CN103919857A - 一种具有降尿酸作用的桉叶提取物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桉叶提取物作为活性成分在制备治疗高尿酸血症的药物中的应用。本发明还提供了该桉叶提取物的制备方法,其主要活性成分为月见草素B6~12%,特里马素Ⅰ1~2%,槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸1~1.5%,鞣花酸0.8~1.2%,特里马素Ⅱ0.2~0.5%,1,2,3,4,6五没食子酰葡萄糖0.1~0.15%,总酚含量在25~50%。通过药理试验证明,本发明所述的桉叶提取物不仅对黄嘌呤氧化酶有抑制作用,并且在体内具有较强的降尿酸和保护高尿酸血症所引起的肾损伤等作用。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种桉叶提取物、制备方法及其在治疗高尿酸血症药物中的应用。
背景技术
高尿酸血症(hyperuricemia),是由痛风(gout)引起的临床症状,是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病,其临床特点为导致血尿酸浓度过高及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积痛风石性慢性关节炎和关节畸形,常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石,并且可能导致代谢综合征和相关的心血管疾病,已被联合国列为21世纪20大顽症之一。
防治高尿酸血症类药物主要分为尿酸生成抑制药(如别嘌醇、非布索坦等)和促尿酸排泄药(如丙磺舒、苯溴马隆等) 两种。黄嘌呤氧化酶是人体内催化尿酸生成过程中最重要的酶,因此抑制其活性能达到防止尿酸产生的作用,虽然其抑制药物别嘌醇一直延用至今,但日前国家食品药品监督管理总局发布第57期《药品不良反应信息通报》,提示别嘌醇引起重症药疹的安全问题,应用后病人可有发热、过敏性皮疹,甚至有肝功能损害等副作用;而促尿酸排泄药如丙磺舒、苯溴马隆等常伴随有皮疹、发热、肾脏损害等副作用。自古以来,包括中国、印度、加拿大在内的多个国家和地区就有用植物药材治疗痛风的传统。据文献报道,天然植物药材来源中含有大量黄嘌呤氧化酶抑制剂和促尿酸排泄成分,并且毒性小,安全性高,不易引起过敏反应且来源广,有的甚至可以用于日常饮食,具有很好的研究及开发前景。
桉树是桃金娘科(Myrtaceae) 桉树属( Eucalyptus) 植物的统称,桉叶作为桉树的副产物一直作为民间传统中草药,常用作清热解毒治感冒等用途,已有研究表明桉叶提取物含有大量强抗氧化活性物质,主要为黄酮类、有机酸类、鞣质及多酚类等有效成分,具有明显的抗衰老、抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎等功效,并且研究表明桉叶中的多种功能都与其抗氧化作用有关。目前,尚未见到采用桉叶提取物治疗高尿酸血症以及痛风的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于一种具有降尿酸作用的桉叶提取物及其制备方法,该提取物不仅对黄嘌呤氧化酶有抑制作用,并且在体内具有较强的降尿酸和保护高尿酸血症所引起的肾损伤等作用。
本发明的提供的具有降尿酸作用的桉叶提取物,含有以下质量百分比的活性成分:月见草素B 6~12%,特里马素Ⅰ1~2%,槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸1~1.5%,鞣花酸0.8~1.2%,特里马素Ⅱ0.2~0.5%,1,2,3,4,6五没食子酰葡萄糖0.1~0.15%,总多酚含量25~50%。
本发明所述桉叶提取物,包括桉叶粗提取物,桉叶萃取物和桉叶大孔树脂制备物三种提取物。
所述桉叶粗提取物的制备方法,其具体步骤包括:取桉叶避光阴干,粉碎至40-80目,放入常规提取罐中,加入40~80%乙醇水溶液,在45~55℃常压提取1~24小时,重复提取1~3次,然后用板框过滤1次再经0.22μm陶瓷膜过滤1次,重复提取一次,合并滤液后于真空浓缩装置,于60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至乙醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶粗提取物,总多酚含量在25~30%(质量百分比)之间。
所述桉叶萃取物的制备方法,是将上述方法制得的桉叶粗提取物用正丁醇或氯仿或乙酸乙酯或乙醇或甲醇进行超声波萃取1~3小时,重复萃取1~3次后,萃取液置于60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至正丁醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶萃取物,总多酚含量在30~40%(质量百分比)之间。
所述桉叶大孔树脂制备物的制备方法,是将上述方法制得的桉叶萃取物,溶解后上已处理好的Diaion HP-20大孔树脂柱,柱子的径高比为1:5~8,上样量与树脂质量比为1:3~10,流速为3~6BV/h,依次用水和10%,20%,30%乙醇洗脱,每种溶剂冲洗2~8倍柱体积,收集30%乙醇浓度的洗脱液,经60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至正丁醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶大孔树脂制备物,总多酚含量在质量百分比为40~50%之间。
以上三种提取物所述制备方法中加入提取溶剂提取时,第一次提取时,桉叶重量kg与提取溶剂L比为1:6~10;第二次提取时,桉叶重量kg与提取溶剂L比为1:5~8。
以上三种提取物所述制备方法中喷雾干燥参数为进风温度:150~200℃,进料速度:70~100rpm,雾化器频率:25~30Hz。
以上三种提取物所述制备方法中大孔树脂可以为离子交换大孔树脂、非极性大孔树脂、中极性大孔树脂或弱极性大孔树脂。
本发明所述的桉叶为广东或四川或广西或福建产的广林9号尾巨按、DH32-29尾巨桉、U6、韦塔桉、粗皮桉、柠檬桉等桉叶提取物中的一种或一种以上的混合物。
上述桉叶提取物可以进一步制各成的剂型包括胶囊剂、片剂、散剂、口服液、软胶囊、丸剂、合剂、糖浆剂、凝胶剂、缓释制剂。为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等,填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等,崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羟甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等,润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等,助悬剂包括:聚乙烯砒咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等,粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等,甜味剂包括:糖精钠、阿斯巴甜、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等,矫味剂包括:甜味剂及各种香精,防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、醋酸氯乙定、按叶油等。
使用本发明的制备方法可获得桉多酚含量在25~50%之间的桉叶提取物,其中主要活性成分占约9~17%,现代药理学实验证明所述提取物不仅对黄嘌呤氧化酶有抑制作用,并且在体内具有较强的降尿酸和保护高尿酸血症所引起的肾损伤等作用,并且桉叶资源丰富价格低廉,本发明制备方法简单制备成本低,符合工业化生产要求,有开发作为药品或者保健品的实际意义和应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作出进一步详细地说明,但并不因此限制本发明。
实施例1:
新鲜采集桉叶30Kg,避光阴干,粉碎至60目,加入混合提取溶剂(浓度为70%乙醇240kg,柠檬酸4.8Kg),在40℃下提取1.5小时,板框过滤,再次加入混合提取溶剂(浓度为70%的乙醇180Kg),再在40℃下提取1.5小时,再次离心过滤,合并滤液,进入蒸馏釜,减压浓缩至10L,并回收乙醇,喷雾干燥,除去溶剂后为桉叶粗提取物,总多酚含量为26.54%,可用于制备治疗高尿酸血症的药物。
实施例2:
新鲜采集桉叶40Kg,避光阴干,粉碎至60目,加入混合提取溶剂(浓度为70%的乙醇320kg,柠檬酸6.4Kg),在42℃下提取1小时,板框过滤,再次加入混合提取溶剂(浓度为70%的乙醇240Kg),再次在38℃下提取2小时,离心过滤,合并滤液,进入蒸馏釜,浓缩至12L,并回收乙醇,用60L乙酸乙酯萃取,分流,在加入48L乙酸乙酯第二次萃取,分流,再次加入48L乙酸乙酯第三次萃取,合并萃取液,浓缩并回收乙酸乙酯,喷雾干燥,除去溶剂后即为桉叶乙酸乙酯萃取物,总多酚含量为33.89%,可用于制备治疗高尿酸血症的药物。
实施例3:
新鲜采集桉叶50Kg,避光阴干,粉碎至60目,加入混合提取溶剂(浓度为70%的乙醇400kg,柠檬酸8Kg),在39℃下提取1.5小时,板框过滤,再次加入混合提取溶剂(浓度为70%的乙醇300Kg),在41℃下再次提取1.5小时,再次离心过滤,合并滤液,进入蒸馏釜,浓缩至17L,并回收乙醇,用85L正丁醇萃取,分流,再加入68L正丁醇第二次萃取,再次加入68L正丁醇第三次萃取,合并萃取液,浓缩并回收正丁醇,萃取浓缩液上已处理好的Diaion HP-20大孔树脂柱,柱子的径高比为1:6,上样量与树脂质量比为1:8,流速为6BV/h,依次用水和10%,20%,30%乙醇洗脱,每种溶剂冲洗2倍柱体积,收集30%乙醇浓度的洗脱液,浓缩除去溶剂后喷雾干燥即为桉叶大孔树脂制备物,总多酚含量为44.17%,可用于制备治疗高尿酸血症的药物。
实施例4:
高效液相色谱法测定桉叶提取物对黄嘌呤氧化酶体外抑制作用
供试品溶液及各实验试剂的配制:准确称取供试样品(桉叶粗提取物,桉叶正丁醇萃取物和桉叶大孔树脂制备物),先加少量DMSO溶解,再用50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8,含0.1‰EDTA)稀释至所需浓度,DMSO终含量为5%,即为样品溶液;空白对照溶液为50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8,含0.1‰EDTA和5%DMSO),阳性对照溶液为别嘌醇溶液,用空白对照溶液稀释至所需浓度。黄嘌呤氧化酶溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8,含0.1‰EDTA)至浓度0.08 U/ml黄嘌呤氧化酶溶液;黄嘌呤溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.8,含0.1‰EDTA和0.1mmol/L NaOH)至浓度1.92mmol/L的黄嘌呤底物溶液。
反应过程:准确量取黄嘌呤底物溶液100uL,置1.5mL离心管中,加入供试品溶液(或别嘌醇溶液和空白对照溶液)100uL,混匀37℃预热5min,加入黄嘌呤氧化酶溶液10uL,混匀,37℃反应15min,加入4mol/L HCl溶液2uL,混匀,1min后,过滤膜,即得供试品反应液、阳性对照反应液和空白对照反应液。
液相条件:色谱柱Dikma Technologies C18(250mm×4.6mm,5μm);以甲醇-50mmol/L K2HPO4缓冲盐溶液(NaOH调pH至7.5)为流动相,比例为5:95;检测波长290nm;流速为1mL/min,进样量为20uL。
抑制率按下式计算:抑制率(%)=(1-供试品反应液尿酸色谱峰面积/空白反应液尿酸色谱峰面积)×100%。
计算结果如表1、2所示,桉叶提取物及其活性成分都对黄嘌呤氧化酶有一定的抑制作用。
表1 不同桉叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率(n=3)
表2 不同桉叶活性成分对黄嘌呤氧化酶的半数抑制率IC50比较(n=3)
实施例5:
桉叶提取物治疗小鼠高尿酸血症降尿酸作用研究实验
试验动物:雄性,SPF级昆明小白鼠,体重约(23±2g);
试验药物和试剂:桉叶提取物,总酚含量约30%;桉叶提取物大孔树脂30%乙醇洗脱组分(P30),总酚含量约50%;尿酸,氧嗪酸钾盐(制模剂),别嘌呤醇,苯溴马隆(阳性对照);尿酸 (UA)、肌酐 (Cr)、尿素氮(BUN)和黄嘌呤氧化酶(XOD)等试剂盒;
实验仪器:分光光度计、电子天平、全自动生化分析仪;
实验方法:雄性昆明小白鼠正常喂养适应1周后按体重随机分成10组:正常组,模型组,桉叶提取物低、中、高剂量组、P30低、中、高剂量组,别嘌醇组,苯溴马隆组,每组6只,共72只小鼠。正常组实验过程中正常饲养,同时以0.5%CMC-Na溶液灌胃,其余各组上午以造模剂灌胃(尿酸250mg/kg +氧嗪酸钾300mg/kg),下午各药物组如表3分别灌胃,各药物皆以0.5%CMC-Na溶液配制成对应浓度,所有动物给药体积均为10ml/kg,连续8d。实验期间,雄性昆明小白鼠自由摄食以及饮水,灌胃前1h禁止摄食不禁饮水。实验第7天收集第(7~8d)大鼠24 h尿液,记录尿量。第8天给药1h后处理大鼠取材,乙醚麻醉后摘眼球采血,常温下凝血1h后,4℃离心分离血清(3000r/min离心5分钟),-80℃保存待测。观察各桉叶组在动物体内的降尿酸作用,具体结果见表4和表5所示,桉叶提取物能有效减低血清中的尿酸、肌酐含量,并且有效地促进尿液中肌酐的排泄和抑制肝脏黄嘌呤氧化酶的活性,具有降低血清中尿酸的作用和同时能保护肾功能的作用。
表3 不同桉叶提取物的灌胃量
药物 | 桉低 | 桉中 | 桉高 | P30低 | P30中 | P30高 | 别嘌醇 | 苯溴马隆 |
浓度mg/kg | 80 | 160 | 320 | 60 | 120 | 240 | 5 | 10 |
表4 不同桉叶提取物对高尿酸血症小鼠血清相关指标的影响
指标 | 空白 | 模型 | 桉低 | 桉中 | 桉高 | P30低 | P30中 | P30高 | 别嘌醇 | 苯溴马隆 |
血清尿酸(mg/L) | 29.22±3.49* * | 40.59±10.73 | 35.60±12.22 | 34.09±9.85 | 34.49±5.93 | 34.06±10.75 | 32.81±12.52* | 29.97±8.88** | 32.10±10.39** | 29.18±8.52** |
血清肌酐(mg/L) | 7.56±0.86* * | 9.93±2.03 | 9.59±0.86 | 9.05±1.41* | 8.51±0.89** | 9.16±2.24* | 8.69±2.01** | 8.79±0.87** | 9.58±0.36 | 8.79±1.45** |
血尿素氮(mmol/L) | 11.40±1.10* * | 16.36±6.50 | 15.43±3.13 | 15.17±2.91 | 14.05±2.55 | 15.63±3.77 | 15.39±2.71 | 15.16±3.83 | 14.80±2.64 | 14.95±3.39 |
注:* p < 0.05, ** p <0.01 vs 与模型组比较
表5 不同桉叶提取物对高尿酸血症小鼠其他相关指标的影响
指标 | 空白 | 模型 | 桉低 | 桉中 | 桉高 | P30低 | P30中 | P30高 | 别嘌醇 | 苯溴马隆 |
尿液尿酸(mg/dL) | 77.94±6.96 | 70.26±4.57 | 70.65±8.29 | 73.04±7.91 | 73.87±8.12 | 72.37±2.46 | 72.31±0.25 | 74.03±3.39 | 73.61±6.16 | 79.36±2.90* |
尿液肌酐(mg/dL) | 125.09±4.14** | 103.62±9.56 | 109.14±4.70 | 112.28±9.07 | 113.29±8.73* | 116.78±5.01** | 118.49±5.62** | 118.60±9.25** | 118.06±4.24** | 124.95±5.77** |
肝脏XOD活性(U/g protein) | 21.02±1.37** | 29.74±2.21 | 26.93±2.39** | 24.31±2.75** | 23.79±2.09** | 26.39±2.70** | 24.93±2.91** | 23.01±0.76** | 22.85±2.11** | 26.56±1.37** |
注:* p < 0.05, ** p <0.01 vs 与模型组比较
Claims (9)
1.一种具有降尿酸作用的桉叶提取物,其特征在于,含有以下质量百分比的活性成分:月见草素B 6~12%,特里马素Ⅰ1~2%,槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸1~1.5%,鞣花酸0.8~1.2%,特里马素Ⅱ0.2~0.5%,1,2,3,4,6五没食子酰葡萄糖0.1~0.15%,总酚含量为25~50%。
2.一种如权利要求1所述桉叶粗提取物的制备方法,其特征在于,包括:取桉叶避光阴干,粉碎至40-80目;放入常规提取罐中,加入40~80%乙醇水溶液,在45~55℃常压提取1~24小时,重复提取1~3次;然后用板框过滤1次再经0.22μm陶瓷膜过滤1次,重复提取一次,合并滤液后于真空浓缩装置,于60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至乙醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶粗提取物,总多酚含量在25~30%之间。
3.根据权利要求2所述桉叶提取物的制备方法,其特征在于,将所得得桉叶粗提取物用正丁醇或氯仿或乙酸乙酯或乙醇或甲醇进行超声波萃取1~3小时,重复萃取1~3次后,萃取液置于60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至正丁醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶萃取物,总多酚含量在30~40%之间。
4.根据权利要求3所述桉叶提取物的制备方法,其特征在于,将所得桉叶萃取物溶解后上已处理好的大孔树脂柱,柱子的径高比为1:5~8,上样量与树脂质量比为1:3~10,流速为3~6BV/h,依次用水和10%,20%,30%乙醇洗脱,每种溶剂冲洗2~8倍柱体积,收集30%乙醇浓度的洗脱液,经60~80℃、300±100pa真空度下减压浓缩至正丁醇完全去除,将剩余滤液经喷雾干燥即得桉叶大孔树脂制备物,总多酚含量在质量百分比为40~50%之间。
5.根据权利要求2或3或4所述的桉叶提取物的制备方法,其特征在于,所述桉叶为广东或四川或广西产的广林9号、DH32-29、U6、韦塔桉、粗皮桉桉叶。
6.根据权利要求2所述桉叶提取物的制备方法,其特征在于,加入提取溶剂乙醇水溶液提取时,第一次提取物料比为桉叶:提取溶剂=1kg:6~10L,第二次提取物料比为桉叶:提取溶剂=1kg:5~8L。
7.根据权利要求2或3或4所述的桉叶提取物的制备方法,其特征在于,喷雾干燥参数为进风温度150-200℃,进料速度70-100rpm,雾化器频率25-30Hz。
8.根据权利要求4所述桉叶提取物的制备方法,其特征在于,大孔树脂为离子交换大孔树脂、非极性大孔树脂、中极性大孔树脂或弱极性大孔树脂。
9.如权利要求1所述的桉叶提取物在制备高尿酸血症药物方面的用途。
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