CN104363961A

CN104363961A - 用于治疗盆底神经源性病症的组合物和方法

Info

Publication number: CN104363961A
Application number: CN201380019080.9A
Authority: CN
Inventors: K·A·狄塞罗斯; E·R·亚当; V·格勒迪纳鲁; S·L·戴普
Original assignee: Leland Stanford Junior University; Circuit Therapeutics Inc
Current assignee: Leland Stanford Junior University; Circuit Therapeutics Inc
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: ES2628006T3; ES2728077T3; US20140024701A1; JP2018052958A; EP2817068A1; US20160038761A1; JP6621791B2; JP6537826B2; EP3205374A1; EP2817068B1; CA2865296A1; AU2013222443B2; EP2817068A4; US11103723B2; AU2013222443A1; JP2015509498A; EP3205374B1; WO2013126521A1; CN104363961B

Abstract

本文提供通过使用能够对使负责膀胱、尿道外括约肌、肛门外括约肌以及男性和女性生殖器的生理功能的肌肉受神经支配的神经细胞进行选择性超极化或去极化的稳定表达的光响应性视蛋白来治疗个体的膀胱功能障碍的方法，所述膀胱功能障碍包括逼尿肌反射亢进和逼尿肌外括约肌协同失调、大便失禁和/或性功能障碍。

Description

用于治疗盆底神经源性病症的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2012年2月21日提交的美国临时专利申请No.61/601,298的权益，该临时申请以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本申请涉及通过使用能够选择性改变使负责泌尿、直肠和性功能的肌肉和器官受神经支配的神经细胞的膜电位的稳定表达的光响应性视蛋白来治疗个体的盆底神经源性病症的方法，所述盆底神经源性病症包括膀胱功能障碍、大便失禁和性功能障碍。

发明背景

“光遗传学”是指用于控制活组织、甚至自由移动的哺乳动物和其它动物内的靶向细胞中的特定事件的遗传学和光学方法的组合，其中时间精度(毫秒时间尺度)是为匹配功能完整的生物系统所需。光遗传学的特点是通过使用特异性靶向机制将快速光响应性离子通道和/或泵蛋白引入靶神经元细胞的质膜，其允许暂时地精确操纵神经元膜电位，同时保持细胞类型解析(参见例如美国专利申请公开No.2007/0054319、No.2009/0093403和No.2010/0145418以及国际专利申请公开号WO 2009/131837和WO 2007/024391)。在短短几年中，光遗传学领域已经推动了关于特定细胞类型如何促进体内生物组织功能(包括骨骼肌和平滑肌与负责其神经支配的神经元之间的相互作用)的基础科学理解。

尿失禁，即不能维持排尿的自主控制，它是一种在世界范围内影响数百万男性和女性的病状。排尿的控制是一个复杂的生理过程，其包括神经反射通路，一些具有中枢神经系统控制、平滑肌和随意肌以及激素作用并且一些没有。(参见DeGroat,1997,Urology 50[增刊6A]:36-52的综述)。很大一部分的尿失禁至少部分具神经源性。临床术语“膀胱过度活动症”一般用于指代任何形式的失禁，其特征在于完全或偶发性的排尿频率或尿意增加，并且其中自主控制丧失的范围为部分至全部。“急迫性尿失禁”是与突然和强烈的尿意相关的非自主尿液流失。急迫性尿失禁经常与逼尿肌的非自主(不受抑制)收缩的尿动力学研究结果相关，所述逼尿肌提供从膀胱中排出尿液的主要动力。具有不受抑制的逼尿肌的患者中的一大部分具有某种神经功能缺损，在这种情况下临床术语为“逼尿肌反射亢进”(DH)。与逼尿肌反射亢进(DH)相关的常见神经病症是帕金森氏病(Parkinson's disease)、中风、糖尿病、多发性硬化(MS)和周围神经病变。另外，遭受创伤性脊髓损伤的个体通常经历与DH相关的症状。

尿道外括约肌还可受脊髓损伤影响，从而导致被称为“协同失调”的病状。协同失调涉及当膀胱收缩时尿道括约肌不能松弛，其包括响应于膀胱排空的主动收缩，阻止尿液流过尿道并导致膀胱的不完全排空和尿液“回流”至肾脏中。

对于逼尿肌反射亢进和尿道外括约肌协同失调的一些治疗依赖于电神经刺激。这种治疗方式依赖于使用相邻待刺激的神经/肌肉定位的电极。用电脉冲激活电极可刺激邻近的神经，从而导致受所述神经支配的肌肉的收缩。然而，电极是非选择性的并且会刺激处在其电场内的每个组织和细胞类型。因此，目前的神经刺激方法和装置不能在细胞类型特异性下局部作用于调节负责与逼尿肌反射亢进和尿道外括约肌协同失调相关的症状的肌肉和神经。

骶神经前根电刺激(SARS，Finetech Medical Limited)是用于恢复具有持续脊髓损伤的患者的膀胱功能的神经刺激装置。SARS需要骶神经根切断术以预防DH/DSD，导致性功能丧失。另外，骶神经根切断术进一步破坏了下泌尿道的传入途径，导致膀胱反射消失或膀胱收缩丧失。结果是，需要手术后电刺激来激活逼尿肌。然而，同时，电极也激活尿道外括约肌，这是因为支配括约肌的神经大于支配逼尿肌的神经并且因此首先募集。因为括约肌的横纹肌相比于逼尿肌的平滑肌更快速地松弛，所以已经受了SARS的个体体验到短暂时间的刺激后排空。然而，除了前述性功能丧失之外，SARS经常导致非常高的膀胱压力，这可能造成短期膀胱输尿管反流并且与肾衰竭长期相关。

用于逼尿肌反射亢进和尿道外括约肌协同失调的其它目前治疗包括永久性或间歇性自我导尿联合抗蕈毒碱剂(例如奥昔布宁(oxybutynin)或托特罗定(tolterodine))、使用α-阻断剂、向尿道外括约肌注射肉毒杆菌毒素(Botulinum Toxin)(例如，(Allergan)或(Ipsen))、尿道外括约肌的球囊扩张以及使用尿道支架。然而，所有这些治疗都具有相当大的缺点，包括需要频繁的重复治疗(在间歇性导管插入和肉毒杆菌毒素施用的情况下)、泌尿道感染增加(导管插入、支架、球囊扩张)、败血病发生率增加(球囊扩张)以及鳞状细胞癌易感性增加(导管插入)。

另一种盆底病症大便失禁是一种由于肠控制减少而导致粪便非自主性排出或泄露的病状。不同程度的大便失禁被认为是许多因素造成的结果，包括肛门括约肌的功能障碍或损伤、盆底功能障碍或直肠顺应性降低。肛门直肠区域的神经供应是躯体性和自主性的。浅会阴神经(阴部神经的分支)向会阴以及肛管粘膜提供感觉纤维。肛门外括约肌从直肠下神经(又名痔下神经，阴部神经的分支)接收其运动神经供应。如同泌尿功能障碍的治疗一样，对于大便失禁的一些治疗依赖于对控制肛门括约肌的肌肉并试图恢复个体的节制的神经进行电刺激。其它的手术治疗如结肠造口术也是常见的。然而，所有这些方法都具有相当大的实际缺点和并发症。

性功能障碍包含各种弊病，包括勃起功能障碍、性高潮功能障碍、早泄和缺乏润滑。性功能障碍困扰着女性和男性，并且可能是终身的或后天的。性功能障碍具有许多生理学和心理学原因，并且在许多患者中病症可能是多因素的。原因包括基本上属于神经源性的若干原因。例如，支配阴茎和阴蒂的自主神经系统所用的途径的损伤可能中断由中枢神经系统发起的性唤起。躯体神经途径(即，与感觉或运动相关的任何神经)的病变(例如，损伤、感染或疾病)可能损害发生反射的性功能(即，对刺激的非自主、本能生理反应)并且可能中断维持性唤起所需的触觉。另外，取决于病变的位置和严重程度，脊髓病变可能产生不同程度的性功能障碍。

目前，还没有精确靶向神经细胞和相关肌肉/器官的良好的长效、具成本效益或有临床意义的疗法，所述神经细胞和相关肌肉/器官在具有与盆底神经源性病症相关的症状的个体中造成有可能产生更多的生理上正常排尿、肠控制和性功能的这些缺陷。

在本说明书通篇中，参考了出版物(例如，科学文章)、专利申请、专利等，其全部以全文引用的方式并入本文中。

发明内容

本文提供通过使用能够对支配膀胱肌肉的神经元、支配尿道外括约肌的神经元、支配肛门外括约肌的神经元、支配负责直肠收缩的肌肉的神经元和/或支配生殖器的神经元进行超极化或去极化的稳定表达的光响应性视蛋白来治疗个体的膀胱功能障碍、大便失禁和性功能障碍的方法，其中超极化或去极化诱发的神经元突触耗竭诱导受所述神经元支配的肌肉的松弛，并且神经元的去极化诱导受所述神经元支配的肌肉的收缩。在一些实施方案中，可通过活化在神经元中表达的一种或多种光响应性视蛋白来诱导逼尿肌收缩和尿道外括约肌松弛以允许排尿。在一些实施方案中，可通过活化在神经元中表达的一种或多种光响应性视蛋白来诱导逼尿肌松弛和尿道外括约肌收缩以允许储尿。在一些实施方案中，可通过活化在神经元中表达的一种或多种光响应性视蛋白来诱导肛门外括约肌收缩以允许粪便储存。在一些实施方案中，可通过活化在神经元中表达的一种或多种光响应性视蛋白来诱导肛门外括约肌松弛以允许排便。此外，可另外通过活化在神经元中表达的一种或多种光响应性视蛋白而诱导的负责直肠收缩的肌肉的同时收缩来促进排便。在一些实施方案中，可通过增加负责生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元的去极化来治疗性功能障碍。

因此，在一些方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在一些方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在一些方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白能够响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许从膀胱中排空尿液，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11组成的群组的序列具有至少95％同一性的序列。

在一些方面，本文还提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白能够诱导神经元的去极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的去极化允许从膀胱中排空尿液并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的去极化允许尿液储存在膀胱中，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11组成的群组的序列具有至少95％同一性的序列。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化允许排便，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ IDNO:1中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化允许排便，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ IDNO:4中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的超极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化允许排便，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与SEQ IDNO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白能够响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许排便，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11组成的群组的序列具有至少95％同一性的序列。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白能够诱导神经元的去极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的去极化允许粪便储存在直肠中，其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的序列具有至少95％同一性的序列。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的性功能障碍的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于负责个体的生殖器神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述视蛋白响应于光而诱导表达视蛋白的神经元的去极化，由此负责生殖器神经支配的神经元的去极化恢复性功能。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含与SEQ IDNO:1中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含与SEQ IDNO:4中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含与SEQ IDNO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一个或多个序列具有至少95％同一性的序列；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在另一个方面，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一个或多个序列具有至少95％同一性的序列；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

在其它方面，本文提供用于治疗有需要的个体的性功能障碍的试剂盒，其包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一个或多个序列具有至少95％同一性的序列；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

附图说明

图1示意性描绘脊髓(包括背外侧核(DLN))的多个截面。

图2描绘表达AAV构建体编码视蛋白的尿道外括约肌(EUS)阴部运动神经元的数目。

图3描绘表达ChR2的阴部神经的光刺激。

图4描绘EUS的光遗传学控制的示例性实施方案。

详细描述

本发明尤其提供用于治疗个体的膀胱功能障碍、大便失禁和/或性功能障碍的方法，其通过选择性改变控制膀胱的充盈和排空、肛门外括约肌的收缩和/或生殖器的肌肉和器官的神经支配的外周神经元细胞的膜电位来实现。本发明人已经开发了使用一种或多种光响应性视蛋白来治疗破坏正常泌尿、直肠和性功能的疾病和病状的方法，所述光响应性视蛋白稳定表达于对负责这些生理过程的肌肉和器官进行神经支配的外周神经细胞中。

对支配逼尿肌和尿道外括约肌(external urinary sphincter/externalurethral sphincter)的神经的膜极化状态进行选择性控制可允许膀胱充盈，而同时允许尿道外括约肌保持“关闭”状态。这可以利用分别通过使用光响应性离子泵或阳离子通道的逼尿肌神经支配的选择性超极化或去极化诱发性突触耗竭，并且允许尿道外括约肌神经支配自然地去极化成关闭状态来实现。可选地，如果尿道外括约肌的神经控制受到破坏、损伤或者以其它方式不能产生足够的肌肉力量来关闭括约肌，则可将光遗传学或传统的电刺激方法与逼尿肌的光遗传学控制组合使用来关闭尿道外括约肌。

当个体感觉尿急或根据预定时程想要排尿时，支配尿道外括约肌的神经可以选择性超极化或经受去极化诱发性突触耗竭，造成括约肌松弛，而同时停止逼尿肌的选择性超极化或去极化诱发性突触耗竭，使其自然地去极化和收缩，从而迫使尿液排出膀胱。然而，如果逼尿肌的神经支配受到破坏、损伤或者以其它方式不能产生足够的肌肉力量来排空膀胱，则可将光遗传学或电刺激方法用于驱动这些神经元的去极化，从而迫使逼尿肌收缩并排空膀胱内含物。

因此，本文公开的方法可以减轻或预防与膀胱功能障碍(例如，逼尿肌反射亢进和逼尿肌外括约肌协同失调)相关的许多症状，包括但不限于白天和夜间遗尿、尿潴留、泌尿道和膀胱感染、膀胱输尿管返流、输尿管水肿、肾结石、肾功能不全和/或肾衰竭。

对支配肛门外括约肌的神经的膜极化状态进行选择性控制可允许控制排便和将粪便储存在直肠中。这可以利用分别通过使用光响应性离子泵或阳离子通道的肛门外括约肌神经支配的选择性超极化或去极化诱发性突触耗竭来实现。当个体感觉迫切需要排便或根据预定时程想要排便时，支配肛门外括约肌的神经可以选择性超极化或经受去极化诱发性突触耗竭，从而造成自然收缩的括约肌松弛。当排便完成时，肛门外括约肌神经支配的光遗传学超极化或去极化诱发性突触耗竭可以停止，从而导致肛门外括约肌恢复其自然关闭状态。可选地，如果肛门外括约肌的神经控制受到破坏、损伤或者以其它方式不能产生足够的肌肉力量来自然关闭括约肌，则可使用光遗传学或传统的电刺激方法来关闭肛门外括约肌。另外，大便节制的控制可以通过直肠神经支配的同时选择性去极化来进一步增强，从而强迫直肠收缩并迫使其内含物进入并通过光遗传学松弛的肛门外括约肌。因此，本文所公开的方法可以减轻或预防大便失禁。

对于支配男性和女性的外生殖器的神经的膜极化状态的选择性控制允许恢复性功能。这可以利用通过使用光响应性阳离子通道对控制性功能(例如，在男性中为勃起、射精或性高潮；以及在女性中为阴道润滑或性高潮)以及恢复维持性唤起所需的触觉的一个或多个骶脊神经和/或阴部神经主干的组分进行选择性去极化来实现。因此，本文公开的方法可以恢复性功能。

一般技术

除非另外说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、免疫学、生理学、泌尿学以及排尿病理生理学的常规技术。这些技术充分解释于例如以下文献中：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook和Russel,2001),(在本文共同称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987,包括至2001年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Publications,New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(在本文共同称为“Harlow和Lane”),Beaucage等编,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000),Handbook of Experimental Immunology,第4版(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,Blackwell Science Inc.,1987)；以及Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)。其它有用的参考文献包括Harrison的Principles of InternalMedicine(McGraw Hill；J.Isseleacher等编)；Corcos和Schickik,Textbook of the Neurogenic Bladder:Adults and Children.(InformaHealth Care,2004)；Walsh等,Campbell's Urology,第8版,(Saunders,2002)；Fecal Incontinence:Diagnosis and Treatment,(Ratto和Doglietto编,Springer,2007)；以及Lechtenberg等,Sexual Dysfunction:Neurologic,Urologic,and Gynecologic Aspects(Lippincott Williams和Wilkins,1994)。

定义

如本文所用，当由于神经递质的末端囊泡储存的耗竭使得神经细胞质膜的连续去极化可阻止神经细胞维持对传出目标的高频动作时，发生“去极化诱发性突触耗竭”。

“个体”可以是哺乳动物，包括人类。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。个体还包括伴侣动物，包括但不限于狗和猫。在一个方面，个体是人类。在另一个方面，个体是非人类动物。

天然蛋白质序列中的氨基酸取代可为“保守性”或“非保守性”并且这些被取代的氨基酸残基可能是或可能不是被遗传密码所编码的氨基酸残基。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上类似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代(即，具有碱性侧链的氨基酸被具有碱性侧链的另一种氨基酸置换)。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上不同侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代(即，具有碱性侧链的氨基酸被具有芳族侧链的氨基酸置换)。将标准的二十种氨基酸“字母”根据其侧链的化学性质而分成多个化学家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有含芳族基团的侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或所需结果的量。对于预防用途，有益或所需的结果包括诸如消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或延迟疾病的发作等结果，所述疾病包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或所需的结果包括诸如减少由疾病产生的一种或多种症状、提高罹患疾病者的生活质量、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、例如通过靶向来增强另一种药物的作用、延迟疾病的进展和/或延长存活等临床结果。可以一次或多次施用来施用有效剂量。就本发明来说，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如临床情形下所了解，可能或可能不结合另一种药物、化合物或药物组合物来实现药物、化合物或药物组合物的有效剂量。因此，在施用一种或多种治疗剂的情形下可考虑“有效剂量”，并且如果结合一种或多种其它剂，则单一剂可考虑以有效量提供，可能实现或已实现所需结果。

如本文所用，“治疗”是获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。就本发明来说，有益或所需临床结果包括但不限于以下一种或多种：减少由疾病产生的症状、提高罹患疾病者的生活质量、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的存活。

如本文所用，“骶脊神经”是指在脊髓与身体中源自脊柱的五个融合骶骨之一(例如S1、S2、S3、S4或S5中的任一种)附近之间带有运动、感觉和自主神经信号的任何混合脊神经。

如本文所用，除非另外说明，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个提及物。

预期在整个本说明书中给出的每个最大数值限度包括每个较低数值限度，就像这些较低数值限度在本文中明确写出一样。在整个本说明书中给出的每个最小数值限度将包括每个较高数值限度，就像这些较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每个数值范围将包括落在这些较宽数值范围内的每个较窄数值范围，就像这些较窄数值范围全部在本文中明确写出一样。

膀胱生理学

健康个体的下泌尿道具有两个离散的活性阶段：储存阶段，其中尿液储存在膀胱中；和排空阶段，当尿液通过尿道释放时发生。这种反射系统受到来自大脑的有意识的信号以及膀胱和尿道内所含的感觉纤维的放电速率控制(Yoshimura和Chancellor,2003,Rev.Urol.5(增刊8):S3-S10)。普通人的膀胱可以容纳350ml至550ml的尿液。当膀胱中液体体积较低时，感觉受体神经放电较低，导致支配尿道外括约肌的神经细胞的兴奋和去极化以及围绕膀胱的逼尿肌的松弛(Blok和Holstege,Neurosci.Lett.,1994,166(1):93-6)。当膀胱几乎充满时，膀胱壁内衬的拉伸受体触发传入放电增加，产生有意识的尿急感。一般来说，当膀胱中有大约200ml的尿液时，人会感觉需要排尿。当个体准备排尿时，他或她有意识地开始排尿，造成膀胱收缩和尿道外括约肌松弛。排尿持续至膀胱完全排空，此时膀胱松弛并且尿道外括约肌收缩以重新开始储存。控制排尿反射的肌肉受到自主神经系统和躯体神经系统控制。在储存阶段，尿道内括约肌保持紧张并且逼尿肌通过交感神经刺激而松弛。在排尿期间，副交感神经刺激造成逼尿肌收缩和尿道内括约肌松弛。尿道外括约肌(又名尿道括约肌)受躯体控制并且在排尿期间有意识地松弛。

膀胱的神经源性功能障碍最经常由排尿控制中所涉及的中枢神经系统或外周神经的细胞的疾病或损伤造成。逼尿肌反射亢进(DH)和逼尿肌-外括约肌协同失调(DSD)是两种由中枢神经系统对排尿反射调节的破坏而产生的病状。本文所述的方法可用于减轻个体中的膀胱功能障碍的症状。

逼尿肌反射亢进

当排尿以挤出尿液时，逼尿肌排尿肌肉(又名逼尿肌、膀胱的固有肌层以及固有肌层)围绕膀胱并收缩。否则，它保持松弛以使膀胱充盈。逼尿肌反射亢进是指逼尿肌异常收缩从而防止膀胱完全排空的神经源性病状。取决于神经系统损伤的部位和性质，DH的症状范围包括逼尿肌活动低下至活动过度。例如，“具有收缩力受损的逼尿肌反射亢进”(DHIC)是指膀胱过度活动症症状，但逼尿肌不能产生足够的压力以使得完全排空。因此，逼尿肌太弱以致于不能进行足够收缩来进行适当排空。所述病状与尿潴留类似，但普遍存在刺激性排尿症状。另外，“逼尿肌反射消失”是指逼尿肌由于下运动神经元病变(例如，骶髓或外周神经)而完全不能排空。

逼尿肌反射亢进的原因是多种多样的。在脑桥上方区域中的大脑病变破坏排尿主控制中心，导致排尿控制完全丧失。然而，下泌尿道的原始排尿反射仍然完好无损。承受这种损伤的个体表现出急迫性尿失禁(又名痉挛性膀胱)。在这种情况下，膀胱快速排空并经常具有相对低体积的尿液。另外，尿液在膀胱中的储存是困难的，并且具有这种问题的个体典型地急着上厕所并且甚至会在到达其目的地之前漏尿。所述病状经常导致在夜间数次睡眠中断，需要个体起身好几趟以解除尿急。可导致逼尿肌反射亢进的症状的脑病变的典型实例包括但不限于中风、脑肿瘤、帕金森氏病、脑积水、脑瘫以及创伤性脑损伤。

脑桥和骶脊髓之间的脊髓疾病或损伤也可导致逼尿肌反射亢进。承受造成截瘫或四肢瘫痪的脊柱损伤的个体典型地经历下肢痉挛。在脊髓创伤后最初的阶段，个体经历运动麻痹所伴随的感觉丧失，其中反射最初丧失但在约6-12周后逐渐恢复。神经系统的这种逐渐恢复经常导致受影响器官(包括膀胱的逼尿肌)的过度刺激。与具有脑病变的个体类似，罹患脊髓创伤的个体经常经历急迫性尿失禁。除了与运动损伤或机动车辆相关的事故之外，多发性硬化(MS)也可造成脊髓疾病。另外，出生时脊髓脊膜膨出的儿童也可能展现神经源性膀胱，产生与逼尿肌反射亢进相关的症状。在本文提供的用于治疗逼尿肌反射亢进的方法的一些方面，在个体中造成逼尿肌反射亢进的神经系统损伤不会发生在位于第二、第三和/或第四骶脊神经(S2、S3、S4)下方的神经细胞中。

导致周围神经病变的疾病也可造成与逼尿肌反射亢进相关的症状。糖尿病和AIDS可损伤或破坏支配膀胱的逼尿肌的神经并且可导致膀胱的沉默和无痛扩张。在膀胱代偿失调之前，具有慢性糖尿病的患者可能首先失去膀胱充盈感。受影响的个体具有排尿困难并且可能还经历DHIC。可造成逼尿肌反射亢进的外周神经系统疾病的其它非限制性实例为脊髓灰质炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、生殖器区域重度疱疹、恶性贫血和神经梅毒。

通过膀胱测压诊断逼尿肌反射亢进，其用于评估膀胱功能。压力-流量研究涉及逼尿肌压力的测量，同时使患者排尿以区分DH与逼尿肌无收缩。其它诊断信息可获自：排尿日记、尿检和培养、血浆电解质和肌酐水平或肾道超声波，其包括排尿后残余(PVR)尿液体积的测量。

逼尿肌-外括约肌协同失调(DSD)

这种排尿障碍与逼尿肌反射亢进类似，不同之处在于当试图排尿时，尿道外括约肌可同时具有与逼尿肌收缩自相矛盾的收缩。通常情况下，逼尿肌与尿道外括约肌协同作用，使得当一者收缩时(例如在储存阶段的括约肌或在排尿阶段的逼尿肌)，另一者松弛(例如在排尿阶段的括约肌或在储存阶段的逼尿肌)。如果膀胱与外括约肌同时收缩，则受影响的个体会感受到强烈的尿意，但实际上可能只能够少量排尿。这种情况的医学术语是逼尿肌-外括约肌协同失调，因为膀胱和外括约肌不能协同作用。即使膀胱试图逼出尿液，外括约肌也会收紧以防止尿液离开。

逼尿肌和尿道外括约肌都通过起源于骶脊髓中的神经来支配。逼尿肌受到由骶脊神经产生的副交感神经逼尿肌神经支配的支配。另一方面，尿道外括约肌受到阴部神经的尿道外括约肌神经支配的支配。阴部神经起源于骶神经丛中并且从第二、第三和第四骶脊神经(S2、S3、S4)的腹侧分支衍生其纤维。它通过梨状肌和尾骨肌之间并通过坐骨大孔的下部离开骨盆。然后，它穿过坐骨的脊椎，并通过坐骨小孔再次进入骨盆。它沿着坐骨直肠窝的侧壁向上和向前伴随着内阴血管，并包含在被称为阴部管的闭孔筋膜鞘内。阴部神经发散出直肠下神经，然后分成两个末端分支：会阴神经，和阴茎背神经(男性)或阴蒂背神经(女性)。肛门下神经在穿过坐骨大孔后不久分支。在本文提供的用于治疗逼尿肌-外括约肌协同失调的方法的一些方面，在个体中造成逼尿肌-外括约肌协同失调的神经系统损伤不会出现在位于第二、第三和/或第四骶脊神经(S2、S3、S4)下方的神经细胞中。

最初根据测量由肌细胞去极化产生的电位的尿道括约肌的肌电图(EMG)迹线来诊断DSD。使用录影尿动力学研究来证实DSD并鉴定其它生理学或解剖学异常。

大便失禁

大便失禁(FI)是有规律的肠控制的丧失。非自主排泄和泄漏在那些受影响者中普遍存在。大便失禁可由对控制肛门括约肌的神经或对检测直肠中的粪便的神经的损伤造成。对于控制括约肌的神经的损伤可能使肌肉不能有效工作。如果感觉神经受损，则不能检测直肠中的粪便，并且将不会感觉需要排便，直到为时已晚。神经损伤可由(但不限于)分娩、长期便秘、中风和引起神经变性的疾病如糖尿病和多发性硬化造成。脊髓损伤也可能导致大便失禁。另外，尽管直肠通常伸展以容纳粪便直至它自主释放，但直肠手术、放射治疗和炎症性肠病可以造成瘢痕，这可能导致直肠壁变得僵硬并缺乏弹性。直肠壁不能尽可能多地伸展并且不能容纳尽可能多的粪便，从而导致FI。炎症性肠病也可以使直肠壁非常受刺激并且从而不能包含粪便。

肛门括约肌保持肛门闭合以使粪便收集在直肠中。最后，直肠壁上的压力造成肛门内括约肌松弛，而对肛门外括约肌(EAS)的有意识的运动控制使粪便经由肛门排出体外。EAS是肌肉纤维的平面，呈椭圆形并且紧密附着于围绕肛门边缘的外皮。EAS与其它肌肉一样，通常呈紧张收缩状态，并且不具有拮抗肌，所述拮抗肌使肛管和肛口关闭。另外，它在意志的影响下可以进入更大收缩状态，以便更牢固地闭塞肛孔。它受到来自第四骶脊神经(S4)的分支和阴部神经的直肠(又名痔下)分支的支配。

性功能障碍

性功能障碍是指个体或夫妇在正常性活动的任何阶段(包括欲望、唤起或性高潮)内所经历的困难。有许多因素可能导致一个人经历性功能障碍，这可能由情绪或身体原因引起。例如，性活动可受到物理因素如使用药物、酒精、尼古丁、麻醉剂、兴奋剂、抗高血压药、抗组胺剂和一些精神治疗药物的影响。由于前列腺肥大问题、血液供应问题和神经损伤(如脊髓损伤)，背部受伤也可能影响性活动。诸如糖尿病性神经病、多发性硬化、肿瘤以及极少数情况下的三期梅毒等疾病也可能影响性活动，因为会破坏各个器官系统(例如心脏和肺)、内分泌紊乱(例如，下丘脑、甲状腺、垂体或肾上腺问题)、激素缺乏(例如，低睾酮、雌激素或雄激素)以及一些出生缺陷。

对于男性来说，阴茎皮肤受阴茎背神经支配，所述神经是阴部神经的最深分支；它沿着坐骨分支伴随着阴部内动脉，沿耻骨的下分支边缘向前延伸，介于尿生殖膈的筋膜的上层与下层之间。在女性中，阴蒂是由被称为阴蒂背神经的阴部神经的类似分支支配。另外，阴部神经在球海绵体肌和坐骨海绵体肌以及围绕阴囊(男性)、会阴和肛门的区域的神经支配中起作用。在性交过程中，在性高潮时，球海绵体肌和坐骨海绵体肌中的痉挛导致男性射精，以及两性中与性高潮经历相关的大部分外部感觉。

光响应性视蛋白

本文提供用光响应性视蛋白对负责逼尿肌和尿道外括约肌的神经支配的神经元进行选择性超极化或去极化以有效恢复罹患膀胱功能障碍(例如DH和DSD)的个体中的逼尿肌-括约肌协同作用的基于光遗传学的方法。本文还提供对负责肛门外括约肌的神经支配的神经元进行选择性超极化或去极化以有效恢复罹患大便失禁的个体中的肠控制的基于光遗传学的方法。另外，本文提供用光响应性视蛋白对负责生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元进行选择性去极化以有效恢复罹患性功能障碍的个体中的性功能的基于光遗传学的方法。光遗传学是指用于控制活组织、甚至自由移动的哺乳动物和其它动物内的靶向细胞中的特定事件的遗传学和光学方法的组合，其中时间精度(毫秒时间尺度)是为匹配功能完整的生物系统所需。光遗传学需要通过使用特异性靶向机制将快速光响应性离子通道或泵蛋白引入靶神经元细胞的质膜，其允许暂时地精确操纵神经元膜电位，同时保持细胞类型解析。可使用可用于响应于光而促进神经细胞膜超极化或去极化的任何微生物视蛋白。例如，光响应性氯离子泵(例如，NpHR、NpHR2.0、NpHR3.0、NpHR3.1)和GtR3质子泵的Halorhodopsin家族可用于响应于光而促进神经细胞膜超极化。作为另一个实例，eARCH(质子泵)可用于响应于光而促进神经细胞膜超极化。另外，光响应性阳离子通道蛋白(例如，ChR2、SFO、SSFO、C1V1)的Channelrhodopsin家族成员可用于响应于光刺激而促进神经细胞膜去极化或去极化诱发性突触耗竭。

增强的细胞内转运氨基酸基序

本公开提供在细胞中表达的光响应性视蛋白的修饰，其通过添加一个或多个增强哺乳动物细胞的质膜的转运的氨基酸序列基序。具有源自进化上更简单的有机体的成分的光响应性视蛋白可能不会被哺乳动物细胞表达或耐受或者当以高水平表达于哺乳动物细胞中时可能展现受损的亚细胞定位。因此，在一些实施方案中，在细胞中表达的光响应性视蛋白可以与选自由信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和/或N端高尔基(golgi)输出信号组成的群组的一个或多个氨基酸序列基序融合。增强光响应性蛋白向哺乳动物细胞的质膜的转运的一个或多个氨基酸序列基序可以与光响应性蛋白的N端、C端或者同时与N端和C端融合。任选地，光响应性蛋白和一个或多个氨基酸序列基序可由接头隔开。在一些实施方案中，光响应性蛋白可通过添加增强蛋白质向细胞质膜转运的运输信号(ts)来修饰。在一些实施方案中，运输信号可源自人类内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其它实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:12)。

适于使用的运输序列可包含与氨基酸序列如人类内向整流钾通道Kir2.1的运输序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:12))具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

运输序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸、例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。

适于使用的信号序列可包含与诸如下列之一等氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

1)hChR2的信号肽(例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQ ID NO:13))；

2)神经元烟碱型乙酰胆碱受体的β2亚单位信号肽(例如，MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(SEQ ID NO:14))；

3)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如，MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(SEQ ID NO:15))；以及

4)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如，MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQ ID NO:16))。

信号序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸、例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。

适用于本公开的修饰视蛋白中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如，VKESL(SEQ ID NO:17)；VLGSL(SEQ ID NO:18)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQ IDNO:19)；FXYENE(SEQ ID NO:20)(其中X是任何氨基酸)，例如，FCYENEV(SEQ ID NO:21)；等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸、例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、或约20个氨基酸至约25个氨基酸的长度。

可增强光响应性蛋白向细胞质膜的转运的其它蛋白质基序描述于美国专利申请No.12/041,628中，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，蛋白质中的信号肽序列可能缺失或被来自不同蛋白质的信号肽序列取代。

光响应性氯离子泵

在本文提供的方法的一些方面，光响应性氯离子泵的Halorhodopsin家族的一个或多个成员表达于包含逼尿肌和尿道外括约肌的神经支配的神经细胞的质膜上。在一些实施方案中，所述一个或多个光响应性氯离子泵表达于包含一个或多个骶脊神经的神经的质膜上。在其它实施方案中，所述一个或多个光响应性氯离子泵表达于包含由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配的神经的质膜上。在另一个实施方案中，所述一个或多个光响应性氯离子泵表达于阴部神经的质膜上。在其它实施方案中，所述一个或多个光响应性氯离子泵表达于包含阴部神经的尿道外括约肌神经支配的神经的质膜上。

在一些方面，表达于上述神经细胞的质膜上的所述一个或多个光响应性氯离子泵蛋白可源自法老(嗜)盐碱单孢菌(Natronomonaspharaonis)。在一些实施方案中，当用琥珀色或红色光照射光响应性氯离子泵蛋白时，光响应性氯离子泵蛋白可以响应于琥珀色光以及红色光并且可以介导神经细胞中的超极化电流。可以激活光响应性氯离子泵的光的波长可介于约580nm与630nm之间。在一些实施方案中，光可以是约589nm的波长或者光可以具有大于约630nm(例如小于约740nm)的波长。在另一个实施方案中，光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白当暴露于连续光脉冲时可以将神经膜超极化至少约90分钟。在一些实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白可以包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。另外，光响应性氯离子泵蛋白可以包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白包含一个或多个保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，光响应性蛋白包含一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性蛋白适当地保持响应于光而超极化神经元细胞的质膜的能力。

另外，在其它方面，光响应性氯离子泵蛋白可包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。这种ER输出信号可以与核心氨基酸序列的C端融合或者可以与核心氨基酸序列的N端融合。在一些实施方案中，ER输出信号通过接头连接至核心氨基酸序列。所述接头可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号可包含氨基酸序列FXYENE(SEQ ID NO:20)，其中X可以是任何氨基酸。在另一个实施方案中，ER输出信号可包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，ER输出信号可以包含氨基酸序列FCYENEV(SEQ ID NO:21)。

适用于本公开的修饰视蛋白中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(例如，VKESL(SEQ ID NO:17)；VLGSL(SEQ ID NO:18)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQ IDNO:19)；FXYENE(其中X是任何氨基酸)(SEQ ID NO:20)，例如，FCYENEV(SEQ ID NO:21)；等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸、例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、或约20个氨基酸至约25个氨基酸的长度。

在其它方面，本文提供的光响应性氯离子泵蛋白可以包含表达于细胞膜上的光响应性蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和运输信号(例如，其可增强光响应性氯离子泵蛋白向质膜的转运)。运输信号可与核心氨基酸序列的C端融合或者可与核心氨基酸序列的N端融合。在一些实施方案中，运输信号可通过接头连接至核心氨基酸序列，所述接头可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，运输信号可源自人类内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其它实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:12)。

在一些方面，光响应性氯离子泵蛋白可包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自由ER输出信号、信号肽和膜运输信号组成的群组的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)增强向哺乳动物细胞质膜转运的氨基酸序列基序。在一些实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，C端ER输出信号和C端运输信号可通过接头连接。所述接头可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头还可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号可能相比于运输信号距C端更近。在其它实施方案中，运输信号相比于ER输出信号距C端更近。在一些实施方案中，信号肽包含氨基酸序列MTETLPPVTESAVALQAE(SEQ ID NO:22)。在另一个实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。

此外，在其它方面，光响应性氯离子泵蛋白可以包含与SEQ IDNO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列，其中SEQID NO:1的N端信号肽缺失或被取代。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(例如来自其它视蛋白的信号肽)。光响应性蛋白可以进一步包含本文所述的ER转运信号和/或膜运输信号。在一些实施方案中，光响应性氯离子泵蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，光响应性视蛋白为包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的NpHR视蛋白。在一些实施方案中，NpHR视蛋白进一步包含内质网(ER)输出信号和/或膜运输信号。例如，NpHR视蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列通过接头连接至ER输出信号。在一些实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE(SEQ ID NO:20)，其中X可以是任何氨基酸。在另一个实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，NpHR视蛋白包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。在其它实施方案中，NpHR视蛋白从N端至C端包含与SEQID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。在其它实施方案中，NpHR视蛋白从N端至C端包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、膜运输信号和ER输出信号。在一些实施方案中，膜运输信号源自人类内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，膜运输信号包含氨基酸序列K S R I T S E G E Y I P LD Q I D I N V(SEQ ID NO:12)。在一些实施方案中，膜运输信号通过接头连接至与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，膜运输信号通过接头连接至ER输出信号。接头可包含长度为5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，光响应性视蛋白进一步包含N端信号肽。在一些实施方案中，光响应性视蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，光响应性视蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

本文还提供编码本文所述的任何光响应性氯离子泵蛋白、例如包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号的光响应性蛋白的多核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸包含编码与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸的序列。多核苷酸可处于表达载体(例如(但不限于)本文所述的病毒载体)中。多核苷酸可用于表达光响应性氯离子泵蛋白。

关于光响应性氯离子泵蛋白的其它公开内容可见于美国专利申请公开No.2009/0093403和No.2010/0145418以及国际专利申请号PCT/US2011/028893中，所述专利申请各自的公开内容特此以全文引用的方式并入。

光响应性质子泵

在本文提供的方法的一些方面，一个或多个光响应性质子泵表达于包含逼尿肌和尿道外括约肌的神经支配的神经细胞的质膜上。在一些实施方案中，一个或多个光响应性质子泵表达于包含一个或多个骶脊神经的神经的质膜上。在其它实施方案中，一个或多个光响应性质子泵表达于包含由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配的神经的质膜上。在另一个实施方案中，一个或多个光响应性质子泵表达于阴部神经的质膜上。在其它实施方案中，一个或多个光响应性质子泵表达于包含阴部神经的尿道外括约肌神经支配的神经的质膜上。

在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白可响应于蓝色光并且可源自蓝隐藻(Guillardia theta)，其中当用蓝色光照射细胞时，质子泵蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。光可具有介于约450nm与约495nm之间的波长或者可具有约490nm的波长。在另一个实施方案中，光响应性质子泵蛋白可包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。光响应性质子泵蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性质子泵蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，光响应性质子泵蛋白可包含一种或多种保守性氨基酸取代和/或一种或多种非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适当地保持响应于光而超极化神经元细胞的质膜的能力。

在本文公开的方法的其它方面，光响应性质子泵蛋白可包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的群组的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)增强向哺乳动物细胞质膜转运的氨基酸序列基序。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，C端ER输出信号和C端运输信号是通过接头连接。所述接头可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号相比于运输信号距C端更近。在一些实施方案中，运输信号相比于ER输出信号距C端更近。

本文还提供编码本文所述的任何光响应性质子泵蛋白、例如包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的分离多核苷酸。本文还提供包含编码本文所述的蛋白质、例如包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的多核苷酸的表达载体(例如本文所述的病毒载体)。多核苷酸可用于表达神经细胞(例如包含由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配和阴部神经的尿道外括约肌神经支配的神经细胞)中的光响应性蛋白。

关于光响应性质子泵蛋白的其它公开内容可见于国际专利申请号PCT/US2011/028893中，所述专利申请的公开内容特此以全文引用的方式并入。

在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白可响应于绿色或黄色光并且可源自苏打盐红菌(Halorubrum sodomense)，其中当用绿色或黄色光照射细胞时，质子泵蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。光可具有介于约560nm与约570nm之间的波长或者可具有约566nm的波长。在另一个实施方案中，光响应性质子泵蛋白可包含与SEQ IDNO:23中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。光响应性质子泵蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性质子泵蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，光响应性质子泵蛋白可包含一种或多种保守性氨基酸取代和/或一种或多种非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适当地保持响应于光而超极化神经元细胞的质膜的能力。

在本文公开的方法的其它方面，光响应性质子泵蛋白可包含与SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的群组的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)增强向哺乳动物细胞质膜转运的氨基酸序列基序。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，C端ER输出信号和C端运输信号是通过接头连接。所述接头可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一种。接头可进一步包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，ER输出信号相比于运输信号距C端更近。在一些实施方案中，运输信号相比于ER输出信号距C端更近。

本文还提供编码本文所述的任何光响应性质子泵蛋白、例如包含与SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的分离多核苷酸。本文还提供包含编码本文所述的蛋白质、例如包含与SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的多核苷酸的表达载体(例如本文所述的病毒载体)。多核苷酸可用于表达神经细胞(例如包含由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配和阴部神经的尿道外括约肌神经支配的神经细胞)中的光响应性蛋白。

光响应性阳离子通道蛋白

在本文提供的方法的一些方面，一个或多个光响应性阳离子通道可表达于包含逼尿肌和尿道外括约肌的神经支配的神经细胞的质膜上。在一些实施方案中，一个或多个光响应性阳离子通道可表达于一个或多个骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的质膜上。在其它实施方案中，一个或多个光响应性阳离子通道可表达于包含由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配的神经的质膜上。在另一个实施方案中，一个或多个光响应性阳离子通道可表达于阴部神经的质膜上。在其它实施方案中，一个或多个光响应性阳离子通道可表达于包含阴部神经的尿道外括约肌神经支配的神经的质膜上。

在一些方面，光响应性阳离子通道蛋白可源自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，其中当用光照射细胞时，阳离子通道蛋白可以能够介导细胞中的去极化电流。在另一个实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白可包含与SEQ ID NO:5中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。用于激活源自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道蛋白的光可具有介于约460nm与约495nm之间的波长或者可具有约480nm的波长。另外，光可具有至少约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活源自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道可造成表达光响应性阳离子通道的神经元的去极化诱发性突触耗竭。光响应性阳离子通道蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性阳离子通道蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，光响应性阳离子通道蛋白可包含一种或多种保守性氨基酸取代和/或一种或多种非保守性氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适当地保持响应于光而将神经元细胞的质膜去极化的能力。

在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的T159C取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的L132C取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的E123T取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的E123A取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的T159C取代和E123T取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的T159C取代和E123A取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ IDNO:5中所示的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代和E123T取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代和E123A取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的L132C取代和E123T取代。在一些实施方案中，光响应性阳离子通道包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的L132C取代和E123A取代。

关于光响应性阳离子通道蛋白的其它公开内容可见于美国专利申请公开No.2007/0054319以及国际专利申请公开号WO2009/131837和WO 2007/024391中，所述专利申请各自的公开内容特此以全文引用的方式并入。

阶跃函数视蛋白和稳定阶跃函数视蛋白

在其它实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白可为阶跃函数视蛋白(SFO)或稳定阶跃函数视蛋白(SSFO)，其可在蛋白质的整个视黄醇结合袋中的关键位置具有特定氨基酸取代。在一些实施方案中，SFO蛋白可在SEQ ID NO:5的氨基酸残基C128处具有突变。在其它实施方案中，SFO蛋白在SEQ ID NO:5中具有C128A突变。在其它实施方案中，SFO蛋白在SEQ ID NO:5中具有C128S突变。在另一个实施方案中，SFO蛋白在SEQ ID NO:5中具有C128T突变。在一些实施方案中，SFO蛋白可包含与SEQ ID NO:6中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，SSFO蛋白可在SEQ ID NO:5的氨基酸残基D156处具有突变。在其它实施方案中，SSFO蛋白可在SEQ ID NO:5的氨基酸残基C128和D156处具有突变。在一个实施方案中，SSFO蛋白在SEQ ID NO:5中具有C128S和D156A突变。在另一个实施方案中，SSFO蛋白可包含与SEQ ID NO:7中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SSFO蛋白可在SEQ IDNO:5中包含C128T突变。在一些实施方案中，SSFO蛋白在SEQ IDNO:5中包含C128T和D156A突变。

在一些实施方案中，当用蓝色光照射细胞时，本文提供的SFO或SSFO蛋白可以能够介导细胞中的去极化电流。在其它实施方案中，光可具有约445nm的波长。另外，光可具有至少约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活SFO或SSFO蛋白可造成表达SFO或SSFO蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭。在一些实施方案中，所公开的阶跃函数视蛋白和稳定阶跃函数视蛋白各自可具有响应于光而用于将神经元细胞的膜去极化的特定性质和特征。

关于SFO或SSFO蛋白的其它公开内容可见于国际专利申请公开号WO 2010/056970以及美国临时专利申请No.61/410,704和61/511,905中，所述专利申请各自的公开内容特此以全文引用的方式并入。

C1V1嵌合阳离子通道

在其它实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白可为源自团藻(Volvox carteri)的VChR1蛋白和来自莱茵衣藻的ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少具有被ChR1的第一和第二跨膜螺旋置换的第一和第二跨膜螺旋的VChR1的氨基酸序列；响应于光；并且当用光照射细胞时能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，C1V1蛋白可进一步包含位于嵌合光响应性蛋白的第二和第三跨膜螺旋之间的胞内环状域内的置换，其中所述胞内环状域的至少一部分被来自ChR1的相应部分置换。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的胞内环状域的部分可被延伸至ChR1的氨基酸残基A145的来自ChR1的相应部分置换。在其它实施方案中，C1V1嵌合蛋白可进一步包含嵌合光响应性蛋白的第三跨膜螺旋内的置换，其中所述第三跨膜螺旋的至少一部分被ChR1的相应序列置换。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的胞内环状域的部分可被延伸至ChR1的氨基酸残基W163的来自ChR1的相应部分置换。在其它实施方案中，C1V1嵌合蛋白可包含与SEQ ID NO:8中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，当用绿色光照射细胞时，C1V1蛋白可介导细胞中的去极化电流。在其它实施方案中，光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，光可具有约542nm的波长。在一些实施方案中，当用紫色光照射细胞时，C1V1嵌合蛋白不能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白不能够介导细胞中的去极化电流。另外，光可具有约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活C1V1嵌合蛋白可造成表达C1V1嵌合蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭。在一些实施方案中，所公开的C1V1嵌合蛋白可具有响应于光而用于将神经元细胞的膜去极化的特定性质和特征。

C1V1嵌合突变体变体

在一些方面，本公开提供包含被取代或突变的氨基酸序列的多肽，其中所述突变多肽保持前体C1V1嵌合多肽的特征性光可活化性质，但在一些特定方面也可具有改变的特性。例如，本文所述的突变光响应性C1V1嵌合蛋白可在动物细胞内或动物细胞质膜上展现增加的表达水平；当暴露于不同波长的光、特别是红色光时改变的响应性；和/或特性的组合，由此嵌合C1V1多肽具有低脱敏、快速失活、用于与其它光响应性阳离子通道进行最小交叉活化的低紫色光激活和/或在动物细胞中的强烈表达的特性。

因此，本文提供可在嵌合多肽的VChR1部分的整个视黄醇结合袋中的关键位置处具有特定氨基酸取代的C1V1嵌合光响应性视蛋白。在一些实施方案中，C1V1蛋白可在SEQ ID NO:7的氨基酸残基E122处具有突变。在一些实施方案中，C1V1蛋白可在SEQ ID NO:7的氨基酸残基E162处具有突变。在其它实施方案中，C1V1蛋白可在SEQ ID NO:7的氨基酸残基E162和E122处具有突变。在其它实施方案中，C1V1蛋白可包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所公开的突变C1V1嵌合蛋白各自可具有响应于光而用于将动物细胞的膜去极化的特定性质和特征。

在一些方面，当用光照射细胞时，C1V1-E122突变嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿色光。在其它实施方案中，光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，光可具有约546nm的波长。在其它实施方案中，当用红色光照射细胞时，C1V1-E122突变嵌合蛋白可介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，红色光可具有约630nm的波长。在一些实施方案中，当用紫色光照射细胞时，C1V1-E122突变嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。另外，光可具有约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活C1V1-E122突变嵌合蛋白可造成表达C1V1-E122突变嵌合蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭。在一些实施方案中，所公开的C1V1-E122突变嵌合蛋白可具有响应于光而用于将神经元细胞的膜去极化的特定性质和特征。

在其它方面，当用光照射细胞时，C1V1-E162突变嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿色光。在其它实施方案中，光可具有约535nm至约540nm的波长。在一些实施方案中，光可具有约542nm的波长。在其它实施方案中，光可具有约530nm的波长。在一些实施方案中，当用紫色光照射细胞时，C1V1-E162突变嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。另外，光可具有约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活C1V1-E162突变嵌合蛋白可造成表达C1V1-E162突变嵌合蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭。在一些实施方案中，所公开的C1V1-E162突变嵌合蛋白可具有响应于光而用于将神经元细胞的膜去极化的特定性质和特征。

在其它方面，当用光照射细胞时，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿色光。在其它实施方案中，光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，光可具有约546nm的波长。在一些实施方案中，当用紫色光照射细胞时，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白不会介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当暴露于紫色光时，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白相对于在E122/E162处缺乏突变的C1V1嵌合蛋白或相对于其它光响应性阳离子通道蛋白可展现较少激活。另外，光可具有约100Hz的强度。在一些实施方案中，用强度为100Hz的光激活C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白可造成表达C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭。在一些实施方案中，所公开的C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白可具有响应于光而用于将神经元细胞的膜去极化的特定性质和特征。

关于C1V1嵌合阳离子通道以及其突变体变体的其它公开内容可见于美国临时专利申请No.61/410,736、61/410,744和61/511,912中，所述专利申请各自的公开内容特此以全文引用的方式并入。

多核苷酸

本公开还提供包含编码本文所述的光响应性蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含表达盒。在一些实施方案中，多核苷酸是包含上述核酸的载体。在一些实施方案中，编码本公开的光响应性蛋白的核酸可操作地连接至启动子。启动子是本领域中众所周知的。在宿主细胞中起作用的任何启动子可用于表达本公开的光响应性视蛋白和/或其任何变体。在一个实施方案中，用于驱动光响应性视蛋白的表达的启动子可以是对运动神经元具特异性的启动子。在其它实施方案中，启动子能够驱动交感和/或副交感神经系统的神经元中的光响应性视蛋白的表达。可用于驱动光响应性视蛋白或其变体在特定动物细胞中的表达的起始控制区或启动子众多并且为本领域技术人员所熟知。可使用能够驱动这些核酸的几乎任何启动子。运动神经元特异性基因的实例可见于例如Kudo等,Human Mol.Genetics,2010,19(16):3233-3253中，其内容特此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，用于驱动光响应性蛋白的表达的启动子可以是Thy1启动子，其能够驱动转基因在中枢和外周神经系统的神经元中的强健表达(参见例如Llewellyn等,2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在其它实施方案中，用于驱动光响应性蛋白的表达的启动子可以是EF1α启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CAG启动子、突触蛋白-I启动子(例如，人类突触蛋白-I启动子)、人类突触核蛋白1启动子、人类Thy1启动子、钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子或能够驱动光响应性视蛋白在哺乳动物的外周神经元中的表达的任何其它启动子。

本文还提供包含编码本文所述的光响应性蛋白或其任何变体的核苷酸序列的载体。可根据本发明施用的载体还包括包含编码RNA(例如，mRNA)的核苷酸序列的载体，所述RNA当从所述载体的多核苷酸转录时将导致光响应性视蛋白积聚在目标动物细胞的质膜上。可使用的载体包括但不限于慢病毒、HSV、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。慢病毒包括但不限于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIAV。慢病毒可用其它病毒(包括但不限于VSV、狂犬病毒、Mo-MLV、杆状病毒和埃博拉病毒)的包膜蛋白假型化。这些载体可使用本领域中的标准方法制备。

在一些实施方案中，载体是重组AAV载体。AAV载体是可以稳定且位点特异性方式整合至其感染细胞的基因组中的相对小尺寸的DNA病毒。它们能够感染宽泛范围的细胞而不会诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响，并且它们似乎不牵涉人类疾病。AAV基因组已被克隆、测序和表征。其涵盖约4700个碱基并且在每个末端包含具有约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其用作病毒的复制起点。基因组的其余部分被分成带有包壳功能的两个必需区域：基因组的左手部分，它包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因；和基因组的右手部分，它包含编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。

AAV载体可使用本领域中的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见例如Blacklow,“Parvoviruses and HumanDisease”的第165-174页,J.R.Pattison编(1988)；Rose,ComprehensiveVirology 3:1,1974；P.Tattersall“The Evolution of Parvovirus Taxonomy”In Parvoviruses(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CRParrish编)第5-14页,Hudder Arnold,London,UK(2006)；和DEBowles,JE Rabinowitz,RJ Samulski“The Genus Dependovirus”(JRKerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CR Parrish编)第15-23页,Hudder Arnold,London,UK(2006)，其各自的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6,566,118、6,989,264和6,995,006以及名称为“Methods for GeneratingHigh Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”的WO/1999/011764中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在杆状病毒系统中制备AAV载体的方法描述于例如WO 2008/024998中。AAV载体可以是自身互补的或单链的。杂交载体的制备描述于例如PCT申请号PCT/US2005/027091中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。将源自AAV的载体用于体外和体内转移基因的用途已经描述(参见例如国际专利申请公开No:91/18088和WO93/09239；美国专利No:4,797,368、6,596,535和5,139,941；以及欧洲专利No:0488528，其全部特此以全文引用的方式并入本文中)。这些公开案描述了其中rep和/或cap基因缺失和被所感兴趣的基因置换的各种AAV源构建体，以及这些构建体用于在体外转移(至培养细胞中)或体内转移(直接至有机体中)所感兴趣的基因的用途。可通过将包含侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的所感兴趣的核酸序列的质粒和带有AAV包壳基因(rep和cap基因)的质粒共同转染至感染人类辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中来制备根据本公开的复制缺陷型重组AAV。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，将用于本公开的方法中的载体包壳于病毒粒子(例如AAV病毒粒子，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)中。因此，本公开包括包含任何本文所述载体的重组病毒粒子(重组体，因为其包含重组多核苷酸)。制备这种粒子的方法是本领域中已知的并且描述于美国专利No.6,596,535中，所述专利的公开内容特此以全文引用的方式并入。

光响应性视蛋白的递送

在一些方面，使用本领域中已知的神经外科技术，例如通过立体定向注射(参见例如Stein等,J.Virol,73:34243429,1999；Davidson等,PNAS,97:3428-3432,2000；Davidson等,Nat.Genet.3:219-223,1993；以及Alisky和Davidson,Hum.Gene Ther.11:2315-2329,2000，其各自内容特此以全文引用的方式并入本文中)或荧光透视法，可用针、导管或相关装置将编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)直接递送至负责逼尿肌的神经支配的神经元和/或负责尿道外括约肌的神经支配的神经元。在一些实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV1载体)可通过将所述多核苷酸注射至一个或多个骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中而递送至负责逼尿肌的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至阴部神经中而递送至负责尿道外括约肌的神经支配的神经元。在另一个实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核(Onuf's nucleus)中而递送至负责尿道外括约肌的神经支配的神经元。

在一些方面，使用本领域中已知的神经外科技术，例如通过立体定向注射或荧光透视法，可用针、导管或相关装置将编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)直接递送至负责肛门外括约肌的神经支配的神经元。在一些实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中而递送至负责肛门外括约肌的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至阴部神经中或通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核中而递送至负责肛门外括约肌的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射在骶脊神经(例如，S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中或通过注射至下腹下神经丛中而递送至负责直肠的神经支配的神经元。

在一些方面，使用本领域中已知的神经外科技术，例如通过立体定向注射或荧光透视法，可用针、导管或相关装置将编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)直接递送至负责男性和女性生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元。在一些实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至骶脊神经(例如，S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中而递送至负责男性和女性生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸注射至阴部神经中或通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核中而递送至负责男性和女性生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元。

还可使用将光响应性视蛋白递送至所感兴趣的神经的其它方法，例如(但不限于)用离子脂质或聚合物转染、电穿孔、光学转染、刺穿感染或通过基因枪。

在另一个方面，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可直接递送至膀胱的逼尿肌和/或负责尿道外括约肌收缩的肌肉。由于将病毒载体直接注射至支配特定肌肉的特定细胞体中所固有的限制，研究人员试图通过将病毒载体直接注射至肌肉中而将转基因递送至外周神经元。这些实验已经表明，一些病毒血清型如腺病毒、AAV2和狂犬病糖蛋白假型化慢病毒可被肌细胞吸收并且穿过神经肌肉突触逆向转运至运动神经元(参见例如Azzouz等,2009,Antioxid Redox Signal.,11(7):1523-34；Kaspar等,2003,Science,301(5634):839-842；Manabe等,2002.Apoptosis,7(4):329-334，其各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。

因此，在一些实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸表达载体直接注射至负责尿道外括约肌收缩的肌肉中而递送至负责尿道外括约肌的神经支配的神经元。在另一个实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸表达载体直接注射至逼尿肌中而递送至负责逼尿肌的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸表达载体直接注射至负责肛门外括约肌收缩的肌肉中而递送至负责肛门外括约肌的神经支配的神经元。在其它实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸表达载体直接注射至负责直肠收缩的肌肉中而递送至负责直肠神经支配的神经元。在另一个实施方案中，编码本文公开的光响应性视蛋白的多核苷酸(例如，AAV载体)可通过将所述多核苷酸表达载体直接注射至负责正常性功能的肌肉和器官(包括但不限于阴茎的球海绵体肌和坐骨海绵体肌、阴茎的皮肤、常年肌肉或阴蒂)中而递送至负责男性和女性生殖器的神经支配的神经元。

光源和电源

在本公开的一些方面，本文公开的光响应性视蛋白可通过置于表达光响应性视蛋白的神经纤维或控制膀胱、尿道外括约肌、肛门外括约肌、直肠和/或男性或女性生殖器的肌肉的神经周围或附近的可植入光源(例如光套)或可植入电极激活。通过手术方式置于用于那些神经的电刺激中的神经周围或附近的电极套和电极是本领域中众所周知的(参见例如美国专利No.4,602,624、7,142,925和6,600,956以及美国专利公开No.2008/0172116和2010/0094372，其各自的公开内容特此以全文引用的方式并入)。本发明的光源(例如光套)或电极可包含任何有用的组合物或组合物的混合物，例如铂或不锈钢，如本领域中所知，并且可具有任何适用于刺激本文公开的光响应性视蛋白或控制膀胱、尿道外括约肌、肛门外括约肌和/或男性或女性生殖器的肌肉和器官的神经的构型。

电极或可植入光源(例如光套)可置于神经周围或附近，例如(但不限于)由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配、阴部神经的尿道外括约肌神经支配、由骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配和/或由阴部神经产生的直肠下神经(又名痔下神经)、由骶脊神经和/或下腹下神经丛产生的直肠的神经支配、由阴部神经产生的阴茎背神经和/或由阴部神经产生的阴蒂背神经。在使用本领域中已知的技术将电极或可植入光源置于神经纤维周围或附近之前，临床医师可鉴别负责前述肌肉和/或器官的神经支配的神经纤维。例如，可用短暂电脉冲刺激神经纤维并且观察由所述电刺激造成的肌肉收缩的位置以确保电极或可植入光源的正确安置。电极或可植入光源非常适合于与特别是阴部神经一起用于支配下泌尿道、肠道、会阴和生殖器的肌肉和器官的远离骶骨根的阴部神经主干或其传入或传出分支(源自阴部神经)上。阴部神经主干和其分支远离骶骨根和脊柱。因此，它们通过手术方式可从身体前方接近并且无需在脊柱上、脊柱中或脊柱附近进行复杂的手术程序或无需进行背神经根切断术。在另一个实施方案中，光源可置于所需神经目标的前根附近。在另一个实施方案中，光源包含置于通过手术方式暴露的所需神经目标附近的纤维光缆。

在一些实施方案中，可植入光源(例如光套)不是完全包围神经，而是可具有U形。在另一个实施方案中，可植入光源可具有可用于将可植入光源(例如光套)引导至神经纤维(例如，由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配和/或阴部神经的尿道外括约肌神经支配)的连接臂。所述连接臂可在植入光源之后除去或者可留在原处以将光源位置固定在所感兴趣的神经纤维附近。

可植入光源(例如光套)可包含内部主体，所述内部主体具有至少一个被配置于动力源的用于产生光的构件。在一些实施方案中，所述动力源可为用于向光产生构件供电的内部电池。在另一个实施方案中，可植入光源可包含用于从向光产生构件供电的外部源接收无线传输的电磁能量的外部天线。所述无线传输的电磁能量可以是无线电波、微波，或可以从外部源传输以向可植入光源(例如光套)的光产生构件供电的任何其它电磁能量源。在一个实施方案中，光产生构件受到使用半导体或本领域中已知的其它方法制备的集成电路的控制。

在一些方面，光构件可以是发光二极管(LED)。在一些实施方案中，LED可产生蓝色和/或绿色光。在其它实施方案中，LED可产生琥珀色和/或黄色光。在一些实施方案中，数个微型LED被嵌入可植入光源(例如光套)的内部主体中。在其它实施方案中，光产生构件是固态激光二极管或能够产生光的任何其它构件。光产生构件可产生强度足以激活在光源(例如光套)附近的神经质膜上表达的光响应性视蛋白的光。在一些实施方案中，光产生构件产生强度为约0.05mW/mm²、0.1mW/mm²、0.2mW/mm²、0.3mW/mm²、0.4mW/mm²、0.5mW/mm²、约0.6mW/mm²、约0.7mW/mm²、约0.8mW/mm²、约0.9mW/mm²、约1.0mW/mm²、约1.1mW/mm²、约1.2mW/mm²、约1.3mW/mm²、约1.4mW/mm²、约1.5mW/mm²、约1.6mW/mm²、约1.7mW/mm²、约1.8mW/mm²、约1.9mW/mm²、约2.0mW/mm²、约2.1mW/mm²、约2.2mW/mm²、约2.3mW/mm²、约2.4mW/mm²、约2.5mW/mm²、约3mW/mm²、约3.5mW/mm²、约4mW/mm²、约4.5mW/mm²、约5mW/mm²、约5.5mW/mm²、约6mW/mm²、约7mW/mm²、约8mW/mm²、约9mW/mm²或约10mW/mm²中的任一种(包涵性，包括这些数字之间的值)的光。在其它实施方案中，光产生构件产生强度为至少约100Hz的光。

在一些方面，光产生构件可被外部控制器外部激活。所述外部控制器可包含可被安装到发射线圈的功率发生器。在外部控制器的一些实施方案中，电池可以被连接到用于向其提供动力的功率发生器。开关可以连接到所述功率发生器，使得个体可手动启用或停用所述功率发生器。在一些实施方案中，在开关启用时，功率发生器可以通过外部控制器上的发射线圈与可植入光源(例如光套)的外部天线之间的电磁耦合向光源上的光产生构件提供动力。发射线圈可以与接近其的可植入光源的外部天线建立电磁耦合，用于向光产生构件提供动力以及向可植入光源传输一种或多种控制信号。在一些实施方案中，外部控制器的发射线圈与可植入光源(例如光套)的外部天线之间的电磁耦合可以是射频磁电感耦合。当使用射频磁电感耦合时，无线电波的操作频率可以介于约1MHz与20MHz之间(包涵性，包括这些数字之间的任何值)(例如，约1MHz、约2MHz、约3MHz、约4MHz、约5MHz、约6MHz、约7MHz、约8MHz、约9MHz、约10MHz、约11MHz、约12MHz、约13MHz、约14MHz、约15MHz、约16MHz、约17MHz、约18MHz、约19MHz或约20MHz)。然而，可使用其它耦合技术，例如光接收器、红外线或生物医学遥测系统(参见例如Kiourti,“Biomedical Telemetry:Communication betweenImplanted Devices and the External World,Opticon1826,(8):Spring,2010)。

在本公开的一些方面，当用光激活时，由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配、阴部神经的尿道外括约肌神经支配、阴部或骶脊神经的肛门外括约肌神经支配中的一种以上可以表达促进神经超极化的光响应性泵。在一些实施方案中，当膀胱储存尿液时，置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源的光产生构件连续产生光，而同时，置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)不产生光。在另一个方面，当膀胱排尿时，置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件不产生光，而同时，置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)可以连续产生光。在一些实施方案中，由外部控制器产生的第一控制信号可启用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时停用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第二控制信号可停用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时启用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的控制信号可启用置于由阴部或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。

在本公开的一些方面，当用光激活时，由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配、阴部神经的尿道外括约肌神经支配和/或阴部或骶脊神经的肛门外括约肌神经支配可表达促进神经去极化诱发性突触耗竭的光响应性阳离子通道。在一些实施方案中，当膀胱储存尿液时，置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源的光产生构件不产生光，而同时，置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)可连续产生强度为至少100Hz的光。在另一个方面，当膀胱排尿时，置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件产生强度为至少100Hz的光，而同时，置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)不产生光。在另一个方面，当肛门外括约肌松弛时，置于由阴部或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件产生强度为至少100Hz的光。在一些实施方案中，由外部控制器产生的第一控制信号可启用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时停用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第二控制信号可停用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时启用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的控制信号可停用置于由阴部或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。

在本公开的一些方面，当用光激活时，由阴部神经或一个或多个骶脊神经产生的男性或女性生殖器的肌肉或器官的神经支配可表达促进神经去极化的光响应性阳离子通道蛋白。在一些实施方案中，当个体希望进行性活动(例如(但不限于)勃起、性高潮、射精和/或阴道润滑)时，置于由阴部或骶脊神经产生的男性或女性生殖器的神经支配周围或附近的可植入光源的光产生构件连续产生光。在一些实施方案中，当个体希望恢复维持性唤起所需的生殖器区域中的触觉时，置于由阴部或骶脊神经产生的男性或女性生殖器的神经支配周围或附近的可植入光源的光产生构件连续产生光。在一些实施方案中，由外部控制器产生的第一控制信号可启用置于由阴部或骶脊神经产生的男性或女性生殖器的肌肉或器官的神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第二控制信号可停用置于由阴部或骶脊神经产生的男性或女性生殖器的肌肉或器官的神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。

在本公开的其它方面，可使用利用光响应性视蛋白和电进行神经刺激的组合来恢复排尿和/或大便节制。在一些实施方案中，由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配可表达本文所述的任何光响应性视蛋白并且电极可置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近。在一些实施方案中，由骶脊神经和/或阴部神经产生的肛门外括约肌神经支配可具有置于由阴部神经和/或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的电极。在其它实施方案中，电极可置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近，而阴部神经的尿道外括约肌神经支配可表达本文所述的任何光响应性视蛋白。在一些实施方案中，由外部控制器产生的第一控制信号可启用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时启用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的电极。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第二控制信号可停用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件，而同时停用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的电极。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第一控制信号可停用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的电极，而同时启用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。在另一个实施方案中，由外部控制器产生的第二控制信号可启用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的电极，而同时停用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)的光产生构件。

光刺激装置(包括光源(例如光套))的实例可见于国际专利申请号PCT/US08/50628和PCT/US09/49936以及Llewellyn等,2010,Nat.Med.,16(10):161-165中，其各自的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中。

方法

本发明是针对用于抑制与膀胱功能障碍、大便失禁(FI)和/或性功能障碍相关的症状(残疾、损伤)的方法。特别是，本文提供的方法是针对治疗和/或减轻与逼尿肌反射亢进(DH)和/或逼尿肌外括约肌协同失调(DSD)相关的症状。因此，无需完全逆转生理损伤或病状的所有影响，但本文所公开方法的影响可能扩展至患者的显著治疗效益。因此，治疗效益未必是DH、DSD、FI和/或性功能障碍的完全治愈，而是可涵盖以下结果，其包括减少或预防由这些病状产生的症状或生理损伤，降低或预防这些症状或损伤(定量或定性)的发生率，降低这些症状或生理作用的严重程度，和/或增强患者在经历DH、DSD、FI和/或性功能障碍的病因(例如(但不限于)脊髓损伤和多发性硬化)后的恢复率。

特别地，本发明的方法可预防与延长的DH、DSD、FI和/或性功能障碍相关的损伤，和/或降低或减轻这些病状的症状或与这些病状相关(由其产生)的病状。因此，保护个体免受由DH、DSD、FI和/或性功能障碍引起的生理作用或症状包括预防或降低所述症状的发生率和/或所述症状的作用的严重程度和治疗已经出现或开始出现症状的患者。本领域的普通技术人员和/或正在治疗患者的经过训练的临床医师可容易地评估有益作用。例如，上述用于诊断DH和/或DSD的许多方法可用于评估在使用本发明方法进行治疗之前和之后的患者以评估治疗的成功。在一些实施方案中，在已经用本发明方法治疗的患者中，相比于那些没有用本发明方法治疗的患者，用于评估这些患者的至少一种临床或生物评分、数值或量度的严重程度或发生率存在积极或有益的差异。

用光响应性视蛋白进行超极化或去极化诱发性突触耗竭以治疗膀胱功能障碍和/或大便失禁

膀胱功能障碍

因此，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性视蛋白能够响应于光而诱导表达光响应性视蛋白的神经元的超极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液。可施用任何编码能够诱导超极化的光响应性视蛋白的本文所述多核苷酸。在一些实施方案中，膀胱功能障碍是DH和/或DSD。在其它实施方案中，负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体通过暴露于琥珀色光而超极化。主题方法的示例性实施方案示意性描绘于图4中。

当通过置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)照射时，表达于逼尿肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白维持超极化中性膜电位，从而防止逼尿肌收缩并允许膀胱充盈。当表达于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，由于正常中性膜电位的恢复，逼尿肌能够收缩，并且所产生的压力促进排尿。类似地，当利用置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源照射时，表达于尿道外括约肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白维持超极化中性膜电位，从而防止尿道外括约肌收缩并允许个体排尿。当表达于阴部神经的尿道外括约肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，尿道外括约肌收缩并允许膀胱充盈。

本文还提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性视蛋白能够响应于光而造成表达光响应性蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许从膀胱中排空尿液。可施用任何编码能够造成去极化诱发性突触耗竭的光响应性视蛋白的本文所述多核苷酸。在一些实施方案中，膀胱功能障碍是DH和/或DSD。在其它实施方案中，负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体可通过暴露于蓝色、绿色、黄色、橙色或红色光而去极化至突触耗竭点。在一些实施方案中，光具有至少约100Hz的强度。

当利用置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)照射时，表达于逼尿肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白引起神经细胞的去极化诱发性突触耗竭，从而防止逼尿肌的收缩并允许膀胱充盈。当表达于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，由于跨突触囊泡的恢复，逼尿肌能够收缩，并且所产生的压力促进排尿。类似地，当通过置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源照射时，表达于尿道外括约肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白造成那些神经元的去极化诱发性突触耗竭，从而防止尿道外括约肌的收缩并允许个体排尿。当表达于阴部神经的尿道外括约肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，尿道外括约肌收缩并允许膀胱充盈。

在一些方面，个体通过启用围绕或位于骶脊神经之一(例如S1、S2、S3、S4或S5中的任一种)和/或阴部神经附近的来自一个或多个光源(例如光套)的光构件来外部控制负责逼尿肌神经支配的神经元和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元的极化状态。在另一个实施方案中，当个体需要排尿和/或尿急或根据预定时程想要排尿时，个体通过启用围绕或位于阴部神经附近的光源而同时停用围绕或位于骶脊神经附近的光源来选择性改变负责逼尿肌神经支配的神经元和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元的膜极化状态。在另一个实施方案中，个体是人类。

在一些方面，在个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体可用包含任何上述多核苷酸的表达载体转染。在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体，例如任何上述病毒表达载体。在一些方面，负责逼尿肌神经支配的神经元群体可通过将表达载体注射至骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中来转染。在其它方面，负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体是通过将表达载体注射至奥那夫核中来转染。在一些方面，能够响应于外部信号而产生光的一个或多个光源(例如光套)，例如上述那些，通过手术方式置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近以及阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围。

大便失禁

本文还提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性视蛋白能够响应于光而诱导表达光响应性蛋白的神经元的超极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化允许括约肌的松弛。可施用任何编码能够诱导超极化的光响应性视蛋白的本文所述多核苷酸。在其它实施方案中，负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体是通过暴露于琥珀色光而超极化。

当通过置于阴部神经和/或一个或多个骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)照射时，表达于肛门外括约肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白维持超极化中性膜电位，从而防止肛门外括约肌收缩并允许个体排便。当表达于阴部神经和/或骶脊神经的肛门外括约肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，肛门外括约肌自然收缩并允许粪便储存在肠道中。

本文还提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性视蛋白能够响应于光而造成表达光响应性蛋白的神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的去极化诱发性突触耗竭允许括约肌的松弛。可施用任何编码能够诱导神经元的去极化诱发性突触耗竭的光响应性视蛋白的本文所述多核苷酸。在其它实施方案中，负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体可通过暴露于蓝色、绿色、黄色、橙色或红色光而去极化至突触耗竭点。在一些实施方案中，光可具有至少约100Hz的强度。

当利用置于由阴部和/或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源照射时，表达于肛门外括约肌神经支配的质膜上的光响应性视蛋白造成那些神经元的去极化诱发性突触耗竭，从而防止肛门外括约肌的收缩并允许个体排便。当表达于阴部神经和/或骶脊神经的肛门外括约肌神经支配上的光响应性视蛋白未用可植入光源照射时，肛门外括约肌自然收缩并允许直肠储存粪便。

在一些方面，个体通过启用围绕或位于骶脊神经和/或阴部神经附近的来自一个或多个光源(例如光套)的光构件而对负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化状态进行外部控制。在另一个实施方案中，当个体需要排便和/或迫切需要排便或根据预定时程想要排便时，个体通过启用围绕或位于阴部神经和/或骶脊神经附近的光源而选择性改变负责肛门外括约肌神经支配的神经元的膜极化状态。在另一个实施方案中，个体是人类。在一些方面，在个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体可用包含任何上述多核苷酸的表达载体转染。在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体，例如任何上述病毒表达载体。在一些方面，负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体通过将表达载体注射至骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)中来转染。在其它方面，负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体是通过将表达载体注射至阴部神经中或通过将表达载体注射至奥那夫核中来转染。在一些方面，能够响应于外部信号而产生光的一个或多个光源(例如光套)，例如上述那些，通过手术方式置于由阴部神经和/或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近。

用光响应性视蛋白或电刺激进行去极化以驱动肌肉收缩

膀胱功能障碍

由于不同于大多数骨骼肌，不存在对抗括约肌收缩的其它肌肉(例如，肱二头肌是相对于肱三头肌)，因此括约肌存在于自然收缩(紧张)状态。然而，在一些情况下，位于括约肌神经支配位点上游的细胞或神经元可能受损、无功能或不能产生足够强以从膀胱排出尿液的肌肉收缩，以关闭尿道外括约肌，或关闭肛门外括约肌。在这些情形下，通过使用光响应性视蛋白或传统电刺激对这些外周神经进行去极化可以用于恢复排尿功能和/或大便节制并分别实现逼尿肌、尿道括约肌和/或肛门括约肌的“开/关”控制。

因此，本文提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的编码第一光响应性视蛋白和第二光响应性视蛋白的多核苷酸序列(例如任何上文公开的多核苷酸序列)，其中所述第一光响应性视蛋白和所述第二光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述第一光响应性视蛋白能够响应于第一波长的光而诱导表达第一光响应性蛋白的神经元的超极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液，其中所述第二光响应性视蛋白能够响应于第二波长的光而诱导表达第二光响应性蛋白的神经元的去极化，由此负责逼尿肌神经支配的神经元的去极化允许从膀胱中排空尿液并且负责尿道外括约肌神经支配的神经元的去极化允许关闭括约肌以允许尿液储存。在一些实施方案中，膀胱功能障碍是DH和/或DSD。

当利用由置于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)提供的具有第一波长的光照射时，表达于逼尿肌神经支配的质膜上的第一光响应性视蛋白将神经支配超极化，从而防止逼尿肌收缩并允许膀胱充盈。当表达于由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配上的第二光响应性视蛋白利用由可植入光源提供的具有第二波长的光照射时，由于逼尿肌神经支配的去极化，逼尿肌能够收缩。类似地，当利用由置于阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)提供的具有第一波长的光照射时，表达于尿道外括约肌神经支配的质膜上的第一光响应性视蛋白将那些神经元超极化，从而防止尿道外括约肌收缩并允许个体排尿。当表达于阴部神经的尿道外括约肌神经支配上的第二光响应性视蛋白利用由可植入光源提供的具有第二波长的光照射时，由于神经支配的去极化使尿道外括约肌收缩，从而允许尿液储存在膀胱中。

大便失禁

另外，本文提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的编码第一光响应性视蛋白和第二光响应性视蛋白的多核苷酸序列(例如任何上文公开的多核苷酸序列)，其中所述第一光响应性视蛋白和所述第二光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述第一光响应性视蛋白能够响应于第一波长的光而诱导表达第一光响应性蛋白的神经元的超极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的超极化允许括约肌松弛以允许排便，其中所述第二光响应性视蛋白能够响应于第二波长的光而诱导表达第二光响应性蛋白的神经元的去极化，由此负责肛门外括约肌神经支配的神经元的去极化允许关闭括约肌以允许粪便储存在肠道中。

当利用由置于由阴部神经和/或骶脊神经产生的肛门外括约肌神经支配周围或附近的可植入光源(例如光套)提供的具有第一波长的光照射时，表达于肛门外括约肌神经支配的质膜上的第一光响应性视蛋白将神经支配超极化，从而防止括约肌收缩并允许括约肌松弛。当表达于由骶脊神经和/或阴部神经产生的肛门外括约肌神经支配的质膜上的第二光响应性视蛋白利用由可植入光源提供的具有第二波长的光照射时，由于括约肌神经支配的去极化，括约肌能够收缩，从而允许粪便储存在直肠中。

在另一个方面，用于治疗大便失禁的方法进一步包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸(例如任何上文公开的多核苷酸序列)，其中光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责造成直肠收缩的肌肉的神经支配的神经元群体的质膜上，其中光响应性视蛋白能够响应于光而诱导表达光响应性蛋白的神经元的去极化，由此负责造成直肠收缩的肌肉的神经支配的神经元的去极化促进排便。在一些方面，个体通过启用围绕或位于由下腹下神经丛产生的骶脊神经和/或神经纤维附近的来自一个或多个光源(例如光套或任何本文所述光源)的光构件而对负责造成直肠收缩的肌肉的神经支配的神经元的去极化状态进行外部控制。在另一个实施方案中，当个体需要排便和/或迫切需要排便或根据预定时程想要排便时，个体通过启用围绕或位于由下腹下神经丛产生的骶脊神经和/或神经纤维附近的光源而选择性改变负责造成直肠收缩的肌肉的神经支配的神经元的膜极化状态。

在其它方面，所述方法还可包括电刺激，其可用于将逼尿肌的神经支配和/或尿道外括约肌的阴部神经支配以及肛门外括约肌的神经支配去极化。在一些实施方案中，将可外部控制的电极置于负责逼尿肌神经支配的神经元、负责尿道外括约肌神经支配的神经元和/或负责肛门外括约肌神经支配的神经元周围或附近。在其它实施方案中，电刺激可用于将由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配去极化，从而导致逼尿肌收缩和膀胱排空，而光响应性视蛋白可用于将由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配的去极化诱发性突触耗竭超极化或造成由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配的去极化诱发性突触耗竭，导致逼尿肌松弛，从而允许膀胱充盈。在另一个实施方案中，电刺激可用于将阴部神经的尿道外括约肌神经支配去极化，从而关闭尿道外括约肌并允许膀胱充盈，而光响应性视蛋白可用于将阴部神经的尿道外括约肌神经支配的去极化诱发性突触耗竭超极化或造成阴部神经的尿道外括约肌神经支配的去极化诱发性突触耗竭，导致尿道外括约肌松弛，从而允许膀胱排空。

用光响应性视蛋白进行去极化以治疗性功能障碍

本文还提供用于治疗有需要的个体的性功能障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责造成性功能的生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性视蛋白能够响应于光而造成表达光响应性蛋白的神经元的去极化，由此负责生殖器神经支配的神经元的去极化在个体中允许性交和/或性功能。在一些实施方案中，性功能是选自由勃起、性高潮、射精和阴道润滑组成的群组的一种或多种功能。在其它实施方案中，性功能是恢复维持性唤起所需的生殖器的触觉。可施用任何编码能够诱导神经元的去极化的光响应性视蛋白的本文所述多核苷酸。在其它实施方案中，神经元群体可通过暴露于蓝色、绿色、黄色、橙色或红色光而去极化至突触耗竭点。

当利用置于阴茎/阴蒂的背神经(阴部神经的分支)或骶脊神经周围或附近的可植入光源照射时，表达于阴茎/阴蒂的背神经的质膜上的光响应性视蛋白造成那些神经元的去极化，导致那些肌肉的收缩和与正常性交相关的感觉和/或功能。这些包括但不限于勃起、性高潮、射精和阴道润滑。另外，当利用置于阴茎/阴蒂的背神经(阴部神经的分支)或骶脊神经周围或附近的可植入光源照射时，表达于阴茎/阴蒂的背神经的质膜上的光响应性视蛋白造成那些神经元的去极化，导致维持性唤起所需的生殖器的触觉恢复。

在一些方面，个体通过启用围绕或位于阴部神经(例如阴部神经的阴茎/阴蒂分支的背神经)或骶脊神经附近的来自一个或多个光源的光构件而对负责生殖器神经支配的神经元的去极化进行外部控制。在另一个实施方案中，当个体想要进行性交时或当个体根据预定时程选择进行性交时，个体通过启用围绕或位于阴部神经和/或骶脊神经附近的来自一个或多个光源的光构件(例如光套)而外部改变负责生殖器肌肉的神经支配的神经元的极化状态。在另一个实施方案中，个体可以是人类。

在一些方面，负责生殖器的肌肉和器官的神经支配的神经元群体可通过将多核苷酸表达载体(例如任何上述多核苷酸表达载体)注射至骶脊神经(例如S1、S2、S3、S4和/或S5中的任一种)的躯体运动神经元细胞体中来转染。在其它方面，负责生殖器的肌肉的神经支配的神经元群体可通过将表达载体注射至阴部神经中来转染。在一些方面，能够响应于外部信号而产生光的一个或多个光源(例如光套)，例如上述那些，可通过手术方式置于阴部神经(例如阴部神经的阴茎/阴蒂分支的背神经)或骶脊神经周围或附近。

试剂盒

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍、大便失禁和/或性功能障碍的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含包括编码光响应性离子泵蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；以及能够响应于外部信号而产生光的套，其中所述光能够激活光响应性离子泵蛋白。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍、大便失禁和/或性功能障碍的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含包括编码光响应性离子泵蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；以及能够响应于外部信号而产生光的套，其中所述光能够激活光响应性离子泵蛋白。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍、大便失禁和/或性功能障碍的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含包括编码光响应性离子泵蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列、ER输出信号和膜运输信号；以及能够响应于外部信号而产生光的套，其中所述光能够激活光响应性离子泵蛋白。

在其它方面，试剂盒可进一步提供一组用于向个体施用有效量的多核苷酸的说明，其中光响应性离子泵蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体、负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体和/或在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和/或用于将套置于骶脊神经的逼尿肌神经支配周围和/或阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围和/或阴部神经或骶脊神经的肛门外括约肌神经支配周围的说明。试剂盒还可提供根据任何上述方法用于使用任何上述光响应性离子泵蛋白的说明。类似地，试剂盒中所提供的光套可为任何上述光套。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一种或多种序列具有至少95％同一性的序列；和b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

主题试剂盒可进一步包括用于向个体施用有效量的多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将光源置于骶脊神经的逼尿肌神经支配周围和/或阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围的说明。在一些情况下，膀胱功能障碍是逼尿肌反射亢进和/或逼尿肌-外括约肌协同失调。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含：i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列；ii)ER输出信号；iii)和膜运输信号；以及b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

主题试剂盒可进一步包括用于向个体施用有效量的多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将光源置于骶脊神经的肛门外括约肌神经支配和/或阴部神经的痔下分支周围的说明。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一种或多种序列具有至少95％同一性的序列；以及b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

所述试剂盒可进一步包括用于向个体施用有效量的多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将光源置于骶脊神经的肛门外括约肌神经支配和/或阴部神经的痔下分支周围的说明。

在一些方面，本发明提供用于治疗有需要的个体的性功能障碍的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一种或多种序列具有至少95％同一性的序列；以及b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活视蛋白。

所述试剂盒可进一步包括用于向个体施用有效量的多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责生殖器神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将光源置于由一个或多个骶脊神经产生的生殖器神经支配、阴部神经的阴茎分支的背神经和/或阴部神经的阴蒂分支的背神经周围的说明。

实施例

实施例1：在逼尿肌外括约肌协同失调(DSD)和逼尿肌反射亢进 (DH)的动物模型中使用基于光遗传学的神经刺激

本实施例验证利用本文所述的光遗传学方法进行治疗的DSD和DH的动物模型。具有脊髓损伤的猫模型已被用于再产生DSD和DH的人类病状，这已经使用PET得到验证(Tai等,2004,ExperimentalNeurol.,190:171)。在脊髓损伤(SCI)大鼠中(Shaker等,2003,NeurourolUrodyn.,22(7):693-8)以及在EAE小鼠(它也是多发性硬化模型)中(Vignes等,2007,J.Physio.578(Pt 2):439-50)，还存在反射亢进动物模型。在本实施例中，使用来自法老(嗜)盐碱单孢菌(NpHR)的膜靶向可光活化阴离子泵halorhodopsin将负责膀胱逼尿肌和尿道外括约肌的神经支配的神经超极化。

材料和方法

根据已知方法制备以实验方法诱导脊髓损伤以复制人类DSD和DH的症状的猫(Tai等,2004,Experimental Neurol.190:171)。将在AAV1病毒载体中并处于猫科Thy1启动子控制下的黄色荧光蛋白(YFP)标记的Halorhodopsin(YFP-NpHr3.0和/或YFP-NpHR3.1；参见www.optogenetics.org)直接注射至负责逼尿肌神经支配的骶脊神经的躯体运动神经元细胞体中。另外，将在AAV1病毒载体中并处于猫科Thy1启动子控制下的YFP-halorhodopsin注射至奥那夫核(阴部神经起源)中。

光套构建和手术植入

光套构建使用0.5mm内径硼硅玻璃吸管。使用具有研磨头的牙科钻将玻璃吸管小心研磨至4mm并且将约0.5mm宽通道沿套长度纵向研磨。将紫外固化环氧树脂(Norland Products,Cranbury,NJ,NOA81)涂覆至套外部并且用UV固化灯固化。将16个小型(1.0×0.6×0.2mm)琥珀色LED(Rohm,Kyoto,Japan,SMLP12BC7T,589nm)应用至玻璃套外部并用UV固化的光学环氧树脂固定在原位。LED被布置在中心面向外周神经的同心圆周中并且用手使用40号铜磁线进行微焊接。利用数字光功率计和高速光检测器(ThorLabs,Newton,NJ,S130A和DET10A)测量单个LED的强度和开/关时间。强度测量值被用作下述光传播模型的输入，并用于构建用于估算实验光的电输入电流与光强度的曲线。

将具有发光二极管(LED)的可外部活化的光套通过手术放置以包围每个神经(一个或多个骶脊神经和/或阴部神经；参见例如Llewellyn等,2010,Nat.Med.,16(10):161-165)。

光传播模型

使用光传播模型来验证由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配以及阴部神经的尿道外括约肌神经支配(或阴部神经自身)的所有区域暴露于超过激活NpHr3.0和/或NpHR3.1氯离子泵所需的最小光强度(3.5mW/mm^-2；Gradinaru等,2010,Cell,141:1-12)的光强度。使用Aravanis等关于漫散射组织所概述的Kubelka-Munk模型来模拟光传播(2007,J Neural Eng 4,S143-56)。简要地说，根据以下公式，光强度随着距离而变化：

\frac{I_{(z)}}{I_{(z = 0)}} = \frac{ρ^{2}}{(Sz + 1) (z + ρ)}

其中

ρ = r \sqrt{{(\frac{n}{NA})}^{2} - 1}

并且S是组织的散射长度，z是距光源的距离，r是LED芯片的直径，n是光穿过的材料的折射率，NA是LED的数值孔径，

NA＝n sinθ_1/2

并且1/2是来自LED的发散半角。这种模型考虑到由于散射和几何损失对光强度的影响。根据经验从小鼠脑切片对于400至900nm之间的波长测定散射长度所用的值，并且假设在外周组织中是类似的。这种模型还假设由于吸收未造成光强度损失，其也未考虑多重散射光子。根据LED制造商的产品册获得1/2和r的值，而利用功率计(ThorLabs,Newton,NJ,S130A)测量单个LED的I(z＝0)。

使用阴部神经直径作为这个模型中的参考，可在神经周围上和神经中枢处测定相对光强度变化。因此可测定穿过神经的任何强度下降以及超过NpHr3.0和/或NpHR3.1氯离子泵的最小光活化强度(3.5mW/mm^-2)所需的最小神经表面。在神经表面处，光套能够超过25mWmm^-2。

阴部神经和骶脊神经的运动轴突成像

通过注射氯胺酮和赛拉嗪将如上所述准备的成年脊髓损伤猫麻醉。通过切开皮肤使逼尿肌和/或尿道外括约肌暴露，接着肌肉内注射4μl的5％逆行标记染料(Fast Blue,Polysciences,Warrington,PA)。通过组织粘合剂(VetBond,3M,St.Paul,MN)闭合皮肤切口，并且使猫恢复。一周后，将动物麻醉并处死。在25℃下将阴部和骶脊神经切片解剖并固定于4％多聚甲醛中30分钟。然后在1X磷酸盐缓冲盐水(以mM计，2.7KCl、1.76KH2PO4、137NaCl、10NaHPO4，pH 7.4)中将样品洗涤两次，每次在25℃下持续5分钟，包埋在50℃低熔点琼脂糖中，并用振动切片机(vibratome)切成50μm切片。

在0.1％Triton X-100(辛基苯酚聚(乙二醇醚)x)和3％正常驴血清中渗透30分钟后，用小鼠单克隆抗核纤层蛋白1:500(Abcam,Cambridge,MA)和兔多克隆抗τ1:1000(DAKO,Cambridgeshire,UK)将切片温育过夜。然后在25℃下用荧光Cy3结合或Cy5结合的二级抗体1:1000(Jackson Laboratories,West Grove,PA)将切片洗涤并温育3小时。使用具有20X/0.70NA或40X/1.25NA油浸物镜的Leica TCSSP5扫描激光显微镜(Leica Microsystems GmbH,Wetzlar,Germany)获取共焦荧光影像。使用相等设置获得多个主题的多个连续堆叠影像。

影像分析

使用ImageJ软件(NIH,Bethesda,MD)通过人工分析测定运动轴突的数目、尺寸和荧光强度(3μm和G比率0.5)。用手画出核纤层蛋白标记的髓鞘和τ标记的轴膜的外周以形成所感兴趣的区域。然后在ImageJ中自动测定所感兴趣的区域的Feret直径和平均像素强度。通过找出每个轴突中心与神经外部之间的最短距离来测定阴部和骶脊神经内的轴突深度。在Matlab(Mathworks,Natick,MA)中使用Lilliefors测试(α＝0.05)进行第一次常态测试后，使用配对双尾Studentt检验(α＝0.05)测试运动轴突直径与黄色荧光蛋白的像素强度的统计学显著相关性。

通过检查与轴突的长轴平行和垂直的阴部和骶脊神经的横截面来定量YFP标记的光响应性氯离子泵在Thy1::NpHR猫的运动轴突内的分布。

通过光套提供的刺激引起逼尿肌和尿道外括约肌的电反应和收缩反应。

使用外部信号来启用LED。将骶脊LED和阴部LED启用，以使得当一者打开时，另一者关闭。当骶脊LED打开时，膀胱松弛并且尿道外括约肌起作用，使得尿液储存。当骶脊LED关闭时，尿道外括约肌打开，使得尿道外括约肌松弛并允许尿液从收缩的膀胱中流过。当排尿完成时，再次打开骶脊LED，同时关闭尿道外括约肌LED。

实施例2：在逼尿肌外括约肌协同失调(DSD)和逼尿肌反射亢进 (DH)的动物模型中使用光响应性阳离子通道来引起去极化诱发性突触耗竭

本实施例验证用上述光遗传学方法进行治疗的DSD和DH的动物模型，由此通过由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配和阴部神经的尿道外括约肌神经支配的选择性去极化诱发性突触耗竭恢复泌尿功能。猫科或啮齿动物模型与实施例1中所用的模型相同。

将在AAV1病毒载体中并处于猫科Thy1启动子控制下的黄色荧光蛋白(YFP)标记的SSFO(pAAV-Thy1-hChR2(E123T/T159C)-EYFP；参见www.optogenetics.org)直接注射至骶脊神经(负责逼尿肌神经支配)的躯体运动神经元细胞体中和奥那夫核(负责尿道外括约肌神经支配)中。

如实施例1中制造光套。将具有发光二极管(LED)的可外部活化的光套通过手术放置以包围由骶脊神经产生的逼尿肌神经支配和阴部神经的尿道外括约肌神经支配。通过用强度为至少100Hz的光激活光响应性阳离子通道蛋白而造成的去极化诱发性突触耗竭引起逼尿肌松弛，从而允许膀胱充盈。另外，通过用强度为至少100Hz的光激活光响应性阳离子通道蛋白而造成的去极化诱发性突触耗竭引起尿道外括约肌松弛，从而允许尿液排空。

实施例3：AAV载体构建体

产生以下腺相关病毒(AAV)构建体：1)AAV1:hsyn-ChR2-EYFP(包含编码ChR2-eYFP融合蛋白的核苷酸序列的AAV1，可操作地连接至人类突触蛋白1启动子)；2)AAV6-hsyn-ChR2-EYFP(包含编码ChR2-eYFP融合蛋白的核苷酸序列的AAV6，可操作地连接至人类突触蛋白1启动子)；3)AAV1-hsyn-NpHR-EYFP(包含编码NpHR3.0-EYFP融合蛋白的核苷酸序列的AAV1，可操作地连接至人类突触蛋白1启动子)；4)AAV6-hsyn-NpHR-EYFP(包含编码NpHR 3.0-EYFP融合蛋白的核苷酸序列的AAV6，可操作地连接至人类突触蛋白1启动子)；5)AAV1-hsyn-eARCH-EYFP(包含编码eARCH 3.0-EYFP融合蛋白的核苷酸序列的AAV1，可操作地连接至人类突触蛋白1启动子)。

在杆状病毒系统(Virovek,Hayward,CA；如WO 2008/024998中所述)中产生单链DNA AAV病毒

实施例4：在大鼠中肌肉内注射编码视蛋白的AAV

将约12μL于实施例3中所述的构建体中的总剂量为约1×10¹²个病毒基因组(vg)注射至各130-170g的雌性F344/Sprague Dawley大鼠的EUS肌肉中。在注射后几天后，将动物处死，并且评估由背外侧核(DLN)中的构建体编码的视蛋白以及脊髓的其它区域的表达。图1示意性描绘脊髓(包括DLN)的多个切片。所有构建体都编码视蛋白-EYFP融合蛋白(例如，ChR2-EYFP；NpHR-EYFP；eARCH-EYFP)。

制备大鼠脊髓的40nm切片。用DAPI将切片染色并用荧光显微镜研究。使用共焦显微镜通过使YFP标记可视化来计数所有切片上的DLN运动神经元。使用40x物镜使运动神经元可视化，并且通过合并来自DAPI(描绘细胞核)和YFP(指示细胞体的区域)通道的影像获得切片的显微照片。在连续切片上计数在DLN内具有被YFP包围的可见细胞核的切片以测定每个动物的总运动神经元计数。在每个切片中，如果细胞关于核染色显示YFP表达和DAPI，则将它们计数为阳性。数据描绘于图2中。

如图2左图中所示，所有阴部运动神经元中有大约一半表达由各种注射的AAV构建体编码的蛋白质。如通过逆行标记测量的阴部运动神经元总数的文献值大约是60(DL右和DL左)，并且总共120。(Kane等,(2002)Anat.Rec.266:21-29)。

实施例5：测量大鼠中EUS肌肉的收缩和膀胱压力

在将AAV1-hsyn-ChR2-EYFP肌肉内注射至EUS中之后90天，进行膀胱和尿道外括约肌的膀胱测压和括约肌-EMG记录。膀胱测压涉及将导管置于钩连至压力传感器的啮齿动物膀胱中。将电极置于EUS中并钩连至记录放大器以测量括约肌收缩(EMG)活性。数据呈现于图3中。

图3示出了在肌肉内(至EUS中)注射AAV1-hsyn-ChR2-EYFP的大鼠的阴部神经处用蓝色光进行光刺激后在不同的频率/持续时间下的EUS肌肉收缩。对阴部神经所观察到的光学诱导收缩追随着5-50Hz的光脉冲频率。

预期仅对本发明具示例性并且因此不应视为以任何方式限制本发明的实施例也描述并详述上文讨论的本发明的方面和实施方案。前述实施例和详细描述以说明方式而非限制方式提供。在本说明书中引用的所有公开、专利申请和专利以引用的方式并入本文中，如同每个单独的公开、专利申请或专利以引用的方式明确且单独地并入一般。特别是，本文引用的所有公开出于描述和公开组合物和方法的目的以引用的方式明确并入本文中，其可结合本发明使用。虽然已为了理解清楚而通过说明和举例的方式详细地描述前述发明，但本领域的普通技术人员鉴于本发明的教导应容易认识到，在不偏离所附权利要求的精神或范围的情况下可对其作出某些变化和修改。

序列

不具有信号肽的NpHR的氨基酸序列：

VTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLSAGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADD(SEQ ID NO:1).

eYFP-NpHR3.0的氨基酸序列：

MTETLPPVTESAVALQAEVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITSEGEYIPLDQIDINVVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV(SEQ ID NO:2).

eYFP-NpHR3.1的氨基酸序列：

MVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITSEGEYIPLDQIDINVVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV(SEQ ID NO:3).

GtR3的氨基酸序列：

ASSFGKALLEFVFIVFACTTLLLGINAAKSKAASRVLFPATFVTGIASIAYFSMASGGGWVIAPDCRQLFVARYLDWLTTTPLLLIDLGLVAGVSRWDIMALCLSDVLMIATGAFGSLTVGNVKWVWWFFGMCWFLHIIFALGKSWAEAAKAKGGDSASVYSKIAGITVTTWFCYPVVWVFAEGFGNFSVTFEVLIYGVLDVISKAVFGLILMSGAATGYESI(SEQ ID NO:4).

ChR2的氨基酸序列：

MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO:5).

SFO的氨基酸序列：

MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIEECLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO:6).

SSFO的氨基酸序列：

MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGL

CYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP(SEQ ID NO:7).

C1V1的氨基酸序列：

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:8).

C1V1(E122T)的氨基酸序列：

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWTTFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:9).

C1V1(E162T)的氨基酸序列：

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED(SEQ ID NO:10).

C1V1(E122T/E162T)的氨基酸序列：

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEED(SEQ ID NO:11).

eArch的氨基酸序列：

MDPIALQAGYDLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFLVRGWGVTDKDAREYYAVTILVPGIASAAYLSMFFGIGLTEVTVGGEMLDIYYARYADWLFTTPLLLLDLALLAKVDRVTIGTLVGVDALMIVTGLIGALSHTAIARYSWWLFSTICMIVVLYFLATSLRSAAKERGPEVASTFNTLTALVLVLWTAYPILWIIGTEGAGVVGLGIETLLFMVLDVTAKVGFGFILLRSRAILGDTEAPEPSAGADVSAAD(SEQ ID NO:23).

eArch3.0-EYFP的氨基酸序列：

MDPIALQAGYDLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFLVRGWGVTDKDAREYYAVTILVPGIASAAYLSMFFGIGLTEVTVGGEMLDIYYARYADWLFTTPLLLLDLALLAKVDRVTIGTLVGVDALMIVTGLIGALSHTAIARYSWWLFSTICMIVVLYFLATSLRSAAKERGPEVASTFNTLTALVLVLWTAYPILWIIGTEGAGVVGLGIETLLFMVLDVTAKVGFGFILLRSRAILGDTEAPEPSAGADVSAADRPVVAVSKAAAKSRITSEGEYIPLDQIDINVVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMLQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV(SEQ ID NO:24).

Claims

1.一种用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：

向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌的神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌的神经支配的神经元群体的质膜上，

其中所述视蛋白响应于光而诱导表达所述视蛋白的所述神经元的超极化，由此负责所述逼尿肌神经支配的所述神经元的超极化允许尿液储存在膀胱中并且负责所述尿道外括约肌神经支配的所述神经元的超极化允许从膀胱中排空尿液，

其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含：i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列；ii)ER输出信号；和iii)膜运输信号。

2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：

向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责所述逼尿肌的神经支配的神经元群体和/或负责所述尿道外括约肌的神经支配的神经元群体的质膜上，

其中所述视蛋白诱导所述神经元的去极化，由此负责所述逼尿肌神经支配的所述神经元的去极化允许从膀胱中排空尿液并且负责所述尿道外括约肌神经支配的所述神经元的去极化允许尿液储存在膀胱中，

其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含与选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的序列具有至少95％同一性的序列。

3.一种用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：

其中所述视蛋白能够响应于光而诱导表达所述视蛋白的所述神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责所述逼尿肌神经支配的所述神经元的去极化诱发性突触耗竭允许尿液储存在膀胱中并且负责所述尿道外括约肌神经支配的所述神经元的去极化诱发性突触耗竭允许从膀胱中排空尿液，

4.一种用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的方法，所述方法包括：

其中所述视蛋白能够诱导所述神经元的去极化，由此负责所述逼尿肌神经支配的所述神经元的去极化允许从膀胱中排空尿液并且负责所述尿道外括约肌神经支配的所述神经元的去极化允许尿液储存在膀胱中，

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述膀胱功能障碍是逼尿肌反射亢进和/或逼尿肌-外括约肌协同失调。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述膀胱功能障碍与脊髓损伤或多发性硬化相关。

7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中负责所述逼尿肌的神经支配的所述神经元群体是所述个体中由一个或多个骶脊神经产生的神经元。

8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中负责所述尿道外括约肌的神经支配的所述神经元群体包含所述个体中的阴部神经的神经元。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中能够响应于外部信号而产生光的光源被置于由所述骶脊神经产生的逼尿肌神经支配周围和/或所述阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围，其中所述光能够激活表达于所述神经元的质膜上的所述光响应性视蛋白。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述光源能够产生红色、琥珀色、蓝色或绿色光。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述个体通过启用围绕所述骶脊神经和/或所述阴部神经的光源而对负责所述逼尿肌的神经支配的神经元和/或负责所述尿道外括约肌的神经支配的神经元的极化状态进行外部控制。

12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至所述骶脊神经的躯体运动神经元细胞体中而施用。

13.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至所述阴部神经中而施用。

14.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核中而施用。

15.一种用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：

向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上，

其中所述视蛋白响应于光而诱导表达所述视蛋白的神经元的超极化，由此负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元的超极化允许排便，

其中所述多核苷酸包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列，所述光响应性视蛋白包含：i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列；ii)ER输出信号；iii)和膜运输信号。

16.如权利要求15所述的方法，其进一步包括：

其中所述视蛋白诱导所述神经元的去极化，由此负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元的去极化允许粪便储存在直肠中，

17.一种用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：

其中所述视蛋白能够响应于光而诱导表达所述视蛋白的所述神经元的去极化诱发性突触耗竭，由此负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元的去极化诱发性突触耗竭允许排便，

18.一种用于治疗有需要的个体的大便失禁的方法，所述方法包括：

其中所述视蛋白能够诱导所述神经元的去极化，由此负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元的去极化允许粪便储存在直肠中，

19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用有效量的包含编码光响应性阳离子通道蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述光响应性阳离子通道蛋白表达于在所述个体中负责造成直肠收缩的肌肉的神经支配的神经元群体的质膜上，其中所述光响应性阳离子通道蛋白能够响应于光而诱导表达所述光响应性蛋白的所述神经元的去极化，由此负责造成所述直肠收缩的所述肌肉的神经支配的所述神经元的去极化促进排便。

20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述大便失禁与分娩、长期便秘、中风、糖尿病、多发性硬化或脊髓损伤相关。

21.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中在所述个体中负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元群体是由一个或多个骶脊神经产生的神经元。

22.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中在所述个体中负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元群体包含阴部神经的痔下分支的神经元。

23.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中能够响应于外部信号而产生光的光源被置于所述骶脊神经的所述肛门外括约肌神经支配周围和/或所述阴部神经的痔下分支周围，其中所述光能够激活表达于所述神经元的质膜上的所述光响应性视蛋白。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述光源能够产生红色、琥珀色、蓝色和/或绿色光。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述个体通过启用围绕所述骶脊神经的所述肛门外括约肌神经支配和/或所述阴部神经的所述痔下分支周围的光源而对负责所述肛门外括约肌神经支配的所述神经元的极化状态进行外部控制。

26.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至骶脊神经的躯体运动神经元细胞体中来施用。

27.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至所述阴部神经中来施用。

28.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核中来施用。

29.一种用于治疗有需要的个体的性功能障碍的方法，所述方法包括：

向所述个体施用有效量的包含编码光响应性视蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述视蛋白表达于所述个体的负责生殖器神经支配的神经元群体的质膜上，

其中所述视蛋白响应于光而诱导表达所述视蛋白的所述神经元的去极化，由此负责所述生殖器神经支配的所述神经元的去极化恢复性功能。

30.如权利要求29所述的方法，其中所恢复的性功能是选自由勃起、性高潮、射精、阴道润滑和维持性唤起所需的生殖器触觉组成的群组的一种或多种功能。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述性功能障碍与糖尿病性神经病、多发性硬化、肿瘤、三期梅毒、内分泌紊乱、激素缺乏或脊髓损伤相关。

32.如权利要求29所述的方法，其中负责所述生殖器神经支配的所述神经元群体包含在所述个体中由一个或多个骶脊神经产生的神经元。

33.如权利要求29所述的方法，其中负责所述生殖器神经支配的所述神经元群体包含男性个体中阴部神经的阴茎分支的背神经的神经元。

34.如权利要求29所述的方法，其中负责所述生殖器神经支配的所述神经元群体包含女性个体中阴部神经的阴蒂分支的背神经的神经元。

35.如权利要求29所述的方法，其中将能够响应于外部信号而产生光的光源置于骶脊神经周围和/或阴部神经的神经支配周围，其中所述光能够激活表达于所述神经元的质膜上的所述光响应性视蛋白。

36.如权利要求29所述的方法，其中所述光源能够产生红色、琥珀色、蓝色和/或绿色光。

37.如权利要求29所述的方法，其中所述个体通过启用围绕所述骶脊神经和/或所述阴部神经的光源而对负责所述生殖器神经支配的所述神经元的极化状态进行外部控制。

38.如权利要求29所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至一个或多个骶脊神经的躯体运动神经元细胞体中来施用。

39.如权利要求29所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至所述阴部神经中来施用。

40.如权利要求29所述的方法，其中所述多核苷酸是通过将所述多核苷酸注射至奥那夫核中来施用。

41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是载体。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述载体是选自由AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体和慢病毒载体组成的群组的病毒载体。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述病毒载体是AAV1、AAV2、AAV6或AAV9。

44.如权利要求1或15所述的方法，其中所述光响应性视蛋白包含信号肽。

45.如权利要求1或15所述的方法，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQ ID NO:21)。

46.如权利要求1或15所述的方法，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:12)。

47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述光响应性视蛋白的表达受到选自由EF1α启动子、CMV启动子、CAG启动子、突触蛋白启动子、Thy1启动子和CAMKII启动子组成的群组的启动子控制。

48.一种用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：

a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含：i)与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；ii)ER输出信号；iii)和膜运输信号；以及

b)能够响应于外部信号而产生光的光源，其中所述光能够激活所述视蛋白。

49.如权利要求48所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述个体施用有效量的所述多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将所述光源置于骶脊神经的逼尿肌神经支配周围和/或阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围的说明。

50.一种用于治疗有需要的个体的膀胱功能障碍的试剂盒，其包含：

a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一种或多种序列具有至少95％同一性的序列；以及

51.如权利要求50所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述个体施用有效量的所述多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责逼尿肌神经支配的神经元群体和/或负责尿道外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将所述光源置于骶脊神经的逼尿肌神经支配周围和/或阴部神经的尿道外括约肌神经支配周围的说明。

52.如权利要求48或50所述的试剂盒，其中所述膀胱功能障碍是逼尿肌反射亢进和/或逼尿肌-外括约肌协同失调。

53.一种用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其包含：

a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码所述视蛋白的核苷酸序列，所述视蛋白包含：i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:23中所示的序列具有至少95％同一性的序列；ii)ER输出信号；iii)和膜运输信号；以及

54.如权利要求53所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述个体施用有效量的所述多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将所述光源置于骶脊神经的肛门外括约肌神经支配和/或阴部神经的痔下分支周围的说明。

55.一种用于治疗有需要的个体的大便失禁的试剂盒，其包含：

56.如权利要求55所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述个体施用有效量的所述多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责肛门外括约肌神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将所述光源置于骶脊神经的肛门外括约肌神经支配和/或阴部神经的痔下分支周围的说明。

57.一种用于治疗有需要的个体的性功能障碍的试剂盒，其包含：

a)编码光响应性视蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含与选自由SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成的群组的一种或多种序列具有至少95％同一性的序列；以及

58.如权利要求57所述的试剂盒，其进一步包含用于向所述个体施用有效量的所述多核苷酸的说明，其中由所述多核苷酸编码的所述光响应性视蛋白表达于在所述个体中负责生殖器神经支配的神经元群体的质膜上；和用于将所述光源置于由一个或多个骶脊神经产生的生殖器神经支配、阴部神经的阴茎分支的背神经和/或阴部神经的阴蒂分支的背神经周围的说明。

59.如权利要求48、49、53、55或57所述的试剂盒，其中所述氨基酸序列进一步包含信号肽。

60.如权利要求48或53所述的试剂盒，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。

61.如权利要求48或53所述的试剂盒，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:12)。

62.如权利要求48至61中任一项所述的试剂盒，其中所述多核苷酸是载体。

63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述载体是选自由AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体和慢病毒载体组成的群组的病毒载体。

64.如权利要求48、49、53、55或57所述的试剂盒，其中所述光源能够产生琥珀色、红色、蓝色或绿色光。

65.如权利要求48、49、53、55或57所述的试剂盒，其中所述外部信号是无线电信号。

66.如权利要求48、49、53、55或57所述的试剂盒，其中所述外部信号是微波信号。