的抑制哺乳动物中基因表达的方法包括根据本发明方法制备组合物并向所述哺乳动物施用所述组合物。
本发明的实施方式可进一步提供通过根据本发明方法制备组合物并向人施用所述组合物而治疗人类疾病的方法，其中所述疾病为癌、膀胱癌、肝癌、肝病、高胆固醇血症、炎症性疾病、代谢疾病、炎症、关节炎、类风湿关节炎、脑炎、骨折、心脏病和病毒性疾病。
本发明进一步涉及治疗疾病的组合物的应用和组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用。
本发明提供了用于向细胞递送生物试剂的多种组合物和制剂。更特别地，在某些方面，本发明提供了大小为纳米级的脂质体制剂和载体颗粒。所述载体颗粒可以被荷载在脂质体内，在递送中可以显示提高的稳定性，并且可以有效地递送药物试剂以调节基因表达或活性。
本发明提供了用于改善药物和生物活性分子的全身和局部递送的组合物、方法和应用。特别地，本申请还提供了用于制备和使用可以以提高的递送效率在细胞内递送活性剂的递送结构和载体的新型组合物和方法。
在一些实施方式中，本发明提供了包含脂质体的组合物，所述脂质体含有一种或多种载体颗粒，每种载体颗粒都含有活性核酸试剂和肽其中，所述肽的质量和所述脂质体的质量之和与所述核酸试剂的质量的比率小于约15，或者小于约12，或者小于约10，或者小于约9，或者小于约8，或者小于约5。
在某些实施方式中，本发明提供了在体内用于ApoB基因沉默的敲减活性为50％或更高、或70％或更高、或者90％或更高的组合物。
在一些变式中，本发明的组合物可以包含含有氨基酸脂质的脂质体。
在某些方面，本发明的组合物可以包含带电荷的载体颗粒、带负电荷的载体颗粒或者带正电荷的载体颗粒。
在某些变式中，所述活性核酸试剂可以为RNAi诱导剂或反义试剂。每种脂质体均可以包含500或更高拷贝、或者1000或更高拷贝、或者5000或更高拷贝的活性剂分子。
在一些变式中，用于载体颗粒的肽可以为可切割的肽或者可交联的肽。在一些实施方式中，所述肽是PN4110或PN183。
本发明提供了用于向细胞递送活性核酸试剂的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并用所述组合物处理所述细胞。
在某些方面，本发明提供了用于抑制细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并用所述组合物处理所述细胞。
在某些方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物中基因表达的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并向所述哺乳动物施用所述组合物。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗人类疾病的方法，所述疾病选自包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症，该方法包括制备脂质体组合物并向人类施用该组合物。
在某些实施方式中，本发明提供了脂质体组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用，所述疾病包括包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症。
在某些变式中，本发明提供了脂质体组合物用于治疗疾病的应用，所述疾病包括包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症。
本发明的该发明内容和具体实施方式以及附图、所附实施例和权利要求书整体上都作为本发明的公开内容。
附图说明
图1：本发明的脂质体实施方式的示意图，其中某些脂质体形成化合物形成了双层囊泡10。在该实施方式中，所述脂质体的外层受到与一种脂质体形成分子的头部基团连接的聚乙二醇链20的保护。脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，所述脂质体囊泡包含活性干扰性RNA组分的负载，其包括缩合的RNA纳米颗粒40、双链RNA双螺旋肽共轭物50、三链mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，这些组分并入本实施方式中。
图2：用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。分别制备包括活性剂溶液、缓冲溶液和一种或多种脂质体形成化合物的溶液的试剂溶液并放置于容器200中。使活性剂溶液和脂质体形成化合物的溶液在撞击流体210中接触。将撞击流体收集在收集容器220中。将所收集的物质置于所述容器中进行温育过程230，该步骤之后通过淬火240使所述物质稳定。使淬火的物质进行过滤过程250。滤液输出物260继续进行整理(finishing)过程。
图3：用于整理本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。所述脂质体组合物(可以为来自脂质体组合物的制备的滤液输出物)经灭菌300。用于运载经灭菌的组合物的器皿在310填装并在320整理，之后在330冷冻所述无菌组合物并在340储藏。将最终的组合物进行运输350以备使用。
图4：用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。将活性剂溶液维持在容器400中。将含有脂质体形成组分(例如DILA2化合物或脂质体)的溶液维持在独立的容器410中。将缓冲溶液维持在另一个容器420中。利用独立的蠕动泵430以独立选择的流速抽吸溶液。所述溶液可以任选流过串联滤器或者在装入容器前过滤。在撞击过程中，所述活性剂溶液与含有脂质体形成组分的溶液在接触点434接触。所述撞击流体可以任选流过一个或多个混合管436。所述撞击流体进入收集容器440用于温育过程。淬火过程缓冲溶液可以任选维持在独立的容器450中。所述脂质体组合物460从收集容器440流出并进入过滤过程。
图5：用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。将来自收集容器的输出460的稳定化脂质体组合物置于容器500中。将经过渗滤的缓冲溶液维持在独立的容器520中。蠕动泵502提供了稳定化脂质体组合物从容器500经过含中空纤维膜的管504的循环。切向流经由该循环而发生以通过除去滤液530而浓缩稳定化的脂质体组合物。加入来自容器520的置换缓冲液可允许以固定或可变体积渗滤。任选地，可以利用蠕动泵506进行稳定化脂质体组合物的渗析以驱动来自容器540的渗析缓冲溶液。特定浓度的所述稳定化脂质体组合物被输出550至整理过程。
图6：图6显示聚精氨酸结合区与增加聚精氨酸结合区长度的dsRNA的结合。图6中，利用PN3499(总共含有10个精氨酸的二聚体肽)观察到最强的结合(具有取代SYBR-Gold染料的最佳能力)。
具体实施方式
本发明的实施方式还提供了包括核酸试剂的药物和治疗剂的递送以及制备物质并利用其进行药物递送的方法。
本发明进一步涉及可用于将各种分子和结构递送至细胞的新型药物递送增强方法和组合物。本发明提供了最终意在药物的递送、治疗剂以及疾病和病症的诊断和治疗、包括对受治疗者基因表达或活性调控产生响应的那些疾病和病症的诊断和治疗的多种方法、化合物、组合物、制剂和应用。更具体地，本发明涉及方法和包含脂质体或层状囊泡的组合物，和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及这些递送物质的治疗方法和应用。
本发明的方法和组合物可进一步用于递送治疗剂、预防剂和诊断剂，如核酸试剂、多核苷酸、肽、蛋白以及小分子化合物和药物。
本发明的组合物和方法可用于诸如包裹在脂质体或层状囊泡中的之类形式的治疗剂的递送。这些形式可以包括各种直径的纳米颗粒。
其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi或iRNA)、RNAi治疗、RNA药物、反义治疗或核酶治疗以及DNA基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有效手段的需求。通常，核酸在引入至细胞或血浆内时仅保持稳定有限的时间。但是，基于核酸的试剂能够被稳定在组合物和制剂中，然后所述组合物和制剂可以被施用并分散以用于细胞递送。
核酸试剂包括含有核酸的任何分子，例如基因沉默剂、基因调节剂、反义试剂、肽核酸试剂、核酶试剂、RNA试剂和DNA试剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可用于递送包裹在脂质体中的治疗剂。在这些实施方式中，治疗剂可以称作负载。
例如，图1显示了本发明的脂质体实施方式的示意图，其中某些亲脂性分子形成双层囊泡10。在该实施方式中，所述脂质体的外层受到与一种亲脂性分子的头部基团连接的聚乙二醇链20的保护。脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，所述脂质体囊泡包含活性RNA组分的负载，其包括缩合的RNA纳米颗粒40、双链RNA双螺旋肽共轭物50、三链mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，这些组分并入本实施方式中。其它形式的治疗剂负载可以包括微RNA、发夹RNA、DNA或核酶形式。
通常，在本发明的方法和组合物中可以使用任何活性剂作为负载。在一些实施方式中，所述负载可以为小的有机分子药物试剂。在某些实施方式中，所述负载可以为带负电荷的治疗剂或中性治疗剂。
本发明一些方面提供的方法和组合物可以以可释放形式或组合物递送治疗剂。可释放形式和组合物包括结合并释放活性剂的分子、结合活性剂并卸载有助于释放该试剂的部分(moiety)的分子、结合活性剂并随后在生物隔室内以有助于该试剂的释放的方式调节的分子，以及含有与释放介导剂化合物混合的活性剂结合的分子的组合物。
在某些方面，本发明提供了用于制备适合递送治疗剂的脂质体组合物的方法和仪器。在某些实施方式中，本发明的活性剂为UsiRNA。本发明的方法可以提供核酸试剂的脂质体组合物，例如双链或三链RNA结构、RNA肽共轭物、缩合的RNA纳米颗粒、切丁酶底物RNA、dsRNA、siRNA、微RNA、发夹RNA和其它活性RNA形式。
本发明的活性剂可以为活性RNA试剂的肽缩合物。例如，通过缩合活性RNA试剂和肽或其它生物分子、RNA和多聚物质的缩合物而形成的纳米颗粒可以作为负载而荷载至本发明的脂质体组合物中。所述纳米颗粒可以为交联的。
在进一步的实施方式中，本发明的活性剂可以为肽、蛋白、蛋白酶、抗体、单克隆抗体、基于抗体的药物、疫苗试剂或小分子药物。
含有活性剂的组合物可以为含水溶液。
本文使用的术语“含水溶液”是指水溶液、无菌水溶液或主体溶剂为水的任何溶液。含水溶液可以包含，例如一些有机溶剂。
含水溶剂的实例包括水、注射用无菌水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。
含有脂质体形成分子或亲脂性分子的组合物可以为非水溶液。
本文使用的术语“非水溶液”是指主体溶剂不是水的任何溶液。非水溶液可以包含一些水。
非水溶剂的实例包括易于与水、烷醇、(C1-6)烷醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、烷醇-水、乙醇-水、乙腈、丙酮、酮类、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、表面活性剂溶液、去污剂溶液及它们的混合物混合的有机溶剂。
用于脂质体组合物的方法
本发明的实施方式可以提供用于制备含有活性剂的含脂质体组合物的多种方法以及药物递送的方法。
在一些方面，可以通过撞击两种组合物，例如含有一种或多种活性剂的组合物和含有一种或多种脂质体形成分子的独立的组合物而制备脂质体组合物。
通常，本发明的脂质体结构在完成制备方法的所有步骤前不是以完全活性形式构成的。本发明方法的每个步骤都需要一定的时间。通常，脂质体组合物的形成比例将依赖于多种可变因素(例如流速、温度、pH和各组分的浓度)的组合的不可预测的作用。在一些实施方式中，使用温育时间以控制形成过程。
图2显示了用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。图2中，单独制备包括活性剂溶液、缓冲溶液和一种或多种脂质体形成化合物的溶液的试剂溶液并置于溶液容器200中。所述试剂溶液可任选单独过滤或者在无菌条件下制备。所述活性剂溶液和脂质体形成化合物的溶液在撞击过程210中接触。将撞击流体收集在收集容器220中。将所收集的物质保持在容器中用于温育过程230，该步骤之后通过淬火240而使物质稳定。使淬火的物质进行过滤过程250。移除过滤输出物260至整理过程。
本发明包括用于制备脂质体组合物的包括撞击过程的方法的实施方式。撞击过程可以具有通过使包含有活性剂的组合物与含有脂质体形成分子的组合物撞击而产生撞击流体的一个或多个步骤。
在一些方面，本发明用于制备活性剂的脂质体组合物的方法可以具有温育过程的一个或多个步骤。温育过程可以包括收集撞击流体并将其保持在容器中持续温育时间。
本发明的实施方式可进一步包括用于制备脂质体组合物的方法，其中所温育的组合物被淬火。可以通过加入溶剂、缓冲剂或稀释剂至所温育的组合物流体或组合物的混合物中而进行淬火。淬火可以将特定组分(例如有机溶剂或分散剂)的浓度稀释至预定水平以下。通常，所温育的组合物的淬火可以形成在进一步的过程或整理步骤中稳定的组合物。淬火的步骤是可操作的以使所温育的可包含脂质体结构的组合物稳定。
收集容器中撞击流体的温育以及方法的其它步骤可以提供其中的活性剂被脂质体高度包裹的脂质体制剂。例如，在某些实施方式中，本发明的脂质体组合物和结构的形成可需要撞击、混合、稀释、收集、温育、调节pH、淬火和过滤的任何步骤。
用于制备本发明的脂质体组合物的方法可以进一步包括一个或多个过滤步骤。过滤步骤可用于改变多种过程参数，例如控制或改变组分的浓度或者改变粒度或分散性以及其它物理溶液参数。
图3显示了用于整理本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。参见图3，所述脂质体组合物(可以为来自脂质体组合物的制备的滤液输出物)经灭菌300。用于运载无菌组合物的容器在310填装并在320后处理，之后在330冷冻所述无菌组合物并在340储藏。将最终的组合物进行运输350以备使用。
本发明涉及物质的灭菌、填装和整理至容器以及所形成的制剂的储藏的过程可以使用本领域已知的步骤和方法，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed.1990)中描述的那些。
用于评价脂质体的包裹、大小和一般制备的一些方法描述在，例如WO2001005374，美国专利公开号20040142025和20070252295以及美国专利号6,843,942。
撞击和混合
在某些方面，本发明提供了用于制备活性剂的脂质体组合物的多种方法和加工条件。
图4显示了用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的过程图。参见图4，将活性剂溶液维持在容器400中。将含有脂质体形成组分(例如DILA2氨基酸化合物或脂质体)的溶液维持在独立的容器410中。将缓冲溶液维持在另一个容器420中。利用独立的蠕动泵430以独立选择的流速经由转移管402抽吸溶液。所述溶液可以任选流过串联滤器或者在装入相应容器前过滤。在撞击过程中，所述活性剂溶液可以在接触点434与含有脂质体形成组分的溶液接触。所述接触点可以为任何形状、角度、方向或尺寸。所述撞击流体可以任选流过一个或多个湍动的混合管436。所述撞击流体进入收集容器440。所述缓冲溶液可以从容器420泵入至收集容器440中。在收集容器440中收集的混合物可以在温育过程中持续一段时间。淬火过程缓冲溶液可以任选维持在独立的容器450中。所述淬火脂质体组合物460从收集容器440流出并进入过滤过程。
在某些实施方式中，容器450中的缓冲溶液可以任选地用于稀释撞击流体，并且可以在收集器皿前或者在任何混合管前与撞击流体接触。
如上文讨论的，为了形成脂质体组合物，本发明的某些过程提供了撞击流体，其经历了在转移管中并任选地在湍动混合管中混合、在器皿或容器中收集、温育过程和淬火。所淬火的物质被输出以用于过滤和整理。
撞击流体通常来自使活性剂的组合物与含有脂质体形成分子的组合物接触。所述撞击流体可仅与所述组合物接触以形成单个流体。所述撞击流体通常可以不提供所述组合物的完全相互分散或相互混合。在任选步骤中，可以将撞击流体置于湍动混合条件。
所述撞击流体的pH可以控制在约3至约9的范围内。在一些实施方式中，撞击流体的pH可以为约5至约8，或者约6至约7，或者约7.4。在某些变式中，所述撞击流体的pH为约3至约6。可以在撞击流体通过转移管转移的过程中或者在混合管中或者在收集容器中调节所述撞击流体的pH。在某些实施方式中，所述撞击流体的起始pH为约5至约8，或者约6至约7.4，或者在起始撞击后调节pH至约3至约6的范围内。在某些实施方式中，所述撞击流体的pH一直为约7.4。
可任选地在撞击前过滤用于形成撞击流体的组合物。本发明的含有一种或多种活性剂的组合物可以通过，例如流式过滤技术以除去尺寸大于约200纳米(nm)或大于约300nm或大于约500nm的不期望的颗粒或者相而过滤。含有多种脂质体形成分子的组合物可以通过，例如流式过滤技术以除去尺寸大于约200nm或大于约300nm或大于约500nm的不期望的颗粒或者相而过滤。
撞击流体的温度可以控制在约15℃至约37℃的范围内。
本发明的方面进一步提供了，可以利用所撞击的组合物的流度控制所述撞击流体组合物。通常，各组合物将流过所选直径的管，因此在撞击流体中合并的流体的相对体积流率提供了描述撞击流体中各种组分的浓度的方式。
例如，当通过撞击流过直径相同的管的两个独立的流体而形成撞击流体时，所述独立流体的流度将决定撞击流体中组分的浓度(与初始流体中组分浓度相比)。因此，可使用流速在用于制备具有特定性质的脂质体组合物的撞击流体中产生期望的组合物。
在某些实施方式中，可以使用流体的流速控制活性剂相对于脂质体形成分子的浓度，和包括溶剂或盐的浓度以及混合力和剪切力在内的其它参数。本发明的实施方式包括用于制备脂质体制剂的方法，在该方法中通过调节加工设备的流速有利地增强了活性剂的包裹和脂质体粒度。
在某些方面，本发明的方法可以采用相同直径的管，用于使活性剂组合物的流体与含有亲脂性分子的组合物的流体撞击。在某些变式中，所述组合物的流速可以相同或不同。在特定的实施方式中，含有活性剂的组合物的流速可以不等于含有亲脂性分子的组合物的流速。例如，在某些实施方式中，含有活性剂的组合物的流速可以为含有亲脂性分子的组合物的流速的两倍。在其它变式中，含有活性剂的组合物的流速可以为含有亲脂性分子的组合物的流速的两倍或更多，或在一些实施方式中，含有活性剂的组合物的流速可以为含有亲脂性分子的组合物的流速的三倍或更多，或者含有活性剂的组合物的流速可以为含有亲脂性分子的组合物的流速的五倍或更多。
通常，所述设备的管可以为任何直径。在某些实施方式中，本发明的方法可以采用不同直径的管，用于使活性剂组合物的流体与含有脂质体形成分子的组合物的流体撞击。在某些变式中，所述管的直径可以相同或不同。例如，在某些实施方式中，容纳活性剂溶液的管的直径可以为容纳亲脂性分子的溶液的管的直径的四分之三。在其它变式中，容纳活性剂溶液的管的直径可以为容纳亲脂性分子的溶液的管的直径的二分之一。在其它变式中，容纳活性剂溶液的管的直径可以大于容纳亲脂性分子的溶液的管的直径。
在一些实施方式中，可以使用用于流通混合的某些方式使撞击流体进一步混合。流通混合的方式包括具有一个或多个通道、毛细管或者通过排列以改变流向的通路的混合仪，其中所述通道、毛细管或通路可以分支并再连接一次或多次以提供湍动混合。流通混合的方式可任选地包括机械搅拌仪、振荡器或搅拌棒、刀片、桨、盘或叶片。
用于湍动混合的雷诺数可以大于2000，或者大于2400。
可以通过调节撞击流体的流速来控制湍动混合仪中混合流体的滞留时间。在某些变式中，可以使用撞击流体在湍动混合仪中的流速和滞留时间来控制脂质体颗粒的分级(sizing)。
用于流通混合的湍动混合管的实例为Cole-Parmer串联静止混合仪K-04669-52,316不锈钢管混合仪；3/16"管OD,21元件。
在本发明的各方法中使用的设备的器皿、管和其它流动元件都可以由对所用反应物和溶剂为惰性的且适合于诸如温度和pH的反应条件的任何材料制备。所述材料的实例包括聚合物、金属、不锈钢、玻璃和陶瓷。所述器皿、管和其它流动元件还可以涂覆有惰性物质。
通常，所述器皿、管和其它流体元件与可控制各个步骤中的溶液和混合物的流速的一个或多个可控泵流体相通。所述设备可以包括多种阀，例如用于控制流动的检测阀。所述器皿、管和其它流动元件可以与可包括箍或O形环在内的多种紧固件相连。所述设备可以在流动通路的各个点具有温度传感器。
本发明的方法和设备可用批次或连续过程。
收集容器、温育过程和淬火过程
参见图4，在一些实施方式中，所述撞击流体进入收集容器440中。在收集容器440中，所收集的撞击流体进入温育过程。
所述温育过程可以包括混合所收集的物质的一个或多个步骤，用稀释缓冲液稀释的一个或多个步骤，调节收集容器中的pH的一个或多个步骤，以及将所收集的物质在特定温度下保持温育时间的一个或多个步骤。
可以利用，例如机械搅拌器、振荡器或搅拌棒、刀片、桨、盘或叶片使所收集的物质在收集容器中混合。
在一些变式中，可以通过使活性剂的组合物与含有脂质体形成化合物的组合物接触并向撞击流体中加入缓冲剂、溶剂或稀释剂，而形成撞击流体。缓冲剂、溶剂或稀释剂的添加可以在混合或收集所述撞击流体之前进行，或者可以作为温育过程的一部分而在收集容器中进行。缓冲剂、溶剂和稀释剂的添加降低了收集容器中的活性剂、脂质体形成分子和诸如另一种溶剂的其它组分的浓度。
在一些实施方式中，不论是向转移管中或是向混合管中或向收集容器中的撞击流体中加入缓冲剂、溶剂或稀释剂，可以将有机溶剂的浓度稀释至约50％(v/v)或更低，或约40％(v/v)或更低，或约35％(v/v)或更低，或约33％(v/v)或更低，或约30％(v/v)或更低，或约25％(v/v)或更低，或约22％(v/v)或更低，或约20％(v/v)或更低。
在收集容器中所收集的混合物或组合物的pH可以控制在约3至约9的范围内。在一些实施方式中，所收集的撞击流体的pH被调节至约5至约8或者约6至约7.4的范围内。在某些实施方式中，所收集的混合物的pH为约5至约8，并且在初始撞击后pH被调节至约3至约6的范围内。在一些变式中，所收集的撞击流体的pH被维持在约7.4。本发明的脂质体组合物还可以在其中各步骤的pH均为约7.4的方法中形成。
在一些方面，收集容器中收集的混合物或组合物经历温育保持期(incubation holdperiod)。在收集容器中温育的保持期时长可以为数分钟至数小时，或者约15分钟至约8小时，或者约0.5小时至约8小时，或者约0.5小时至约4小时，或者约1小时至约4小时，或者约1小时至约2小时。
在所述方法的变式中，湍动混合发生在用缓冲剂、溶剂或稀释剂稀释撞击流体之后，并且温育的保持期可以为约0.5小时至约8小时，或者约1小时至约4小时，或者约1小时至约2小时。
在某些变式中，湍动混合发生在用缓冲剂、溶剂或稀释剂稀释撞击流体之前，并且温育的保持期可以为数分钟至数小时，或者约15分钟至约8小时，或者约0.5小时至约8小时，或者约0.5小时至约4小时，或者约1小时至约4小时，或者约1小时至约2小时。
温育过程的温育期的时长通常可依赖于其它过程参数，例如撞击流的流速以及温度和pH。
在保持期内，在收集容器中收集的组合物的温度可以被控制在约15℃至约37℃，或者约22℃至约35℃。
在一些方面，可以通过快速添加缓冲剂、溶剂或稀释剂来对温育物淬火而终止温育过程。所述淬火步骤可以将有机溶剂的浓度降低至约20％(v/v)或更低，或约15％(v/v)或更低，或约10％(v/v)或更低，或约5％(v/v)或更低。
在一些实施方式中，所述淬火过程可进一步产生含有包裹活性剂的脂质体的稳定化脂质体组合物。
过滤和整理
如上文所讨论的，在一些实施方式中，撞击流体经历混合、收集、温育过程以及淬火过程。经淬火的物质可以是稳定化的脂质体组合物，其可以被输出以用于过滤和整理。
图5显示了通过过滤和整理制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的过程图。参见图5，将稳定化的脂质体组合物，例如经淬火的脂质体组合物460装载至容器500中。将渗滤缓冲溶液保持在单独的容器520中。蠕动泵502提供了稳定化的脂质体组合物从容器500通过含有中空纤维膜的管504的循环。切向流过滤在经过该循环时发生以浓缩稳定化的脂质体组合物，并且从含有中空纤维膜的管504除去滤液530。将来自容器520的置换缓冲剂加入至所述循环中可以允许以固定或可变的体积渗滤。还可以通过加入缓冲剂对稳定化的脂质体组合物进行稀释，以获得制剂中活性剂的终浓度。任选地，可以利用蠕动泵506进行稳定化脂质体组合物的渗析以驱动来自容器540的渗析缓冲液。特定浓度的稳定化脂质体组合物被输出550至整理步骤。
通常，滤液530可以包含有机溶剂和未包裹的活性剂。因此，滤液的去除可以去除并降低稳定化脂质体组合物中有机溶剂的浓度，并去除未包裹的活性剂。
通常，经淬火的温育物中活性剂浓度可以低于期望用于制备药物组合物的范围。在一些实施方式中，经淬火的温育物中非水溶剂的浓度可以对于制备药物组合物来说太高。如上文所讨论的，可以通过切向流过滤和渗滤调节这些浓度。
在一些实施方式中，经淬火的温育物循环至中空纤维切向流过滤设备或者筒式或盒式切向流过滤设备。在不加入缓冲剂或溶剂循环时，切向流过滤将脂质体组合物保留在体积降低的缓冲剂或溶剂中，由此提高其浓度。
可以将类似的设备用在渗滤模式中以除去非水溶剂并用渗滤缓冲剂取代之。在渗滤模式中，通过加入渗滤缓冲剂而将循环滞留物的体积保持基本恒定。因此，在进入渗透时有机溶剂的浓度降低并被去除。
可以通过向渗滤步骤的滞留物中加入缓冲剂而调节活性剂的浓度，以获得期望的终浓度。可以随后将浓度经过调节的滞留物提供至灭菌单元，在此使用直流式过滤对滞留的产物溶液进行灭菌。灭菌的产物可用在无菌的装瓶过程，并将产品瓶储藏在低温。可以使用快速冷冻、冻干和低温冻干以及其它方式用以制备和保藏所述产品。
在某些实施方式中，为了达到期望的活性剂浓度，可以首先通过切向流过滤，然后渗滤以除去有机溶剂，然后通过额外的切向流过滤并最后用缓冲剂、溶剂或稀释剂的稀释，来浓缩经过淬火的温育物。
Mark C.Porter,Handbook of Industrial Membrane Technology(Noyes 1990),第186-87页中给出了用于过滤的方法和物质的实例。Munir Cheryan,Ultrafiltration andMicrofiltration Handbook(1998)中给出了过滤的一些方面。
活性剂的包裹
脂质体颗粒对活性剂的包裹程度通常受多个过程参数的影响。
在一些实施方式中，温育过程后脂质体颗粒对活性剂的包裹程度为50％或更高，或者60％或更高，或者70％或更高，或者80％或更高，或者90％或更高，或者95％或更高，或者96％或更高，或者97％或更高，或者98％或更高，或者99％或更高，或者基本为100％。
本发明的活性剂脂质体组合物通常包含均一尺寸的脂质体颗粒。所述脂质体粒度直径可以为约300nm或更低，或者约250nm或更低，或者约200nm或更低，或者约180nm或更低，或者约160nm或更低，或者约150nm或更低，或者约140nm或更低，或者约130nm或更低，或者约120nm或更低，或者约110nm或更低，或者约100nm或更低，或者约90nm或更低，或者约80nm或更低，或者约70nm或更低。
所述脂质体粒度的范围可以为约50nm至约500nm，或者约60nm至约400nm，或者约70nm至约300nm，或者约70nm至约200nm，或者约70nm至约160nm，或者约80nm至约160nm。
在一些变式中，所述稳定化的脂质体组合物可以包含小于约10％的在脂质体颗粒之外且未包裹的活性剂，或者小于约8％的未包裹的活性剂，或者小于约5％的未包裹的活性剂，或者小于约4％的未包裹的活性剂，或者小于约3％的未包裹的活性剂，或者小于约2％的未包裹的活性剂，或者小于约1％的未包裹的活性剂。
稳定化脂质体组合物中活性剂的包裹水平可以为约70％至约99％，或者约80％至约99％，或者约90％至约99％，或者约95％至约99％。稳定化脂质体组合物中活性剂的包裹水平可以基本为100％。
基因沉默治疗剂的有效递送
本发明整体上涉及用于递送生物活性剂和药物试剂的新型化合物和组合物及其方法和应用。本发明的化合物和组合物可用于向所选择的细胞、组织、器官或受治疗者递送治疗剂。更具体地，本发明涉及包括核酸试剂在内的治疗剂的递送，以及用于制备并使用包含肽的物质以递送生物活性剂和药物试剂的方法。
本发明提供了药物和生物学活性分子的全身和局部有效递送的多种化合物、组合物、方法和应用。可以通过利用包括肽在内的多种载体分子将活性剂高程度地荷载至脂质体中而产生有效递送。本发明的化合物和组合物可以实现活性剂的高效递送。
递送效率的一种计算是递送效率比。本文使用的递送效率比是载体分子的总质量与活性剂的质量的比。递送效率比越低，与活性剂相比的载体物质的质量越低，且潜在的不期望的毒性和副作用越低。如本文所使用的，较低的递送效率比更有利且更为人所期望。
本发明整体涉及用于核酸递送的载体和制剂的领域。用于核酸的载体包括与包括可交联和可切割肽结构在内的肽组分形成的化合物和组合物。更具体地，本发明提供了与核酸结合以形成复合物或缩合组合物的可交联肽结构和可切割肽结构。
在一些实施方式中，本发明提供了由肽和核酸形成的复合物。这些复合物包含具有肽和核酸的复合物的核心结构和具有多个肽和核酸层的核心结构。适合与核酸形成本发明的复合物的肽包括任意阳离子肽。
在一些方面，肽和核酸的复合物、缩合物或纳米颗粒可以被荷载至脂质体脂质中。本发明的脂质体制剂可以为生物活性剂和药物试剂尤其是核酸试剂提供稳定的递送系统。
在一些方面，本发明的组合物和制剂可以提供毒性降低的生物活性。
本发明还提供了在改变基因表达或活性中使用本发明的载体、肽、核酸构建体或与肽的复合物以及制剂(任选地与细胞靶向组分和其它药物制剂组分组合)的方法。
本发明提供了用于向细胞递送生物活性剂的多种载体组合物。更具体地，本发明提供了核酸试剂被缩合成小颗粒的大小为纳米级的多种载体结构。所述载体颗粒可以在递送中具有提高的稳定性，并且可有效地递送活性剂。荷载至脂质体中的载体颗粒的制剂可以提供提高的稳定性和递送效率。
本发明的新型化合物和组合物可以实现系列有利递送效率比。在一些实施方式中，本发明的组合物提供了用于RNAi诱导试剂的小于15或小于10的递送效率比。
本发明的组合物和方法可用于递送治疗剂、预防剂和诊断剂，例如核酸、多核苷酸、肽、蛋白和小分子化合物和药物。这些组合物可以包括各种直径的纳米颗粒。
本发明提供了用于细胞内和体内递送最终用作治疗剂的通常维持细胞保护作用且相对低毒的活性剂的新型化合物、组合物和制剂。本发明的化合物和组合物可用于为改变疾病状态或表型而向所选择的细胞、组织、器官或隔室内递送活性剂。
在一些方面，本发明提供了向细胞递送RNA结构以产生RNA干扰应答、反义作用或基因组表达的调节或调整的化合物、组合物和方法。
在一些变式中，本发明提供了向细胞递送DNA结构或含DNA的物质的化合物、组合物和方法。
本文使用的术语“肽核酸复合物”是指与核酸结合或复合的肽。
诱导RNAi的反义试剂的有效递送
在一些方面，本发明的组合物和方法通过提供具有高浓度或密度的活性剂分子的载体颗粒而提供了活性剂的有效递送。可以将载体颗粒荷载至脂质体中以在药物制剂中提供高浓度或密度的活性剂分子。
在某些方面，本发明的组合物和方法提供了具有多种递送效率比的RNAi诱导剂或反义试剂的制剂。本发明的用于RNAi诱导剂或反义试剂的制剂的递送效率比可以有利地为小于15，或者小于12，或者小于10，或者小于9，或者小于8，或者小于5。
在某些实施方式中，可以利用由与阳离子肽缩合的核酸试剂组成的载体颗粒实现有效递送。例如，基于与核酸试剂(例如RNAi诱导剂或反义试剂)组合的阳离子肽的电荷，所述载体颗粒可以包括其中高达6个或更多个肽结合区可以结合至活性RNA试剂的结构。
在一些变式中，在含有由荷载至脂质体中的核酸试剂(例如RNAi诱导剂或反义试剂)组成的载体颗粒的制剂中，脂质体的每个颗粒可以具有大于500或者大于1,000或者大于5,000或者大于6,000或者大于7,000或者大于8,000或者大于9,000或者大于10,000或者更多拷贝的RNAi诱导剂或反义试剂分子。
例如，在一些方面，对于N:P为2、密度为1g/cc、颗粒体积为1.26×106nm3且由MW 3781.2的肽(7个净正电荷)和MW 13,500的双链RNA(40个净负电荷)组成的球形颗粒，颗粒质量为1.26×10-9μg，且颗粒的每个双链RNA具有11.4个肽。在该实例中，递送效率比为肽质量与RNA质量的比，为3.2。由RNA表示的颗粒的质量分数为0.24，颗粒中双链RNA分子的数量为13,369，每颗粒的肽分子数为1.53×105。换句话说，含有这些载体颗粒且不含额外的载体分子的制剂递送效率比为3.2，且基于颗粒的RNAi试剂质量分数荷载为24％。
脂质体制剂
在一些方面，本发明的载体颗粒可以被荷载或包裹在脂质体制剂中。例如，在一些实施方式中，载体颗粒可以被包裹在脂质体制剂中而递送(例如美国专利申请12/114,284所公开的)。
在某些实施方式中，与没有本发明的肽载体颗粒组合物的RNA脂质体制剂相比，包裹在脂质体制剂中递送的本发明的载体颗粒的药物制剂可以将双链RNA的负载量提高20倍。
例如，在一些实施方式中，与没有本发明的肽载体颗粒组合物的RNA脂质体制剂相比，包裹在脂质体制剂中递送的本发明的载体颗粒的药物制剂可以将载体物质的量降低45％。
在一些实施方式中，用于RNA试剂的载体颗粒的药物制剂包括使用肽递送核酸的含肽的递送系统。该系统可以将可并入至脂质体制剂的RNA试剂的负载量提高。利用包含肽的纳米颗粒，递送效率以及递送系统的组织分布型式可以增强。在一些实施方式中，所述递送系统可以证明每个脂质体颗粒将RNA负载量提高高达20倍，同时将载体赋形剂的总量降低约45％。在一些变式中，例如通过ApoB的体内敲减所计算的，与没有肽的脂质体制剂相比，所述系统可以实现RNA试剂的30％的降低，同时在小鼠肝脏中和小鼠空肠中维持85％的敲减。因此，本发明的载体颗粒的药物制剂可显著提高RNA试剂(例如siRNA、mdRNA或反义试剂)的递送效率。
载体纳米颗粒
在一些实施方式中，可以按照2008年10月16日提交的美国专利申请61/106,062的描述制备本发明的载体颗粒。
本发明的载体颗粒通常为均一粒度。所述载体粒度直径可以为约300nm或更低，或者约250nm或更低，或者约200nm或更低，或者约180nm或更低，或者约160nm或更低，或者约150nm或更低，或者约140nm或更低，或者约130nm或更低，或者约120nm或更低，或者约110nm或更低，或者约100nm或更低，或者约90nm或更低，或者约80nm或更低，或者约70nm或更低。
本发明的活性剂载体颗粒的粒度的范围可以为，例如约50nm至约500nm，或者约60nm至约400nm，或者约70nm至约300nm，或者约70nm至约200nm，或者约70nm至约160nm，或者约80nm至约160nm。
在一些实施方式中，本发明的活性剂载体颗粒可以带负电荷。例如，由RNAi试剂和阳离子肽组成的载体颗粒可以被缩合从而使所述颗粒保留负电荷。
在一些实施方式中，本发明的活性剂载体颗粒可以带正电荷。例如，由RNAi试剂和阳离子肽组成的载体颗粒可以被缩合从而使所述颗粒获得正电荷。
载体和肽结合区
在一些方面，可以用通过结合至生物活性核酸组分而与所述核酸缩合的肽组分形成本发明的载体化合物和组合物，以形成纳米尺寸的颗粒。
在一些实施方式中，适合本发明的载体组合物的肽描述于2008年11月19日提交的美国专利申请61/116,258中。
在具有一个或多个结合区的肽与核酸结合时，可形成载体。
在某些变式中，肽的多于一个阳离子结合区可以与相同或不同的核酸分子结合。
本发明的可交联和可切割的肽构建体可以有利地具有多个阳离子残基，其沿着肽链分布在一个或多个结合区内。可以使用阳离子残基的数量和分布的变化而改变肽与活性剂的结合强度。
本发明的肽包括具有足以与核酸结合的正电荷的结合区和一个或多个连接子基团的阳离子肽。本发明的肽的结合区可以具有足以与核酸结合的正电荷。连接子基团可以彼此连接以将两个或更多个肽交联在单个分子内。
本发明的能够与活性核酸试剂缩合以形成载体颗粒的肽可以具有足以与核酸结合的正电荷和足以形成包含结合核酸的自交联构建体的连接子基团。
本发明提供了具有足以与核酸结合的带正电荷的残基且能够形成自交联肽的肽。
在一些实施方式中，所述生物活性剂为能够与阳离子肽结合的核酸试剂。核酸试剂可以结合1个、2个、3个、4个、5个或6个肽或更多肽，以形成复合物。可以通过核酸-肽复合物的聚合和结合而形成缩合物颗粒。
在一些实施方式中，核酸试剂可以结合具有多于一个肽的部分从而使所述肽连接多于一种核酸试剂。
可以通过混合本发明的可交联的或可切割的肽和与所述肽结合的生物活性剂而形成载体结构或构建体。所述肽与所述试剂的结合可以在发生所述肽的交联的同一时间进行，或者在所述肽被交联前或者交联后进行。
在一些方面，所述载体是交联的肽构建体，其可以为肽和核酸的缩合物。所述缩合物可以形成可以并入生物活性剂(例如核酸)的纳米尺寸的载体颗粒。
可交联的肽
在一些实施方式中，本发明的可交联的肽可以包含可交联的末端残基或基团。
例如，可交联的肽可以具有可以通过形成肽间二硫键(形成肽的二聚体)而交联的单个末端半胱氨酸残基。
在一些变式中，所述肽可以包含可以交联以形成多聚肽构建体的一个或多个巯基基团，其中所述多聚肽构建体与生物活性剂结合并且可以为生物活性剂的载体。
在一些实施方式中，可交联的基团可以形成可以在低pH下被切割或者可以被蛋白或酶作用而切割的可切割的交联。可切割的交联的实例包括化学上可切割的酸不稳定交联和酶可切割的交联。
可交联的基团的实例包括具有高达1000个原子、双功能连接子、双功能交联子和杂双功能连接子的有机基团。所述可交联的基团可以是肽残基的取代基或者可以连接至肽的末端。
在某些实施方式中，可交联的肽结构包括在各个末端具有可交联的基团的肽。在一些变式中，可交联的肽结构包括在各个末端具有可交联的基团的肽的二聚体、三聚体和多聚体。
可切割的肽
在一些方面，本发明提供了含有位于肽序列的各部分之间的内部可切割连接子基团的可切割肽。
在一些实施方式中，可切割的肽可以具有通过可切割基团连接在一起的两个阳离子结合区。所述可切割基团可以被切割以使肽的多个结合区彼此分离。
所述阳离子结合区可以与生物活性剂(例如核酸)结合。
在一些变式中，与不可切割的肽相比，所述肽的使结合区分离的连接子基团的切割可以允许肽从生物活性剂上更快速地解离。
可以通过化学还原或者通过细胞内环境中多种蛋白或酶的作用，切割在细胞内可切割的连接子。
缩合物颗粒和可释放的形式
本发明的化合物和组合物包括由一个或多个肽组分和一个或多个活性剂组成的缩合物颗粒或载体。
通常，由肽和活性剂形成的缩合物颗粒可以为阴离子、中性或阳离子。对于载体颗粒的体内递送，可以优选中性或阳性离子形式。缩合物颗粒可以指核心颗粒。
在一些实施方式中，可以用可交联肽的第一部分和活性剂形成缩合物颗粒。可以向所述颗粒中加入一个或多个额外的相同或不同可交联肽的层。
在一些变式中，可以用可切割肽的第一部分和活性剂形成缩合物颗粒。可以向所述颗粒中加入一个或多个额外的相同或不同可切割肽的层。
在某些实施方式中，可以用可切割肽的第一部分和活性剂形成缩合物颗粒。可以向所述颗粒中加入一个或多个额外的可交联肽层。
在一些变式中，可以用可交联肽的第一部分和活性剂形成缩合物颗粒。可以向所述颗粒中加入一个或多个额外的可切割肽层。
在一些实施方式中，可以用可交联或可切割肽的第一部分和活性核酸剂形成阴离子缩合物颗粒。可以向所述阴离子颗粒中加入一个或多个额外的阳离子可交联或可切割肽的层，以形成中性或阳离子载体颗粒。
在某些变式中，可以用可交联或可切割肽的第一部分和活性核酸剂形成阴离子缩合物颗粒。可以向所述阴离子颗粒中加入一个或多个额外的阳离子可交联或可切割肽的层，以形成中性或阳离子载体颗粒。可以向所述中性或阳离子载体颗粒中加入一个或多个额外的阴离子溶内体(endosomolytic)化合物的层，以形成中性或阳离子载体颗粒。
在一些方面，所述活性剂可以为一种或多种药物化合物，一种或多种反义试剂，一种或多种RNAi诱导剂，或者一种或多种含DNA的试剂。
在一些实施方式中，可以通过将缩合物颗粒或分层的载体颗粒荷载至阳离子脂质体中而制备本发明的组合物或制剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可以提供可释放形式或组合物的治疗剂的递送。可释放的形式或组合物包括结合并释放活性剂的分子、结合活性剂并卸载有助于释放该试剂的部分的分子、结合活性剂并随后在生物隔室内以有助于该试剂的释放的方式调节的分子，以及含有与释放介导化合物混合的活性剂结合的分子的组合物。
本文使用的可释放形式包括含有本发明的可交联或可切割肽的形式，或者含有溶内体化合物或物质的形式。
加合物或载体颗粒可以包含可切割的肽结构或基质。某些事件，例如载体进入含有能够切割所述肽交联的化合物的生物环境或隔室，可以触发肽结构的切割。肽连接子基团的切割可以在细胞内在胞质溶胶中或在各种细胞隔室或细胞外隔室内发生。
二硫化物肽连接子基团的切割可以通过化学发生，例如通过用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇来还原二硫化物而进行。
在某些实施方式中，可以使用二硫化物还原酶切割肽二硫化物键。
一旦在细胞内，二硫化物交联可以被还原，由此释放用于有效递送的活性剂。认为内涵体的环境是还原的且介导二硫化物的还原以及活性剂的释放。
可以通过肽交联的断裂或切割，以及通过生物活性剂从所述肽的解离而在细胞内发生释放。
本发明的肽和肽构建体可有利地包含1个、2个或更多个具有1个或多个带正电荷的氨基酸残基的结合区。所述结合区可以在链中连接，所述链中一个带正电荷的结合区通过可切割的交联可切割地连接下一个结合区。
所述阳离子区可以作为用于诸如核酸试剂的活性剂的结合区，并且数个阳离子区可以结合至同一活性剂以共同使肽与活性剂连接。
在某些实施方式中，本发明的可释放形式包括肽和核酸的缩合物颗粒，其中所述肽组分包括可以被切割以实现核酸的释放的交联。所述肽的连接子基团的切割可以由肽环境的变化而触发，例如在从细胞外运输至细胞内结构域中发生的变化，或者在细胞对内涵体的内吞或摄取和递送过程中的变化。
用于肽的可切割的连接子的实例包括酸可切割基团，例如在内吞作用过程中或者通过与溶酶体的细胞内相互作用而可被切割的腙。
在一些实施方式中，可由酸不稳定连接子产生活性剂的释放。
酸不稳定连接子的实例包括含有原酸酯基团、腙、顺式-乙酰甲基、缩醛、缩酮、甲硅烷基醚、硅氮烷、亚胺、柠檬酸酐(citriconic anhydride)、马来酸酐、冠醚、氮杂冠醚、硫杂冠醚、二硫代苯甲基基团、顺式乌头酸、顺式羧基链三烯、甲基丙烯酸及其混合物的连接子。
酸不稳定基团和连接子的实例描述在美国专利7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931中。
用于肽的可裂解连接子的实例包括组织蛋白酶可切割的连接子，例如可以被细胞内组织蛋白酶裂解的Val-Cit。用于组织蛋白酶B、D和L的底物序列的实例分别示于表1、2和3中。可切割的连接子包括组织蛋白酶B、D和L底物的二肽、三肽和四肽亚单位(P2-P2′)。
表1：组织蛋白酶B底物
表2：组织蛋白酶D底物
表3：组织蛋白酶L底物
在一些变式中，本发明可释放形式包括肽和核酸以及溶内体化合物的缩合物颗粒。在这些变式中，溶内体化合物可有助于从内涵体释放核心颗粒和活性剂至细胞中，而肽组分可以包括可以被切割以实现核酸在细胞内从核心缩合物颗粒的释放和解离的交联。
溶内体化合物的实例包括氯喹、4-氨基喹啉、氨基喹啉、阿莫地喹、细胞渗透肽、转运蛋白(Transportan)、穿透素、来自流感病毒的血凝素融合肽(见，例如，Han等，Nat.Struct.Biol.第8卷,715-720,2001)以及基于流感病毒的肽diINF7。
在某些实施方式中，载体颗粒或构建体可以与用于细胞或亚细胞递送的靶向试剂一起配制。在一些变式中，载体颗粒可以与合成聚合物(例如聚乙二醇(PEG))组合，以降低非特异作用或与血液组分的相互作用。合适的合成聚合物包括聚乙二醇链(PEG)或PEG共聚物，例如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。参见，例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992)。
使用方法
本发明包括用于向细胞递送治疗性核酸的方法，所述方法包括制备包含含有核酸试剂的载体颗粒的组合物和用所述组合物处理细胞。
本发明包括用于抑制细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备包含含有核酸试剂的载体颗粒的组合物和用所述组合物处理细胞。
本发明包括用于抑制哺乳动物基因表达的方法，所述方法包括制备包含含有核酸试剂的载体颗粒的组合物和向所述哺乳动物施用所述组合物。
本发明包括用于治疗人类疾病的方法，所述疾病选自包括类风湿关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症；所述方法包括制备脂质体组合物和向人施用所述组合物。
活性剂
在一些方面，本发明提供了用于制备适合递送治疗剂的组合物的方法。本发明的方法可以提供核酸试剂组合物，例如缩合的RNA纳米颗粒、双链或三链RNA结构、RNA肽共轭物、切丁酶底物RNA、dsRNA、siRNA、微RNA、发夹RNA和其它活性调节性RNA形式、包括反义RNA和反义DNA在内的反义治疗剂形式、以及DNA和含DNA的形式。
本发明的活性剂可以为单链或双链核酸。本发明的活性剂可以为抗原性或免疫原性蛋白或者多肽。
本发明的活性剂可以为活性剂的肽缩合物。例如，活性剂可以由通过缩合活性剂与肽或其它生物分子而形成的纳米颗粒组成，或者由活性剂与肽、生物分子或聚合分子的缩合物或复合物组成。可以交联纳米颗粒或缩合物。纳米颗粒或缩合物可以作为负载而荷载至脂质体组合物中。
本发明的活性剂可以为反义或正义DNA或RNA寡核苷酸，或者经修饰的DNA或RNA寡核苷酸，其通过多种相互作用结合靶核酸序列以阻断靶序列的转录或翻译。反义或正义试剂可以与核苷酸双螺旋形成三螺旋，或者可以为核酶，或者可以编码包括启动子序列或增强子序列在内的转录或翻译调节序列。反义或正义寡核苷酸可用于阻断蛋白的表达，并且可以具有经修饰的核苷碱基或糖基基团，或者其它基团，或者可以与生物分子、肽或蛋白共轭，用于增强稳定性或活性。可以通过本文描述的组合物和方法将反义或正义寡核苷酸递送至含有其靶核酸的细胞中。如本文所述，可以使用寡核苷酸-载体复合物或者脂质体制剂将反义或正义寡核苷酸递送至含有其靶核酸的细胞中。
可交联和可切割的肽
本发明的可交联的肽包括具有式I所示结构的可交联肽：
A-B式I
其中，A为2至约16个氨基酸残基的肽，其可以含有阳离子结合区，B为可交联的基团，其中A在pH7下含有一个或多个带正电荷的残基。
B的实例包括半胱氨酸。
B的其它实例包括具有高达1000个原子、双功能连接子、双功能交联子和杂双功能连接子、氨基甲酸酯和酯的有机基团。
A的实例包括阳离子肽。
A的实例包括具有式II所示结构的阳离子肽：
(Xaa1)m-(Xaa2)n-(Xaa3)o-(Xaa4)p  式II
其中Xaa为氨基酸残基，各Xaa1、Xaa2、Xaa3和Xaa4均为独立选择的相同或不同的氨基酸残基，各m、n、o和p均为0至4，只要m、n、o和p之和为2或更高，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3和Xaa4中的一个或多个是在pH7下带正电荷的残基。
可以制备阳离子肽，其中例如A的残基具有碱性侧链。具有碱性侧链的氨基酸的实例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(侧链–(CH2)4NH(C＝NH)NH2)、正精氨酸(正Arg)(侧链–(CH2)2NH(C＝NH)NH2)、正-正精氨酸(正正Arg)(侧链-(CH2)NH(C＝NH)NH2)、鸟氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸及其侧链经修饰的衍生物。
本文使用的术语“高”，当指氨基酸时，表示额外的碳被加入至侧链，术语“正”，当指氨基酸时，表示从侧链减去碳。因此，高赖氨酸表示侧链–(CH2)5NH2。
还可以制备其中残基的侧链含有可电离基因或取代基的阳离子肽。
在一些实施方式中，所示阳离子残基为NG-甲基精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二甲基精氨酸、NG-甲基-高精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二甲基-高精氨酸、NG-甲基-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二甲基-正精氨酸或NG-甲基-正-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二甲基-正-正精氨酸.
在一些实施方式中，所示阳离子残基为NG-乙基精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二乙基精氨酸、NG-乙基-高精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二乙基-高精氨酸、NG-乙基-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二乙基-正精氨酸或者NG-乙基-正-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二乙基-正-正精氨酸。
在某些实施方式中，所示阳离子残基为NG-烷基精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二烷基精氨酸、NG-烷基-高精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二烷基-高精氨酸、NG-烷基-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二烷基-正精氨酸或者NG-烷基-正-正精氨酸、对称或不对称的NG,NG-二烷基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，所示阳离子残基为含胍或含脒的侧链的氨基酸。例如，Xaa残基的侧链可以包含诸如胍基、脒基、二氢咪唑、4-胍基-苯基、4-脒基-苯基、N-脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4,5-二氢咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷基或4-[(2-氨基嘧啶基)]乙基的基团。
阳离子残基的实例可以具有包括以下结构及其盐形式的侧链：
本发明的可切割的肽包括式I所示结构的二聚体的肽，例如二聚体A-B-B-A，其中连接子基团B能够彼此连接，并且其中-B-B-连接是可以切割的。
例如二聚体A-B-B-A可以为A-B-(S-S)-B-A，其中(S-S)为二硫键。
-B-B-连接的其它实例包括具有高达1000原子的有机基团、由双功能连接子形成的连接、由双功能交联子形成的连接和由杂双功能连接子形成的连接、肼连接子、氨基甲酸酯连接和酯连接。
本发明的可交联的肽包括具有式II所示结构的可交联肽：
B-A-B式II
其中，A为2至约16个氨基酸残基的肽，B为以上定义的可交联基团，其中A在pH7下含有一个或多个带正电荷的残基。
B的实例包括半胱氨酸。
A的实例包括阳离子肽。
本发明的可切割的肽包括式II所示结构的二聚体、三聚体或多聚体，例如二聚体B-A-B-B-A-B和多聚体–(B-A-B)n-，其中连接子基团B能够彼此连接，并且其中-B-B-连接是可以切割的。这些可切割肽中的一些由于其在各个末端保留了可交联基团而保持可交联。
适合制备本发明的肽的阳离子结合区的实例示于表4。本发明的可交联的肽可以具有在图4所示的肽的N-末端或C-末端连接有半胱氨酸的表4所示的结合区。本发明的可交联肽可以形成二聚体。
表4：用于制备肽的结合区
SEQ ID NO: 结合区
195 GRKKRRQRRRPPQ
196 KKKRKV
197 KKKRKVKKKRKV
198 GRKKRR
199 RRRPPQ
200 WKKKK
201 RRRPPQH
202 KKRRQH
203 RRR
204 RRRR
205 RRRRR
206 KKK
207 RRRRWW
208 RRRWW
209 RRWW
210 KKWW
211 KKKWW
212 WHHRRKK
213 RRKKHHWW
214 KKRRW
215 KKRRHW
216 KKRRHHW
SEQ ID NO: 结合区
217 KKRRQ
218 KKRRQ
219 GRKKRRQ
220 QGRKKRR
221 RRH
222 RRRH
223 RRRRH
224 RRRRRH
225 KKH
226 KKKH
227 HWKKRR
228 HWKKRR
229 PPHRRR
230 PPHRRR
231 GRKKRRVRRRPPQ
232 WWHHKKRRGGRRKKHHWW
233 WWHHKKRR
234 YYHHKKRR
235 RRKKHHYY
236 VQAAIDYING
237 WWRRHH
238 HHRRWW
239 YYRRHH
240 HHRRYY
241 WWRRR
242 RRRWW
243 YYRRR
244 RRRYY
245 WWRRRHH
SEQ ID NO: 结合区
246 HHRRRWW
247 YYRRRHH
248 HHRRRYY
249 WWRRRR
250 RRRRWW
251 YYRRRR
252 RRRRYY
253 WWRRRRHH
254 HHRRRRWW
255 YYRRRRHH
256 HHRRRRYY
257 WWHH-Orn-Orn-RR
258 WWHHHRRR
259 WWHHHRRR
260 WWWHHHHRRR
261 WWWKKRRR
262 KKKWRRW
263 WRRRWRR
264 WWHHKKRR
265 WWCHHKKCRR
266 WWHHHRRR
267 WWHHCKKRR
268 WWHHKKCRR
269 RRWWKKHH
270 WWHHKKKK
271 WWHHRRRR
272 RRRRHH
273 HHKKKK
SEQ ID NO: 结合区
274 HHRRRR
275 YYRRRRHH
276 YYKKKKHH
本发明的可切割肽的实例示于表5。
表5：可切割的肽
SEQ ID NO: 肽
277 GRKKRRV-Cit-RRRPPQ
278 GRKKRRV-Cit-RRKKRG
279 RRRPPQV-Cit-PPRRR
280 RRKKRGV-Cit-GRKKRR
281 QPPRRRV-Cit-RRRPPQ
282 WKKKKV-Cit-KKKKW
283 KKKKWV-Cit-WKKKK
284 HQPPRRRV-Cit-RRRPPQH
285 QPPRRRV-Cit-RRRPPQ
286 HQRRKKV-Cit-KKRRQH
287 RRV-Cit-RR
288 RRRV-Cit-RRR
289 RRRRV-Cit-RRRR
290 RRRRRV-Cit-RRRRR
291 KKV-Cit-KK
292 KKKV-Cit-KKK
293 KKKKV-Cit-KKKK
294 KKKKKV-Cit-KKKKK
295 WWRRRRV-Cit-RRRRWW
296 WWRRRV-Cit-RRRWW
297 WWRRV-Cit-RRWW
SEQ ID NO: 肽
298 WWKKV-Cit-KKWW
299 WWKKKV-Cit-KKKWW
300 WWKKKKV-Cit-KKKKWW
301 KKRRHHWV-Cit-WHHRRKK
302 WWHHKKRRV-Cit-RRKKHHWW
303 WRRKKV-Cit-KKRRW
304 WHRRKKV-Cit-KKRRHW
305 WHHRRKKV-Cit-KKRRHHW
306 QRRKKV-Cit-KKRRQ
307 KKRRQV-Cit-QRRKK
308 RRKKRGV-Cit-GRKKRR
309 GRKKRRV-Cit-RRKKRG
310 QRRKKRGV-Cit-GRKKRRQ
311 QGRKKRRV-Cit-RRKKRGQ
312 HRRV-Cit-RRH
313 HRRRV-Cit-RRRH
314 HRRRRV-Cit-RRRRH
315 HRRRRRV-Cit-RRRRRH
316 HKKV-Cit-KKH
317 HKKKV-Cit-KKKH
318 HKKKKV-Cit-KKKKH
319 HKKKKKV-Cit-KKKKKH
320 HWKKRRV-Cit-RRKKWH
321 RRKKWHV-Cit-HWKKRR
322 PPHRRRV-Cit-RRRHPP
323 RRRHPPV-Cit-PPHRRR
324 YYHHKKRRC-二硫键-CRRKKHHYY
325 YYHHKKRRV-Cit-RRKKHHYY
SEQ ID NO: 肽
326 WWRRC-二硫键-CRRWW
327 WWRRV-Cit-RRWW
328 YYRRC-二硫键-CRRYY
329 YYRRV-Cit-RRYY
330 WWRRHHC-二硫键-CHHRRWW
331 WWRRHHV-Cit-HHRRWW
332 YYRRHHC-二硫键-CRRHHYY
333 YYRRHHV-Cit-RRHHYY
334 WWRRRC-二硫键-CRRRWW
335 WWRRRV-Cit-RRRWW
336 YYRRRC-二硫键-CRRRYY
337 YYRRRV-Cit-RRRYY
338 WWRRRHHC-二硫键-CHHRRRWW
339 WWRRRHHV-Cit-HHRRRWW
340 YYRRRHHC-二硫键-CRRRHHYY
341 YYRRRHHV-Cit-RRRHHYY
342 WWRRRRC-二硫键-CRRRRWW
343 WWRRRRV-Cit-RRRRWW
344 YYRRRRC-二硫键-CRRRRYY
345 YYRRRRV-Cit-RRRRYY
346 WWRRRRHHC-二硫键-CHHRRRRWW
347 WWRRRRHHV-Cit-HHRRRRWW
348 YYRRRRHHC-二硫键-CRRRRHHYY
349 YYRRRRHHV-Cit-RRRRHHYY
350 WWHHKKRRWV-Cit-WRRKKHHWW
351 WWHH-Orn-Orn-RRV-Cit-RR-Orn-Orn-HHWW
352 WWHHC-二硫键-CKKRR
本文使用的氨基酸名称和命名是指相应氨基酸的任意立体异构体。
在表5中，在肽序列内部的基团可以提供切割位点。例如，内部切割位点可以为二硫键或Val-Cit连接。
如美国专利公开20080166363中描述的，可切割的连接的实例包括Phe-Lys、Val-Cit、Ala-Leu、Leu-Ala-Leu和Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:376)。
给药途径
本发明的活性剂组合物可以用在药物组合物中。向受治疗者施用本发明的脂质体制剂可以通过肠胃外、口服、通过吸入、局部、粘膜、直肠或经口颊。肠胃外应用包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、干内(intrastemal)、鞘内、病灶内、颅内注射或输注技术。
有效量
用于治疗特定疾病的本发明活性剂组合物的有效量通常是足以改善或减轻疾病症状的量。本发明的活性剂组合物的有效量可以为足以引起由所述试剂产生的任何生物作用的量。所述组合物可以作为单剂量施用，或者可以通过重复给药而施用。
DILA2氨基酸脂质体形成化合物
本发明的脂质体组合物可以包括US 2008-0317839A1中公开的一种或多种DILA2氨基酸化合物。
DILA2氨基酸化合物是可以在某种条件下形成脂质体结构的合成有机化合物。可以通过在氨基酸的N-末端或C-末端或者两端用递送增强尾或亲脂性尾取代，形成DILA2氨基酸化合物。在一些实施方式中，氨基酸核心可以包括一个或多个氨基酸，或者可以为2至20个氨基酸残基的肽。
DILA2氨基酸化合物可以为阳离子的或非阳离子的，其中非阳离子包括中性或阴离子。除非另有指明，否则本文使用的物质的生理状态或离子性是指pH约为7的环境。
在一些方面，DILA2氨基酸化合物可以以可释放的形式提供治疗剂的递送。可释放的形式和组合物经设计以足以产生细胞对试剂的摄取，从而提供治疗作用。
可释放的形式包括结合并释放活性剂的DILA2氨基酸化合物。在一些实施方式中，可以由酸不稳定连接子提供活性剂的释放。
酸不稳定连接子的实例包括含有原酸酯基团、腙、顺式-乙酰甲基、缩醛、缩酮、甲硅烷基醚、硅氮烷、亚胺、柠檬酸酐、马来酸酐、冠醚、氮杂冠醚、硫杂冠醚、二硫代苯甲基基团、顺式乌头酸、顺式羧基链三烯、甲基丙烯酸及其混合物的连接子。
酸不稳定基团和连接子的实例见于美国专利7,098,032、6,897,196、6,426,086、7,138,382、5,563,250和5,505,931。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括结合活性剂且能将有助于该试剂释放的部分放出的分子。在一些实施方式中，DILA2氨基酸化合物可以包括释放小分子(如帮助递送试剂至细胞的乙醇)的基团。DILA2氨基酸化合物可以结合活性剂，且随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输，在酸性环境中水解以释放帮助递送试剂的乙醇。在一些实施方式中，小分子(如帮助递送试剂的乙醇)可以结合到亲脂性组分。
在一些实施方式中，DILA2氨基酸化合物可以与释放小分子(如帮助递送试剂至细胞的乙醇)的化合物混合。
本发明的化合物和组合物的可释放形式包括DILA2氨基酸化合物，其可以结合活性剂，随后与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输，在酸性环境中调节成阳离子形式从而帮助释放试剂。
在一些实施方式中，DILA2氨基酸化合物可以结合活性剂，且可以与在酸性环境中可被调节成阳离子形式从而帮助释放活性剂的化合物混合。
可水解和可调节的基团实例在美国专利号6,849,272；6,200,599；以及G.Gregoriadis(编辑),Liposome Technology,第3版(CRC Press 2006)的Z.H.Huang和F.C.Szoka,“Bioresponsive liposomes and their use for macromolecular delivery,”中给出。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合活性剂的DILA2氨基酸化合物，且可以与在酸性环境中能调节为中性形式从而帮助释放活性剂的脂质或化合物混合。可以随后进入酸性环境以与细胞接触，或随后在具有低于生理pH的局部pH的生物隔室内运输。
可从阴离子调节至中性形式的化合物的实例包括胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)，如美国专利号6,897,196、6,426,086和7,108,863中所述。在一些实例中，如Cullis,1463Biochimica et Biophysica Acta 107-14(2000)中的描述，CHEMS显示pH敏感的多态性。
在一些实施方式中，本发明的化合物和组合物的可释放形式包括能结合活性剂的DILA2氨基酸化合物，其可与pH敏感性聚合材料混合。
pH敏感性聚合材料的实例在美国专利号6,835,393中给出。
在一些实施方式中，活性剂的释放可以通过酶可裂解肽来提供。
在一些方面中，本发明提供了如式I所示的一系列的DILA2氨基酸化合物及其盐：
R3-(C＝O)-Xaa-Z-R4  式I
其中
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸残基，或2至20个氨基酸残基的肽，其中
R1是非氢，取代或未取代的氨基酸侧链；
R2是氢或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1至20个碳原子的有机基团或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基或羟基；
RN是氢或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1至20个碳原子的有机基团或C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(3-5)烯基、C(3-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯-C(1-5)烷基、羧基或羟基；
R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾或下文描述的任一脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾或下文描述的任一脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1至40个原子组成的有机连接子。
在一些实施方式中，R3独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基；R4独立地是取代或未取代的C(6-22)烷基或C(6-22)烯基。
残基Xaa可以是D-或L-立构中心。
在一些实施方式中，R1是非氢取代或未取代的氨基酸侧链，其中侧链取代基是由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1至40个原子组成的有机基团。
在一些实施方式中，Z是烷基或有机连接子合成聚合物，如聚乙二醇链(PEG)，或PEG共聚物，如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯。参见如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992)。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸化合物，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
R4是衍生自天然存在的或合成的磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂的亲脂性尾；或取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；或任意其它的天然存在的或合成的脂质的亲脂性尾，或下文描述的任一脂质的亲脂性尾，而且可以包括类固醇；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1至40个原子组成的有机连接子。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸化合物，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是NH、O、S、-CH2S-、-CH2S(O)-或由选自氢、碳、氧、氮和硫原子的1至40个原子组成的有机连接子。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸化合物，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意的D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是NH。
在一些实施方式中，本发明提供了如上式I所示的一系列DILA2氨基酸化合物，其中：
Xaa是具有通式-NRN-CR1R2-(C＝O)-的任意的D-或L-氨基酸，其中
R1是非氢取代或未取代的氨基酸的碱性侧链；
R2是氢，或C(1-5)烷基，
RN是氢，或C(1-5)烷基，
R3是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
R4是取代或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)烷氧基-C(3-22)烷基；
Z是O。
可以制备阳离子DILA2氨基酸化合物，其中例如Xaa具有碱性侧链。具有碱性侧链的氨基酸实例包括精氨酸(Arg)、高精氨酸(高Arg)(侧链-(CH2)4NH(C＝NH)NH2)、正精氨酸(正Arg)(侧链-(CH2)2NH(C＝NH)NH2)、正-正精氨酸(正正Arg)(侧链-(CH2)NH(C＝NH)NH2)、鸟氨酸、赖氨酸、高赖氨酸、组氨酸、1-甲基组氨酸、吡啶基丙氨酸(Pal)、天冬酰胺、N-乙基天冬酰胺、谷氨酰胺和4-氨基苯丙氨酸和它们的侧链经修饰的衍生物。
在本文中，术语“高”，当指氨基酸时，是指额外的碳添加到侧链，而术语“正”，当指氨基酸时，是指碳从侧链减去。因此，高赖氨酸是指侧链-(CH2)5NH2。
可以制备阴离子DILA2氨基酸化合物，其中例如Xaa是谷氨酸或天冬氨酸。
还可以制备阳离子和阴离子DILA2氨基酸化合物，其中氨基酸侧链含有电离基团或取代基。
可以制备非阳离子DILA2氨基酸化合物，其中例如Xaa是亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-甲基精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二甲基精氨酸、NG-甲基-高精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二甲基-高精氨酸、NG-甲基-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二甲基-正精氨酸或NG-甲基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二甲基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-乙基精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二乙基精氨酸、NG-乙基-高精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二乙基-高精氨酸、NG-乙基-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二乙基-正精氨酸或NG-乙基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二乙基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是NG-烷基精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二烷基精氨酸、NG-烷基-高精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二烷基-高精氨酸、NG-烷基-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二烷基-正精氨酸或NG-烷基-正-正精氨酸、对称的或不对称的NG,NG-二烷基-正-正精氨酸。
在一些实施方式中，Xaa是含胍或含脒侧链的氨基酸。例如，Xaa残基的侧链可以包括如胍基、脒基、二氢咪唑、4-胍基-苯基、4-脒基-苯基、N-脒基-哌啶、N-脒基-哌嗪、4,5-二氢咪唑、2-(N-脒基)-吡咯烷基或4-[(2-氨基嘧啶基)]乙基的基团。
Xaa侧链的实例包括以下结构，及其盐的形式：
适合可释放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代侧链的实例包括pKa为约5至约7.5或约6至约7的释放官能团。通常，弱碱的释放官能团在局部pH高于pKa时可以表现出显著的中性形式，且在局部pH低于pKa时可以表现出显著的离子形式。弱酸的释放官能团在局部pH高于pKa时可以表现出离子形式，且在局部pH低于pKa时可以表现出中性形式。参见，如P.Heinrich Stahl,Handbook of Pharmaceutical Salts,(2002)。
在一些实施方式中，Xaa可以具有含pKa为5至7.5的官能团的侧链。
适合可释放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代侧链的实例包括1-甲基组氨酸。
适合可释放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代侧链的实例包括3,5-二碘酪氨酸。
适合可释放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸的取代侧链的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括结构：
适合可释放形式的DILA2氨基酸化合物的氨基酸侧链上的取代基实例包括衍生自下述的可释放官能团：3,5-二碘-酪氨酸、1-甲基组氨酸、2-甲基丁酸、2-邻-茴香基丙酸、内消旋-酒石酸、4,6-二甲基嘧啶胺、对苯二甲酸、肌酸酐、丁酸、N,N-二甲基-1-萘胺、戊酸、4-甲基戊酸、N-甲基苯胺、1,10-邻二氮杂菲、3-吡啶羧酸、己酸、丙酸、4-氨基苯甲酸、2-甲基丙酸、庚酸、辛酸、环己烷羧酸、喹啉、3-氨基喹啉、2-氨基苯甲酸、4-吡啶羧酸、壬酸、三聚氰胺、8-羟基喹啉、三甲基乙酸、6-甲氧基喹啉、4-(甲基氨基)苯甲酸、对甲基苯胺、3-(甲基氨基)苯甲酸、苹果酸、N-乙基苯胺、2-苯甲基吡啶、3,6-二硝基苯酚、N,N-二甲基苯胺、2,5-二甲基哌嗪、对氨基苯乙醚、5-甲基喹啉、2-苯基苯并咪唑、吡啶、吡啶甲酸、3,5-二碘酪氨酸，对茴香胺、2-(甲基氨基)苯甲酸、2-氨基噻唑、戊二酸、己二酸、异喹啉、衣康酸、邻苯二甲酸、苯并咪唑、哌嗪、庚二酸、吖啶、菲啶、琥珀酸、甲基丁二酸、4-甲基喹啉、3-甲基吡啶、7-羟基异喹啉、丙二酸、甲基丙二酸、2-甲基喹啉、2-乙基吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、组胺、组氨酸、马来酸、顺式-1,2-环己烷二胺、3,5-二甲基吡啶、2-乙基苯并咪唑、2-甲基苯并咪唑、卡可基酸、呸啶(Perimidine)、柠檬酸、异柠檬酸、2,5-二甲基吡啶、罂粟碱、6-羟基-4-甲基蝶啶、L-甲状腺素、3,4-二甲基吡啶、甲氧基吡啶、反式-1,2-环己烷二胺、2,5-吡啶二胺、l-1-甲基组氨酸、l-3-甲基组氨酸、2,3-二甲基吡啶、黄蝶呤、1,2-丙烷二胺、N,N-二乙基苯胺、阿脲酸、2,6-二甲基吡啶、L-肌肽、2-氨基吡啶、N-b-丙氨酰组氨酸、毛果芸香碱、1-甲基咪唑、1H-咪唑、2,4-二甲基吡啶、4-硝基苯酚、2-硝基苯酚、酪氨酰胺、5-羟基喹唑啉、1,1-环丙烷二羧酸、2,4,6-三甲基吡啶、佛罗那、2,3-二氯苯酚、1,2-乙二胺、1-氨基异喹啉和它们的组合物。
在一些实施方式中，对应式I的一系列DILA2氨基酸化合物的结构如下：
其中R1、R2、RN、R3和R4如上定义。
在一些实施方式中，R3和R4是独立选择的亲脂性尾，其赋予充分的亲脂特性或亲脂性，如被水/辛醇分隔开，从而递送通过膜或被细胞摄取。当用于DILA2氨基酸化合物中时，这些尾提供两性分子。亲脂性尾尤其可以衍生自磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂等，且可以包括类固醇。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是具有甘油骨架的亲脂性尾。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基或C22烷基。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地为具有下述结构之一的亲脂性尾：
在上述结构中，X代表直接连接到氨基酸残基端的尾原子，且以数字指示记作其一原子，例如“18:3”。在一些实施方式中，X可以是碳、氮或氧原子。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地是具有下述结构之一的亲脂性尾：
其中X如上定义。
在一些实施方式中，R3和R4是独立选择的亲脂性尾，其可以包括胆固醇、固醇或类固醇，如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、柳珊瑚甾烷(gorgostane)、羊毛甾烷、环波罗烷、以及前述的任何固醇或动物甾醇衍生物和它们的生物中间体和前体，可以包括如胆固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇它们的混合物和衍生物。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地衍生自脂肪酸样尾，如衍生自肉豆蔻酸(C14:0)烯基、棕榈酸(C16:0)烯基、硬脂酸(C18:0)烯基、油酸(C18:1，双键在碳9)烯基、亚油酸(C18:2，碳双键在碳9或12)烯基、亚麻酸(C18:3，双键在碳9、12或15)烯基、花生四烯酸(C20:4，双键在碳5、8、11或14)烯基和二十碳五烯酸(C20:5，双键在碳5、8、11、14或17)烯基的尾。其它的脂肪酸样尾的实例参见Donald Voet和Judith Voet,Biochemistry,第3版(2005),第383页。
在一些实施方式中，R3和R4可以独立地衍生自类异戊二烯。
在本文中，术语“氨基酸”包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。因此DILA2氨基酸化合物可以由遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的氨基酸或合成氨基酸制得。
氨基酸的实例包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
氨基酸的实例包括吖丁啶、2-氨基十八烷酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、2,3-二氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2,3-二氨基丁酸、2,4-二氨基丁酸、2-氨基异丁酸、4-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,2′-二氨基庚二酸、6-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、锁链素、鸟氨酸、瓜氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-乙基甘氨酸、环己基甘氨酸、4-氧代-环己基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、环己基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-氯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-卤代苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、2-噻吩基丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、正精氨酸、正-正精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、4-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、正缬氨酸、O-烯丙基-丝氨酸、O-烯丙基-苏氨酸、α-氨基己酸、α-氨基戊酸和焦谷氨酸。
在本文中，术语“氨基酸”包括α-和β-氨基酸。
其它氨基酸残基可参见Fasman,CRC Practical Handbook of Biochemistry andMolecular Biology,CRC Press,Inc.(1989)。
通常，化合物可以包括一种或多种手性中心。含一种或多种手性中心的化合物可以包括被称为“异构体”、“立体异构体”、“非对映异构体”、“对映异构体”、“光学异构体”或“外消旋混合物”的那些。立体化学命名公约，例如Cahn,Ingold和Prelog的立体异构体命名法，以及确定立体化学和分离立体异构体的方法是本领域已知的。参见，例如Michael B.Smith和Jerry March,March’s Advanced Organic Chemistry,第5版,2001。本发明的化合物和结构意欲包括所有可能的异构体、立体异构体、非对映异构体、对映异构体和/或光学异构体，其应理解为以指定化合物或结构，包括其任何混合物、消旋体或其它形式存在。
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-Arg-NH-R4，其中Arg是D-或L-精氨酸，且R3和R4独立地是烷基或烯基。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-正Arg-NH-R4，其中正Arg是D-或L-正精氨酸，且R3和R4独立地是烷基或烯基。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-正正Arg-NH-R4，其中正正Arg是D-或L-正-正精氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-高Arg-NH-R4，其中高Arg是D-或L-高精氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-4-吡啶基丙氨酸-NH-R4，其中吡啶基丙氨酸是D-或L-吡啶基丙氨酸，且R3和R4独立地是烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基和十一烷基。DILA2氨基酸化合物R3-(C＝O)-吡啶基丙氨酸-NH-R4的实例包括药学上可接受的吡啶盐，如4-[N-甲基吡啶基]丙氨酸氯化物。吡啶基丙氨酸DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-Lys-NH-R4，其中R3和R4独立地是烷基或烯基。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-His-NH-R4，其中R3和R4独立地是烷基或烯基。HisDILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-Xaa-O-R4，其中R3是烷基且R4是鞘氨基醇。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括R3-(C＝O)-Xaa-NH-R4，其中R3和R4是烷基或烯基。DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物的实例包括(C10酰基)-Arg-NH-(C10烷基)(SEQ ID NO:11)、(C12酰基)-Arg-NH-(C12烷基)(SEQ ID NO:11)、(C14酰基)-Arg-NH-(C14烷基)(SEQ ID NO:11)、(C16酰基)-Arg-NH-(C16烷基)(SEQ ID NO:11)、(C18酰基)-Arg-NH-(C18烷基)(SEQID NO:11)、(C10酰基)-高Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-高Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-高Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-正-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-正正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-正正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-4-Pal-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C16烷基)和(C18酰基)-4-Pal(Me)-NH-(C18烷基)。
通常，名称“C14-正Arg-C14”例如是指(C13烷基)-(C＝O)-正Arg-NH-(C14烷基)，其等同于(C14酰基)-正Arg-NH-(C14烷基)。
DILA2氨基酸化合物的实例包括(C10酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-Arg-L-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-高Arg-L-高Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正Arg-L-正Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-D-正-正Arg-L-正正Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-D-正正Arg-L-正正Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-D-正-正Arg-L-正-正Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-D-正-正Arg-L-正-正Arg-NH-(C18烷基)。
DILA2氨基酸化合物的实例包括(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Arg-NH-(C18烷基)。
DILA2氨基酸化合物的实例包括(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-His-Asp-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-His-Asp-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-His-Asp-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-His-Asp-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-His-Asp-NH-(C18烷基)。
DILA2氨基酸化合物的实例包括(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)、(C10酰基)-Pal-Arg-NH-(C10烷基)、(C12酰基)-Pal-Arg-NH-(C12烷基)、(C14酰基)-Pal-Arg-NH-(C14烷基)、(C16酰基)-Pal-Arg-NH-(C16烷基)、(C18酰基)-Pal-Arg-NH-(C18烷基)。
可以将DILA2氨基酸化合物制备成聚合体或多聚体，如二聚体、三聚体或四聚体。聚合体或多聚体可以制备自一种或多于一种的DILA2氨基酸化合物。在一些实施方式中，聚合体或多聚体DILA2氨基酸化合物可以通过在氨基酸侧链上提供巯基或其它可交联基团或使用连接的或系锁的(tethered)氨基酸结构(如锁链素或瓜氨酸)来制备。在其它的实施方式中，聚合体或多聚体DILA2氨基酸化合物可以用生物共轭连接子化学方法来制备。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
DILA2氨基酸化合物可以制备成具有共价连接到氨基酸侧链的肽或聚合物链的共轭物。肽或聚合物链可以利用氨基酸侧链反应基团来连接，例如分别利用半胱氨酸或蛋氨酸的硫醇或甲基硫醇基团，或丝氨酸的醇基，或赖氨酸的氨基。肽或聚合物链可以利用取代或修饰的氨基酸侧链的任何反应基团来连接。各种连接子基团，如NHS、马来酰亚胺基和生物共轭技术和连接子都可以使用。
DILA2氨基酸化合物可以制备成连接寡聚或聚合框架的构建体。例如，DILA2氨基酸化合物可以与聚乙二醇、聚丙二醇、寡核苷酸网状物或网格、聚(氨基酸)、碳水化合物、葡聚糖、水凝胶或淀粉连接。
DILA2氨基酸化合物可以制备成连接药物化合物或组合物或生物活性剂的构建体。例如，DILA2氨基酸化合物可以与核酸药物如调节性或干扰性RNA连接。
DILA2氨基酸化合物的实例包括以下结构：
其中R是任意的氨基酸侧链。
本发明的化合物和组合物可以引入包括聚合体结构的增溶或官能化基团或结构。参见，如.R.L.Dunn和R.M.Ottenbrite,Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems,ACSSymp.Ser.469(1991)。可以对DILA2氨基酸化合物进行衍生化以便提高溶解性，例如连接二醇，制备季铵或带电基团，连接羟基或胺基如醇、多元醇或聚醚，或连接聚乙烯亚胺、聚乙二醇或聚丙二醇。连接的聚合体组分如聚乙二醇的分子量可以是任何值，例如200、300、400、500、750、1000、1250、1500、2000、3000、4000、5000、7500、10,000、15,000、20,000、25,000或30,000Da或更大。例如，聚乙二醇链可以通过氨基酸侧链的氨基或其它反应基团来连接。
通常，在本文中，除非另外说明，常规的化学术语是指指定类型的所有基团，包括具有任何数量和类型的原子的基团。例如“烯基”广义上是指具有如下文定义的2至22个碳原子的烷基，其中(C18:1)烯基是指具有18个碳原子和1个双键的烯基。
在本文中，术语“烷基”是指饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的含有1至22个碳原子的脂肪族基团。这些定义可以应用于其它基团的烷基部分，例如烷氧基、烷酰基、芳烷基和下文定义的其它基团。在本文中，术语“环烷基”是指饱和的，取代或未取代的含3至12个碳原子的环烷基环。
在本文中，术语“烯基”是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2至22个碳原子和至少1个碳碳双键的烷基或环烷基。在本文中，术语“炔基”是指不饱和的，支链的或无支链的，取代或未取代的具有2至22个碳原子和至少1个碳碳三键的烷基或环烷基。
在本文中，术语“烷氧基”是指共价键合氧原子的烷基、环烷基、烯基或炔基。在本文中，术语“烷酰基”是指-C(＝O)-烷基，其还可称作“酰基”。在本文中，术语“烷酰氧基”是指-O-C(＝O)-烷基。在本文中，术语“烷基氨基”是指基团-NRR’，其中R和R’各自是氢或烷基，且至少R和R’之一是烷基。烷基氨基包括如哌啶基的基团，其中R和R’形成环。术语“烷基氨基烷基”是指-烷基-NRR’。
在本文中，术语“芳基”是指各环中有4至12个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环系统，其中至少一个环是芳香族。芳基的一些实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯。其中芳基取代基是双环，且一个环是非芳香族，应该理解连接的是芳环。芳基可以是取代或未取代的。
在本文中，术语“杂芳基”是指任何稳定的各环有4至12个原子的单环的、双环的或多环的碳环系统，其中至少一个环是芳香族，且含有1至4个选自氧、氮和硫的杂原子。杂芳基的一些实例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基和四氢喹啉基。杂芳基包括含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
在本文中，术语“杂环”或“杂环基”是指5至22个原子的芳香族或非芳香族环系统，其中1至4个环原子是选自氧、氮和硫的杂原子。因此，杂环可以是杂芳基或其二氢或四氢形式。
在本文中，术语“芳酰基”是指衍生自芳香羧酸的芳基基团，如取代的苯甲酸。术语“芳烷基”在本文中是指键合烷基的芳基，例如苯基。
在本文中，术语“羧基”表示式-C(＝O)OH或-C(＝O)Oˉ的基团。术语“羰基”和“酰基”在本文中是指氧原子与碳原子以双键键合的基团>C＝O。在本文中，术语“羟基”是指-OH或-Oˉ。在本文中，术语“腈”或“氰基”是指-CN。术语“卤素”或“卤代”是指氟代(-F)、氯代(-Cl)、溴代(-Br)和碘代(-I)。
在本文中，术语“取代的”是指原子具有一个或多个取代或取代基，其可以相同或不同，且可以包括氢取代基。因此，术语烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基和芳烷基在本文中是指包括取代的变体的基团。取代的变体包括线性的、分支的和环状变体，和具有代替一个或多个连接到该基团上任意碳原子的氢的取代基的基团。可连接到基团上碳原子的取代基包括烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基、芳烷基、酰基、羟基、氰基、卤代、卤代烷基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳氧基，芳氧基烷基、巯基、硝基、氨基甲酰基、氨基甲酰基和杂环。例如，术语乙基包括但不限于：-CH2CH3、-CHFCH3、-CF2CH3、-CHFCH2F、-CHFCHF2、-CHFCF3、-CF2CH2F、-CF2CHF2、-CF2CF3和如上所述的其它变体。通常，取代基可以进一步被任何原子或原子基团取代。
DILA2氨基酸化合物可以通过本领域已知的方法来合成。
制备各种有机基团和保护基团的方法是本领域已知的，且通常其应用和修饰也在本领域技术人员的能力范围内。参见如Stanley R.Sandler和Wolf Karo,Organic FunctionalGroup Preparations(1989)；Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(1996)；Leroy G.Wade,Compendium Of Organic Synthetic Methods(1980)；保护基团的实例见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups In Organic Synthesis(第3版，1991)。
例如，可以根据以下路线合成DILA2氨基酸化合物PONA：
具有足够碱性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是与例如无机酸或有机酸的酸加成盐，所述无机酸或有机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氯磺酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、醋酸、丙酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸或酒石酸，和烷烃磺酸或芳烃磺酸，如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氯苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸和樟脑磺酸。
具有足够酸性的本发明的肽或蛋白组合物的药学上可接受的盐可以是碱金属盐，例如钠或钾盐，或碱土金属盐，例如钙或镁盐，或锌或锰盐，或铵盐，或可提供生理学上可接受阳离子的有机碱的盐，例如甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟基乙基)胺的盐，且包括氨基酸如精氨酸的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐。参见如Berge等，J.Pharm.Sci.66:1-19,1977。
包含干扰RNA制剂和DILA2氨基酸化合物、脂质、肽或蛋白的本发明组合物的盐或药学上可接受的盐还可以包含干扰RNA试剂和DILA2氨基酸化合物、脂质、肽或蛋白的盐复合物。干扰RNA试剂和DILA2氨基酸化合物、脂质、肽或蛋白的盐复合物可以自干扰RNA试剂的药学上可接受的盐形成，或自DILA2氨基酸化合物、脂质、肽或蛋白的药学上可接受的盐形成。
本发明的某些化合物可以同时包括碱性和酸性官能团，这能将化合物制成碱或酸加成盐。
本发明的一些化合物、肽和/或蛋白组合物可以具有一个或多个手性中心和/或几何异构中心(E-和Z-异构体)，且应该理解本发明涵盖全部此类光学异构体、非对映异构体、几何异构体和它们的混合物。
本发明涵盖本文公开的任何和全部互变异构体、溶剂化物或非溶剂化物、水合或非水合形式、以及化合物的任何原子同位素形式、肽和/或蛋白组合物。
脂质
在本发明的一些方面中，一种或多种DILA2氨基酸化合物和一种或多种脂质可以用于递送和施用调节性RNA组分、RNA拮抗剂、干扰性RNA或核酸。更具体地，本发明的组合物可以包括一种或多种DILA2氨基酸化合物以及阳离子脂质和非阳离子脂质。
阳离子脂质可以是单阳离子或聚阳离子。一些阳离子脂质包括中性脂质和在特定pH下大致具有零净电荷的脂质，例如，两性脂质。非阳离子脂质也包括阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分与DILA2氨基酸化合物和阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物可以是一种或多种调节性或干扰性RNA试剂与一种或多种DILA2氨基酸化合物和一种或多种阳离子脂质的混合物或复合物。
本发明的化合物和组合物可以与各种用于递送活性剂至有机体细胞、组织、器官或区域的靶向配体或试剂混合或连接。靶向试剂的实例包括抗体、受体的配体、肽、蛋白、凝集素、(聚)糖、半乳糖、甘露糖、环糊精、核酸、DNA、RNA、核酸适配子和聚氨基酸。
阳离子脂质的实例包括N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1,2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、1,2-双(二肉豆蔻氧基)-3-3-(三甲基氨)丙烷(DMTAP)；1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰)胆固醇(DC-Chol)；3β-[N',N'-二胍基乙基-氨基乙烷]氨基甲酰胆固醇(BGTC)；2-(2-(3-(双(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N,N-双十四烷基乙酰胺(RPR209120)；它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
阳离子脂质的实例包括1,2-二烯酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(EPC)，如1,2-二油酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
阳离子脂质的实例包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。
聚阳离子脂质的实例包括四甲基四棕榈酰精胺(TMTPS)、四甲基四油烯基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油烯基精胺(TMDOS)、它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
聚阳离子脂质的实例包括2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(双十八烷基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS)；2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八碳-9-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS-9-en)；2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DLinGS)；3-β-(N4-(N1,N8-二羰苯酰氧基亚精胺)氨基甲酰)胆固醇(GL-67)、(9Z,9’Z)-2-(2,5-双(3-氨基丙基氨基)戊氨基)丙烷-1,3-二基-双十八碳-9-烯酸酯(DOSPER)；2,3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)；它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
阳离子脂质的实例包括DS404-28BGTC(CAS 182056-06-0)、DOSPER(CAS178532-92-8)、GL-67(179075-30-0)、RPR209120(CAS 433292-13-8)、DOGS(12050-77-7)、DOGS(9-en,C18:1)、DLinGS(C18:2)和DOTMA(104162-48-3)。
阳离子脂质的实例描述于美国专利4,897,355、5,279,833、6,733,777、6,376,248、5,736,392、5,334,761、5,459,127、2005/0064595、5,208,036、5,264,618、5,279,833、5,283,185、5,753,613和5,785,992中。
在一些实施方式中，组合物是RNA组分和DILA2氨基酸化合物和非阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物是一种或多种RNA组分和一种或多种DILA2氨基酸化合物和一种或多种非阳离子脂质的混合物或复合物。
非阳离子脂质包括中性、两性和阴离子脂质。因此，非阳离子两性脂质可以包括阳离子头基。
非阳离子脂质的实例包括1,2-二月桂酰-sn-甘油(DLG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(DMG)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油(DPG)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油(DSG)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DPPA)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA)；1,2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DMPC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-0-乙基-3-胆碱磷酸(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DPPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DSPC)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DSPG)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(PLinoPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(POPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG)；1-棕榈酰-2-4o-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(P-lyso-PC)；1-硬脂酰-2-lyso-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(S-lyso-PC)；和它们的混合物。
非阳离子脂质的实例包括聚合化合物和聚合物脂质共轭物或聚合脂质，如含有分子量为300、500、1000、1500、2000、3500或5000的PEG区的聚乙二醇化的脂质，包括聚乙二醇、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇750)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-750)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-5000)；胆固醇硫酸酯钠盐(SCS)；它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DOPE-PEG、DLPE-PEG、DDPE-PEGDLinPE-PEG和二酰基甘油-PEG-2000或二酰基甘油-PEG-5000。
非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如多支聚乙二醇化化合物，例如DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。
非阳离子脂质的实例包括聚合脂质，如DSPE-PG8G聚甘油脂质。
非阳离子脂质的实例包括二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二植烷酰磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DOPC)和1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DPhPC)。
非阳离子脂质的实例包括胆固醇、固醇和类固醇，如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、菜油甾烷、多孔甾烷、豆甾烷、柳珊瑚甾烷、羊毛甾烷、环波罗烷、以及前述物质的任何固醇或动物甾醇衍生物和它们的生物中间体和前体，其包括例如胆固醇、羊毛固醇、豆甾烷醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括聚乙二醇化的胆固醇和胆甾烷3-氧代(C1-22酰基)衍生物，如胆固醇乙酸酯、胆固醇花生四烯酸酯、胆固醇丁酸酯、胆固醇己酸酯、胆固醇辛酸酯、胆固醇正癸酸酯、胆固醇十二烷酸酯、胆固醇肉豆蔻酸酯、胆固醇棕榈酸酯、胆固醇山嵛酸酯、胆固醇硬脂酸酯、胆固醇神经酸酯、胆固醇壬酸酯、胆固醇正戊酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇反油酸脂、胆固醇芥酸酯、胆固醇庚酸酯、胆固醇反亚油酸酯、胆固醇亚油酸脂和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自植物固醇的化合物，包括植物甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、麦角甾醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麦甾醇和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括胆汁酸、胆酸、鹅胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甲基石胆酸和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括糖皮质激素、皮质醇、氢化可的松、皮质脂酮、Δ5-孕烯醇酮、孕酮、去氧皮质脂酮、17-OH-孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-去氧皮质醇、脱氢表雄甾酮、硫酸脱氢表雄甾酮、雄烯二酮、醛甾酮、18-羟基皮质甾酮、四氢化可的索、四氢化可的松、可的松、波尼松、6α-甲基强的松、9α-氟-16α-羟基波尼松龙、9α-氟-16α-甲基波尼松龙、9α-氟皮质醇和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括雄激素、睾酮、二氢睾酮、雄(甾)烯二醇、雄(甾)烯二酮、雄(甾)烯二酮、3α,5α-雄(甾)烷二醇和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，包括雌激素、雌三醇、雌素酮、雌二醇和它们的混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自光甾醇和维生素D化合物的化合物。
非阳离子脂质的实例包括具有范围从C10:0至C22:6的尾的脂质，例如DDPE(C10:0)(CAS 253685-27-7)、DLPE(C12:0)(CAS 59752-57-7)、DSPE(C18:0)(CAS1069-79-0)、DOPE(C18:1)(CAS 4004-05-1)、DLinPE(C18:2)(CAS 20707-71-5)、DLenPE(C18:3)(CAS 34813-40-6)、DARAPE(C20:4)(CAS 5634-86-6)、DDHAPE(C22:6)(CAS 123284-81-1)、DPhPE(16:0[(CH3)4])(CAS 201036-16-0)。
阴离子脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇(pi(4)p、pi(4,5)p2)、心磷脂(钠盐)、溶血磷脂、氢化磷脂、鞘脂、神经节苷脂、植物鞘氨醇、鞘氨醇、它们的药学上可接受的盐和它们的混合物。
用于递送RNA治疗剂的应用
在一些方面中，本发明大体涉及调节性RNA和RNA干扰、反义治疗剂和RNA治疗剂的递送领域。更具体地说，本发明涉及核糖核酸的组合物和制剂，和其用于药剂和作为治疗剂用于递送的用途。本发明大体涉及在RNA干扰中使用核糖核酸在细胞或在哺乳动物中进行基因表达的基因特异性抑制，从而改变疾病状态或表型的方法。
RNA干扰是指通过称作短干扰性RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的方法。参见Fire等,Nature 391:806,1998,和Hamilton等,Science286:950-951,1999。RNAi为不同菌群和门为共有，而且确信是抵抗外来基因表达的进化保守性细胞防御机制。参见Fire等,Trends Genet.15:358,1999。
因此RNAi是普遍存在的内源机制，其利用小型的非编码RNA来沉默基因表达。参见Dykxhoorn,D.M.和J.Lieberman,Annu.Rev.Biomed.Eng.8:377-402,2006。RNAi可以调节参与细胞死亡、分化和发育的重要基因。RNAi还可以防止基因组免受由转座子和病毒编码的遗传元件侵袭。当将siRNA导入细胞中时，它可以结合内源RNAi结构，从而破坏含具高度特异性的互补序列的mRNA的表达。任何致病基因和任何细胞类型或组织都可以潜在地被靶向。该技术已经快速用于基因功能分析和药物靶的发现和确认。控制性RNAi也具有很大的治疗前途，虽然将siRNA导入体内细胞还存在着许多障碍。
虽然RNAi的机制尚未完全表征，但认为是通过切割靶mRNA。RNAi应答涉及称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物，其介导互补于siRNA双螺旋反义链的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在互补于siRNA双螺旋反义链的区域中间(Elbashir等,Genes Dev.15:188,2001)。
实现RNAi的一个方法是将siRNA引入细胞或在细胞中表达siRNA。另外一个方法是利用称作切丁酶的内源核糖核酸酶III酶。切丁酶的一个活性是将长dsRNA加工成siRNA。参见Hamilton等,Science 286:950-951,1999；Berstein等,Nature 409:363,2001。衍生自切丁酶的siRNA通常是全长约21至23个核苷酸，并有约19个碱基对双螺旋化。参见Hamilton等，见上；Elbashir等,Genes Dev.15:188,2001。实质上，可以将长dsRNA作为siRNA的前体导入细胞。
本发明提供了一系列的组合物、制剂和方法，其包括调节性RNA、干扰性核酸或其前体与包括DILA2氨基酸化合物、脂质和天然或合成的聚合物在内的各种组分的组合。
在本文中，术语“dsRNA”是指任何双链RNA分子，其能抑制或下调基因表达，例如以序列特异性方式通过促进RNA干扰(“RNAi”或“iRNA”)或基因沉默。本发明的dsRNA可以是适合切丁酶的底物，或是适合与RISC结合以通过RNAi来介导基因沉默的底物。dsRNA的一条或两条链可以进一步包括末端磷酸基团，如5’-磷酸或5’,3’-二磷酸。在本文中，dsRNA分子，除了至少一个核糖核苷酸之外，可以进一步包括取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
dsRNA分子的实例可参见例如美国专利申请号11/681,725、美国专利号7,022,828和7,034,009和PCT国际申请公开号WO/2003/070897。
如PCT国际申请公开号WO2008/147824中的描述，本发明的核酸试剂的实例可以包含一个或多个无环单体。无环单体的实例包括WO2008/147824的图1和2中所示的单体D至单体J。
本发明的活性剂的实例包括含有WO2008/147824中的无环单体的核酸分子。
本发明的活性剂的实例包括UsiRNA。UsiRNA是包含UNA的siRNA，其中UNA是“开锁的核苷碱基类似物”(unlocked nucleobase analog)。WO2008/147824的无环单体D至无环单体J是UNA的实例。
经修饰的核苷酸的实例参见美国专利号6,403,566、6,509,320、6,479,463、6,191,266、6,083,482、5,712,378和5,681,940。经修饰的核苷酸可以具有以下结构：
其中，X是O或CH2，Y是O，且Z是CH2；R1选自下述基团：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和杂环，其中杂环是选自下述基团：取代的1,3-二嗪、未取代的1,3-二嗪和未取代的7H咪唑并[4,5]1,3-二嗪；且R2、R3独立地选自基团H、OH、DMTO、TBDMSO、BnO、THPO、AcO、BzO、OP(NiPr2)O(CH2)2CN、OPO3H、二磷酸盐和三磷酸盐，其中R2和R3同时可以是PhCHO2、TIPDSO2或DTBSO2。在本文中，缩写“Ac”是指乙酰基；缩写“Bn”是指苯甲基；缩写“Bz”是指苯甲酰基；缩写“DMT”是指二甲氧基三苯甲基；缩写“THP”是指四氢吡喃基；缩写“TBDMS”是指叔丁基二甲基甲硅烷基；缩写“TIPDS”是指四异丙基二甲硅烷基；和缩写“DTBS”是指二(叔丁基)甲硅烷基。
另外，在本文中，术语“dsRNA”、“RNAi诱导剂”和“RNAi制剂”与其它用于描述能介导序列特异性RNAi的核酸分子的术语是同义的，包括部分双螺旋RNA(meroduplex RNA，mdRNA)、带切口的dsRNA(ndsRNA)、缺口的dsRNA(gdsRNA)、短干扰性核酸(siRNA)、siRNA、微RNA(miRNA)、单链RNA、短发夹RNA(shRNA)、短干扰性寡核苷酸、短干扰性取代的寡核苷酸、短干扰性修饰的寡核苷酸、化学修饰的dsRNA和转录后基因沉默性RNA(ptgsRNA)、以及上述任一的前体。
术语“大双链(ds)RNA”是指大于约40个碱基对(bp)至约100bp或更大，尤其是高至约300bp至约500bp的任意双链RNA。大dsRNA序列可以代表mRNA片段或完整的mRNA。双链结构可以通过自身互补的核酸分子形成或通过两种或多种不同的互补核酸分子链退火形成。
在一些方面中，dsRNA包括包含第一链(反义)和第二链(正义)的两个分离的寡核苷酸，其中所述反义链和所述正义链是自身互补的(即各链含有与另一条链核苷酸序列互补的核苷酸序列，且两条分离的链形成双螺旋或双链结构，例如，其中双链区是约15至约24个碱基对，或约26至约40个碱基对)；反义链包括互补于靶核酸分子(如人mRNA)中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分；且正义链包括对应于(即同源于)靶核酸序列中的核苷酸序列或其部分(如对应于靶核酸约15至约25个核苷酸或约26至约40个核苷酸的正义链或其部分)。
在一些实施方式中，dsRNA可以组装自单一寡核苷酸，其中dsRNA的自身互补的正义链和反义链一起通过核酸基连接子或非核酸基连接子相连接。在一些实施方式中，dsRNA分子的第一(反义)链和第二(正义)链通过如本文描述的和本领域所已知的核苷酸或非核苷酸连接子共价连接。在一些实施方式中，第一dsRNA分子通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接子与至少一个第二dsRNA分子共价连接，其中第一dsRNA分子可以与多个其它dsRNA分子(相同或不同)或其其任意组合物连接。在一些实施方式中，连接的dsRNA可以包括与连接的dsRNA形成部分双螺旋的第三链。
在一些方面，本文所述的dsRNA分子形成具有三条或更多链的部分双螺旋RNA(mdRNA)，例如'A'(第一或反义)链、'S1'(第二)链和'S2'(第三)链，其中'S1'和'S2'链与'A'链的非重叠区互补并与之形成碱基对(bp)(如mdRNA可以具有A:S1S2形式)。S1、S2或更多的链共同本质上含有'A'链的正义链。通过'S1'和'A'链退火形成的双链区与通过'S2'和'A'链退火形成的双链区不相同且非重叠。mdRNA分子是“缺口”分子，意思是范围为0个核苷酸到高至约10个核苷酸的“缺口”。在一些实施方式中，A:S1双螺旋与A:S2双螺旋被产生于'A'链的至少一个非配对核苷酸(高至约10个非配对核苷酸)的缺口分开，所述缺口位于A:S1双螺旋和A:S2双螺旋之间，而且不同于一种或多种'A'、'S1'或'S2'链的3’-端的任何一个或多个非配对核苷酸。在一些实施方式中，A:S1双螺旋与A:B2双螺旋被在A:S1双螺旋和A:S2双螺旋间的零核苷酸缺口分开(即其中多核苷酸分子中仅位于两个核苷酸间的磷酸二酯键被打开或缺失的缺口)，其也称作带切口的dsRNA(ndsRNA)。例如，A:S1S2可以由具有总共约14个碱基对至约40个碱基对的至少两个双链区的dsRNA组成，且双链区被约0至约10个核苷酸的缺口分开，任选地具有平末端，或A:S1S2可以具有由高至10个核苷酸的缺口分开的至少两个双链区的dsRNA组成，其中至少一个双链区含有约5个碱基对至13个碱基对。
如本文所述，含有三条或更多条链的dsRNA可以被称作“部分双螺旋”RNA(mdRNA)。mdRNA分子的实例可以参见美国临时专利申请60/934,930和60/973,398。
dsRNA或大dsRNA可以包括取代或修饰，其中所述取代或修饰可以在磷酸骨架键、糖、碱基或核苷中。所述核苷取代可以包括天然的非标准核苷(如5-甲基尿苷或5-甲基胞苷或2-硫代胸腺嘧啶核糖核苷)，且所述骨架、糖或核苷修饰可以包括烷基或杂原子取代或添加，如甲基、烷氧基烷基、卤素、氮或硫或本领域已知的其它修饰。
另外，在本文中，术语“RNAi”的意思等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语，如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学。例如，本发明的dsRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平或其组合上通过表观遗传学沉默基因。
在一些方面中，本发明提供了包括靶向一种或多种基因或靶转录物的一种或多种RNAi诱导剂以及一种或多种递送组分的组合物。递送组分的实例包括DILA2氨基酸化合物、脂质、肽、聚合物、聚合脂质和它们的共轭物。
本发明的组合物和制剂可以用于将RNAi诱导实体如dsRNA、siRNA、mdRNA、miRNA、shRNA或RNAi诱导载体递送至完整的哺乳动物受治疗者的细胞内，而且可以用于将这些制剂递送至培养中的细胞内。
本发明还提供了将一种或多种RNAi诱导剂或实体递送至哺乳动物体内的细胞、器官和组织的方法。在一些方面，可以通过不同的途径引入包含RNAi诱导实体的组合物以使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞摄取，在此可以调控靶转录物的表达。
通常，本发明包括RNAi诱导剂，其是预防和治疗以各种异常过程为特征的疾病或病症的有用治疗剂。例如，感染哺乳动物的病毒可以通过控制宿主细胞的细胞机制来进行复制。参见如Fields Virology(2001)。因此，dsRNA可用于破坏控制病毒产生或复制的病毒路径。
本发明包括通过利用具有广谱抵抗靶病毒株效力的一种或多种治疗性RNAi诱导剂来治疗或预防受治疗者病毒感染的方法。本发明的RNAi诱导剂可以靶向已知的病毒变异株或病毒变异体中的病毒基因序列，并且在这些变异体内表现出靶病毒基因的序列特异性基因沉默。例如，RNAi诱导剂可以靶向和表现出抵抗流感病毒季节毒株以及流感变异株的效力。
本发明的组合物和制剂可以用于在体外递送药物制剂或生物活性剂至各种细胞。体外递送的细胞实例包括表皮细胞如A549、永久细胞系如HeLa、肝细胞瘤细胞如HepG2、大鼠胶质肉瘤细胞如9L/LacZ、人单核细胞如THP-1、马-达二氏犬肾细胞(MDCK)、各种纤维原细胞系和在存在或缺失各种血清的情况下培养的原代细胞等。
本发明的组合物和制剂可用于在体内递送药物试剂或生物活性剂至各种细胞、组织或器官。体内递送试剂的方法包括局部、肠内和肠胃外途径。体内递送试剂的方法实例包括颗粒或液滴吸入，鼻或鼻咽滴剂、颗粒或悬浮液递送，透皮和经粘膜途径，以及通过肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、鞘内、骨内、腹膜内和硬膜外的注射或输注途径。
在一些实施方式中，试剂可以通过直接接触来源于哺乳动物受治疗者的细胞、组织或器官而离体给药。
利用本发明的组合物或制剂来递送的药物试剂或生物活性剂可以是任何形式，包括例如纯净形式、结晶形式、固体形式、纳米颗粒、缩合形式、复合物形式或共轭物形式。
本发明还提供了递送一种或多种RNAi诱导实体至哺乳动物体内的器官和组织的方法。在一些实施方式中，可以通过不同的途径引入包含RNAi诱导实体、一种或多种DILA2氨基酸化合物和一种或多种脂质组分的组合物以使其在体内转运并被一种或多种器官或组织内的细胞摄取，在此可以调控靶转录物的表达。
本发明提供了含有治疗性递送核酸和基因沉默RNA的各种DILA2氨基酸化合物或脂质的药学上可接受的核酸组合物。具体地说，本发明提供了用于体外和体内递送dsRNA以降低、下调或沉默靶核酸序列翻译或基因表达的组合物和方法。这些组合物和方法可用于预防和/或治疗哺乳动物中的疾病。在本发明的示例性的方法中，使核糖核酸分子如siRNA或shRNA与DILA2氨基酸化合物接触以配制成能施用于细胞或受治疗者(如哺乳动物)的组合物。在一些实施方式中，本发明提供了通过使含核酸的组合物与细胞接触来在细胞内递送siRNA或shRNA的方法。
在示例性的实施方式中，本发明包括包含核酸分子如双链RNA(dsRNA)、短干扰性RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)的组合物，所述核酸分子与DILA2氨基酸化合物和聚合脂质混合或复合以形成提高核酸分子细胞内递送的组合物。在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括dsRNA和可以是阳离子或非阳离子的一种、两种或多种DILA2氨基酸化合物。在某些变式中，递送组合物可以包含dsRNA、DILA2氨基酸化合物和一种或多种聚合脂质。在一些实施方式中，递送组合物可以包括dsRNA、一种或多种DILA2氨基酸化合物、一种或多种脂质和一种或多种聚合脂质。本发明的组合物可以形成稳定颗粒，其能引入作为干扰性RNA制剂的dsRNA。本发明的组合物和制剂可以包括进一步的递送增强组分或赋形剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括直径约5nm至约400nm的稳定的含RNA颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50nm至约150nm的均匀直径。
在本发明的示例性的组合物中，双链RNA可以与DILA2氨基酸化合物混合或复合，以形成相比于使靶细胞与裸dsRNA接触能提高dsRNA细胞内递送的组合物。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和脂质(如果存在)总量约0.5％至约70％(摩尔％)的一种或多种DILA2氨基酸化合物，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约10％至约55％的一种或多种DILA2氨基酸化合物。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约15％至约35％的一种或多种DILA2氨基酸化合物。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和脂质(如果存在)总量约2％至约95％(摩尔％)的一种或多种非阳离子脂质，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含约20％至约75％或约45％至约75％或约45％至约55％的一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含约10％至约50％的一种或多种非阳离子脂质。
在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占DILA2氨基酸化合物和脂质(如果存在)总量约0.2％至约20％(摩尔％)的一种或多种聚合脂质，和包括任何聚合组分但不包括RNA组分的递送增强组分。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包括约0.5％至约10％的一种或多种聚合脂质。在一些实施方式中，本发明的组合物可以包含占组合物约1％至约5％的一种或多种聚合脂质。
核酸治疗剂组合物和应用
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物受治疗者疾病或病症的方法。可以向患有与能被该组合物降低、减少、下调或沉默的基因表达或过表达相关疾病或病症的受治疗者施用包含干扰性RNA、DILA2氨基酸化合物、非阳离子脂质、聚合脂质和一种或多种递送增强组分或赋形剂的治疗有效量的本发明组合物。
本发明包括通过向受治疗者施用治疗有效量的组合物来治疗肺部疾病，如呼吸窘迫、哮喘、囊性纤维化、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、支气管炎或肺气肿的方法。
本发明包括治疗包括癌症、膀胱癌、肝癌、肝病、高胆固醇血症、炎症性疾病、代谢性疾病、炎症、关节炎、类风湿性关节炎、脑炎、骨折、心脏病、病毒性疾病、肝炎和流感在内的疾病的方法。
制备脂质体的方法参见例如G.Gregoriadis,Liposome Technology(CRC Press 1984),和M.J.Ostro,Liposomes(Marcel Dekker 1987)。
可以首先在适合的培养基如细胞培养基中将核酸组分、DILA2氨基酸化合物和其它组分混合在一起，然后添加一种或多种脂质或化合物至该混合物。可选地，可以首先在适合的培养基如细胞培养基中混合DILA2氨基酸化合物，然后添加核酸组分。
在本发明的一些实施方式中，将dsRNA与一种或多种DILA2氨基酸化合物或一种或多种DILA2氨基酸化合物和非阳离子脂质的组合物混合。
干扰性RNA试剂还可以与DILA2氨基酸化合物或聚合脂质复合或共轭，并与一种或多种非阳离子脂质，或一种或多种非阳离子和阳离子脂质的组合物混合。
可以首先将干扰性RNA试剂和DILA2氨基酸化合物混合在一起，然后加入一种或多种非阳离子脂质或加入到适合培养基如细胞培养基中的非阳离子和阳离子脂质组合。可选地，可以首先混合DILA2氨基酸化合物和脂质组分，然后加入适合培养基中的RNA试剂。
在一些实施方式中，本发明包括胶束分散组合物，其含有与DILA2氨基酸化合物和分散剂混合或复合的药物或活性剂，从而形成提供细胞内递送药物或活性剂的组合物。
在一些实施方式中，本发明的分散组合物可以包括一种或多种药物或活性剂、一种或多种DILA2氨基酸化合物和一种或多种分散剂。在某些变式中，递送组合物可以包括药物或活性剂、分散剂、DILA2氨基酸化合物和任选的聚合脂质。本发明的分散组合物可以形成能引入药物或活性剂的稳定颗粒。
在一些方面中，本发明的分散组合物可以包含直径约5nm至约400nm的稳定的核酸分散颗粒。在一些实施方式中，颗粒可以具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒可以具有约50nm至约150nm的均匀直径。
胶束分散体可以用于配制和改进包括RNAi治疗剂的药物或活性剂的生物利用率。胶束分散体可以提供具有疏水性油样核心的分散液滴或纳米颗粒。分散纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。分散结构利用脂质体结构来递送活性剂可以避免固有的某些弱势，而且因为亲脂性核心而可以提供递送优势。
本发明提供了一系列的胶束分散组合物，其包含用于药物或药剂且用于递送和施用RNA制剂的DILA2氨基酸化合物或脂质和分散剂。
分散剂的实例包括合成化合物，包括聚氧甘油酯，如聚乙二醇化的癸酰基甘油酯、乙氧基二甘醇、聚乙二醇化的脂肪酸甘油酯、二甘醇单乙醚和它们的混合物。分散剂的实例包括LABRAFIL、LABRASOL、ARLATONE、TRANSCUTOL和它们的混合物。分散剂的实例包括合成的化合物，如烷基磷酸-N-甲基乙醇胺和烷氧基肌氨酸(alkoylsarcosine)。分散剂的实例包括FOS-MEA和CRODASINIC。
在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包括药物或活性剂、一种或多种油、一种或多种DILA2氨基酸化合物和乳化剂和稳定剂脂质。在某些变式中，递送组合物可以包括药物或活性剂、油、脂质乳化剂、DILA2氨基酸化合物、非阳离子脂质和聚合脂质。
本发明的组合物可以形成可以引入药物或活性剂的稳定颗粒。在一些方面中，本发明的组合物包括直径为约5nm至约400nm的稳定的药物或活性剂乳剂颗粒。在一些实施方式中，颗粒具有约10nm至约300nm的均匀直径。在一些实施方式中，颗粒具有约50nm至约150nm的均匀直径。
在一些实施方式中，药物或活性剂可以与油、乳化剂、DILA2氨基酸化合物和聚合体稳定化的脂质混合或复合，以形成提高细胞内递送药物或活性剂的组合物。
水包油乳剂可以用于配制和提高包括RNAi治疗剂的药物或活性剂的生物利用率。
水包油乳剂可以提供具有围绕疏水性油核心的DILA2氨基酸化合物或脂质层的乳剂液滴或纳米颗粒。乳剂液滴或纳米颗粒可以悬浮在连续水相中。利用脂质体结构来递送活性剂，乳剂结构可以避免固有的某些弱势，并且因为亲脂性核心而能提供递送优势。
本发明提供了一系列的新型乳剂组合物，包括新型组成和干扰性RNA试剂与油、乳化剂、DILA2氨基酸化合物和脂质组分的使用。
油的实例包括合成的油、丙二醇脂肪酸酯、乙二醇醚、甘油油、胆固醇油、植物油、花生油、精油、矿物油、脂质可溶性化合物如生育酚和维生素E和它们的混合物。油的实例包括合成油，如CAPRYOL 90(丙二醇单酯)、CAPRYOL PGMC(丙二醇单酯)、LABRAFAC PC(丙二醇单酯)、LABRAFAC PG(丙二醇二酯)、LAUROGLYCOL 90(丙二醇单酯)、LAUROGLYCOL FCC(丙二醇单酯)、PLUROL OLEIQUE CC 497(丙二醇单酯)、LABRAFAC LIPOPHILE WL 1349(甘油三酯)、PECEOL(甘油单酯)、MAISINE 35-1(甘油单酯)和它们的混合物。
用于RNA治疗剂的组合物和方法
本发明提供了利用调节性RNA如通过RNA干扰来调节基因表达的组合物和方法。本发明的组合物可以递送核糖核酸试剂至能产生RNAi应答的细胞。可用于本发明的核酸试剂的实例包括双链核酸、修饰的或降解抗性的核酸、RNA、siRNA、siRNA、shRNA、miRNA、piRNA、RNA拮抗剂、单链核酸、DNA-RNA嵌合体、反义核酸和核酶。在本文中，术语siRNA、siRNA和shRNA分别包括siRNA、siRNA和shRNA的前体。例如，术语siRNA包括适合作为切丁酶底物的RNA或双链RNA。
可用于本发明的核糖核酸试剂可以靶向各种基因。适合作为靶标的人基因的实例特别包括TNF、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、BCR-ABL和MAPK家族等。适合作为靶标的人基因的实例和其核酸序列包括描述于下述文献中的那些：PCT/US08/55333、PCT/US08/55339、PCT/US08/55340、PCT/US08/55341、PCT/US08/55350、PCT/US08/55353、PCT/US08/55356、PCT/US08/55357、PCT/US08/55360、PCT/US08/55362、PCT/US08/55365、PCT/US08/55366、PCT/US08/55369、PCT/US08/55370、PCT/US08/55371、PCT/US08/55372、PCT/US08/55373、PCT/US08/55374、PCT/US08/55375、PCT/US08/55376、PCT/US08/55377、PCT/US08/55378、PCT/US08/55380、PCT/US08/55381、PCT/US08/55382、PCT/US08/55383、PCT/US08/55385、PCT/US08/55386、PCT/US08/55505、PCT/US08/55511、PCT/US08/55515、PCT/US08/55516、PCT/US08/55519、PCT/US08/55524、PCT/US08/55526、PCT/US08/55527、PCT/US08/55532、PCT/US08/55533、PCT/US08/55542、PCT/US08/55548、PCT/US08/55550、PCT/US08/55551、PCT/US08/55554、PCT/US08/55556、PCT/US08/55560、PCT/US08/55563、PCT/US08/55597、PCT/US08/55599、PCT/US08/55601、PCT/US08/55603、PCT/US08/55604、PCT/US08/55606、PCT/US08/55608、PCT/US08/55611、PCT/US08/55612、PCT/US08/55615、PCT/US08/55618、PCT/US08/55622、PCT/US08/55625、PCT/US08/55627、PCT/US08/55631、PCT/US08/55635、PCT/US08/55644、PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、PCT/US08/55662、PCT/US08/55672、PCT/US08/55676、PCT/US08/55678、PCT/US08/55695、PCT/US08/55697、PCT/US08/55698、PCT/US08/55701、PCT/US08/55704、PCT/US08/55708、PCT/US08/55709和PCT/US08/55711。
要递送的本发明RNA可以具有互补于病毒基因区域的序列。例如，本发明的某些组合物和方法可以用于调节流感病毒的病毒基因组的表达。在一些实施方式中，本发明提供了通过RNA干扰来调节流感病毒的表达和感染活性的组合物和方法。流感病毒的表达和/或活性可以通过向细胞递送例如具有互补于流感病毒的RNA聚合酶亚单位区域的序列的短干扰性RNA分子来进行调节。靶向流感病毒的RNA实例参见美国专利公开号20070213293A1。
在一些实施方式中，本发明提供了通过给受治疗者施用含有效量的RNAi诱导化合物，如短干扰性寡核苷酸分子或其前体，来抑制受治疗者内靶转录物表达的组合物和方法。RNAi利用小干扰性RNA(siRNA)来靶向信使RNA(mRNA)和削弱翻译。本发明使用的siRNA可以是切丁酶加工的前体，例如加工成siRNA的长dsRNA。本发明提供了治疗或预防与靶转录物表达或由靶转录物编码的肽或蛋白活性相关的疾病或病症的方法。
基于RNAi的治疗策略可以通过切断病毒或微生物的生长或功能，以及通过切断内源基因产物在疾病通道中的功能来治疗多种疾病。
在一些实施方式中，本发明提供了递送RNAi诱导实体如短干扰性寡核苷酸分子和其前体的新型组合物和方法。具体地，本发明提供了包含靶向受治疗者细胞、组织和/或器官的一种或多种转录物的RNAi诱导实体的组合物。
siRNA可以是具有约19个核苷酸长度的互补性区域的两条RNA链。siRNA任选包括一个或两个单链突出端或环。
shRNA可以是具有自身互补区域的单一RNA链。单一RNA链可以形成具有茎和环和任选地在RNA的5'和/或3'部分的一种或多种非配对部分的发夹结构。
活性治疗剂可以是具有改良的体内核酸酶降解抗性和/或改善的细胞摄取的化学修饰的RNA，其保留RNAi活性。
本发明的siRNA试剂可以是具有互补于靶基因区域的序列。本发明的siRNA可以具有29至50个碱基对，例如具有互补于靶基因区序列的dsRNA。另外，双链核酸可以是dsDNA。
在一些实施方式中，活性剂可以是能够调控基因产物表达的短干扰性核酸(siRNA)、短干扰性RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA或短发夹RNA(shRNA)。
提供了对比方法和组合物，其靶向与受治疗者特定疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达，包括已知由于与所选疾病状况相关的决定因素或促成因素使其表达异常增加的多种基因中的任意基因。
本发明的RNAi诱导化合物可以与其它已知疗法联合来治疗疾病。
在一些实施方式中，本发明涉及包含与递送增强化合物混合或复合或共轭的小核酸分子(如短干扰性核酸、短干扰性RNA、双链RNA、微RNA或短发夹RNA)的组合物。
在本文中，术语“调节性RNA”、“短干扰性核酸”、“siRNA”、“短干扰性RNA”、“短干扰性寡核苷酸分子”和“化学修饰的短干扰性核酸分子”是指通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来调节、抑制或下调基因表达或如病毒复制的任何核酸分子。调节性RNA包括单链RNA拮抗剂。
在一些实施方式中，siRNA是含有自身互补的正义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中反义区含有互补于用于下调表达的靶核糖核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义区包含对应于(即，其在序列上实质一致)靶核糖核酸序列的核苷酸序列或其部分。
在本文中，“siRNA”是指小干扰性核糖核酸，即相对短长度的双链核酸或任选地其较长前体。在一些实施方式中，本发明中可用siRNA的长度优选为约20至50bp的长度。但是，在此对可用siRNA(包括siRNA)长度没有特殊限制。例如，siRNA可以最初以前体形式存在于细胞中，所述前体形式与递送至靶细胞时或递送至靶细胞后表现和发挥基因沉默活性的siRNA的最终或加工形式实质上不同。例如，siRNA的前体形式可以包括前体序列元件，所述元件在递送时或递送后就会被加工、降解、改变或切割，以产生在细胞内有介导基因沉默活性的siRNA。在一些实施方式中，可用的siRNA具有的前体长度为例如约100至200个碱基对或50至100个碱基对或少于约50个碱基对，其在靶细胞内会产生有活性的，加工过的siRNA。在其它实施方式中，可用的siRNA或siRNA前体长度约为10至49bp或15至35bp或约21至30bp。
在本发明的一些实施方式中，增强多核苷酸递送的多肽可以用于促进核酸分子包括siRNA的大核酸前体的递送。例如，本文的方法和组合物可用于提高代表期望siRNA的“前体”的较大核酸的递送，其中前体氨基酸可以在递送至靶细胞之前、期间或之后被切割或被加工，从而形成用于在靶细胞内调节基因表达的活性siRNA。
例如，选择的dsRNA前体多核苷酸可以是环状的单链多核苷酸，其具有两个或多个环结构和含有自身互补的正义和反义区的茎，其中所述反义区含有互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区具有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分，且其中所述环状多核苷酸可以被在体内或体外加工，以产生能诱导RNAi的活性dsRNA分子。
本发明的siRNA分子，特别是非前体形式，可以是少于30个碱基对或约17至19bp或19至21bp或21至23bp。
siRNA可以在哺乳动物系统内介导选择性基因沉默。具有短环和茎内19至27个碱基对的发夹RNA也选择性地沉默与双链茎内序列同源的基因的表达。哺乳动物细胞可以将短发夹RNA转变为siRNA以介导选择性基因沉默。
RISC介导具有互补于siRNA双螺旋反义链的序列的单链RNA切割。靶RNA的切割发生在互补于siRNA双螺旋反义链的区域内。21个核苷酸的siRNA双螺旋通常在包含两个核苷酸3'-突出端时活性最高。
用脱氧核糖核苷酸代替具有2-核苷酸3'突出端的21-mer siRNA双螺旋的3'-突出端片段可能对RNAi活性无副作用。将siRNA各末端的高至4个核苷酸用脱氧核糖核苷酸代替是可以接受的。
可选地，siRNA可以作为单个或多个转录产物来递送，所述转录产物由编码单个或多个siRNA且指向其在靶细胞内表达的多核苷酸载体所表达。在这些实施方式中，欲在靶细胞内表达的siRNA终转录产物的双链部分可以是如15至49bp、15至35bp或约21至30bp长。
在本发明的一些实施方式中，其中两条链配对的siRNA的双链区可以包括凸起或错配的部分，或凸起和错配的部分。其中两条链配对的siRNA的双链部分不限于完全配对的核苷酸片段，且可以包含由于如错配(相应的核苷酸不互补)、凸起(在一条链上缺失对应的互补核苷酸)或突出端引起的非配对部分。在不干扰siRNA形成的情况下可以包含非配对部分。在一些实施方式中，“凸起”可以包含1至2个非配对的核苷酸，且其中两条链配对的siRNA的双链区可以包括约1至7或约1至5个凸起。另外，包括在siRNA双链区内的“错配”部分可以存在的数量是约1至7或约1至5个。错配情况中最常见的是，一个核苷酸是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。所述错配可以归因于如在编码正义RNA的对应DNA中C突变成T、G突变成A或其混合，但其它原因也是可以预料的。
本发明的siRNA的末端结构可以是平末端或粘性(突出)末端，只要siRNA保持其沉默靶基因表达的活性。粘性(突出端)末端结构并不限于3'突出端，且包括5'突出结构，只要其保持诱导基因沉默的活性。另外，突出核苷酸的数量并不限于2个或3个核苷酸，而可以是任意数量的核苷酸，只要其保持诱导基因沉默的活性。例如，突出端可以包含1至约8个核苷酸或2至4个核苷酸。
具有突出端结构的siRNA的长度可以表述为配对的双螺旋部分和各末端的任意突出部分。例如，具有2-bp 3’反义突出端的25/27-mer siRNA双螺旋具有25-mer正义链和27-mer反义链，其中配对部分长度为25bp。
任意突出端序列都可以具有对靶基因的低特异性，而且可以与靶基因序列不互补(反义)或不相同(正义)。只要siRNA保持基因沉默活性，其就可以在突出端部分包括低分子量结构，例如天然RNA分子(如tRNA、rRNA、病毒RNA)，或人工RNA分子。
siRNA的末端结构可以具有茎-环结构，其中双链核酸的一侧末端通过连接子核酸例(如连接子RNA)连接。双链区(茎部分)的长度可以是如15至49bp或15至35bp或约21至30bp。可选地，作为靶细胞中表达的siRNA的终转录产物的双链区长度可以是如约15至49bp或15至35bp或约21至30bp。
siRNA可以包含具有互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列的单链多核苷酸或其部分，其中单链多核苷酸可以包含末端磷酸基团如5'-磷酸(参见如Martinez等,Cell.110:563-574,2002,和Schwarz等,Molecular Cell 10:537-568,2002)，或5',3'-二磷酸。
在本文中，术语siRNA不限于仅含天然存在的RNA或DNA的分子，但也包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方式中，本发明的短干扰性核酸分子缺少含2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在一些实施方式中，短干扰性核酸不需要存在用于介导RNAi等的具有2'-羟基的核苷酸，照此，本发明的短干扰性核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(如具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不需要在siRNA分子中存在核糖核苷酸来维持RNAi的siRNA分子可以具有一个或多个连接的连接子或其它连接或结合的基团、实体或包含具有2'-OH基团的一种或多种核苷酸的链。siRNA分子可以在至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。
在本文中，术语siRNA包括能介导序列特异性RNAi的核酸分子，例如，短干扰性RNA(siRNA)分子、双链RNA(dsRNA)分子、微RNA分子、短发夹RNA(shRNA)分子、短干扰性寡核苷酸分子、短干扰性核酸分子、短干扰性修饰的寡核苷酸分子、化学修饰的siRNA分子和转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)分子等。
在一些实施方式中，siRNA分子包括分离的正义和反义序列或区域，其中正义和反义区通过核苷酸或非核苷酸连接子分子共价连接，或通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆集相互作用非共价连接。
“反义RNA”是具有互补于靶基因mRNA的序列的RNA链，其能通过结合靶基因mRNA来诱导RNAi。
“正义RNA”是具有互补于反义RNA的序列的RNA链，且与其互补的反义RNA退火而形成siRNA。
在本文中，术语“RNAi结构”或“RNAi前体”是指RNAi诱导化合物，如小干扰性RNA(siRNA)、发夹RNA和能在体内被切割而形成siRNA的其它RNA种类。本文的RNAi前体还包括表达载体(也称作RNAi表达载体)，其能产生在细胞内形成dsRNA或发夹RNA的转录物，和/或产生能在体内生成siRNA的转录物。
短干扰杂交体(siHybrid)分子是具有与siRNA相似功能的双链核酸。取代是双链RNA分子，短干扰杂交体由RNA链和DNA链组成。优选地，该RNA链是结合靶mRNA的反义链。通过将DNA和RNA链杂交而生成的短干扰杂交体具有杂交互补部分，且优选具有至少一个3’突出端。
本发明所用的siRNA可以组装自两个分离的寡核苷酸，其中一条链是正义链且另一条是反义链，其中反义链和正义链是自身互补的(即，各链含有互补于另一条链中的核苷酸序列的核苷酸序列；如，其中反义链和正义链形成双螺旋或双链结构，例如，其中双链区是约19个碱基对)。反义链可以包括互补于靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且正义链可以包含对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。可选地，siRNA可以组装自单个寡核苷酸，其中siRNA的自身互补的正义区和反义区是通过基于核酸的或基于非核酸的连接子而连接。
在一些实施方式中，用于细胞内递送的siRNA可以是具有双螺旋、不对称双螺旋、发夹或不对称的发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的正义区和反义区，其中所述反义区含有互补于分离的靶核酸分子中的核苷酸序列的核苷酸序列或其部分，且所述正义区含有对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分。
可在siRNA中进行的化学修饰的实例包括引入硫代磷酸酯核苷酸间键、2'-脱氧核糖核苷酸、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和末端甘油基和/或反向脱氧无碱基残基。
siRNA分子的反义区可以在所述反义区的3’-端上包括硫代磷酸酯核苷酸间键。反义区可以在所述反义区的5’-端上包含约1至约5个硫代磷酸酯核苷酸间键。siRNA分子的3'-端核苷酸突出端可以包括在核酸糖、碱基或骨架上可进行化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。3'-端核苷酸突出端可以包括一种或多种通用碱基核糖核苷酸。3'-端核苷酸突出端可以包括一种或多种无环核苷酸。
例如，化学修饰的siRNA可以在一条链内具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键，或可以在各链内具有1至8个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯核苷酸间键可以存在于siRNA双螺旋的一条或两条寡核苷酸链上，例如在正义链、反义链或两条链上。
siRNA分子可以包括在正义链、反义链或两条链上的3’-端、5’-端或3'-和5’-端的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，示例性的siRNA分子可以包括在正义链、反义链或两条链上的5'-端的1、2、3、4、5或更多个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链或两条链上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施方式中，siRNA分子包括在正义链、反义链或两条链上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间键。
siRNA分子可以包括环状核酸分子，其中siRNA在长度上是约38至约70个核苷酸，例如约38、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸，具有约18至约23个碱基对，例如约18、19、20、21、22或23个碱基对，其中环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃型结构。
环状siRNA分子可以包括2个环基序，其中siRNA分子的一个或两个环部分是生物可降解的。例如，环状siRNA分子的环部分可以在体内转化以生成具有3'-端突出端的双链siRNA分子，如包含约2个核苷酸的3'-端核苷酸突出端。
siRNA分子中的修饰的核苷酸可以在反义链、正义链或两者上。例如，修饰的核苷酸可以具有Northern构型(如Northern假回转环；参见如Saenger,Principles of Nucleic AcidStructure,Springer-Verlag ed.,1984)。具有Northern构型的核苷酸实例包括锁定核酸(LNA)核苷酸(如2'-O,4'-C-亚甲基-(D-核糖呋喃糖基)核苷酸)、2'-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2'-甲基-硫代-乙基,2'-脱氧-2'-氟代核苷酸、2'-脱氧-2'-氯代核苷酸、2'-叠氮核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。
化学修饰的核苷酸可以对核酸酶降解具有抗性，且同时保持介导RNAi的能力。
双链siRNA分子的正义链可以在正义链的3’-端、5’-端或3'和5’-端上具有端帽部分，如反向的脱氧无碱基部分。
共轭物的实例包括描述于2003年4月30日提交的Vargeese等人的美国申请序列号10/427,160中的共轭物和配体，其整体(包括附图)引入本文作为参考。
在本发明的一些实施方式中，共轭物可以通过生物可降解的连接子共价连接化学修饰的siRNA分子。例如，共轭分子可以与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链或两条链的3’-端连接。
在一些实施方式中，共轭分子与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链或两条链的5’-端连接。在一些实施方式中，共轭分子与化学修饰的siRNA分子的正义链、反义链或两条链的3’-端和5’-端或其任意组合连接。
在一些实施方式中，共轭分子包括能促进化学修饰的siRNA分子递送至生物系统如细胞内的分子。
在一些实施方式中，连接化学修饰的siRNA分子的共轭分子是聚乙二醇、人血清白蛋白或介导细胞摄取的细胞受体的配体。本发明期望的能连接化学修饰的siRNA分子的特异性共轭分子的实例描述于Vargeese等，美国专利公开号20030130186和20040110296中。
siRNA可以包含将siRNA的正义区和siRNA的反义区相连接的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸连接子。在一些实施方式中，核苷酸连接子可以是3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。在一些实施方式中，核苷酸连接子可以是核酸适配子。在本文中，术语“适配子”或“核酸适配子”包括特异性结合靶分子的核酸分子，其中核酸分子包含在其自然状态下被靶分子识别的序列。另外，适配子可以是结合非自然结合核酸的靶分子的核酸分子。
例如，适配子可以用于结合蛋白的配体结合域，从而可以防止天然存在的配体与蛋白发生相互作用。参见例如Gold等,Annu.Rev.Biochem.64:763,1995；Brody和Gold,J.Biotechnol.74:5,2000；Sun,Curr.Opin.Mol.Ther.2:100,2000；Kusser,J.Biotechnol.74:27,2000；Hermann和Patel,Science 287:820,2000；和Jayasena,Clinical Chemistry 45:1628,1999。
非核苷酸连接子可以是无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如，如那些具有2至100个乙二醇单元的聚乙二醇)。具体的实例包括下述文献中描述的那些：Seela和Kaiser,Nucleic Acids Res.18:6353,1990和NucleicAcids Res.15:3113,1987；Cload和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.113:6324,1991；Richardson和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.113:5109,1991；Ma等,Nucleic Acids Res.21:2585,1993和Biochemistry 32:1751,1993；Durand等,Nucleic Acids Res.18:6353,1990；McCurdy等,Nucleosides&Nucleotides 10:287,1991；Jaschke等,Tetrahedron Lett.34:301-304,1993；Ono等,Biochemistry 30:9914,1991；Arnold等，国际公开号WO89/02439；Usman等，国际公开号WO95/06731；Dudycz等，国际公开号WO95/11910；和Ferentz和Verdine,J.Am.Chem.Soc.113:4000,1991。
“非核苷酸连接子”是指能引入核酸链内代替一个或多个核苷酸单元(包括糖和/或磷酸取代)且使保留的碱基表现其酶活性的基团或化合物。所述基团或化合物可以是无碱基的，因为其在如糖的C1位置上不含有常规公认的核苷酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，修饰的siRNA分子可以具有磷酸骨架修饰，包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、缩甲醛(formacetal)、硫代缩甲醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修饰的实例在Hunziker和Leumann,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in Modern Synthetic Methods,VCH,第331-417页,1995和Mesmaeker等,Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides,inCarbohydrate Modifications in Antisense Research,ACS,第24-39页,1994中给出。
可以化学修饰的siRNA分子可以通过下述方法合成：(a)合成siRNA分子的两条互补链；和(b)在适合获得双链siRNA分子的条件下将两条互补链一起退火。在一些实施方式中，siRNA分子互补部分的合成是通过固相寡核苷酸合成，或通过固相串联寡核苷酸合成来实现的。
寡核苷酸(如某些修饰的寡核苷酸或缺失核糖核苷酸的寡核苷酸部分)是利用本领域熟知的方法来合成，例如下述文献中所描述的：Caruthers等,Methods in Enzymology211:3-19,1992；Thompson等,国际PCT公开号WO99/54459；Wincott等,Nucleic Acids Res.23:2677-2684,1995；Wincott等,Methods Mol.Bio.74:59,1997；Brennan等,BiotechnolBioeng.61:33-45,1998；和Brennan,美国专利号6,001,311。包括本发明的某些siRNA分子在内的RNA的合成根据如下文献所述的方法进行，例如Usman等,J.Am.Chem.Soc.109:7845,1987；Scaringe等,Nucleic Acids Res.18:5433,1990；和Wincott等,Nucleic AcidsRes.23:2677-2684,1995；Wincott等,Methods Mol.Bio.74:59,1997。
在本文中，“不对称发夹”是线性siRNA分子，其含有反义区、环部分和正义区，所述环部分可包含核苷酸或非核苷酸，所述正义区在具有足够可与反义区碱基配对的互补核苷酸且形成具有环的双螺旋的前提下包含少于反义区的核苷酸。
在本文中，“不对称的双螺旋”是具有两条分离的链的siRNA分子，其含有正义区和反义区，其中正义区在具有足够可与反义区碱基配对的互补核苷酸且形成具有环的双螺旋的前提下包含少于反义区的核苷酸。
在本文中，“调控基因表达”是指上调或下调靶基因的表达，其可以包括上调或下调细胞中存在的mRNA水平或mRNA翻译或由靶基因编码的蛋白或蛋白亚单位的合成。
术语“抑制”、“下调”或“减少表达”在本文中是将指基因的表达、或编码一种或多种蛋白或蛋白亚单位的RNA分子或相当的RNA分子的表达的水平，或由靶基因编码的一种或多种蛋白或蛋白亚单位的水平或活性降低到低于在缺失本发明的核酸分子(如siRNA)时观察到的水平。
在本文中，“基因沉默”是指在细胞中部分或完全抑制基因表达，还可以称作“基因敲减”。基因沉默的程度可以通过本领域已知的方法来确定，其中的一些总结在国际公开号WO99/32619。
本文中，术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。核糖核苷酸是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、以及通过添加、删除、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的和改变的RNA。RNA的改变可以包括例如向如siRNA的末端或如在RNA的一个或多个核苷酸内部添加非核苷酸材料。
RNA分子中的核苷酸包括非标准的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物。
“高度保守序列区域”是指靶基因中一个或多个区域的核苷酸序列在从一代到另一代或从一个生物体系到另一个生物体系没有显著变化。
“正义区”是指具有互补于siRNA分子的反义区的siRNA分子的核苷酸序列。另外，siRNA分子的正义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
“反义区”是指具有互补于靶核酸序列的siRNA分子的核苷酸序列。另外，siRNA分子的反义区可以包括具有互补于siRNA分子的正义区的核酸序列。
“靶核酸”是指其表达或活性待调节的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA或RNA。
“互补”是指核酸通过常规Watson-Crick或通过其它的非常规结合模式可以与另一个核酸序列形成氢键。
在本文中，术语“生物可降解连接子”是指设计成作为生物可降解连接子以将一个分子与另一个分子连接(例如，生物活性分子与siRNA分子或siRNA分子的正义和反义链连接)的核酸或非核酸连接子分子。如此设计生物可降解连接子，使得其稳定性可以为特定目的(如递送至特定组织或细胞类型)而发生调节。基于核酸的生物可降解连接子分子的稳定性可以以不同的方式调节，例如，通过核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸如2'-O-甲基、2'-氟代、2'-氨基、2'-O-氨基、2'-C-烯丙基、2'-O-烯丙基和其它的2'-修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸连接子分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸分子，例如长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包括具有磷基键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单核苷酸。生物可降解的核酸连接子分子还可以包括核酸骨架、核酸糖或核酸碱基修饰。
对于如本文所述的2'-修饰的核苷酸，“氨基”是指2'-NH2或2'-O-NH2，其可以是修饰的或未修饰的。所述修饰的基团描述于例如，Eckstein等，美国专利号5,672,695和Matulic-Adamic等，美国专利号6,248,878中。
本发明使用的递送核酸分子的辅助或补充方法描述于，例如，Akhtar等,Trends CellBio.2:139,1992；"Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,"Akhtar编辑,1995,Maurer等,Mol.Membr.Biol.16:129-140,1999；Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.137:165192,1999；和Lee等,ACS Symp.Ser.752:184-192,2000。Sullivan等，国际PCT公开号WO94/02595中进一步描述了递送酶核酸分子的常规方法。
核酸分子可以在制剂中施用，所述制剂包括一种或多种组分，如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、助剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
在本文中，术语“载体”是指药学上可接受的固体或液体稀释剂、溶剂、填充剂或包裹材料。载体的实例包括盐水、生物学上和药学上的缓冲系统和生物学上可接受的介质。含水的液体载体可以包括药学上可接受的添加剂，如酸化剂、碱化剂、抗菌防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、润湿剂、溶剂、悬浮剂和/或粘度增强剂、张力剂、润湿剂或其它生物相容性材料。上述范畴的组分实例可参见U.S.PharmacopeiaNational Formulary,1990,第1857-1859页，以及Raymond C.Rowe等,Handbook ofPharmaceutical Excipients,第5版,2006，和"Remington:The Science and Practice ofPharmacy,"第21版,2006,David B.Troy编辑。
防腐剂的实例包括苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、间甲酚、硫柳汞、苯扎氯铵和它们的混合物。
表面活性剂的实例包括油酸、失水山梨醇三油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱、各种长链甘油二酯和磷脂和它们的混合物。
磷脂的实例包括磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺和它们的混合物。
分散剂的实例包括乙二胺四乙酸。
气体的实例包括氮气、氦气、氯氟烃(CFC)、氢氟烃(HFC)、二氧化碳、空气和它们的混合物。
在一些实施方式中，siRNA和/或多肽可以包裹入脂质体或存留在脂质体内部或外部或存在于脂质体层内或通过离子电渗施用或加入到其它载体，如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊、生物粘性微球或蛋白质载体。参见，例如O'Hare和Normand，PCT国际公开号WO00/53722。可选地，核酸组合物可以通过直接注射或通过利用输注泵来局部递送。本发明核酸分子的直接注射，无论经皮下、经肌肉内或经皮内，都可以利用标准的针和注射器操作法，或采用无针技术，如Conry等，Clin.Cancer Res.5:2330-2337,1999，和Barry等，国际PCT公开号WO99/31262中所描述。
本发明的组合物可以有效地用作药物制剂。药物制剂预防、调节患者中疾病状态或其它不良状况的发生或严重程度，或治疗(减轻一种或多种症状至可检测或可测量的程度)患者中疾病状态或其它不良状况。
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物和方法，特征是存在或施用一种或多种多核酸，所述多核酸通常是与DILA2氨基酸化合物或脂质结合、复合或共轭的一种或多种siRNA，其可以进一步与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂或缓冲剂配伍。
通常地，siRNA会靶向以高水平表达的基因，该基因作为与受治疗者疾病或不良状况相关的决定因素或促成因素。在这种情况下，siRNA会有效地下调该基因的表达水平，从而预防、减轻或降低一种或多种相关疾病症状的严重性或复发。可选地，对于各种不同的疾病模型来说，靶基因的表达不一定会随着疾病或其它不良状况的结果或结局而提高，通过降低基因表达(即降低选定的mRNA的水平和/或靶基因的蛋白产物的水平)，下调靶基因将仍然会获得治疗结果。可选地，本发明的siRNA可以靶向较低表达的一个基因，这可以导致上调“下游”基因，该“下游”基因的表达被该靶基因的产物或活性负性调节。
本发明的siRNA可以以任何形式给药，例如经透皮或通过局部注射(如在银屑病斑块位点上局部注射以治疗牛皮癣，或局部注射入患银屑病关节炎或RA患者关节内)。在更具体的实施方式中，本发明提供了制剂和施用治疗有效量的直接抵抗TNF-α的mRNA的siRNA的方法，该siRNA有效下调TNF-αRNA，并因此降低或预防一种或多种TNF-α相关炎症性病症。提供了对比方法和组合物，其针对与动物受治疗者中所选疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达，包括已知其表达随着与所选疾病状况相关的决定因素或促成因素会异常增加的大量基因中的任何基因。
本发明的组合物还可以配制，并用作口服给药的片剂、胶囊或酏剂，直肠给药的栓剂，无菌溶液，注射给药的悬浮液，以及本领域已知的其它形式。
药理学组合物或制剂是指适合给药的形式的组合物或制剂，例如全身给药至细胞或患者，包括如人类。适合的形式部分依赖于用途或进入途径，例如经口服、经透皮、经上皮或通过注射。所述形式并不妨碍组合物或制剂到达靶细胞(即，希望带负电的核酸递送到的细胞)。例如，注入到血液中的药理学组合物应该是可溶的。其它因素是本领域已知，包括如毒性的考虑因素。
“全身给药”是指药物在血液中体内全身吸收或累积，随后分布到全身。会导致全身吸收的给药途径包括但不限于：经静脉、经皮下、经腹腔、吸入、口服、经肺内和经肌肉内。
适合与本发明的核酸分子一起配制的试剂的实例包括：P-糖蛋白抑制剂(如PluronicP85)，其能提高药物进入CNS(Jolliet-Riant和Tillement,Fundam.Clin.Pharmacol.13:16-26,1999)；生物可降解的聚合物，如在脑内植入后用于缓释递送的聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)微球(Emerich,D.F等,Cell Transplant 8:47-58,1999,Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)；和载药纳米颗粒，如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些，其能递送药物穿过血脑屏障并能改变神经摄取机制(Prog.Neuropsychopharmacol Biol.Psychiatry 23:941-949,1999)。用于本发明核酸分子递送方法的其它实例包括描述于下述文献中的材料：Boado等，J.Pharm.Sci.87:1308-1315,1998；Tyler等，FEBS Lett.421:280-284,1999；Pardridge等，PNAS USA.92:5592-5596,1995；Boado,Adv.Drug Delivery Rev.15:73-107,1995；Aldrian-Herrada等，Nucleic Acid Res.26:4910-4916,1998；和Tyler等，PNAS USA.96:7053-7058,1999。
本发明还包括所制备的用于储藏或给药的组合物，其包括在药学可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的期望化合物。治疗使用的可接受的载体或稀释剂是药物领域所熟知的，且描述于，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)中。例如，可以使用防腐剂、稳定剂、染料和增味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外，抗氧化剂和悬浮剂也可以使用。
药学有效剂量是预防、抑制疾病状态的发生，治疗或改善疾病状态的症状到一定程度所需的剂量。活性核酸的给药量应该是每日每千克体重0.01mg至50mg。
水性悬浮液可以包括与适合制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。所述赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷基亚乙氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯。含水悬浮液还可以包括一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种增味剂和一种或多种增甜剂，如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过在植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或在矿物油如液体石蜡中悬浮活性成分来配制。油性悬浮液可以包括增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可添加增甜剂和增味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来进行保存。
适合通过加水制备水性悬浮液的可分散粉剂和颗粒提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。也可以存在其它赋形剂，例如增甜剂、增味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以是水包油乳剂型。油相可以是植物油或矿物油或两者的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的橡胶，例如阿拉伯树胶或黄芪树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。乳剂还可以包括增甜剂和增味剂。
药物组合物可以是无菌注射的水性或油性悬浮液形式。该悬浮液可以按照本领域已知的方法，利用上文所述的适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。其中可以使用的可接受的载体和溶剂是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油可用作溶剂或悬浮介质。为此，任何温和的不挥发性油都可以使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，发现脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
siRNA还可以以栓剂形式给药，例如用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过将药物与适合的非刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体，因此其能在直肠中溶解而将药物释放。所述材料包括可可油和聚乙二醇。
siRNA可以通过使用核酸酶抗性基团如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-O-甲基、2'-H修饰来进行广泛地修饰，以提高稳定性。综述参见Usman和Cedergren,TIBS 17:34,1992；Usman等，Nucleic Acid Symp.Ser.31:163,1994。siRNA结构可以利用常规方法通过凝胶电泳来纯化或通过高压液相层析来纯化，并在水中重悬浮。
包含修饰(碱基、糖和/或磷酸)的化学合成的核酸分子可以防止其被血清核糖核酸酶降解，这可以增加其效力。参见，例如Eckstein等，国际公开号WO92/07065；Perrault等，Nature 344:565,1990；Pieken等，Science 253,314,1991；Usman和Cedergren,Trends inBiochem.Sci.17:334,1992；Usman等，国际公开号WO93/15187；和Rossi等，国际公开号WO91/03162；Sproat，美国专利号5,334,711；和Gold等，美国专利号6,300,074。全部上述参考文献都描述了能对本文描述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖实体进行的各种化学修饰。
在现有技术中有一些实例描述了能够引入核酸分子并且会显著提高其核酸酶稳定性和功效的糖、碱基和磷酸修饰。例如，寡核苷酸通过用核酸酶抗性基团，例如，2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟代、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-H核苷酸碱基修饰来修饰，以提高稳定性和/或提高生物活性。综述参见Usman和Cedergren,TIBS 17:34,1992；Usman等，Nucleic Acid Symp.Ser.31:163,1994；Burgin等，Biochemistry 35:14090,1996。核酸分子的糖修饰已经被现有技术所广泛描述。参见Eckstein等，国际公开PCT号WO92/07065；Perrault等，Nature 344:565-568,1990；Pieken等，Science 253:314-317,1991；Usman和Cedergren,Trends in Biochem.Sci.17:334-339,1992；Usman等，国际公开PCT号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，J.Biol.Chem.270:25702,1995；Beigelman等，国际PCT公开号WO97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824；Usman等，美国专利号5,627,053；Woolf等，国际PCT公开号WO98/13526；Thompson等，Karpeisky等，Tetrahedron Lett.39:1131,1998；Earnshaw和Gait,Biopolymers(NucleicAcid Sciences)48:39-55,1998；Verma and Eckstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134,1998；和Burlina等，Bioorg.Med.Chem.5:1999-2010,1997。这些出版物描述了确定将糖、碱基和/或磷酸修饰等引入核酸分子而不调节催化性的位点的常规方法和策略。在这些指导下，如本文所述，类似的修饰可用于修饰本发明的siRNA核酸分子，只要siRNA在细胞内促进RNAi的能力不被显著抑制。
虽然包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸酯键的寡核苷酸核苷酸间键的化学修饰会提高稳定性，但是过度的修饰会导致某些毒性或降低活性。因此，当设计核酸分子时，应该最小化这些核苷酸间键的量。这些键的浓度降低就会降低毒性，而使这些分子获得增加的效力和较高的特异性。
在一些实施方式中，本发明涉及具有磷酸骨架修饰的修饰的siRNA分子，所述磷酸骨架修饰包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰酰胺化物、聚酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸酯、缩甲醛(formacetal)、硫代缩甲醛(thioformacetal)和/或烷基甲硅烷基取代。寡核苷酸骨架修饰的综述参见Hunziker和Leumann,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in ModernSynthetic Methods,VCH,1995,第331-417页，和Mesmaeker等，"Novel BackboneReplacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications in Antisense Research,"ACS,1994,第24-39页。
递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，Trends Cell Bio.2:139,1992；"DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,"Akhtar编辑,1995；Maurer等，Mol.Membr.Biol.16:129-140,1999；Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.137:165-192,1999；和Lee等，ACS Symp.Ser.752:184-192,2000。Beigelman等，美国专利号6,395,713和Sullivan等，PCT WO94/02595进一步描述了递送核酸分子的常规方法。这些指导方案可以用于递送几乎任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的各种方法来施用给细胞，包括但不限于通过脂质体内部或外部包裹、通过离子电渗或通过引至其它载体，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见如Gonzalez等，Bioconjugate Chem.10:1068-1074,1999；Wang等，国际PCT公开号WO03/47518和WO03/46185)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见如美国专利号6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430)、生物可降解纳米胶囊和生物粘性微球，或通过蛋白质载体(O'Hare和Normand，国际PCT公开号WO00/53722)。可选地，核酸/载体组合物可以通过直接注射或采用输注泵来局部递送。直接注射本发明核酸分子，无论经皮下、经肌肉内或经皮内，都可以利用常规针和注射器操作法或采用无针技术进行，如Conry等，Clin.Cancer Res.5:2330-2337,1999和Barry等，国际PCT公开号WO99/31262中所描述的。本发明的分子可以用作药物制剂。药物制剂预防、调节受治疗者疾病状态的发生，或治疗受治疗者疾病状态(减轻症状至某种程度，优选全部症状)。
“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意思是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、删除、取代和/或改变一种或多种核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。所述改变可以包括例如在RNA的一个或多个核苷酸上添加非核苷酸物质到如siRNA末端或内部。在本发明的RNA分子中的核苷酸还包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作天然存在的RNA的类似物或相似物。
“帽结构”是指在寡核苷酸的任一末端所引入的化学修饰(参见，如Adamic等，美国专利号5,998,203，引入本文作为参考)。这些末端修饰保护核酸分子免受核酸外切酶降解，并且帮助在细胞内的递送和/或定位。该帽可以存在在5'-端(5'-帽)或3'-端(3'-帽)或可以存在着两端。在非限制性实例中，5'-帽包括但不限于甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)；4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；碱基修饰的核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3',4'-开环核苷酸；无环3,4-二羟基丁基核苷酸；无环3,5-二羟基戊基核苷酸，3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向无碱基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3'-氨基磷酸酯；磷酸己酯；磷酸氨基己酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。
3'-帽的实例包括但不限于甘油基、反向脱氧无碱基残基(部分)、4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；碱基修饰的性核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3',4'-开环核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向无碱基部分；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；桥连和/或非桥连5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥连甲基膦酸酯和5'-巯基部分(详细描述参见Beaucage和Lyer,Tetrahedron 49:1925,1993；其引入以供参考)。
术语“非核苷酸”是指能引至核酸链代替一种或多种核苷酸单元(包括糖和/或磷酸取代)且允许残留碱基表现其酶活性的任何基团或化合物。所述基团或化合物是无碱基的，原因是不包含常规公认的核苷酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，因此在1'-位置缺失碱基。
在本文中，“核苷酸”如本领域所公认的，包括天然碱基(标准)和本领域熟知的修饰的碱基。所述碱基通常位于核苷酸糖部分的1'位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸基团。核苷酸可以在糖、磷酸和/或碱基部分是未修饰的或修饰的，(还可互换地称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见，如Usman和McSwiggen，见上；Eckstein等，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等，国际PCT公开号WO93/15187；Uhlman&Peyman，见上，其在此全部引入以供参考)。本领域已知的修饰的核酸碱基的一些实例总结在Limbach等，Nucleic Acid Res.22:2183,1994。可引入核酸分子的碱基修饰的某些非限制性实例包括肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二羟尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如胸腺嘧啶核苷)、5-卤代尿苷(如5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔等(Burgin等，Biochemistry 35:14090,1996；Uhlman和Peyman，见上)。该方面中“修饰的碱基”意思是在1'位置上除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或其等同物。
“靶位点”或“靶序列”或“靶定的序列”意思是靶核酸(如RNA)内部的序列，即通过siRNA构建体介导切割而被“靶向标”，所述siRNA构建体在其反义区内含有互补于靶序列的序列。
siRNA分子可以与DILA2氨基酸化合物或阳离子脂质复合，封装在脂质体内，或以其它方式递送到靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以被引至或不引至生物聚合物内，通过注射、输注泵或支架局部给药。在另一个实施方式中，聚乙二醇(PEG)可以共价地连接本发明的siRNA化合物或多肽或两者。连接的PEG可以是任何分子量，优选约2,000至约50,000道尔顿(Da)。
正义区可以通过连接子分子，如多核苷酸连接子或非核苷酸连接子，与反义区相连。
“反向重复序列”是指含有正义和反义元件的核酸序列，当该重复序列被转录时，所述正义和反义元件的位置能够让它们可以形成双链的siRNA。反向重复序列可以任选地包括连接子或异源序列，如在重复序列的两个元件间的自切割核酶。反向重复序列元件具有足够的长度，以便形成双链RNA。通常，反向重复序列的各元件为约15至约100个核苷酸长，优选约20至30个碱基的核苷酸，优选约20至25个核苷酸长，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其单链或双链型聚合物。该术语包括含已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，该核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，且以与参照核苷酸相似的方式代谢。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
“大双链RNA”是指尺寸大于约40bp的任何双链RNA，例如大于100bp或更优选大于300bp。大dsRNA的序列可以代表mRNA片段或完整mRNA。大dsRNA的最大尺寸不受本文的限制。双链RNA可以包括修饰的碱基，其中可以对磷酸糖骨架或核苷进行修饰。所述修饰可以包括氮或硫杂原子或本领域已知的任何其它修饰。
双链结构可以由自身互补的RNA链来形成，如出现发夹或微RNA，或通过两条不同的互补RNA链退火。
“重叠”是指两个RNA片段在一条链上具有多个核苷酸重叠的序列，例如其中多个核苷酸(nt)数量少到2至5个核苷酸或5至10个核苷酸或更多。
“一种或多种dsRNA”是指在初级序列基础上相互不同的dsRNA。
“靶基因或mRNA”是指任何感兴趣的基因或mRNA。靶基因或mRNA可以包括发育基因和调节基因，以及代谢或结构基因或编码酶的基因。靶基因可以是内源或外源的。靶基因可以以直接或间接影响表型特征的方式在表型被研究的那些细胞中或在生物体中表达。所述细胞包括成体或胚胎动物或植物体内的任何细胞，包括配子或任何分离的细胞，如存在于永生细胞系或原代细胞培养物中。
递送活性剂的应用
本发明的化合物和组合物可以用于递送任何生理学上或生物学上的活性剂以及活性剂的任何组合，如上所述或如本领域所知。活性剂可以在本发明的组合物和用途中以足以提供期望的生理学上的或改善的效应的量存在。
本发明的化合物和组合物能够定向地提高在哺乳动物受治疗者内的一系列的药剂和生物学活性剂的递送，包括小分子化合物和药物、肽、蛋白、抗体、单克隆抗体、基于抗体的药物和疫苗试剂。
活性剂的实例包括肽、蛋白、核酸、双链RNA、补血剂、抗感染药；抗痴呆药；抗病毒剂、抗肿瘤剂、、解热药、止痛剂、消炎药、抗溃疡剂、抗变应性剂、抗抑郁剂、精神药物、强心剂、抗心律失常剂，血管扩张剂、抗高血压药、降压利尿剂、抗糖尿药、抗凝剂、降胆固醇剂、骨质疏松症治疗剂、激素、抗生素、疫苗、细胞因子、激素、生长因子、心血管因子、细胞粘附因子、中枢或周围神经系统因子、体液电解质因子、血液有机物质、骨生长因子、胃肠道因子、肾因子、结缔组织因子、感官因子、免疫系统因子、呼吸系统因子、生殖器官因子、雄激素、雌激素、前列腺素、生长激素、促性腺激素、白介素、类固醇、细菌性类毒素、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、抗体片段和免疫球蛋白。
活性剂的实例包括促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素、因子VII、因子VIII、因子IX、干扰素、肝素、水蛭素原、水蛭联(hirulos)和水蛭素。
活性剂的实例包括吗啡、氢吗啡酮、氧吗啡酮、羟甲左吗喃、烯丙左吗喃、可待因、纳美芬、纳洛芬、纳洛酮、纳屈酮、丁丙诺啡、布托啡诺或纳布啡、可的松、氢化可的松、氟氢可的松、泼尼松、氢化泼尼松、甲泼尼龙、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松、氟轻松、秋水仙素、醋氨酚、非甾体抗炎剂NSAID、阿昔洛韦、利巴韦林、三氟胸苷、阿糖呋喃糖腺嘌呤(Ara-A)、酰基鸟苷、去甲脱氧鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、二脱氧腺苷、二脱氧胞苷、安体舒通、睾酮、雌二醇、黄体酮、促性腺激素、雌激素、孕酮、罂粟碱、硝基甘油、舒血管肠肽、降钙素基因相关肽、赛庚啶、多虑平、丙咪嗪、甲腈咪胺、右美沙芬、氯氮平、超氧物歧化酶、神经脑啡肽酶、两性霉素B、灰黄霉素、咪康唑、酮康唑、噻康唑、伊曲康唑、氟康唑、头孢菌素、四环素、氨基葡糖苷、红霉素、庆大霉素、多粘菌素B、五氟尿嘧啶、博来霉素、氨甲喋呤、羟基脲、二脱氧肌苷、氟尿苷、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、去甲氧正定霉素、紫杉酚、紫杉醇、生育酚、奎尼丁、哌唑嗪、异搏定、硝苯吡啶、硫氮草酮、组织纤溶酶原激活物TPA、表皮生长因子EGF、酸性或碱性成纤维细胞生长因子FGF、血小板衍生生长因子PDGF、转化生长因子TGF-α或β、舒血管肠肽、肿瘤坏死因子TNF、下丘脑释放因子、促乳素、促甲状腺激素TSH、促肾上腺皮质激素ACTH、甲状旁腺素PTH、促卵泡激素FSF、黄体生成素释放激素LHRH、内啡肽、胰高血糖素、降钙素、催产素、卡贝缩宫素、aldoetecone、脑啡肽、生长抑素、生长激素、生长调节素、α-黑色素细胞刺激素、利多卡因、舒芬太尼、特布他林、氟哌利多、东莨菪碱、促性腺激素释放激素、环吡司、丁螺环酮、色甘酸钠、咪达唑仑、环孢菌素、赖诺普利、卡托普利、地拉普利、雷尼替丁、法莫替丁、超氧化物歧化酶、天门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胰蛋白酶、化学胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、铃蟾肽、P物质、加压素、α-球蛋白、转铁蛋白、血纤蛋白原、β-脂蛋白、β-球蛋白、凝血素、血浆铜蓝蛋白、α2-糖蛋白α2-球蛋白、胎球蛋白、α1-脂蛋白、α1-球蛋白、白蛋白和前白蛋白。
活性剂的实例包括阿片样物质或阿片样物质拮抗剂、例如吗啡、氢吗啡酮、氧吗啡酮、羟甲左吗喃、烯丙左吗喃、可待因、纳美芬、纳洛芬、纳洛酮、纳屈酮、丁丙诺啡、布托啡诺和纳布啡；皮质酮、例如可的松、氢化可的松、氟氢可的松、泼尼松、氢化泼尼松、甲泼尼龙、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松、氟轻松；其它消炎药、例如秋水仙素、布洛芬、茚甲新和吡罗昔康；抗病毒药物，例如阿昔洛韦、利巴韦林、三氟胸苷、阿糖呋喃糖腺嘌呤、酰基鸟苷、去甲脱氧鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、二脱氧腺苷、二脱氧胞苷；抗雄激素例如安体舒通；雄激素、例如睾酮；雌激素、例如雌二醇；孕酮；肌肉松弛剂、例如罂粟碱；血管扩张剂、例如硝基甘油、舒血管肠肽和降钙素相关基因肽；抗组胺、例如赛庚啶；具有组胺受体位点阻断活性的试剂、例如多虑平、丙咪嗪和甲氰咪胺；止咳药、例如右美沙芬；神经松弛剂例如氯氮平；抗心律失常药；镇痫剂；酶，例如超氧化物歧化酶和神经脑啡肽酶；抗真菌剂，例如两性霉素B、灰黄霉素、咪康唑、酮康唑、噻康唑、伊曲康唑和氟康唑；抗细菌剂、例如青霉素、头孢菌素、四环素、氨基葡糖苷、红霉素、庆大霉素、多粘菌素B；抗癌剂、例如五氟尿嘧啶、博来霉素、氨甲喋呤和羟基脲、双脱氧肌苷、氟尿苷、6-巯基嘌呤、阿霉素、道诺霉素、去甲氧正定霉素、紫杉酚和紫杉醇；抗氧化剂、例如生育酚、类视黄醇、类葫萝卜素、泛醌、金属螯合剂和植酸；抗心律失常剂、例如奎尼丁；抗高血压剂例如哌唑嗪、维拉帕米、硝苯吡啶和地尔硫卓；镇痛药例如醋氨酚和阿斯匹林；单克隆和多克隆抗体、包括人源化抗体和抗体片段；反义寡核苷酸；和RNA、调节性RNA、干扰性RNA、DNA和含有编码治疗肽和蛋白的基因的病毒载体。
用于给药的组合物和制剂
在本文中，术语“给药”包括直接和间接地递送化合物或组合物至作用位点的全部方法。本发明的化合物和组合物可以单独给药，或者与本文未公开的其他化合物、组合物或治疗剂组合给药。
本发明的组合物和方法可以通过各种粘膜给药模式给药至受治疗者，包括经口、经直肠、经阴道、经鼻内、经肺内或经透皮递送，或通过局部递送至眼、耳、皮肤或其它粘膜表面。在本发明的一些方面，粘膜组织层包括上皮细胞层。上皮细胞可以是肺部的、气管的、支气管的、齿槽的、鼻的、口腔的、表皮的或肠胃的。本发明的组合物可以使用推进器给药，如机械喷雾器，以及加压的、电动的或其它类型的推进器。
本发明的组合物可以作为鼻或肺喷雾以水溶液给药，而且可以采用本领域技术人员熟知的各种方法以喷雾形式分散。本发明组合物的肺部递送可以通过将组合物以液滴、颗粒或喷雾的形式给药来实现，其可以是，例如、烟雾化的、雾化的或成雾状的。肺部递送可以以液滴、颗粒或喷雾形式，通过鼻或支气管通道来进行组合物给药。组合物颗粒、喷雾或气溶胶可以是液体或固体形式。适合以鼻部喷雾来分散液体的优选系统公开在美国专利号4,511,069中。所述制剂可以便利地通过将本发明的组合物溶解在水中以制备水溶液，并将所述溶液灭菌来制备。制剂可以存在于多剂容器中，例如美国专利号4,511,069公开的密封性分散系统中。其它适合的鼻部喷雾递送系统描述于Transdermal Systemic Medication,Y.W.Chien ed.,Elsevier Publishers,New York,1985中；和美国专利号4,778,810中。另外的气溶胶递送形式可以包括例如压缩空气喷雾器、喷射喷雾器、超声喷雾器和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在药物溶剂例如水、乙醇或其混合物中的生物活性剂。
本发明的鼻部和肺部喷施溶液通常包括药物或要递送的药物，任选地与表面活性剂如非离子表面活性剂(如聚山梨醇酯-80)和一种或多种缓冲液一起配制。在本发明的某些实施方式中，鼻部喷施溶液进一步包括推进剂。鼻部喷施溶液的pH可以是约pH 6.8至7.2。使用的药学溶剂还可以是pH 4至6的弱酸性水缓冲液。可以添加其它组分来增强或保持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。
在某些实施方式中，本发明是包括含有本发明组合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻内喷雾或气溶胶的推进器的药品。
本发明组合物的剂型可以是液滴或乳剂形式、或是喷雾剂形式的液体。
本发明的组合物的剂型可以是固体，其可以在施用前在液体中重构。固体可以以粉末给药。固体可以是胶囊、片剂或凝胶形式。
在本发明中为了配制适合肺部递送的组合物，可以将生物活性剂与不同药学上可接受的添加剂或递送增强组分以及适合分散活性剂的基质或载体组合。添加剂或递送增强组分的实例包括pH调节剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸和它们的混合物。其它添加剂或递送增强组分包括局部麻醉剂(如苄醇)、等渗剂(如氯化钠、甘露醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(如吐温80)、增溶剂(如环糊精和其衍生物)、稳定剂(如血清白蛋白)和还原剂(如谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物是液体时，参考将0.9％(重量/体积)生理盐溶液的张力作为单位所测定，通常将制剂的张力调节到在给药位点的粘膜内不会引起实质上不可逆的组织损害的值。通常，将溶液的张力调节到约1/3至3的值，更通常是1/2至2，最通常是3/4至1.7。
生物活性剂可以分散在基质或载体内，其可以包含具有分散活性剂和任何需要的添加剂能力的亲水性化合物。基质可以选自范围广泛的适合载体，包括但不限于聚羧酸或其盐、羧酸酐(如马来酸酐)与其它单体(如(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物；亲水性乙烯基聚合物，如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；纤维素衍生物，如羟甲纤维素、羟丙纤维素等；和天然聚合物，如壳聚糖、胶原、海藻酸钠、明胶、透明质酸和它们的无毒金属盐。生物可降解的聚合物可以选作基质或载体，例如聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-羟基乙酸)共聚物和它们的混合物。合成的脂肪酸酯，如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸糖酯等可被用作载体。亲水性聚合物和其它载体可以单独使用或者组合使用，可通过部分结晶化、离子键合、交联等来赋予该载体提高的结构完整性。提供的载体可以是各种形式，包括用于直接施用至鼻粘膜的流体或粘性溶液、凝胶、贴剂、粉末、微球和膜剂。使用本发明所选的载体可以促进生物活性剂的吸收。
生物活性剂可以按照各种方法与基质或载体组合，活性剂的释放可以通过扩散、载体分解或相关的水通道制剂而进行。在某些情况下，活性剂分散在自适合的聚合物如2-氰基丙烯酸异丁酯(参见，如Michael等，J.Pharmacy Pharmacol.43:1-5,1991)制备的微胶囊(微球)或纳米胶囊(纳米球)内，和分散在施于鼻粘膜的生物相容性的分散介质内，这会在延长的时间内产生持续不断的递送和生物活性。
用于粘膜、鼻或肺部递送的制剂可以包括作为基质或赋形剂的亲水性低分子量化合物。所述亲水性低分子量化合物提供通道介质，水溶性活性剂如生理性活性肽或蛋白通过该通道介质可以通过该基质扩散至吸收活性剂的身体表面。亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或给药环境吸收水分和溶解水溶性活性肽。亲水性低分子量化合物的分子量通常不大于10,000，且优选不大于3000。亲水性低分子量化合物的实例包括多元醇化合物，如寡糖、二糖和单糖，包括蔗糖、甘露醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油、聚乙二醇和它们的混合物。进一步的亲水性低分子量化合物的实例包括N-甲基吡咯烷酮，醇(如寡乙烯基醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)和它们的混合物。
本发明的组合物可选地包括与所需生理条件近似的药学上可接受的载体物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂和润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和它们的混合物。对于固体组合物，可以使用无毒的药学上可接受的载体，其包括例如药物梯度的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
在本发明的某些实施方式中，生物活性剂可以以时间释放制剂的形式给药，例如，以在包括缓慢释放聚合物的组合物中的形式。活性剂可以采用防御快速释放的载体来制备，例如控释载体，如聚合物、微胶囊化的递送系统或生物粘性胶。在本发明的各种组合物中，活性剂的延长递送可以大约通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶)来获得。
在本发明的某些实施方式中，组合物可以包括一种或多种天然或合成表面活性剂。某些天然的表面活性剂可存在于人肺(肺表面活性剂)中，是磷脂和蛋白的复合混合物，该混合物在肺泡的空气-液体表面形成单层，降低呼气时的表面张力接近于0，并防止肺泡破裂。超过90％(重量)的肺表面活性剂是由磷脂组成，其中大约40至80％是DPPC，且剩余的是不饱和的卵磷脂POPG、POPC和磷脂酰甘油。剩余的10％(重量)的表面活性剂由血浆蛋白和脱辅基蛋白(如表面蛋白(SP)-A、SP-B、SP-C和SP-D)组成。
可用于本发明的天然的表面活性剂的实例包括SURVANTATM(贝拉康坦)、CUROSURFTM(poractantalfa)和INFASURFTM(calfactant)和它们的混合物。
合成的表面活性剂的实例包括：西那普肽；二棕榈酰卵磷脂、棕榈酰油酰磷脂酰甘油和棕榈酸的组合物；SURFAXINTM(lucinactant)；和EXOSURFTM(colfosceril)；可以包括四丁酚醛、DPPC和十六醇的组分；和它们的混合物。
制备递送组合物的方法包括利用塞满规定孔径的聚碳酸酯薄膜滤剂的NorthernLipids Lipex Extruder系统的乙醇注射法和挤压法。可以使用利用探针针尖和浴超声波仪的超声处理法来获得均匀大小的颗粒。均质和单分散颗粒大小可以通过不添加核酸组分来获得。对于体外转染组合物来说，在转染剂制成并用缓冲组分稳定后，可以添加核酸组分。对于体内递送组合物来说，核酸组分是制剂的一部分。
本发明的组合物和制剂可以通过各种途径来给药，例如以经由静脉、肠胃外或腹膜内途径实现全身递送。在某些实施方式中，可以细胞内递送制剂,例如在靶组织如肺或肝的细胞中，或在炎性组织中。本发明包括通过移取受治疗者细胞，将试剂递送至已移出的细胞内，并将细胞再引至受治疗者内，来递送制剂的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明提供了体内递送制剂的方法。可以将组合物经静脉、皮下或腹膜内给药至受治疗者。在某些实施方式中，本发明提供了体内递送制剂至哺乳动物患者肺部的方法。
本发明的活性剂脂质体组合物可以用在用于体内的药物组合物中。向受治疗者施用本发明的活性剂脂质体组合物可以通过肠胃外、口服、通过吸入、局部、粘膜、直肠或口颊途径。肠胃外使用包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内(intrasynovial)、干内(intrastemal)、鞘内、病灶内、颅内注射或输注技术。
用于治疗特定疾病的本发明活性剂脂质体组合物的有效量通常是足以改善或减轻疾病症状的量。所述组合物可以作为单剂量施用，或者可以通过重复给药而施用。
其它实施方式
本文引用的全部出版物、参考文献、专利、专利出版物和专利申请都明确地以其整体引入本文作为参考。
虽然本发明描述了一些实施方式，且许多详细内容是为了进行说明，本领域的技术人员显而易见的是，本发明包括另外的实施方式，且本文描述的某些详细内容可以适当地在不脱离本发明的情况下改变。本发明包括所述另外的实施方式、改变和相等物。特别是，本发明包括各种说明性的组分和实例的特征、术语或要素的任意组合。
本文使用的术语“一个(种)”和本发明描述的和权利要求中的类似术语解释为包括单数和多数。
术语“含有”、“具有”、“包括”和“”解释为开放式术语，其意思是例如“包括但不限于”。因此，术语如“含有”、“具有”、“包括”和“包含”解释为包括性的，而不是排他性的。
本文一定范围的数值叙述是指落入该范围内的单独的各值和任何分散数值，如同其在本文单独叙述一样，而不论该范围内的某些数值是否确切表述。例如，范围“4至12“包括且并不限于数值5、5.1、5.35和大于或等于4且小于或等于12的任何其它整数、分数或有理数。应该理解，本文使用的特定值是示例性的，且并不限制本发明的范围。
本文一定范围的碳原子数量的叙述是指落入该范围内的单独的各值和任何分散数值，如同其在本文单独叙述一样而不论该范围内的某些数值是否确切表述。例如，术语“C1-22“包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21和C22。
本文提供的技术术语定义应该解释为包括没有说明的那些与本领域技术人员已知的术语相关的意思，且并不意欲限制本发明的范围。本文提供的技术术语定义应该解释为优于本领域的可选定义或通过参考引入本文的定义，在某种程度上可选定义会跟本文提供的定义发生冲突。
本文所给的实施例，和本文所用的示例性语言仅仅是出于解释的目的，且并不意欲限制本发明的范围。
当给出了一系列实施例时，如适合本发明的一系列化合物或分子，对于本领域的技术人员来说，很显然所列的化合物或分子的混合物也是适合的。
实施例
实施例1
制备含有RNA的脂质体制剂的方法
本实施例描述了用于制备含有RNA的脂质体制剂的方法的实施方式。所述方法中使用的一些物质总结于以下：
C18:1-正Arg-C16(棕榈酰油酰正精氨酸,PONA)(MDRNA,Inc.)(化学式量683.3)
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(DMPE-PEG2k)(Genzyme Pharmaceuticals,Cambridge,Mass.)
胆固醇(Solvay Pharmaceuticals)
胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)GMP(Merck Eprova AG)
乙醇(纯的，200标准酒精度)；注射用无菌水
磷酸钠：单价碱，无水，二价碱，无水
蔗糖,99+％
5N氢氧化钠；2N盐酸；冰醋酸
三乙醇胺(Tris)USP级(Research Organics)
150mL容量的0.2μm过滤瓶,PES
校准的20μL、200μL和1mL Rainin移液器
Iso-disc滤器PTFE25-10
Cole-Parmer在线静止混合仪
Watson Marlow 520Di泵；Watson Marlow 523泵；Filtertec泵
Vivaflow 50100,00MWCO PES(Sartorius)
Slide-a-Lyser渗析盒10,000MWCO(Pierce)
按照以下步骤制备缓冲溶液蔗糖磷酸(SUP)制剂缓冲剂(20mM磷酸钠、215mM蔗糖，pH7.4)。将2.17g无水磷酸二氢钠和8.79g无水磷酸氢二钠加入至含3600mL Milli-Q DI水的量筒中，并利用搅拌棒充分混合。利用5N氢氧化钠或2N盐酸将pH调节至pH7.4。缓慢加入294.38g蔗糖并充分溶解。将最终水体积调节至4L。利用0.2μm滤器过滤溶液。
按照以下步骤制备含25mM脂质体形成分子的90％v/v乙醇USP储备溶液。将90mL乙醇USP(200标准酒精度)分散在经高压灭菌的干净的100mL Pyrex瓶中。向乙醇中连续加入1291umol C18:1-正Arg-C16(PONA)、721.6umol胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)粉、61.7umol DMPE-PEG2K粉和515umol胆固醇。将所述组分均加入至溶液中并利用搅拌棒充分混合。对混合物进行超声处理15分钟。加入10mL注射USP用无菌水并充分混合。将所述储备溶液通过1um孔径的ISO-DISC滤器PTFE-25mm过滤。将储备溶液储藏在80℃并通过具有蒸发光散射检测的反相HPLC分析DILA2氨基酸化合物和脂质组分。
按照以下步骤在注射用无菌水中制备siRNA储备溶液。将5mL注射用无菌水分散在无菌的15mL Falcon管中。向管中加入100mg siRNA粉并充分涡旋。利用10mL注射器使溶液通过0.22uM Millex GP滤器单元过滤。将siRNA溶液储藏在-20℃并以1:1000稀释以通过OD(A260和A280)检测纯度和浓度。
用Watson Marlow 520Di蠕动泵校准流速为40mL/分钟。将泵设定为210rpm并且从管道系统分离。通过泵过40mL 90％的乙醇以清洗管线。将乙醇泵至烧杯中15秒并称重以确定流速(mL/分钟)。调节泵速以提供40±0.5mL/分钟的流速。以类似的方式对用于siRNA和蔗糖磷酸溶液的泵进行校准。
使用三种溶液按照下述步骤制备siRNA制剂。(a)用于泵送的第一溶液为siRNA溶液。通过在50mL锥形管用SUP缓冲剂稀释siRNA并充分涡旋来制备第一溶液。(b)用于泵送的第二溶液是DILA2氨基酸化合物和三种脂质的溶液。制备包含以下脂质的混合脂质的90％乙醇储备液：CHEMS、胆固醇和DMPE-PEG。。向所述脂质储备液中加入DILA2氨基酸化合物。向所述脂质储备液中加入含Tris的注射用无菌水溶液试样，以在溶液中形成1:1摩尔Tris:CHEMS浓度。通过用正置换移液器将混合的脂质储备液移至50mL锥形管中，用90％乙醇稀释并充分涡旋，制备用于泵送的第二溶液。(c)用于泵送的第三溶液为SUP缓冲溶液。
按照以下步骤制备siRNA制剂。将第一siRNA溶液和第二脂质体形成分子溶液同时泵至撞击流体中。将前1mL流出的撞击流体丢弃，然后将siRNA制剂收集在器皿中。使用Watson Marlow 323泵将SUP缓冲溶液泵至器皿中，以将乙醇的浓度调节至约33％。在板式磁性搅拌仪上在温和震荡下将siRNA制剂在器皿中温育1小时。
温育之后，将制剂荷载至具有10,000MWCO的Pierce slide-a-lyzer渗析盒中，并在4℃用100体积的SUP渗析12-18小时。
该实施例进一步描述了通过切向流和渗滤制备含RNA的脂质体制剂的方法的实施方式。除了用切向流过滤(TFF)过程取代最后的渗析步骤外，siRNA制剂如上文提供。
在板式磁性搅拌仪上在轻柔震荡2分钟内将siRNA制剂稀释至10％(v/v)乙醇终浓度。
用50mL 70％乙醇USP清洗使用Sartorius Vivaflow 50100,000MWCO PES膜的TFF系统，然后利用100mL 70％的乙醇以60mL/分钟的泵流速再循环。用50mL无菌水清洗TFF系统，然后用100mL无菌水以60mL/分钟的泵流速再循环。用50mL SUP清洗TFF系统，然后用100mL SUP以60mL/分钟的泵流速再循环。
将稀释的siRNA制剂荷载至TFF器皿中，并浓缩5次至siRNA的终浓度为0.5mg/mL(进料压力～20psi，滞留物压力<0.2psi，透过液流速～2mL/分钟)。每cm2膜所处理的配制在脂质体组合物中的siRNA的最大量为1mg。
通过5体积SUP(其中乙醇已除去)的渗滤以2mL/分钟的流速对浓缩的siRNA制剂进行过滤。
将浓缩的siRNA制剂进一步浓缩至期望体积(1mg/ml siRNA)。
该实施例进一步描述了通过siRNA脂质体制剂的无菌过滤制备含RNA的脂质体制剂的方法的实施方式。按照以上描述提供siRNA制剂。将10mL siRNA制剂抽入10mL聚丙烯注射器中，并除去气泡。将siRNA制剂通过0.22uM Millex GP滤器单元过滤。对注射器施加中等压力以使10mg siRNA制剂(1mg siRNA/mL)通过Millex GP滤器单元过滤。将该药物产品的1mL试样于80℃储藏在3mL I型无菌玻璃管中以备后用。
实施例2
siRNA脂质体制剂
本发明的脂质体siRNA制剂的实施方式示于表6。
表6：脂质体siRNA制剂
组分 μM MW mg/ml 给药(mg/kg)
dsRNA 7.5 13255.4 0.100 1.0
DMPE-PEG2K 38.5 2815 0.108 1.1
chol 366.2 386 0.141 1.4
CHEMS 506.8 486 0.246 2.5
PONA 929.3 683 0.635 6.3
实施例3
物理过程参数对含RNA的脂质体组合物的影响
在该实施例中，观察了用于收集、温育和淬火的某些过程参数对siRNA脂质体组合物的性质的影响。通过使用实施例1中描述的基本方法制备组合物。
在各个实施例中，所述组合物的活性剂为用于沉默ApoB的dsRNA。所述脂质体形成组分为含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16以及脂质胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、胆固醇(Anatrace CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇-水溶液。
在第一实施例中，如表7所示，观察了收集步骤中有机溶剂的浓度对脂质体粒度以及分散性的影响。根据流速和转移管直径计算有机溶剂乙醇的浓度。表7中各制剂的温育时间均为4小时。
表7：脂质体siRNA制剂的收集和温育
表7的结果表明，总的来说脂质体颗粒的大小随收集器中有机溶剂乙醇浓度的提高而提高。粒度分布的分散性也随有机溶剂浓度的提高而提高。表7的结果表明，利用由撞击流体和收集容器中混合物(pH7.4)制备的脂质体组合物实现了活性siRNA试剂的高水平包裹。
在第二实施例中，观察了温育时间对脂质体siRNA制剂在小鼠体内的基因沉默活性的影响。在小鼠肝脏内测定了脂质体制剂的体内ApoB基因沉默活性。用于沉默ApoB的一些RNAi试剂描述在WO08/109357中。
在小鼠肝脏内测定了某些脂质体制剂在体内的ApoB基因沉默活性并与小鼠血清胆固醇水平相比较。在体内的ApoB mRNA降低活性和体内相应的血清胆固醇降低示于表8。表8中的各脂质体制剂为[C18-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/28/20/2)]。各情况下的剂量均为1.0mg/kg/天。利用收集容器中基于流速和转移管直径的33％的乙醇浓度制备各个制剂。
表8：温育时间对小鼠体内基因沉默活性的影响
温育时间(hr) 体内ApoB敲减(％) 血清胆固醇的降低(％)
0 19 8
1 31 24
2 38 6
4 51 27
表8的结果表明，含有ApoB基因沉默性RNAi试剂的脂质体制剂在体内的基因沉默性敲减活性随温育时间的提高而提高至有利的水平。
在第三实施例中，如表9所示，观察了温育时间对脂质体siRNA制剂在体内的基因沉默活性的影响。在这些试验中，利用渗析而非TFF过滤制备脂质体siRNA制剂。利用撞击流体和收集容器中的混合物(pH7.4)制备所示组合物。如表9所示，收集容器中有机溶剂乙醇的浓度变化为30-36％。表9中的各脂质体制剂为[C18-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/28/20/2)]。
表9：收集容器中各浓度乙醇下温育对脂质体siRNA制剂的体内基因沉默活性的影响
表9的结果表明，当使用温育时间时，含ApoB基因沉默性RNAi试剂的脂质体制剂在小鼠体内的基因沉默活性显著提高至有利水平。
在第四实施例中，如表10所示，观察了对脂质体siRNA制剂淬火对其在小鼠体内的基因沉默活性的影响。在这些试验中，利用撞击流体和收集容器中的混合物(pH7.4)和1小时温育时间来制备脂质体siRNA制剂。如表10所示，收集容器中有机溶剂乙醇的浓度从33％淬火至降低的浓度。表10中的各脂质体制剂为[C18-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k]。通过计算siRNA活性剂在淬火后1小时和48小时的平均粒度和包裹，确定所示制剂的稳定性。
表10：脂质体siRNA制剂的淬火
表10中的结果表明，含有RNAi试剂的脂质体制剂在淬火至低于约25％的乙醇浓度后48小时的时间内保持了RNAi试剂的稳定的平均粒度和高水平包裹。
实施例4
pH对通过温育制备的脂质体组合物的影响
在该实施例中，观察了pH对脂质体组合物的制备的影响。使用实施例1中描述的基本方法通过撞击和温育制备组合物。
所示活性剂为在含水溶液中制备的1mg/mL的沉默ApoB的dsRNA。
所述脂质体形成组分为含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16以及脂质胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、胆固醇(Anatrace CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基酸化合物和脂质的相对量为(50/28/20/2)，其表示用于所示组合物的各组分(C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16/CHEMS/胆固醇/DMPE-PEG2k)相对于DILA2氨基酸化合物加脂质的总量的百分数(w/w)。
如表11所示，在pH7.4和pH4下制备了Z-平均粒度为128-137nm的dsRNA制剂。表11的制剂的制备方法是向撞击流体中加入缓冲剂以调节乙醇的浓度至约33％，然后为湍动混合。收集流体，并将所收集的混合物温育1小时。
表11：pH7.4和4下的脂质体组合物
总之，表11所示的结果以及实施例3的表7、9和10所示的结果表明，在pH为7.4下制备了脂质体包裹的RNAi诱导剂的制剂。
实施例5
通过流速控制制备含RNA脂质体组合物
在该实施例中，通过利用RNAi试剂溶液和脂质体形成组分的溶液的流速控制撞击流体组合物而制备脂质体组合物。利用实施例1描述的基础方法通过撞击和温育制备组合物，不同之处在于对RNAi试剂溶液和脂质体形成组分的溶液的流速进行调节以获得收集容器中没有额外SUP缓冲剂的有机溶剂和RNAi-试剂的某种浓度。利用收集并温育1小时的撞击流体制备所示制剂。pH为7.4，活性剂为用于沉默ApoB的dsRNA。
所述脂质体形成组分为含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg(NH3Cl)-C16以及脂质胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、胆固醇(Anatrace CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基酸化合物和脂质的相对量为(50/28/20/2)。
如表12所示，利用RNAi试剂溶液的流速与脂质体形成组分的溶液的流速之比为1.7:1、3:1和5:1制备dsRNA制剂。
表12：具有受控制的流速比的脂质体组合物的制备
表12的结果表明，利用RNAi试剂溶液的流速与脂质体形成组分的溶液的流速之比为约2至约5制备了具有活性剂的良好包裹和用于小鼠体内ApoB的基因沉默活性的脂质体组合物。
表12的结果表明，利用RNAi试剂溶液的流速与脂质体形成组分的溶液的流速之比为约3至约5实现了低至80nm的平均粒度和低的粒度分散性。
实施例6
含RNA的脂质体组合物的过滤
在该实施例中，观察了通过切向流过滤浓缩活性RNAi试剂在脂质体组合物的制备中的影响。利用实施例1中描述的基本方法通过在收集容器中收集22％EtOH下的撞击流体并温育30分钟而制备pH7.4的组合物。将组合物淬火至EtOH浓度为10％，用于切向流过滤。
所述脂质体形成组分为含DILA2氨基酸化合物C18:1-正Arg-C16以及脂质胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS,Anatrace,CH210)、胆固醇(Anatrace CH200)和DMPE-PEG2k(Genzyme)的乙醇溶液。DILA2氨基酸化合物和脂质的相对量为(50/28/20/2)。
利用Amersham PES柱通过切向流过滤对制剂进行过滤。如表13所示，在所进行的将活性RNAi试剂的浓度浓缩高达16倍的切向流过滤下，所示组合物保持了活性RNAi试剂的稳定的相关粒度和包裹。活性RNAi试剂的终浓度高达5mg/ml。
表13：利用温育和过滤制备的脂质体RNAi制剂的体内基因沉默活性
实施例7
含RNA的脂质体组合物的稳定性
在该实施例中，观察了在提高的温度下持续7天的脂质体组合物的稳定性。使用实施例1中描述的基本方法通过撞击和温育1小时制备组合物。使用湍动混合管，并且收集容器中EtOH的浓度为33％。制备后，将制剂在45℃保持7天。7天后，平均粒度为116nm，包裹为71％。对于经过热处理的制剂，在7天后没有观察到小鼠体内ApoB基因沉默活性的损失。
实施例8
肽结合区
利用染料结合试验测定阳离子肽与RNAi诱导剂结合的相对强度。
以7.8μl制备RNAi诱导剂(10ml)以制备20μg/ml的储备液，然后为75μl/孔。以3.75μl制备SYBR-Gold稀释液(15ml)，对于2.5×储备液为1:4000稀释。
将肽溶解在含5％葡萄糖的Hepes缓冲剂中并稀释。对肽进一步稀释，从而可以向各个孔加入75μl以形成期望的N:P(范围为0-4)。认为肽的纯度为50％，但实际肽量未知。
进行SYBR-Gold染料结合试验。利用每孔150μl的样本体积进行96孔板测定。pH7.4的10mM hepes/5％葡萄糖中dsRNA的终浓度为10μg/ml。将肽稀释至不同的工作溶液从而加入等体积以达到不同的N/P比。对于添加过程，首先加入dsRNA(75μl，20μg/ml)然后为150μl 2.5×SYBR-Gold。然后加入肽(75μl)，以竞争SYBR染料。总体积为300μl。根据缓冲剂中单独的染料背景校正荧光。在Molecular Devices读板仪上读取的SYBR-Goldex/em为495nm/537nm。
通过转移至384孔板以利用Wyatt粒度仪测定，而对制剂粒度进行测定。所转移的96孔板的每个孔均为一式两份。板中保持的体积为200μl。
在适当的时候，通过二硫键还原或酶促裂解触发肽的释放。以半胱氨酸作为末端的肽可以通过谷胱甘肽还原而裂解。含V-Cit的肽可以通过组织蛋白酶B的酶促裂解而裂解。细胞内存在的谷胱甘肽为0.1至10mM，溶酶体中存在的组织蛋白酶B为1mM。(对于0.14ng/μl的组织蛋白酶B，参见BMC Gastroenterology 2002,2:16)。
对于释放，向一式两份的孔之一加入终浓度为1mM的适当分子，然后随时间测定SYBR GOLD荧光。
如图6所示，聚精氨酸结合区与dsRNA的结合随聚精氨酸结合区的长度而提高。在图6中，利用PN3499、肽(SEQ ID NO:353)RRRRRCCRRRRR(总共含10个精氨酸的二聚体肽)观察到了最强的结合(取代SYBR-Gold染料的最佳能力)。
实施例9
在A549细胞中的PPIB基因表达敲减的体外试验
亲环素B(PPIB)基因敲减测定可被用作干扰性RNA递送制剂的主要活性的体外试验。通常，以较小的变化按照以下描述进行测定。
亲环素B(PPIB)基因表达敲减是在人肺泡上皮基底细胞A549中测定的。为了进行PPIB基因敲减测定，用干扰性RNA制剂转染A549细胞，转染后24小时制备总RNA，并通过RT-PCR对PPIB mRNA进行分析。进行36B4(酸性核糖体磷蛋白PO)mRNA表达的QRT-PCR，从而进行标准化。
以7,500个细胞/孔(96孔)接种A549细胞，在培养基中过夜培养。转染时的汇合度为约50％。转染复合物的制备是通过将干扰性RNA加至培养基(OptiMEMTM)并涡旋，分别将递送制剂加至培养基(OptiMEMTM)并涡旋，最后将培养基中的干扰性RNA与培养基中的递送制剂混合，室温下温育20分钟，从而获得转染复合物。用新鲜的OptiMEMTM代替温育细胞的培养基，将转染复合物加至各孔中。在37℃和5％CO2温育细胞5小时，然后添加完全培养基(至最终的胎牛血清浓度10％)，并继续温育直至转染后24小时。
为了进行PPIB基因敲减，将细胞裂解，制备RNA(Invisorb RNA Cell HTS 96-Kit/C，Invitek,Berlin，或RNeasy 96Kit,Qiagen)。在DNA Engine Opticon2热循环仪(BioRad)上，利用一步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)进行定量RT-PCR。
PPIB所用的引物是：
(SEQ ID NO:354)
5’-GGCTCCCAGTTCTTCATCAC-3’(正向)和
(SEQ ID NO:355)
5’-CCTTCCGCACCACCTC-3’(反向)以及
(SEQ ID NO:356)
5’-FAM-CTAGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGG-TAMRA-3’作为探针。
对于36B4，引物是：
(SEQ ID NO:357)
5’-TCTATCATCAACGGGTACAAACGA-3’(正向)和
(SEQ ID NO:358)
5’-CTTTTCAGCAAGTGGGAAGGTG-3’(反向)以及
(SEQ ID NO:359)
5’-FAM-CCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTA-TAMRA-3’作为探针。
本发明的一些双链RNA(dsRNA)的结构示于表14。
表14：双链RNA
在表14中，“mU”表示2'-O-甲基尿苷，“mC”表示2'-O-甲基胞苷，“s”表示硫代磷酸酯键。
实施例10
利用层状载体和所触发的释放肽进行PPIB基因表达敲减
在A549细胞中针对PPIB基因敲减活性对RNAi诱导剂的纳米颗粒载体进行测定。以特定N/P比最初形成dsRNA RNAi诱导剂和所触发的释放肽的二元复合物。加入溶内体试剂，其将N/P比调节至最终值。
通常通过首先将dsRNA涡旋在HEPES/葡萄糖缓冲剂中而制备层状载体制剂。在涡旋下加入所触发的释放肽以与dsRNA复合。对复合物温育15分钟。加入戊二醛并允许核心交联1.5小时。通过加入pH 7.4的1M Tris缓冲液使反应淬火。加入溶内体试剂，并在加入至细胞前温育载体混合物15分钟。
利用含有所触发的释放肽的层状载体进行的PPIB基因表达敲减测定如表15所示。表15的结果表明，在溶内体试剂存在下，含有所触发的释放肽的载体可有效地将活性dsRNA试剂递送至细胞以产生显著的基因沉默作用。
表15：利用所触发的释放肽进行的PPIB基因表达敲减
在该实施例中使用的物质如下：
PN4110
SEQ ID NO:373
WWHHKKRRCCRRKKHHWW
PN3033(diINF7)
SEQ ID NO:374
NH2-GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC-CO2H
最终的N/P比对利用含有所触发的释放肽的层状载体的PPIB基因表达敲减测定的影响，结果如表16所示。表16中的结果表明，在溶内体试剂存在下，含有所触发的释放肽的载体可有效地将活性dsRNA试剂递送至细胞以产生显著的基因沉默作用。此外，表16的结果还表明，在2.5-3.5的较低终N/P比时，含有所触发的释放肽的层状载体在体外的敲减得到增强。
表16：终N/P比对体外基因敲减的影响
实施例11
具有有利的低递送效率比的载体颗粒
利用用PN4110缩合的DX227制备一批载体纳米颗粒。本批的递送效率比为0.63。颗粒直径为223nm(Z-avg,PDI 0.2)。
利用用PN183缩合的DX4227制备一批载体纳米颗粒。本批的递送效率比为1.28。颗粒直径为208nm(Z-avg,PDI 0.2)。
本实施例使用以下物质：
PN183
SEQ ID NO:375
NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRPPQ
实施例12
由荷载有载体颗粒的氨基酸脂质制备的脂质体制剂
利用表17所示的组成制备RNAi试剂和氨基酸脂质的脂质体制剂。针对ApoB的RNAi试剂描述在WO08/109357中。
表17：ApoB RNAi试剂和氨基酸脂质的脂质体制剂
实施例13
利用由荷载有肽缩合物载体颗粒的氨基酸脂质制备的脂质体制剂在体外对HepG2细 胞中ApoB基因沉默敲减
测定了由荷载有肽缩合物载体颗粒的氨基酸脂质制备的脂质体制剂在体外的ApoB基因沉默活性。由在HepG细胞中的体外试验获得ApoB基因敲减活性。计算了所示制剂的标准化的ApoB mRNA表达值。
用于HepG试验的方法和方案如以下：
第1天：向孔中加入25μL复合物，然后向孔中含有10％FBS的DMEM或者无血清的OPTIMEM中加入75μL细胞。对于无血清的OPTIMEM，在4至5小时后加入100μL含20％血清的完全培养基，使最终的FBS浓度为10％。
第2天：在24小时裂解细胞，制备RNA，并针对ApoB和36B4进行qRT-PCR，或者在第3天针对GAPDH mRNA进行qRT-PCR。
制备脂质体制剂[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]，其中C18:1-正Arg-C16是美国专利申请12/114,284中描述的氨基酸脂质。使所示脂质体制剂荷载肽缩合物载体颗粒DX4227/PN4110。最初的N/P比为0.8。与Qneg相比，对于100nMDX4227RNAi试剂，该制剂显示91％的敲减。
如表18所示，制备额外的脂质体制剂[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]并使其荷载有肽缩合物载体颗粒DX4227/PN183。
表18：脂质体制剂在HepG中的体外ApoB基因沉默敲减
如表18所示，与Qneg相比，对于浓度为25nM和2.5nM的DX4227RNAi试剂，这些制剂显示有利的高敲减活性。
实施例14
利用由荷载有肽缩合物载体颗粒的氨基酸脂质制备的脂质体制剂在体内对ApoB基 因的沉默敲减
利用由荷载有含ApoB基因沉默RNAi试剂的肽缩合物载体颗粒的氨基酸脂质制备脂质体制剂。在小鼠体内测定这些脂质体制剂的ApoB基因沉默活性并与小鼠血清胆固醇水平相比。体内ApoB mRNA的活性降低和体内相应的血清胆固醇降低示于表19中。表19中的脂质体制剂为[C18:1-正Arg-C16/CHEMS/chol/DMPE-PEG2k(50/32/16/2)]，并且每种情况下的剂量均为2mg/kg。
表19：利用荷载有肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在小鼠体内沉默ApoB基因
表19的结果表明，荷载有含ApoB基因沉默RNAi试剂的肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在小鼠体内有利地得到良好耐受，原因是，在给药后48小时体重增加整体高于没有肽缩合物载体颗粒的同一制剂。
此外，表19的结果还表明，荷载有肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在体内对ApoB基因沉默具有有利的高活性(在降低ApoB mRNA和降低血清胆固醇两方面)。表19的结果表明，优选1.0的较高初始N/P和0.6-0.7的较低的终N/P。
利用荷载有含ApoB基因沉默RNAi试剂的肽缩合物载体颗粒的氨基酸脂质制备其它脂质体制剂。在小鼠体内测定这些脂质体制剂的ApoB基因沉默活性并与小鼠血清胆固醇水平相比。体内的ApoB mRNA降低活性和体内的相应血清胆固醇降低示于表20。
表20：利用荷载有肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在小鼠体内的ApoB基因沉默
对于表20中荷载有肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂，制剂3的递送效率比为9.21，制剂4的递送效率比为9.86。
表20的结果表明，荷载有含ApoB基因沉默RNAi试剂的肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在小鼠体内有利地得到良好耐受，原因是，在给药后48小时的体重增加，而没有肽缩合物载体颗粒的同一制剂的体重降低。
此外，表20的结果还表明，荷载有肽缩合物载体颗粒的脂质体制剂在体内对ApoB基因沉默具有有利的高活性(在降低ApoB mRNA和降低血清胆固醇两方面)。

Claims (34)

1.一种制备包含活性剂的组合物的方法，所述方法包括：
a)提供第一流体，所述第一流体包含活性剂的含水缓冲溶液，所述活性剂选自基因沉默剂、基因调节剂、反义试剂、肽核酸试剂、核酶试剂、RNA试剂、DNA试剂和药物化合物；
b)提供第二流体，所述第二流体包含处于有机溶剂中的一种或多种脂质体形成化合物的非水溶液，所述有机溶剂易于与水、烷醇、烷醇-水、乙腈、丙酮、酮类、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、表面活性剂溶液、去污剂溶液及它们的混合物混合；其中所述脂质体形成化合物包括胆固醇琥珀酸单酯(CHEMS)和一种或多种非阳离子脂质化合物；
c)使所述第一流体与所述第二流体撞击，由此形成所述有机溶剂浓度为20％至50％v/v且pH为6至7.4的撞击流体；
d)在收集容器中于20℃至35℃的温度下温育所述撞击流体0.5小时至8小时，由此形成含有脂质体的温育物，
其中所述第一流体的体积流率是所述第二流体的体积流率的两倍或更高。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质化合物选自1,2-二月桂酰-sn-甘油(DLG)；1,2二肉豆蔻酰-sn-甘油(DMG)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油(DPG)；1,2二硬脂酰-sn-甘油(DSG)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA)；1,2二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA)；1,2二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DPPA)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA)；1,2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)；1,2二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DMPC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-0-乙基-3-胆碱磷酸(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DPPC)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DSPC)；1,2二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DSPG)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(PLinoPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(POPC)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG)；1-棕榈酰-2-4o-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(P-lyso-PC)；1-硬脂酰-2-lyso-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(S-lyso-PC)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二植烷酰磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DOPC)和1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DPhPC)，和胆固醇。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述烷醇是指C1-C6烷醇。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述C1-C6烷醇选自乙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇。
5.如权利要求1所述的方法，其中烷醇-水是指乙醇-水。
6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括通过向所述温育物中加入足以使所述有机溶剂的浓度小于20％v/v的缓冲剂而使所述温育物淬火。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述第一流体的体积流率是所述第二流体的体积流率的三倍或更高。
8.如权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述第一流体的体积流率是所述第二流体的体积流率的五倍或更高。
9.如权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述撞击流体的pH调节为3至6。
10.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在3至6的pH下温育。
11.如权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述收集容器加入缓冲剂以调节所述有机溶剂的浓度。
12.如权利要求1所述的方法，其进一步包括所述活性剂以大于50％的水平被包裹在脂质体中。
13.如权利要求1所述的方法，其进一步包括所述活性剂以大于70％的水平被包裹在脂质体中。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述活性剂为siRNA、微RNA或UsiRNA。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述脂质体组合物在45℃的温度下保持基因沉默活性达7天。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述脂质体组合物在45℃的温度下保持包裹所述活性剂达7天。
17.如权利要求1所述的方法，其中，在切向流过滤后，所述脂质体尺寸均一，其直径小于160nm。
18.如权利要求1所述的方法，其中，在切向流过滤后，所述脂质体尺寸均一，其平均直径为40nm至160nm。
19.如权利要求1所述的方法，其中，在切向流过滤后，所述脂质体尺寸均一，其平均直径为80nm至150nm。
20.如权利要求1所述的方法，其进一步包括通过切向流过滤和渗滤过滤所述温育物。
21.如权利要求1所述的方法，其进一步包括对所述温育物进行灭菌。
22.如权利要求1所述的方法，其进一步包括用不同的药学上可接受的缓冲剂交换所述有机溶剂。
23.如权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述第一流体中加入有机溶剂使其浓度为1％至40％v/v。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂为C1-C6烷醇浓度为40％至99％v/v的注射用无菌水溶液。
25.如权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂为C1-C6烷醇浓度为70％至95％v/v的注射用无菌水溶液。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述温育时间为1小时至4小时。
27.由权利要求1-26中任一项所述的方法制备的药物组合物。
28.一种体外向生物细胞递送治疗性核酸的方法，其包括根据权利要求1-26中任一项所述的方法制备组合物和用所述组合物处理所述细胞，其中所述方法是非诊断或非治疗目的。
29.一种体外抑制生物细胞中基因表达的方法，其包括根据权利要求1-26中任一项所述的方法制备组合物和用所述组合物处理所述细胞，其中所述方法是非诊断或非治疗目的。
30.权利要求1-26中任一项所述的方法制备的组合物在制备抑制哺乳动物中基因表达的药物中的应用。
31.权利要求1-26中任一项所述的方法制备的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病包括癌、肝病、高胆固醇血症、炎症性疾病、代谢疾病、骨折、心脏病和病毒性疾病。
32.如权利要求31所述的应用，其中所述疾病是膀胱癌、肝癌、关节炎或脑炎。
33.如权利要求32所述的应用，其中关节炎是类风湿关节炎。
34.如权利要求31所述的应用，其中所述疾病是炎症。
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