CN103667340A - 一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，胚性玉米愈伤组织作为转化受体材料。使用基因枪介导的遗传转化方法，将携带外源基因的转化载体pCAMBIA3300金粉包裹后轰击玉米胚性愈伤组织完成转化，经过组织培养、筛选、分化后进行炼苗、移栽得到一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米新材料，通过回交和分子标记辅助选择的方法验证了该抗性基因在不同遗传背景中的优良表现，为后续抗螟虫玉米新品种的培育提供了优良的种质资源。

Description

一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法

技术领域

本发明属于玉米生物技术育种技术领域，具体涉及一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，通过基因枪介导的转化技术转入抗虫基因，对转基因后代进行了一系列基因纯合鉴定、表达验证，农艺性状筛选、抗性鉴定，遗传稳定性研究；并通过回交和分子标记辅助选择的方法将抗虫基因导入育种材料中获得了高抗玉米螟的优良玉米种质材料。

背景技术

玉米（Zea mays L.），学名玉蜀黍，是重要的粮食作物，也是重要的饲料和工业原料，在国民生计和经济建设中起着至关重要的作用。世界范围内玉米虫害约350种，其中以蛀茎性和食叶性的鳞翅目害虫玉米螟分布最为广泛，危害最重，是世界性的重要玉米虫害，严重影响着玉米的产量和品质。世界上每年因为玉米螟危害造成10%以上的减产和经济损失，大发生年甚至绝收。因此有效地防治虫害对玉米生产具有重要的意义。玉米材料中缺乏有效的天然抗性基因，很难利用传统的育种技术手段筛选得到具有优良抗虫性的玉米材料，传统的害虫防治措施主要为化学防治，但是化学农药具有成本高、环境污染、易残留、会毒害有益昆虫和害虫天敌等弊端不适宜长期使用。

植物基因工程的兴起与发展，为玉米病虫害的防治提供了一条崭新的思路。利用基因工程手段培育抗虫新品种具有不污染环境、对害虫的杀虫性具有专一性、育种周期短、育种和栽培成本低等优点。现在应用基因工程手段培育的抗虫材料数量直线上升，几乎涵盖了所有的重要农作物。在众多的抗虫基因中，Bt杀虫蛋白基因是一类作用机理研究比较清楚，市场应用最广泛和最有潜力的杀虫蛋白。自从1993世界上第一例成功的转cry1Ab基因抗虫玉米出现，抗虫转基因玉米发展迅速，直到1996年，表达cry1Ab基因的转Bt基因玉米被批准商业应用于控制欧洲玉米螟危害。随后，携带来自于苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的转基因玉米越来越多地被用来控制玉米生产中主要的鳞翅目害虫。具有Cry1Ab蛋白表达的玉米种质用来进行玉米的杂交已经被证明是一个可以减少农药使用，并减少对环境和人类潜在危害的有效管理措施。

随着国内外转基因植物研究的快速发展，有关Bt基因的专利覆盖范围越来越广，而且近年来针对中国农业微生物和植物生物技术方面的飞速发展，高技术的竞争日趋激烈；获得我国自主知识产权的携带新型自主产权的Bt杀虫基因的优良种质资源，并尽快用于新一代转基因抗虫作物育种，为我国转基因农作物的持续发展提供技术保障成为极为紧迫的任务。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，通过该方法可获得一种玉米抗虫转基因新材料，命名为ZmKc，经过各种分子生物学鉴定与功能鉴定和田间试验以及分子标记辅助选择育种，获得的新的携带抗虫转基因的新材料全生育期表现出稳定的抗性，农艺性状优良，遗传稳定，适用于新型抗虫玉米材料的生产并可以有效的在玉米分子育种中广泛应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明使用的为优化后的cry1C基因，即cry1C*，其序列为SEQ ID NO.1所示。胚性玉米愈伤组织（引自华中农业大学作物遗传育种国家重点实验室，参照Plant TransformationFacility（http://agron-www.agron.iastate.edu/ptf/）作为转化受体材料。使用基因枪介导的遗传转化方法，将携带外源基因的转化载体pCAMBIA3300金粉包裹后轰击玉米胚性愈伤组织完成转化，经过组织培养、筛选、分化后进行炼苗、移栽得到转化单株。对转化材料及其后代进行一系列分子生物学实验检测和田间表型与主要农艺性状的测定，获得了一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米新材料，通过回交和分子标记辅助选择的方法验证了该抗性基因在不同遗传背景中的优良表现，为后续抗螟虫玉米新品种的培育提供了优良的种质资源。

一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，其步骤如下：

（1）按照常规方案制备胚性玉米愈伤组织。

（2）转基因载体的构建：

pCAMBIA3300载体用BamH I和Hind III进行双酶切消化并重新连接cry1C*基因获得目的载体。然后使用限制性内切酶samI切下载体上的潮霉素抗性基因，使用连接酶将带有samI酶接头的草丁膦抗性基因bar基因替换，获得转基因载体。

（3）利用基因枪介导转化的方法，将包裹有目的基因载体的金粉轰击高渗培养后的胚性愈伤组织。基因枪轰击后恢复培养7-10天后转入含有2mg/L双丙氨膦的筛选培养基筛选培养2-3轮，每轮20-30天。筛选后将具有除草剂抗性的愈伤组织转到分化培养基分化成苗，得到一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米单株。

所述的cry1C*基因序列为SEQ ID NO.1所示。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本研究首次实现了cry1C*基因在玉米中的转化，得到了含有该基因的转基因玉米优良抗虫新材料。

（2）本研究对转cry1C*基因玉米的高代自交材料的遗传稳定性和表达稳定性进行了研究分析。完成了对抗虫蛋白在不同时期不同组织的表达测定，为其优良抗性提供了有效的表达证据。

（3）由本方法获得的转基因玉米纯系ZmKc，抗性好、农艺性状优良，为玉米抗螟虫育种提供了优异的新的种质资源。

（4）利用回交和分子标记辅助选择的策略，将优良的抗性基因导入到不同遗传背景的玉米纯系中，对回交导入材料后代表达的稳定性和农艺性状进行了比较系统的分析，为转基因玉米自交系的直接杂交应用及通过分子标记辅助选择回交转育的方法将外源基因导入到其他农艺性状优良的骨干自交系中提供了依据和成功范例。

附图说明

图1为一种抗虫基因转化质粒结构示意图。

图中cry1C*基因由Ubi启动子驱动，连接在载体pCAMBIA3300多克隆位点。筛选标记基因为35S启动子驱动的bar基因。

图2为一种T₀代转cry1C*基因玉米PCR检测结果。

图中，泳道1：DNA分子量标记BM2000；泳道2：质粒模板阳性对照；泳道3-8：独立转化单株DNA为模板PCR检测。

图3：是T₁代cry1C*基因Southern blot检测结果，图中，泳道1：DNA分子量标记λ/HindIII；泳道2:质粒阳性对照；泳道3-6：独立转化单株为模板Southern检测。

图4：是T₁代cry1C*基因RT-PCR检测结果，图中，泳道M：DNA分子量标记BM2000；泳道P：质粒模板阳性对照；泳道W：未转化单株RNA模板对照；泳道C：假阳性转化单株RNA模板对照；泳道1-8：独立转化单株RNA为模板RT-PCR检测；泳道9-16：T3代单株RNA为模板RT-PCR检测。

图5：是T₃代Cry1C*蛋白ELISA检测结果，图中，a：独立转基因材料中抗虫蛋白含量变化；b：同一转化事件中不同时期抗虫蛋白含量变化；c：不同组织中蛋白质含量变化。

图6：是T₃代玉米螟抗性表型鉴定结果，图中，a：田间虫害抗性，箭头指示虫害部位；b：室内叶片喂虫表型，箭头指示虫害部位；c：茎秆虫害表型，箭头指示虫害部位。

表1:是转基因材料后代农艺性状测量结果。

具体实施方式

以下实例进一步定义本发明，并描叙了转化cry1C*基因、筛选分化转化单株及转基因种质的筛选鉴定和功能验证。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件，在本发明中，所用技术方案及步骤如未特别说明，均为常规技术方案，可参照《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年。

实施例1：

一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，其步骤如下：

（1）胚性玉米愈伤组织的制备：

通过人工控制授粉，制备得到愈伤组织诱导材料Hi-II（A188*B73）材料种子，将F₁代种子田间种植，进行严格自交授粉，挂牌记录授粉材料和日期。授粉10-14天后取回幼穗，用75%酒精表面消毒后挑取幼胚（直径1.2-1.8mm）置于N6诱导培养基，28℃暗培养诱导愈伤组织，待I型愈伤组织形成后转入继代培养基上，28℃暗培养，每20天继代一次诱导胚性愈伤组织（疏松干燥、颜色鲜亮、生长迅速的体细胞胚）作为转化受体。

具体步骤如下：

1）玉米的控制授粉

a）玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用别针别住，收集花粉。

b）雌穗花丝未抽出前，用小口袋将其套住，并用别针别好。

c）授粉前一天，当花丝伸长约2cm时，用剪刀剪去花丝顶部，促进其伸长。

d）第二天，当花丝伸长后，进行授粉，并挂牌记录。

e）10-14天收获，4℃存放。

2）幼胚的剥离和培养

a）收获鲜穗（胚约1mm）后于4℃存放1-2天。

b）将玉米雌穗的苞叶和花丝去净，75%酒精浸泡3-5min，用刀切去头尾部分。

c）用手术刀切去籽粒上半部分（根据幼胚大小切去1/2-2/3）。

d）用小镊子挑出幼胚。

e）将幼胚放入无菌水中清洗。

3）幼胚培养

a）将幼胚转移到诱导培养基上，胚轴（较平的一面）向下，盾片向上。

b）27-28℃暗培养3-4周，使之开始脱分化形成I型愈伤组织。

c）每2-3周继代一次，经过2-3次继代，选择生长迅速，质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织作为转化受体。

所述培养基如下：

MS培养基（1升）：MS大量元素、微量元素、有机物、铁盐、30g蔗糖、8g琼脂、pH5.8；

N6培养基（1升）：N6大量元素、微量元素、有机物、铁盐、20g蔗糖、0.69g脯氨酸、0.2g水解酪蛋白、7g琼脂、pH5.8；

幼胚诱导培养基：N6培养基+2mg/L2,4-D；

愈伤继代培养基：N6培养基+2mg/L2,4-D+0.5gMES；

高渗培养基：N6培养基+0.4M甘露醇；

筛选培养基：N6培养基+2mg/L2,4-D+2mg/L草丁膦；

分化培养基：N6培养基+2mg/L6-BA，pH5.8；

生根培养基：1/2MS培养基+0.4mg/L NAA，pH5.8；

备注：大量元素、微量元素、铁盐、有机物的配方按N6、MS基本配方配制（朱至清，1975），上述培养基均需高压灭菌。

（2）植物转化超表达载体构建

根据pCAMBIA3300载体的多克隆位点和cry1C*、bar基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择BamHI、HindIII和samI作为内切酶。首先以野生型基因型Bt杀虫蛋白基因cry1Ca5为基础，根据植物密码子偏爱性碱基优化后合成基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，并根据已知序列信息合成除草剂抗性基因bar基因。pCAMBIA3300载体用BamH I和Hind III进行双酶切消化并重新连接成目的载体。然后使用限制性内切酶samI切下载体上的潮霉素（hygromycinphosphotransferase）抗性基因，使用连接酶将带有samI酶接头的草丁膦抗性基因bar（phosphinotricinacetyltransferase）基因替换（图1）(Tang et al.2006)。

pCAMBIA1300载体双酶切体系总体积为40μl，其中含有pCAMBIA3300质粒8μl、10×K缓冲液（购自Takara）4μl、BamH I和Hind III各1μl，双蒸水24μl。37℃酶切过夜后分别纯化回收。连接反应体系中包含10×T4连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，cry1C*基因与载体pCAMBIA3300分别为4μl和1μl，并用双蒸水补齐至10μl，16℃连接过夜。之后以全部的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，经PCR检测的阳性单克隆送测序，序列无误的单克隆提取重组质粒。携带目的基因的pCAMBIA3300载体双酶切体系总体积为40μl，其中含有pCAMBIA3300质粒8μl、10×K缓冲液（购自Takara）4μl、samI1μl，双蒸水25μl。37℃酶切过夜后纯化回收，得到去除潮霉素筛选基因的开链载体，与合成的bar基因进行连接，连接反应体系中包含10×T4连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，bar基因与载体pCAMBIA3300分别为4μl和1μl，并用双蒸水补齐至10μl，16℃连接过夜。之后以全部的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，经PCR检测的阳性单克隆送测序，序列无误的单克隆提取重组质粒。应用冻融法（参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）将重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中并保存。

（3）转基因植株的获得：

利用基因枪介导转化的方法，使用PDS1000/He biolistic gun and all disposables fromBio-Rad(Hercules,CA)型基因枪，参照Plant Transformation Facility（http://agron-www.agron.iastate.edu/ptf/）中提供的操作流程，将包裹有目的基因载体的金粉轰击高渗培养后的胚性愈伤组织。基因枪轰击后恢复培养7-10天后转入含有2mg/L双丙氨膦的筛选培养基筛选培养2-3轮，每轮20-30天。筛选后将具有除草剂抗性的愈伤组织转到分化培养基分化成苗，得到T₀代转化单株。

（4）基因组DNA的提取——CTAB法（Soyle et al.）：

1）取5g叶片，液氮研磨成粉（勿使材料融化）加入50mL离心管中；

2）加入15mL1.67XCTAB Buffer充分混匀，65℃水浴1小时；

3）冷却至室温，加入15mL氯仿/异戊醇（24:1），轻轻摇晃混匀成乳浊液，之后10000rpm离心15分钟；

4）将上清液转入洁净离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒数次，勾出DNA，放入另一洁净的10mL离心管；

5）75%乙醇清洗DNA两遍，室温干燥2-3小时；

6）500μL去离子水溶解DNA后转入1.5mL离心管，再加入5μL RNase(10mg/mL)，37℃处理1小时；

7）加入500μL苯酚，充分混匀，离心5分钟，上清转入另一新离心管；

8）分别加入250μL苯酚和氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入另一新离心管；

9）加入500μL氯仿，充分混匀，离心5分钟，上清液转入洁净的10mL离心管；

10）加去离子水至3mL，然后加入1/10体积的3M NaAche2倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒数次；

11）75%乙醇清洗沉淀出的DNA两次，转移至1.5mL离心管中，室温干燥并冗余500μL去离子水；

12）分光光度计测定DNA浓度。

（5）转基因植株的PCR检测：

1）PCR反应引物：使用目标基因序列设计PCR引物Cry1C*-F：gtccgttgaaagtgaatgat-3和Cry1C*-R：acacttacaagtggactc，目标片段540bp；

2）PCR反应体系：配制20μLPCR体系，包含30ng模板DNA，2.0μL10×buffer,1.0μL2mMdNTPs,1.5μL25mM MgCl2,0.4μl10μM引物和1.5U Taq酶；

3）PCR反应程序：在PCR仪上扩增-使用程序94℃变性5min；94℃变性40s；55℃退火45s；72℃延伸50s；共35个循环；72℃延伸5min；

4）PCR产物使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（图2）。第3-8泳道分别为独立转化单株DNA为模板进行PCR扩增的条带，均得到与阳性对照相同大小的540bp的特异性条带。

（6）基因枪转化轰击了200块愈伤组织，筛选得到9块愈伤组织具有除草剂抗性。筛选、继代扩繁后，分化得到120棵转化单株获得种子。其中PCR检测筛选后得到87棵携带cry1C*基因，命名为ZmKc。温室种植，自交收获T₀代种子，用于后续表达验证，功能验证和遗传稳定性分析，选取其中的三株ZmKc-2-3,ZmKc-3-2,ZmKc-3-5作为田间抗性测试。

实施例2：

抗虫转基因植株后代整合与表达验证，具体步骤如下：

T₀代种子在武汉华中农业大学田间种植，得T₁代单株。拔节期使用CTAB法提取鲜叶DNA，使用目标基因序列设计PCR引物（Cry1C*-F和Cry1C*-R）进行PCR检测，挑选携带目标基因的单株进行Southern杂交检测，选取拷贝数较少的单株进行RT-PCR检测和ELISA反应。

（1）穗行种植转基因植株种子，使用T₀代相同的引物和PCR检测方法,筛选携带目标基因的T₁代单株进行后续验证。

（2）cry1C*基因整合情况Southern杂交检测：

1)使用CTAB法提取鲜叶基因组DNA；

2)基因组DNA酶切：15μg基因组DNA作为模板，限制性内切酶BamHI配制50μL酶切体系，包含模板DNA10μL，酶（10U/μL）5μL，10X Buffer5μL和无菌水30μL。混匀后37℃酶切过夜；

3)酶切产物电泳：取5μL酶切产物进行电泳分离，检查酶切效果；制备0.8%琼脂糖凝胶，电泳分离酶切产物，开始使用高电压，待溴酚蓝跑出点样孔2-3cm后降低电压电泳10小时左右；

4)转膜：电泳结束后，依次对凝胶进行如下处理：0.25M HCl中浸泡20分钟，待凝胶中溴酚蓝变成黄色；0.4M NaOH变性液中处理凝胶45分钟；去离子水中浸泡30分钟；

5)采用毛细管转移法将DNA转移至尼龙膜；转膜结束后2X SSC漂洗尼龙膜，将尼龙膜室温晾干后80℃烘膜1小时，固定DNA样品；

6)标记探针：使用PCR引物（Cry1C*-F和Cry1C*-R）扩增质粒载体获得540bp长度片段，使用随机引物标记试剂盒配制反应体系：DNA模板，4.0μLPCR产物，2μL随机引物，0.4μLλ/HindIII引物，7.6μLddH2O,将上述体系混匀，95℃变性3分钟，迅速置于冰上5分钟；加入试剂10×buffer2.5μL，dNTPs2.5μL，α-P[32]-dCTP5μL和kenow enzyme1μL混匀后，37℃温育1-2小时，95℃变性5分钟后置于冰上5分钟；

7)分子杂交：将已转尼龙膜放入杂交管中，加入预热的预杂交液，65℃预杂交4-6小时；换新杂交液，加入经过杂交变性的探针，65℃杂交12-16小时；

8)洗膜：50mL2X SSC+0.5%SDS，65℃洗膜30分钟；50mL1X SSC+0.5%SDS，65℃洗膜30分钟；在洗膜过程中，不时采用放射性检测仪对杂交膜进行检测，以控制洗膜程度；

9)成像：洗膜结束后，取出尼龙膜，用保鲜膜包好，压入磷屏中，12小时后扫描结果（图3）。Southern杂交结果显示T₁代植株中cry1C*基因具有1-4个拷贝。片段大小在4Kb至6.5Kb之间，其中大部分具有和阳性对照大小相似的片段。

（3）cry1C*基因表达情况RT-PCR检测：

1)植物总RNA的提取（Trizol法）（Chomczynski et al.）：

a)取玉米鲜叶0.1g，液氮冷冻研磨成粉状，转入DEPC处理过的1.5mL离心管，加入1mL Trizol(Invitrogen,USA)，震荡至彻底混匀；

b)室温放置5分钟后加入0.5mL氯仿，上下颠倒混匀；4℃，12000rpm离心15分钟，取上层转入新的无RNase离心管；

c)加入等体积异丙醇，混匀，室温放置30分钟；

d)4℃，12000rpm离心15分钟，弃掉上清，加1mL75%乙醇清洗；

e)4℃，12000rpm离心1分钟，倒出液体；晾干管内沉淀；

f)加20μL无RNase水，溶解RNA。

2)RT-PCR分析：

纯化后取5ug总RNA，使用M-MLV RTasecDNA Synthesis Kit(Takara,Japan)试剂盒进行RT-PCR反应，得到的cDNA为模板进行PCR反应检测外源基因(图3)。

a)PCR反应引物：使用目标基因序列设计PCR引物Cry1C*-F：gtccgttgaaagtgaatgat-3和Cry1C*-R：acacttacaagtggactc，目标片段540bp；

b)PCR反应体系：配制20μLPCR体系，包含30ng模板DNA，2.0μL10×buffer,1.0μL2mMdNTPs,1.5μL25mM MgCl2,0.4μl10μM引物和1.5U Taq酶；

c)PCR反应程序：在PCR仪上扩增-使用程序94℃变性5min；94℃变性40s；55℃退火45s；72℃延伸50s；共35个循环；72℃延伸5min；

d)PCR产物使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（图4a）。泳道M：DNA分子量标记BM2000；泳道P:质粒模板阳性对照；泳道W:未转化单株RNA模板对照；泳道C：假阳性转化单株RNA模板对照；泳道1-8：独立转化单株RNA为模板RT-PCR检测。目标单株均获得与阳性对照相同的540bp的电泳条带。

（4）Cry1C*蛋白含量ELISA法测定：

1)选取RT-PCR检测阳性的单株进行ELISA反应检测Cry1C*蛋白浓度。分别提取拔节期和灌浆期的叶片蛋白,使用ELISA反应检测叶片中Cry1C*蛋白含量。每个样品取20mg新鲜叶片，于500μL提取缓冲液研磨均匀，静置30分钟吸取上清液20μL加入480μL提取缓冲液。ELISA反应后，使用酶标仪(Multiskan MK3,Labsystem,P.R.China)450nm波长下检测,依据检测的结果可以计算出Cry1C*蛋白含量。检测结果显示拔节期转基因材料叶片Cry1C*蛋白质含量占叶片鲜重分别ZmKc-3-5为1.39μg/g,,ZmKc-2-3为4.03μg/g和ZmKc-3-2为2.97μg/g。而灌浆期这些材料中Cry1C*蛋白含量在0.89–1.12μg/g之间（图5）。整体变化趋势表现为随着植株从营养生长到生殖生长呈下降趋势。

2)在蜡熟期，分别提取转基因单株的不同组织：叶片、苞叶、雄穗、茎、雌穗、穗轴、花粉和籽粒。提取和检测方法均与叶片中蛋白含量检测方法相同，以ZmKc-2-3检测结果分别为鲜叶中3.43μg/g，苞叶中3.36μg/g，雄穗中2.71μg/g，茎中0.99μg/g，雌穗中0.79μg/g，穗轴中2.71μg/g，花粉中0.19μg/g，籽粒中0.09μg/g。变化趋势为营养器官中cry1C*蛋白含量高于生殖器官，在籽粒中该蛋白含量最低。

实施例3：

携带cry1C*的新材料田间抗性和表型分析，具体步骤如下：

（1）田间抗性检测

2011年田间种植T3代转基因材料ZmKc-2-3,ZmKc-3-2,ZmKc-3-5株系和郑58背景的ZmKc-2-3回交导入材料，以自交系郑58为对照，全生育期不施用农药进行田间抗性鉴定，评估自然条件下亚洲玉米螟伤害。虫害出现后第15天统计叶片被伤害的比例，对照郑58叶片有43.71%被严重损伤，平均有5.75个叶片被损害，而转基因单株叶片损伤不超过0.02个。待生长到乳熟期，统计茎秆被钻蛀造成雄穗死亡的比例，对照受虫害比例为39.36%，而转基因植株几乎没有受到虫害损伤（图6）。

（2）转基因植株表型分析

以自交系郑58为对照，测量郑58为背景的转基因导入材料表型，每个材料调查100株计算平均值。成熟期测量株型（PT）、株高（PH）、穗位高（EH）和雄穗分支数（TB），成熟期每行收获12株测量穗长（EL）、穗宽（EW）、穗行数（ER）、粒型（GT）和百粒重（HGW）。所有植株株型、雄穗分支数、穗长、穗宽、穗行数、粒型和百粒重均表现出一致性的特点。只有株高和穗位高比对照郑58略高（表1）。

表1

实施例4：

转基因材料高代遗传稳定性及抗性稳定性分析，具体步骤如下：

（1）抗性稳定性分析

提取T3代植株鲜叶RNA，使用T1代相同的抽提、反转录和PCR检测方法进行cry1C*基因表达情况RT-PCR检测，结果如图（4b）所示，泳道9-16中分别检测出cry1C*基因表达的条带。

（2）遗传稳定性分析

每一代均进行PCR检测，计算阳性率，T₃代后自交均保持转入基因阳性率在100%，表明cry1C*基因在改转基因材料中稳定遗传。在T₅代，将携带cry1C*基因材料与郑58回交后自交，BC1F1代PCR检测外源基因，3/4植株中携带目标基因cry1C*。表明该基因在高代转基因材料中稳定存在，并符合孟德尔遗传规律。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法

 

<130>  一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1018

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

cacaggtgcg gtctgcgtcg agagttggtc cactggcagg ccggaatgaa gaagtgcgcg     60

 

tcggagctgg agctggaggc gttcatccgg gagagcggcg aggacgcccg cgccgccgcc    120

 

ggaggtagca gtccggggtg cggtggatca agcgatcccg gagggagtgg cgtcttctca    180

 

cccggcttcg gtttcgccga ctcggacacc atggatggag gcagttggtg gtacgggaac    240

 

gtccgcacgc cgaacccagt catgtcgcag gcggcgtcca tatccgctag ccccgggcta    300

 

accacctcag ccaatcatgc tcttgaaagc gagtcagact ccgacagcga atcactgtat    360

 

gaggtagagg gagttccata cgagcgaggt aacagatcca ttgagacgaa gcgaataaga    420

 

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Claims (1)

1.一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米的构建方法，其步骤如下： 

（1）按照常规方案制备胚性玉米愈伤组织；

（2）转基因载体的构建：

pCAMBIA3300载体用BamH I和Hind III进行双酶切消化并重新连接cry1C*基因获得目的载体；然后使用限制性内切酶samI切下载体上的潮霉素抗性基因，使用连接酶将带有samI酶接头的草丁膦抗性基因bar基因替换，获得转基因载体；

（3）利用基因枪介导转化的方法，将包裹有目的基因载体的金粉轰击高渗培养后的胚性愈伤组织；基因枪轰击后恢复培养7-10天后转入含有2mg/L双丙氨膦的筛选培养基筛选培养2-3轮，每轮20-30天；筛选后将具有除草剂抗性的愈伤组织转到分化培养基分化成苗，得到一种可稳定遗传的抗虫转基因玉米单株；

所述的cry1C*基因序列为SEQ ID NO.1所示。

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