CN103599541A - 用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含蛋白质和游离蛋氨酸以及一种或多种能够防止蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的化合物的药物制剂。更具体地，本发明涉及氧化敏感性治疗剂的稳定的药学有效制剂。本发明还涉及抑制这些治疗剂氧化的方法。

Description

用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法
本申请是申请日为2009年9月9日的、发明名称为“用于防止蛋白质氧化降解的组合物和方法”的中国专利申请200980144528.3(PCT/US2009/056365)的分案申请。
发明领域
本发明涉及芳香族化合物作为稳定剂在防止蛋白质氧化降解中的用途。更具体地，本发明涉及氧化敏感性治疗剂的稳定的药学上有效的制剂。本发明还涉及抑制这些治疗剂氧化的方法。
发明背景
蛋白质在纯化和储存中会经历不同程度的降解。氧化是蛋白质的主要降解途径之一，并对蛋白质稳定性和效能具有破坏作用。氧化反应引起氨基酸残基的破坏、肽键的水解、和由此的因蛋白质三级结构改变和蛋白质聚集导致的蛋白质不稳定性(Davies,J.Biol.Chem.262:9895-901(1987))。Nguyen(Formulation and Delivery of Protein and Peptides中的第四章(1994)),Hovorka,(J.Pharm Sci.90:25369(2001))和Li(BiotechBioengineering48:490-500(1995))已综述了蛋白质药物的氧化。
蛋白质氧化的原因
氧化可以经许多不同的互相关联的途径发生，并可以由多种触发条件（包括升高的温度、氧水平、氢离子水平（pH）和暴露于过渡金属、过氧化物和光）催化。一般地，导致蛋白质氧化降解的一个重要因素是暴露于氧气、活性氧类别(reactive oxygen species)和金属。可以在药物组合物中配制某些赋形剂以提供抵抗蛋白质聚集的保护作用，但是这些试剂也可能因为包含活性氧类别而增强氧化。例如，通常使用的表面活性剂例如聚山梨醇酯80（通常被称为Tween）含有微量的过氧化物污染，在低浓度金属存在下其可导致该表面活性剂的进一步氧化从而产生更大量的活性氧类别（氧自由基）(Ha等人,J Pharm Sci91:2252–2264(2002);Harmon等人,JPharm Sci95:2014–2028(2006))。氧自由基和金属的组合为使用该表面活性剂配制的蛋白质的氧化以及由此的降解提供了催化环境。在液体或冻干制剂中蛋白质的氧化也被证实可以由聚山梨醇酯或其他制剂赋形剂例如聚乙二醇（PEG）中的过氧化物和微量金属例如铁或铜触发。此外，药物制品通常被包装进由低密度聚乙烯（LDPE）或聚丙烯制成的塑料容器中以方便储存和应用。然而，这些塑料容器可容易地渗透氧气。氧气可以形成活性氧类别，其导致药物蛋白质中氧化敏感性残基的快速氧化，例如蛋氨酸至蛋氨酸亚砜的氧化(Manning等人,Pharmaceutical Research,Vol.6,No.11,(1989))。
按敏感性的顺序，特别易于发生氧化的为半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、组氨酸（His）和酪氨酸（Tyr）残基的侧链。这些氨基酸残基对氧化的敏感性是与芳族环形成的加成物的结果，这些环通过离域至邻近的双键上而稳定化。Cys中的巯基是反应性最强的官能基团，因为该巯基提供了易于被自由基吸取的氢，因此极少的药物蛋白质中含有游离Cys。
蛋氨酸的氧化形成蛋氨酸亚砜(Met[O])
蛋氨酸的氧化形成蛋氨酸亚砜(Met[O])，在极端条件下形成砜。以下示例为展示Met氧化的药物蛋白质，并给出了在各研究中使用的氧化剂：生长激素(hGH,Teh,L-C,J.Biol Chem262:6472-7,(1987)使用H2O2,Pearlman R,第一章,Pharmaceutical Biotechnology卷5(1993),Zhao F,J.Biol Chem272:9019-9029(1997),使用Asc/Cu(II)/O2),IL-2(Sasaoki K,Chem Pharm Bull37:2160-4(1989)使用100倍H2O2,CadéJA,PharmRes.18:1461-7(2001)使用过硫酸盐,Ha E,J Pharm Sci91:2252-64,(2002)使用Tween),小肽(Li,Pharm Res12:348-55(1995)),松弛素(Nguyen TH,Pharm Res.10:1563-71(1993)和Pharmaceutical Biotechnology卷9中的第五章(1996)使用2000x H2O2,Li,Biochem34:5762-72(1995)使用Asc/Cu(II)/O2),rhGCSF(Lu HS,Arch Biochem Biophys362:1-11(1999),Herman AC,Pharmaceutical Biotechnology卷9中的第七章(1996),Yin,Pharm Res21:2377-83(2004)和Pharm Res22:141-7(2005)使用H2O2),rhVEGF(Duenas ET,Pharm Res.18:1455-60(2001),使用H2O2&tBHP),IGF-1(Fransson,Pharm Res13:1252(1996),使用溶解的O2,Fe(III)EDTA),rhCNF和rhNGF(Knepp V,PDA J Pharm Sci Tech.50:163-171(1996),使用H2O2),BDNF(Jensen JL,Pharm Res.17:190-6(2000),使用Asc/Cu(II)/O2),rhLeptin(Liu JL,Pharm Res.15:632-40(1998)使用tBHP和H2O2),Actimmune和Activase(Keck RG,Anal Biochem.236,56-62(1996),使用tBHP),Herceptin(Shen FJ,Techniq.Protein Chem.VII.275-284(1996)使用tBHP,Lam XM,J Pharm Sci86:1250-5(1997)使用热、光和不锈钢),和PTH(Yin等人,Pharm Res22:141-7(2004),Chu等人,Biochem43:14139-48(2004)和(Chu等人,J Pharm Sci93:3096-102(2004),使用H2O2),和单克隆抗体(Wei等人Anal Chem.79:2797-805,2007;使用tBHP,紫外线照射和臭氧)。值得注意的是，在过去20年中，很多种氧化剂已被用于研究蛋白质的氧化。tBHP和H2O2被使用得最多。除了抗坏血酸盐，其他所有都是无金属氧化剂。
组氨酸的氧化形成氧代-组氨酸
组氨酸的氧化大多数形成氧代-组氨酸，但取决于氧化条件也形成多种其他氧化产物。通过使用Asc/Cu(II)/O2,Li等人(J Pharm Sci.85:868-72,1996)观察到松弛素中的组氨酸残基的氧化。在人生长激素中，当相同的氧化系统被用于在金属结合位点处模拟金属催化的氧化时，Zhao等人(JBiol Chem272:9019-9029,1997)观察到氧代组氨酸。在Cu(II)/H2O2存在下，在β-淀粉样蛋白肽中也检测到作为His氧化产物的天冬氨酸和天冬酰胺(Kowalik-Jankowska等人,J Inorg Biochem98(6):940-950,2004)。
色氨酸的氧化
在色氨酸氧化中形成多种产物。有关水溶液中的色氨酸(Lee,J ParentSci Tech42:20-2(1988))、小肽和溶菌酶(Simat TJ,J Agric Food Chem46:490-8(1998))和牛α-晶体蛋白(Finley EL,Protein Sci7:2391-7(1998))中的色氨酸残基的稳定性研究，明确鉴定了主要降解物为5-羟色氨酸、氧基吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸。与氨基酸氧化的其他形式相比，有关药物蛋白质中Trp氧化的文章相对较少。Davies等人(J BiolChem.262:9902-7,1987)通过钴辐射产生的氧自由基氧化牛血清白蛋白，Uchida等人(Agric Biol Chem53:3285-92,1989)使用Fe(II)/EDTA/Asc胁迫白蛋白并检测到Trp和His的选择性氧化。最近，Amgen(Yang等人JChrom.A.1156:174-82,2007)和MedImmune(Wei等人Anal Chem.79:2797-805,2007)报导了由臭氧和紫外线照射胁迫的单克隆抗体中的Trp氧化。在Genentech，已在抗-VEGF,抗-CD40,抗-CD22和Apomab抗体中检测到Trp的氧化。在Apomab中，降低的效能与Trp的氧化程度相关。
氧化机制
基于上述分析，蛋白质可通过图1中显示的任意或所有3种降解机制以及光诱导的氧化而对氧化攻击敏感。当蛋白质产物暴露于（作为蛋白质隔离器中的消毒剂使用的或由通常使用的赋形剂例如聚山梨醇酯（例如Tween）或聚乙二醇的降解产生的）蒸气H2O2时观察到的氧化反应可为与H2O2的亲核反应。当微量金属（铁、铜或铬）进入配制溶液，例如通过接触不锈钢，H2O2和Fe(II)的芬顿反应(fenton reaction)开始起作用。第三降解机制是通过烷基过氧化物，其可来自降解的Tween，如上述。(Jaeger J,J Biochem Biophys Methods29:77-81,1994)。
经历氧化的蛋白质药物通常发生蛋白质的修饰和效能的丧失。蛋白质（例如含有单克隆抗体的溶液）的氧化可导致抗体的降解、聚集和片段化，从而丧失抗体的活性。在其他情况下，即使蛋白质药物在氧化后仍然具有生物活性，根据监管机构（例如FDA）的标准，生长因子也可能是药物应用所不可接受的，例如，当高水平的蛋氨酸亚砜存在时。在制剂的制造和包装中排除氧气的现有防范措施已被证明在防止药物蛋白质的显著氧化方面无效。后果是，与如果可以抑制氧化反应时的潜在可能有效寿命相比，药物制品的有效期较短。因此，在本领域需要鉴定可以抵消蛋白质降解加速的物理和化学条件，以提供可在一段时间内耐受氧化条件的稳定的含蛋白质药物组合物。因此期望在含有肽和抗体的药物组合物中配制可保护蛋白质免受多种触发因素引发的氧化损伤的赋形剂。
本领域中的氧化稳定剂
某些氨基酸及其各种组合与表面活性剂例如聚山梨醇酯和泊洛沙姆等等一起已用于稳定肽和蛋白质组合物。见，例如Yu-Chang John Wang andMusetta A.Hansen,"Parenteral Formulations of Proteins and Peptides:Stability and Stabilizers",Journal of Parenteral Science and Technology,42:S14,1988。Neema等人(J Pharm Sci Tech51:166-71(1997))汇编了用于所有注射产品的抗氧化剂集合，其中列出了亚硫酸氢盐、抗坏血酸盐、丁羟苯甲醚、半胱氨酸等等。然而，列出的试剂看起来没有一种能有效地应对所有类型的氧化降解机制以及随之的蛋白质中不仅仅是蛋氨酸而且还有色氨酸和其他芳香族氨基酸残基的氧化。作为抗氧化剂，游离蛋氨酸最早在美国专利5,272,135(Takruri,1993)中以及也在美国专利申请2003/0104996A1(Li,2003)中被提及。游离蛋氨酸可在许多市售的胃肠外产品例如depo-subQ Provera,Follistim AQ,Gonal-f RFF,Lutropin-α中找到。组氨酸也已在美国专利5,849,700(Sorensen等人,1998)中被公开为潜在的抗氧化剂。Sorensen等人公开了包含生长激素和作为添加剂或缓冲物质的组氨酸或组氨酸衍生物的药物组合物，证明其在对抗脱酰胺化、氧化（通过亚砜的浓度来度量）和肽键断裂方面具有非常高的稳定性。其他可控制蛋白质氧化的试剂包括金属螯合剂（例如EDTA）和自由基清除剂（例如甘露醇），这些已在教科书和综述文章中被广泛述及。见，例如Yu-ChangJohn Wang and Musetta A.Hansen,"Parenteral Formulations of Proteinsand Peptides:Stability and Stabilizers",Journal of Parenteral Science andTechnology,42:S14,1988。已联合使用N-乙酰色氨酸盐和辛酸盐(作为与特定位点结合的配体)，以在巴氏消毒中稳定人血清白蛋白(PetersBiochemistry,genetics,and medical applications.Academic Press,NY,1995)。然而，没有一种氨基酸或表面活性剂被用于阻止经由烷基过氧化物（其可来自降解的表面活性剂）的氧化。因此，需要一种可以在具有氧化攻击敏感性氨基酸序列的多肽的药物载体（vehicle）中抑制多重氧化机制的方法。
发明概述
本发明提供了改进的组合物和方法用于保护蛋白质免受氧化导致的损伤。所述组合物含有与一种或多种能够有效地限制自由基介导的氧化的化合物配制在一起的一种或多种对氧化敏感的蛋白质，其中所述自由基介导的氧化一般导致色氨酸、酪氨酸或组氨酸残基氧化。所述组合物展示对氧化具有提高的抵抗性，从而导致例如更长的产品保存期、允许在室温贮存的更好的稳定性和/或在产品包装上更大的灵活性。由此，本发明提供了保护（即稳定）甚至是多亚基蛋白质组合物例如抗体组合物的重要手段。
在本发明的一个实施方案中，提供了药物制剂，其包含用一种或多种能够防止蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的化合物配制的蛋白质（例如以制剂，例如实验室级别的组合物或制药上的组合物的形式）。优选的实施方案使用游离芳香族氨基酸、核苷酸或维生素和它们的衍生物与蛋氨酸组合，其一起有效地对抗所有最常见的蛋白质氧化机制。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于制备稳定的蛋白质组合物的方法，包括将蛋白质与蛋氨酸和一种或多种能够防止所述蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的化合物配制在一起，如下述。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于预防或治疗哺乳动物疾病或病症的方法，其包括对哺乳动物以有效预防或治疗所述疾病或病症的量施用制剂，所述制剂包含基于蛋白质的治疗剂和一种或多种能够防止所述治疗剂中的芳香族氨基酸残基氧化的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制造药物制剂的方法，其包括制备包含蛋白质和一种或多种能够防止所述蛋白质中芳香族氨基酸残基氧化的化合物的制剂，和评估制剂中的蛋白质的物理稳定性、化学稳定性或生物活性。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于稳定蛋白质的药物组合物的方法，其包括在所述组合物中以足够抑制所述蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的量加入蛋氨酸和一种或多种化合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于制造药物制剂的方法，其包括在蛋白质组合物中加入一定量的表面活性剂和一定量的足够抵制(negate)由所述表面活性剂的降解产生的氧化类别的化合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于防止敏感蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的方法，其包括加入蛋氨酸和一种或多种选自芳香族氨基酸、核苷酸、维生素和它们的衍生物的化合物。
通过以下详细描述和实施例，本发明的其他特征和优势将是显而易见的，不应将详细描述和实施例视为限制性的。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容在此处明确并入作为参考。
附图简述
图1描述了蛋氨酸、色氨酸和组氨酸的可能氧化途径。
图2描述了AIBN，一种在加热后生成烷基自由基的偶氮化合物，该自由基当与氧结合后形成烷基过氧化物（圈出的）。也显示了AAPH，另一种偶氮化合物及其结构。
图3描述了被H2O2降解的PTH的rp-HPLC色谱图。在40℃反应，在2、4和6小时移取样品。显示了增加的单氧化PTH和双氧化PTH的峰高。
图4为用AAPH处理的PTH的色谱图，显示出突出的Trp[O]-PTH峰。在40℃反应，在2、4和6小时移取样品。
图5描述了降解的（氧化的）色氨酸的化学结构。以+4、+16和+32注释了它们的质量。
图6.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入2mg/mL的游离蛋氨酸。
图7.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入15%的甘露醇或6%的蔗糖。
图8.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入mg/mL的EDTA。
图9.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入2mg/mL的游离色氨酸。
图10.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入2mg/mL的游离色氨酸和蛋氨酸两者。
图11.数据图表，其显示AAPH对PTH的位点特异性氧化、以及Trp和Met与其他试剂相比的不同保护作用。对Trp23、Met8和Met18残基单独的氧化鉴定，基于其对应的胰蛋白酶解肽的MS/MS片段化谱来确定。基于氧化肽和非氧化肽的积分的提取离子色谱(integrated extracted ionchromatograms)，定量相对氧化水平。
图12.数据图表，其显示通过H2O2/Fe的PTH的位点特异性氧化、以及Trp和Met与其他试剂相比的不同保护作用。对Trp23、Met8和Met18残基单独的氧化鉴定，基于其对应的胰蛋白酶解肽的MS/MS片段化谱来确定。基于氧化肽和非氧化肽的积分的提取离子色谱，定量相对氧化水平。
图13.不同抗-VEGF样品的IEC色谱。H2O2在碱性区不产生氧化类别，而AAPH产生。当使用差批次的Tween时，碱性峰在合格批次(qualification lot)中显著。
图14.当用AAPH进行氧化（无Trp）、之后在制剂中加入2或10mg/mL游离Trp时抗-VEGF抗体的IEC。氧化的Mab在碱性区洗脱。在加入Trp后，这些碱性峰降至基线。
图15.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入2mg/mL的游离Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，一种水溶性维生素衍生物）。
图16.被AAPH、H2O2+铁和H2O2氧化的PTH溶液的rpHPLC色谱。反应在40℃进行6小时。在样品中加入或不加入2mg/mL的游离吡哆醇（通常被称为维生素B6）。
优选实施方案详述
I.定义
蛋白质的化学不稳定性可涉及蛋白质一级结构中的共价键的断裂或形成。已经报导了在蛋白质中的一些氧化反应。在碱性或中性介质中，氨基酸残基半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸特别倾向于氧化。而在酸性条件下，蛋氨酸敏感。氧化反应常导致生物活性甚至免疫原性的严重丧失。本发明主要涉及用于保护蛋白质免受氧化导致的损伤的改进组合物和方法。所述组合物包含与一种或多种芳香族化合物配制在一起的一种或多种对氧化敏感的蛋白质，其中所述化合物可以有效限制自由基介导的氧化，所述氧化典型地引起色氨酸、酪氨酸或组氨酸残基的氧化。
由于当芳香族化合物与自由基反应时芳香性（例如，核苷酸的嘌呤和嘧啶中的芳香环，或特别地，氨基酸色氨酸的吲哚）可使额外的电子离域，故可以通过电子离域来稳定产品。因此，芳香族化合物和自由基之间的反应是有利的。净结果是自由基被吸收进芳香族化合物中，不能对其他分子造成进一步的损伤。因此，当作为制剂赋形剂被加入时，芳香族化合物可以作为有效试剂中和自由基的氧化损伤作用。
生理学上相容的2种主要芳香族化合物为核苷酸和氨基酸。由于这些化合物是身体化学的天然成分，故它们具有有益的安全特征并适合用作胃肠外产品的赋形剂。游离蛋氨酸已被常规的用作抗氧化剂，可在许多市售的胃肠外产品中找到。然而，此氨基酸单独不能防御所有氧化机制，其在抑制蛋氨酸或半胱氨酸残基的亲核氧化中最有效。此外，还众所周知，DNA对自由基引起的损伤高度敏感，这一事实支持使用核酸衍生物来与自由基进行有利的反应。迄今为止，关于使用核酸衍生物作为制剂赋形剂，几乎是不知道的，并且市场中没有使用核酸作为制剂赋形剂的产品。
在本发明的一个方面，本发明的组合物典型地含有选自色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的芳香族氨基酸。优选的用于减轻通过烷基过氧化物（其常由降解的表面活性剂生成）的氧化的芳香族氨基酸为色氨酸或其衍生物N-乙酰色氨酸钠。当在制剂中加入蛋氨酸或蛋氨酸衍生物时，也可抑制蛋氨酸或半胱氨酸的亲核氧化。因此，游离色氨酸和蛋氨酸的组合可以有效抑制多重氧化机制。当在制剂中存在色氨酸时，组合物一般含有约2–10mg/ml的量。在一个实施方案中，本发明涉及包含生物活性剂的药物制剂（例如以制品，例如实验室级别组合物或制药组合物的形式），其中所述生物活性剂与色氨酸（单独地或与一种或多种另外的芳香族氨基酸组合地）和蛋氨酸配制在一起。优选的氨基酸组合为色氨酸和蛋氨酸，其一起可以有效地防御所有最常见的蛋白质氧化机制。
在本发明的另一个方面，本发明的组合物也包含游离核苷酸或其类似物。可在蛋白质和肽的胃肠外制剂中（单独或与蛋氨酸组合）加入核酸衍生物。当一种或多种游离核苷酸作为稳定剂存在时，制剂一般含有约0.1至10mg/mL的量。在一个具体的实施方案中，一种或多种游离核苷酸与一种或多种游离芳香族氨基酸组合。优选的实施方案可包含与蛋氨酸组合的游离核苷酸。
在本发明的另一个方面，本发明的组合物也可包含维生素衍生物例如trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，一种水溶性维生素衍生物）和吡哆醇（通常被称为维生素B6）。在一个具体的实施方案中，一种或多种维生素与一种或多种游离芳香族氨基酸组合。优选的实施方案可包含与蛋氨酸组合的维生素衍生物。
本发明的组合物可进一步包含一种或多种中和游离氧自由基的试剂（即ROS清除剂）。合适的ROS清除剂包括例如甘露醇、蛋氨酸和/或组氨酸。由此，在另一个实施方案中，本发明提供了含有一种或多种蛋白质的组合物，所述蛋白质与芳香族氨基酸和一种或多种ROS清除剂（例如甘露醇、蛋氨酸和/或组氨酸）配制在一起。也可使用金属螯合剂（例如EDTA），因为其可抑制ROS产生的开始。
本发明的组合物也可包含一种或多种抑制蛋白质聚集的试剂。在一个具体的实施方案中，所述试剂选自TWEEN、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、甘油和泊洛沙姆聚合物。组合物还可进一步包含缓冲剂，缓冲剂将组合物的pH优选地维持在约5.0至约8.0。合适的缓冲剂包括，例如组氨酸、Tris、醋酸盐、MES、琥珀酸、PIPES、Bis-Tris、MOPS、ACES、BES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸和马来酸。组合物还可包含张力调节剂(tonicifier)例如氯化钠、精氨酸盐等等。
“表面活性剂”为具有充分确定的极性和非极性区的分子，所述区域允许分子在溶液中聚集以形成胶束(micell)。取决于极性区的性质，表面活性剂可为非离子型、阴离子型、阳离子型和两性离子型。大多数胃肠外可接受非离子表面活性剂来自聚山梨醇酯或聚醚类。聚山梨醇酯20和80是目前市售的蛋白质制剂中使用的表面活性剂稳定剂。
过氧化物是非离子表面活性剂的已知污染物。在聚山梨醇酯中的过氧化物可导致蛋白质的氧化降解。制剂师往往要针对过氧化物污染来筛选蛋白质制剂中的聚山梨醇酯和其他聚合物添加剂的来源，并为添加剂的使用建立过氧化物规范。或者，可以通过加入抗氧化剂，以帮助克服非离子表面活性剂充当氧敏感性蛋白质的氧化催化剂的可能性。
任何合适的对氧化敏感的目的蛋白质或多肽均可以根据本发明进行保护和因此稳定化（即，可将其配制为如本文描述的防氧化组合物）。蛋白质可为其天然（例如，原来的）状态或可以被修饰，例如通过微囊化或缀合来修饰。蛋白质可为治疗的或诊断的。这些蛋白质包括例如免疫球蛋白、肽、蛋白质和其类似物(对抗氧化损伤)。
此外，可根据本发明保护多亚基蛋白质（例如抗体），此类蛋白对氧化损伤、蛋白质聚集和降解特别敏感，这使其在诊断上和治疗上变得无功能。在一个具体的实施方案中，本发明提供了受保护（即稳定的）抗体组合物，该组合物例如包括一种或多种单克隆抗体，包括全人抗体，及其片段和免疫缀合物(即，与治疗剂，例如毒素、聚合物、呈像剂或药物缀合的抗体)。
尽管本发明优选的实施方案涉及用于保护蛋白质免受氧化导致的损伤的组合物和方法，但生物活性剂也可选自肽、小分子、碳水化合物、核酸、脂质、蛋白质、抗体和/或其类似物。
在本文中，之前加有术语“约”的数字范围或量明确地包括该确切的范围或确切的数量。
术语“药物制剂”指这样的制剂/制品，该制剂的形式将允许活性成分的生物活性为有效的，且该制剂不含对制剂将施用的受试者具有不可接受的毒性的另外成分。
如果抗体在给定时间的生物活性为药物制剂制备时展示出的生物活性的约10%以内（在试验误差范围内），则抗体在药物制剂中具有“生物活性”，所述活性可以通过抗体在体外或体内结合抗原及导致可测量的生物反应的能力来确定。
“稳定的”制剂为其中的蛋白质在储存中基本上维持其物理和/或化学稳定性的制剂。稳定性可在选定的温度和选定的时期中测量。优选地，制剂在室温(～30℃)或在40℃稳定至少1个月和/或在约2-8℃稳定至少1年，优选至少2年。例如，在储存中的聚集程度可用于指示蛋白质的稳定性。因此，“稳定的”制剂可为下述制剂，即其中少于约10%和优选少于约5%的蛋白质在制剂中以聚集物存在。多种测量蛋白质稳定性的分析技术是本领域可得的，并在例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,VincentLee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中综述。
术语“水溶液”指下述溶液，即其中水是溶解介质或溶剂。当物质在液体中溶解时，该混合物称为溶液。溶解的物质是溶质，用于溶解的液体（在这里是水）是溶剂。
“抑制”氧化旨在表示防止、减轻或降低氧化的量，通过比较包含至少一种氧化抑制剂的含蛋白质溶液中存在的氧化量和不含至少一种氧化抑制剂的含蛋白质溶液中存在的氧化量来测量。
本文中“氧化的”蛋白质或抗体为其一个或多个氨基酸残基已被氧化的蛋白质或抗体。
“对氧化敏感的”蛋白质或抗体为包含一个或多个已被发现易于氧化的氨基酸残基的蛋白质或抗体。
在本发明中可用于测量蛋白质氧化的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、层析例如大小排阻层析、离子交换层析和反向高效液相色谱、肽作图、寡糖作图、质谱、紫外光吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析型超速离心、动态光散射、蛋白质水解、和交联、浑浊度测量、过滤阻滞实验、免疫学实验、荧光染料结合实验、蛋白质染色实验、显微镜和其他结合实验。
“多肽”或“蛋白质”指链长度足够产生高级的三级和/或四级结构的氨基酸序列。因此，蛋白质与“肽”有区别，后者也是基于氨基酸的分子但不具有这些结构。
所配制的蛋白质为优选地基本上纯的和理想地基本上均质的（即不含污染蛋白质）。“基本上纯的”蛋白质指组合物包含至少约90%以重量计的蛋白质（基于组合物的总重量），优选地至少约95%以重量计的蛋白质。“基本上均质的”蛋白质指组合物包含至少约99%以重量计的蛋白质（基于组合物的总重量）。
在某些实施方案中，蛋白质为抗体。本文中的抗体指向目的“抗原”。优选地，抗原为生物学上重要的蛋白质，而对患有疾病或紊乱的哺乳动物施用抗体可导致在该哺乳动物中的治疗益处。然而，也考虑针对非蛋白质抗原（例如肿瘤相关糖脂抗原；见美国专利5,091,178）的抗体。当抗原为蛋白质时，其可为跨膜分子（例如受体）或配体例如生长因子。示例性抗原包括上述的那些蛋白质。本发明包含的抗体的优选分子靶标包括CD多肽例如CD3,CD4,CD8,CD19,CD20,CD34和CD40；HER受体家族成员例如EGF受体(HER1),HER2,HER3或HER4受体；细胞粘附分子例如LFA-1,Mac1,p150,95,VLA-4,ICAM-1,VCAM和av/b3整合素，包括其α或β亚基（例如，抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体）；巨噬细胞受体例如CRIg，肿瘤坏死因子例如TRAIL/Apo-2，生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖（OB）受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C等等。其他示例性蛋白质包括生长激素（GH），包括人生长激素（hGH）和牛生长激素（bGH）；生长激素释放因子；副甲状腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵胞激素；降血钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子，组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子例如蛋白质C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或组织型纤溶酶原激活物（t-PA）；bombazine；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES（激活调节的、正常T细胞表达和分泌的因子）；人巨噬细胞炎症蛋白质(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白（HSA）；副中肾管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；DNA酶；抑制素；活化素；激素或生长因子受体；整合素；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源的神经营养因子（BDNF），神经营养因子-3,-4,-5或-6(NT-3,NT-4,NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板源的生长因子（PDGF）；成纤维细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子（EGF）；转化生长因子（TGF）例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II（IGF-I和IGF-II）；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；红细胞生成素(EPO)；促血小板生成素（TPO）；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α,-β和-γ；集落刺激因子(CSF),例如M-CSF,GM-CSF和G-CSF；白介素(ILs),例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子（DAF）；病毒抗原例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫黏附素；抗体；和上面所列多肽中任一种的生物活性片段或变体。依照本发明可使用许多其他抗体和/或其他蛋白质，上面的列表无意为限制性的。
可溶性抗原或其片段，任选地与其他分子缀合，可用作免疫原用于产生抗体。对跨膜分子例如受体，可使用其片段（例如受体的细胞外结构域）作为免疫原。可选地可使用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这些细胞可来源于天然来源（例如，癌细胞系）或可为已通过重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。
在本文中进行配制的抗体的实例包括但不限于：HER2抗体，包括trastuzumab
Figure BDA0000426222280000151
(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289(1992),美国专利号5,725,856)和pertuzumab(OMNITARGTM)(WO01/00245)；CD20抗体（见下）；IL-8抗体(St John等人,Chest,103:932(1993),和国际公布号WO95/23865)；VEGF或VEGF受体抗体，包括人源化和/或亲和力成熟的VEGF抗体例如人源化VEGF抗体huA4.6.1bevacizumab
Figure BDA0000426222280000152
和ranibizumab
Figure BDA0000426222280000153
(Kim等人,Growth Factors,7:53-64(1992),国际公布号WO96/30046和WO98/45331,在1998年10月5日公开);PSCA抗体(WO01/40309);CD11a抗体，包括efalizumab(美国专利号6,037,454,美国专利号5,622,700,WO98/23761,Stoppa等人,Transplant Intl.4:3-7(1991),和Hourmant等人,Transplantation58:377-380(1994));结合IgE的抗体，包括omalizumab
Figure BDA0000426222280000155
(Presta等人,J.Immunol.151:2623-2632(1993),和国际公布号WO95/19181;美国专利号5,714,338,在1998年2月3日授予，或美国专利号5,091,313,在1992年2月25日授予,1993年3月4日公布的WO93/04173,或在1998年6月30日提交的国际申请号PCT/US98/13410,美国专利号5,714,338);CD18抗体(美国专利号5,622,700,在1997年4月22日授予,或1997年7月31日公布的WO97/26912);Apo-2受体抗体(1998年11月19日公布的WO98/51793);组织因子(TF)抗体(1994年11月9日授予的欧洲专利号0420937B1);α4-α7整合素抗体(1998年2月19日公布的WO98/06248);EGFR抗体(例如嵌合的或人源化的225抗体,cetuximab,在1996年12月19日公布的WO96/40210中的);CD3抗体例如OKT3(1985年5月7日颁布的美国专利号4,515,893);CD25或Tac抗体例如CHI-621
Figure BDA0000426222280000162
和
Figure BDA0000426222280000163
(见1997年12月2日颁布的美国专利号5,693,762);CD4抗体例如cM-7412抗体(Choy等人,Arthritis Rheum39(1):52-56(1996));CD52抗体例如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann等人,Nature332:323-337(1988));Fc受体抗体例如针对Fc的M22抗体(如在Graziano等人,J.Immunol.155(10):4996-5002(1995)中的RI);癌胚抗原(CEA)抗体例如hMN-14(Sharkey等人,Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s(1995));针对乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3,hu-Mc3和CHL6(Ceriani等人,Cancer Res.55(23):5852s-5856s(1995);和Richman等人,Cancer Res.55(23Supp):5916s-5920s(1995));结合结肠癌细胞的抗体例如C242(Litton等人,Eur J.Immunol.26(1):1-9(1996));CD38抗体,例如AT13/5(Ellis等人,J.Immunol.155(2):925-937(1995));CD33抗体例如Hu M195(Jurcic等人,Cancer Res55(23Suppl):5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771;EpCAM抗体例如17-1A
Figure BDA0000426222280000164
GpIIb/IIIa抗体例如abciximab或c7E3Fab
Figure BDA0000426222280000165
RSV抗体例如MEDI-493
Figure BDA0000426222280000166
CMV抗体例如
Figure BDA0000426222280000167
HIV抗体例如PRO542;肝炎抗体例如Hep B抗体CA125抗体，包括抗-MUC16(WO2007/001851;Yin,BWT和Lloyd,KO,J.Biol.Chem.276:27371-27375(2001))和OvaRex;独特型GD3表位抗体BEC2;αvβ3抗体(例如
Figure BDA0000426222280000169
Medimmune);人肾细胞癌抗体例如ch-G250;ING-1;抗-人17-1An抗体(3622W94);抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗-人黑色素瘤抗体R24;抗-人鳞状细胞癌(SF-25);人白细胞抗原(HLA)抗体例如Smart ID10和抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-1);CD37抗体例如TRU016(Trubion);IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗-B细胞抗体(Impheron);B细胞靶向MAb(Immunogen/Aventis);1D09C3(Morphosys/GPC);LymphoRad131(HGS);Lym-1抗体,例如Lym-1Y-90(USC)或抗-Lym-1Oncolym(USC/Peregrine);LIF226(Enhanced Lifesci.);BAFF抗体(例如WO03/33658);BAFF受体抗体(见例如WO02/24909);BR3抗体;Blys抗体例如belimumab;LYMPHOSTAT-BTM;ISF154(UCSD/Roche/Tragen);gomilixima(Idec152;Biogen Idec);IL-6受体抗体例如atlizumab(ACTEMRATM;Chugai/Roche);IL-15抗体例如HuMax-Il-15(Genmab/Amgen);趋化因子受体抗体,例如CCR2抗体(例如MLN1202;Millieneum);抗-补体抗体,例如C5抗体(例如eculizumab,5G1.1;Alexion);人免疫球蛋白的口服制剂(例如IgPO;Protein Therapeutics);IL-12抗体例如ABT-874(CAT/Abbott);Teneliximab(BMS-224818;BMS);CD40抗体，包括S2C6和其人源化变体(WO00/75348)和TNX100(Chiron/Tanox);TNF-α抗体，包括cA2或infliximab
Figure BDA0000426222280000171
CDP571,MAK-195,adalimumab(HUMIRATM),聚乙二醇化TNF-α抗体片段例如CDP-870(Celltech),D2E7(Knoll),抗-TNF-α多克隆抗体(例如PassTNF;Verigen);CD22抗体例如LL2或epratuzumab(
Figure BDA0000426222280000172
Immunomedics)，包括epratuzumab Y-90和epratzumab I-131,Abiogen的CD22抗体(Abiogen,Italy),CMC544(Wyeth/Celltech),combotox(UT Soutwestern),BL22(NIH),和LympoScan Tc99(Immunomedics),以及抗-淀粉样蛋白β肽(Abeta),抗-CD4(MTRX1011A),抗-EGFL7(EGF-样结构域7),抗-IL13,Apomab(抗-DR5-靶向的促凋亡受体激动剂(PARA),抗-BR3(CD268,BLyS受体3,BAFF-R,BAFF受体),抗-β7整合素亚基,dacetuzumab(抗-CD40),GA101(抗-CD20单克隆抗体),MetMAb(抗-MET受体酪氨酸激酶),抗-神经毡蛋白-1(NRP1),ocrelizumab(抗-CD20抗体),抗-OX40配体,抗-氧化LDL(oxLDL),pertuzumab(HER二聚化抑制剂(HDIs),和rhuMAb IFNα。
抗-CD20抗体的示例包括：“C2B8,"现称为“rituximab”
Figure BDA0000426222280000173
(美国专利号5,736,137);钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，名为“Y2B8"或“Ibritumomab Tiuxetan”
Figure BDA0000426222280000174
可购自IDECPharmaceuticals,Inc.(美国专利号5,736,137;2B8，于1993年6月22日保藏于ATCC，保藏号为HB11388);鼠IgG2a“B1,"又称“Tositumomab,”任选地用131I标记以生成“131I-B1"或“碘I131tositumomab”抗体(BEXXARTM)，可购自Corixa(又见美国专利号5,595,721);鼠单克隆抗体“1F5"(Press等人,Blood69(2):584-591(1987))和其变体，包括“构架补缀（patched）”或人源化1F5(WO2003/002607,Leung,S.;ATCC保藏号HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利号5,677,180);人源化2H7(WO2004/056312,Lowman等人,);2F2(HuMax-CD20),靶向B细胞的细胞膜中的CD20分子的高亲和性完全人抗体(Genmab,Denmark;见例如Glennie和van de Winkel,Drug Discovery Today8:503-510(2003)和Cragg等人,Blood101:1045-1052(2003);WO2004/035607;US2004/0167319);WO2004/035607和US2004/0167319中陈述的人单克隆抗体(Teeling等人,);US2004/0093621中描述的具有复杂的N-糖苷连接的糖链的结合Fc区的抗体(Shitara等人,);结合CD20的单克隆抗体和抗原结合片段(WO2005/000901,Tedder等人,)例如HB20-3,HB20-4,HB20-25和MB20-11;CD20结合分子例如AME系列抗体,例如WO2004/103404和US2005/0025764中陈述的AME33抗体(Watkins等人,Eli Lilly/Applied Molecular Evolution,AME);CD20结合分子例如在US2005/0025764中描述的那些(Watkins等人,);A20抗体或其变体例如嵌合或人源化A20抗体(cA20,hA20，分别地)或IMMU-106(US2003/0219433,Immunomedics);CD20-结合抗体,包括表位耗竭的Leu-16,1H4或2B8,任选地与IL-2缀合,如在US2005/0069545A1和WO2005/16969中的那些(Carr等人,);结合CD22和CD20的双特异性抗体,例如hLL2xhA20(WO2005/14618,Chang等人,);单克隆抗体L27,G28-2,93-1B3,B-C1或NU-B2，可购自International Leukocyte Typing Workshop(Valentine等人,In:Leukocyte Typing III(McMichael,编,p.440,Oxford University Press(1987));1H4(Haisma等人,Blood92:184(1998));抗-CD20auristatin E缀合物(Seattle Genetics);抗-CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope);抗-CD20MAb治疗剂(EpiCyte);抗-CD20抗体TRU015(Trubion)。
本文中使用的术语“抗体”包括单克隆抗体（包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体），具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体（例如双特异性抗体、双抗体(diabody)和单链分子，以及抗体片段（例如Fab,F(ab')2和Fv）。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换使用。
本文中使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上均质的抗体中得到的抗体，即组成群体的每个抗体是相同的，除了可能以极少量存在的可能的天然突变和/或翻译后修饰（例如异构化、酰胺化）以外。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与一般包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的传统（多克隆）抗体制品相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性以外，单克隆抗体具有下述优势，即它们由杂交瘤培养物合成，不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指抗体从基本上均质的抗体群体中得到的特征，不应被理解为需要通过任意特定方法产生该抗体。例如，依照本发明可使用的单克隆抗体可通过Kohler等人,Nature,256:495(1975)最先描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法（见例如美国专利号4,816,567）制备。“单克隆抗体”也可从噬菌体抗体文库中分离，使用例如在Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术。
本文中的单克隆抗体特别包含“嵌合”抗体（免疫球蛋白），其中重和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其他部分与来源于另一种物种或属于另一种抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源；以及这些抗体的片段，只要它们展示期望的生物活性（美国专利号4,816,567;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)）。本文中的目的嵌合抗体包括“灵长类源化的（primitized）”抗体，其包含来源于非人灵长类（例如旧世纪猴，猿等等）的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
术语“治疗抗体”指在疾病的治疗中使用的抗体。治疗抗体可具有多种作用机制。治疗抗体可结合并中和与抗原相关的靶的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需的蛋白质的活性的单克隆抗体导致该细胞的死亡。另一种治疗单克隆抗体可结合并激活与抗原相关的靶的正常功能。例如，单克隆抗体可结合细胞上的蛋白质并触发凋亡信号。还有另一种单克隆抗体可结合只在患病组织上表达的靶抗原；毒性有效载荷（有效试剂）例如化学治疗剂或放疗剂与单克隆抗体的缀合可产生可以将该毒性有效载荷特异性递送至患病组织的试剂，从而降低对健康组织的伤害。治疗抗体的“生物学功能片段”将展示若非一些或全部则至少一种的归因于完整抗体的生物功能，所述功能包括至少特异性结合靶抗原。
“完整的”抗体为包含抗原结合位点以及CL和至少重链结构域CH1,CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域（例如人天然序列恒定结构域）或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的示例包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体（见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]）；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“生物学功能片段”包含完整抗体的仅一部分，其中所述部分保留与该部分存在于完整抗体中时通常相关的功能中的至少一种，至多达大部分或全部功能。在一个实施方案中，抗体的生物学功能片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体的生物学功能片段，例如包含Fc区的抗体生物学功能片段，保留与Fc区存在于完整抗体中时通常相关的生物学功能中的至少一种，例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体的生物学功能片段为具有与完整抗体类似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体生物学功能片段可包含与Fc序列连接的抗原结合臂，所述Fc序列能够赋予片段体内稳定性。
非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式为大部分是人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（例如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或抗体的其他抗原结合序列），其包含极少的来源于非人免疫球蛋白的序列。就绝大部分而言，人源化抗体为人免疫球蛋白（接受体抗体），其中接受体的高变区（又称CDR）残基被具有期望特异性、亲和性和能力的非人物种例如小鼠、大鼠或兔（供体抗体）的高变区残基替换。有时候，人免疫球蛋白的Fv构架区（FR）残基被对应的非人残基替换。此外，本文中使用的“人源化抗体”也可包含既不在接受体抗体又不在供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步精炼和优化抗体的性能。人源化抗体任选地也可包含免疫球蛋白（一般为人免疫球蛋白）恒定区（Fc）的至少一部分。更详细的资料见Jones等人,Nature,321:522-525(1986);Reichmann等人,Nature,332:323-329(1988);and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
当用于描述本文公开的各种多肽和抗体时，“分离的”指多肽或抗体已从其生产环境的成分中被鉴定、分离和/或回收。优选地，分离的多肽与其生产环境的所有其他成分没有联系。其生产环境的污染成分（例如重组转染细胞所导致的污染成分）为一般干预多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至（1）足以通过使用自旋杯式测序仪得到N-端或内部至少15个残基的氨基酸序列的程度，或（2）通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染得到的均质性。然而一般，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽或抗体。
“治疗”指治疗性处理和预防或防止措施二者。需要治疗的对象包括已经患有疾病的对象以及有待预防疾病的对象。
对治疗来说的“哺乳动物”指被划分为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，和动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等等。优选地，哺乳动物为人。
“病症”为可从使用蛋白质的治疗中获益的任意病况。这包括慢性和急性疾病或病症，包括使哺乳动物易于患所述疾病的那些病理学状况。本文中有待治疗的病症的非限制性示例包括癌和炎症。
“治疗有效量”为至少引起特定疾病的可测量的改善或防止所需的最小浓度。已知蛋白质的治疗有效量是本领域熟知的，而下文中显示的蛋白质的治疗有效量可通过熟练技术人员（例如普通医师）技术范围内熟知的标准技术测定。
II.实施本发明的模式
最近在单克隆抗体候选物中的氧化事件促使我们研究在Met,Trp和His残基上的氧化机制并寻找合适的稳定剂。通过使用模式蛋白质甲状旁腺激素（PTH，1-34），通过rp-HPLC、肽作图和LC/MS/MS分析的辅助，我们已经能够鉴定和定量在这些脆弱的残基上由不同氧化剂导致的氧化。
A.氧化损伤的表征
在许多药物蛋白质中都可以容易检测到氧化的蛋氨酸(Met[O])，这一事实可能归因于其对氧化剂（不仅仅是单独的H2O2）的敏感性。多个实验室已使用光、tBHP和/或过硫酸盐生成Met[O]。在药物蛋白质中的Trp或His的氧化在正常储存条件下可非常缓慢。为了加速氧化，通常使用一种或多种胁迫模型。
很多蛋白质制剂含有聚山梨醇酯（20和80）。已经报道，在陈化的聚山梨醇酯中存在氧化剂，其主要由H2O2组成（高达75%）。(Jaeger等人,Biochem Biophys Methods29:77-81,(1994))。Ha等人(J Pharm Sci91:2252–2264(2002))报导了由陈化的聚山梨醇酯导致的白介素-2突变体的增加氧化。由于聚山梨醇酯是蛋白质药物产品中的氧化剂来源，故可以考虑使用H2O2来模拟在含表面活性剂的制剂中的氧化反应。此外，H2O2一直被用作填充无菌产品的隔离器(isolator)的消毒剂。在药物产品中可发现残留的H2O2。因此，测定蛋白质对H2O2引起的氧化作用的敏感性十分重要。
Trp和His的氧化被认为是金属催化的或自由基介导的氧化(Davies等人1987,Hawkins and Davies2001)。理论上，金属催化的氧化可用作有用的模型。然而在实验设计中，金属（例如铁或铜）的选择和决定是否加入螯合剂（例如EDTA）对实验结果的后果具有巨大影响。以下实例说明了从涉及金属的氧化中得到的结果的复杂性。在氧化系统中加入金属，例如抗坏血酸盐/Cu(II)/O2后，松弛素中的2个Met和1个His残基被氧化，但2个色氨酸残基没有一个被氧化。在牛血清白蛋白中，从Fe(II)/EDTA/抗坏血酸盐系统中产生的自由基偏好色氨酸，而Cu(II)/抗坏血酸盐（不含EDTA）偏好组氨酸(Uchida K,Agric Biol Chem53:3285-92,1989)。H2O2/Fe(II)/EDTA和H2O2/Cu(II)产生不同模式的白蛋白降解(Kocha等人,Biochim Biophys Acta1337:319-26(1997))。通过金属催化的氧化，在α-晶体蛋白中的色氨酸和蛋氨酸被H2O2/Fe(II)/EDTA氧化(Finley等人,Protein Sci.7:2391-7,(1998))。
在药物生产中，重组蛋白质必然会暴露于不锈钢；因此，蛋白质溶液可包含痕量的铁或其他金属。因此，我们选择H2O2加Fe(II)——公知的芬顿反应——作为胁迫条件以评估我们的药物候选物的氧化潜能。
如在前面的章节所讨论的，金属的存在增加了氧化研究的复杂性。AAPH(2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐)是不依赖金属离子的活性氧类别（ROS）生成系统(Niki等人Methods Enzymology.186:100-8,1990)。以确定的速率，其在有氧水溶液中分解产生烷基自由基和烷基过氧化物。烷基过氧化物的化学结构和生成显示于图2。用AAPH处理导致肝蛋白质中的Met、Tyr和Trp残基的氧化(Chao等人,Proc Natl Acad Sci94:2969-74,(1997))。在同一研究中，也检测到了来自氧化的另一种氨基酸衍生物，二酪氨酸。当谷氨酰胺合成酶暴露于AAPH4小时后，2个Trp残基，16个His中的2个，17个Tyr中的6个和16个Met中的5个均丢失(Ma等人,Arch Biochem Biophys363:129-134,(1999))。这2个报导表明除了Met之外，AAPH还导致广泛的氨基酸的氧化。更为最近，在小分子药物中评估了AIBN(2,2’-偶氮二异丁腈)和ACVA(4,4'-偶氮双-4-氰基戊酸)（均为与AAPH类似的偶氮化合物）在氧化胁迫的降解研究中的用途(Nelson ED,J Pharm Sci95:1527-39,(2006))。因为偶氮化合物可产生可重现量的自由基而不依赖于金属，故AAPH由于其尤其是产生Trp-氧化蛋白质的能力而是一种模式氧化剂。
对于非位点特异性氧化，因为下列原因将甲状旁腺激素（1-34）（PTH）选为模式蛋白质：其小的三级结构(Barden等人,J Biochem,32:7126-32(1993))和其序列含有所有3种期望的氨基酸(1个Trp,2个Met和3个His)，容易通过反相高效液相层析(rp-HPLC)测定、和其可得性。麻省理工学院的Trout组研究了仅由H2O2胁迫的PTH中的Met氧化，发现Met8和Met18的不同氧化速率与2-壳层水配位数(2-shell water coordinationnumber)相关(Chu等人,Biochem43:14139-48(2004)和J Pharm Sci93:3096-102(2004))。低于1.5倍的差异不足够显著到影响我们从我们的研究中所得到的结论。生长激素(The等人,J Biol Chem262:6472-7,(1987))和rhVEGF(Duenas等人,Pharm Res18:1455-60,(2001))中不同Met残基的氧化速率主要归因于暴露于溶剂的不同程度。我们预计在PTH、生长激素和rhVEGF中完全暴露于溶剂的Met的氧化速率是相当的。因此，PTH上的2个Met残基可模拟在所有蛋白质中的暴露于溶剂的Met。因为仅有一个Trp而容易通过LC/MS分析，故PTH成为用于我们研究的良好模式蛋白质。
尽管H2O2、tBHP加和不加Fe(II)主要氧化2个Met残基，但AAPH和H2O2+Fe(II)氧化Met和Trp残基，前者生成Trp[O]类别的能力比后者更强。AAPH是一种不依赖金属的自由基生产者，其产生烷基过氧化物，可以模拟自降解的Tween生成的活性氧类别。
另一方面，位点特异性金属催化的氧化与仅使用H2O2产生的反应具有很大差别。例如，在松弛素中，Met-B(25)与H2O2的反应比Met-B(4)与H2O2的反应更快。当松弛素与Asc/Cu(II)通过金属催化的反应方式反应时则顺序相反，靠近金属结合位点的Met-B(4)倾向于更快的被氧化(Li等人,Biochem34:5762-72(1995))。在我们的研究中，作为对位点特异性金属催化的氧化敏感的蛋白质，我们使用了适应于治疗新生血管（湿性）年龄相关性黄斑变性的人源化抗-VEGF抗体片段，因为我们已发现可通过加入EDTA抑制Trp50（H2）的氧化，此外，当相邻的His被突变时，Trp50(H2)变得稳定（手稿正在准备中）。我们还研究了抗-CD11a抗体的氧化（所述抗体被设计为可以选择性和可逆地阻断导致牛皮癣发生的T细胞的活化、再活化和运输），因为该抗体已在多种条件下被氧化，其中已观察到不同的Met[O]产物。然而，在这些胁迫条件下在抗-CD11a抗体中未发现Trp的氧化，这是与抗-VEGF抗体相比非常不同的行为。因此，在我们的研究中包括了抗-CD11a抗体。
B.筛选防止氧化降解的稳定剂
在此研究中的一个关键目的是筛选稳定剂。期望在这些胁迫研究中产生的信息可引导我们发现新的稳定剂用于药学有效制剂。通过使用H2O2,H2O2+Fe(II)和AAPH筛选稳定剂是明智的，因为它们代表了来自如下物质的潜在攻击：通常被用作消毒剂的蒸汽H2O2，自降解的Tween产生的H2O2和来自不锈钢表面的金属、以及也来自降解的Tween的烷基过氧化物。从我们的筛选研究中，我们确定了：1）游离蛋氨酸保护PTH免受H2O2和H2O2+Fe(II)的氧化，2）甘露醇和EDTA有效对抗H2O2+Fe(II)，3）游离色氨酸仅针对AAPH的氧化有效，而Trp和Met的组合有效对抗所有3种氧化条件。
抗-VEGF抗体的氧化代表位点特异性金属催化的氧化。AAPH可造成抗-VEGF抗体降解物，其在IEC色谱中在碱性区显示额外的峰，与有问题的合格批次(qualification lot)一样。当用AAPH氧化时，游离Trp有效减轻抗-VEGF抗体中的氧化。这些结果提示游离Trp有效对抗位点特异性金属催化的氧化。为了确保所有脆弱氨基酸残基例如蛋氨酸、色氨酸和可能的组氨酸都受到保护，蛋氨酸和色氨酸组合将是一个有效的措施。
除了色氨酸与蛋氨酸组合是良好的稳定剂以外，我们还证明trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，一种水溶性维生素衍生物）和吡哆醇（通常被称为维生素B6）也都显示出了对蛋白质中的色氨酸残基的出色保护作用（图15和16）。按下述方式，分别以2mg/mL浓度检测了这些稳定剂中的每一种：加入0.1mg/mL PTH蛋白质溶液，pH5.0中。之后通过加入1mM AAPH对蛋白质溶液进行胁迫，并在40℃孵育6小时。在没有trolox或吡哆醇的保护下，PTH展示了在其色氨酸残基上的大量氧化，而在trolox或吡哆醇存在时，色氨酸残基获得了良好的保护（图15和16）。这些结果确认了使用自由基清除剂保护蛋白质中的色氨酸残基的效用。
实施例1
蛋白质氧化的研究：蛋氨酸和色氨酸是对抗氧化降解机制的有效稳定剂
此实施例说明单独的色氨酸和色氨酸与蛋氨酸的组合在防止抗体和蛋白质氧化中的用途。
实验方法
材料：
AAPH（2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐）(批号D00024287)购自CalBiochem(Gibbstown,NJ)。甲状旁腺激素(1-34)(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF,批号U07046A1)购自AmericanPeptide Company(Sunnyvale,CA)。在此报告中，将其简称为PTH。
L-蛋氨酸和EDTA二钠(批号E05643)购自J.T.Baker(Phillipsburg,NJ)。醋酸钠、醋酸铵、H2O2,t-BHP,L-色氨酸（批号1152333）和六水合三氯化铁(批号53H0619)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。四水合氯化亚铁(批号NA1759)购自EMD(Gibbstown,NJ)。甘露糖(G10303,批号139476)和蔗糖(G20244,批号292426)来自Genentech,Inc。测序级（TPCK处理的）胰蛋白酶购自Promega(Madison,WI)。HPLC级乙腈（ACN）和水购自Fisher Scientific(Fairlawn,NJ)。在样品制备实验中使用的水来自Milli-Q Plus纯化系统(Millipore,Bedford,MA)。
样品制备
PTH(0.1mg/mL)分别与H2O2,H2O2/Fe(II),t-BHP,t-BHP/Fe(II)或AAPH以1:42（蛋白质：氧化剂）的摩尔比在pH5.0的20mM醋酸铵缓冲液中混合。Fe(II)的浓度为0.2mM。组合物的详细信息见表1。在这些样品中加入相应浓度的甘露糖(15%),蔗糖(6%),Met(2mg/mL),EDTA(0.04%),和Trp(2mg/mL)作为稳定剂，括号中显示检测样品中的终浓度。对于抗-VEGF抗体样品，检测了2和10mg/mL的Trp浓度。在40℃孵育6和24小时后，将等分试样的样品与甲醇和Met混合以猝灭反应，之后进行rp-HPLC分析、肽作图和液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)。用31mM的AAPH检测了92mg/mL的液体形式的复水(reconstituted)抗-CD11a抗体冻干制剂。在变性条件中，使用6M盐酸胍变性5mg/mL的抗-CD11a抗体，并加入1.7mM AAPH。
反相色谱（rp-HPLC）
实验使用C4（Vydac,214TP,5μ,2.1x250mm）在Waters HPLC仪器上进行。溶剂A为0.1%在水中的三氟乙酸（TFA），溶剂B为0.08%在乙腈中的TFA。使用从20%B至80%B的线性梯度以0.2mL/分钟的流速在45分钟中分析了样品。柱温度设置为30℃。紫外光检测设置在214nm。
胰蛋白酶消化
通过加入1M碳酸氢铵将样品的pH调整为>7.5。将5微升0.5mg/mL胰蛋白酶加入200μL样品，之后将其在37℃孵育3至4小时。用0.1%TFA猝灭该消化。
胰蛋白酶解肽片段图谱(tryptic peptide map)的LC/MS/MS表征：
PTH样品在用胰蛋白酶消化后使用Agilent1200Series HPLC系统分离，使用在线联用的LTQ线性离子阱质谱(Thermo Electron,San Jose,CA)测定肽的质量和序列。使用Jupiter Proteo1.0×150mm柱(颗粒大小4μm,孔径90
Figure BDA0000426222280000271
;Phenomenex,Torrance,CA)；将其温度控制在30℃，在214nm监视柱流出物。将流速控制在150μL/min，使用的流动相为0.1%在水中的TFA（A）和0.1%在乙腈中的TFA（B）。注射100μL体积的样品。优化的梯度（以分钟/%B表示）为0/2%,3/2%,10/8%,15/8%,60/40%,61/95%,65/95%,66/2%和76/2%。将HPLC中的流出物直接注入LTQ电喷射离子化源。通过使用4.5kV的针喷雾电压和44V的毛细管电压，以阳离子模式进行电喷射离子化。在LC/MS/MS实验中，9个扫描事件（包括在300至2000m/z范围中的全扫描）后，在4种最强离子上进行了4个循环的放大扫描和MS/MS扫描。
使用BioWorks Browser版本3.2软件(Thermo Electron)应用SEQUEST算法进行自动数据库检索，以及对每个匹配的产物离子谱进行人工检查，完成了MS/MS谱的解释和肽的确定(assignment)。创建了PTH的FASTA单蛋白质数据库并用作检索靶。对于氧化产物的确定，定义氧化相关的修饰为可变修饰（相对于PTH，+4,+16和+32Da用于Trp;+16Da用于Met;+16,-22和-23Da用于His）。选择具有满意的相关因子值（Xc≥1.5用于单电荷的,≥2.0用于双电荷的,和≥2.5用于三电荷的肽离子）的肽匹配作为潜在有意义的匹配用于氧化修饰的肽。之后，对匹配肽离子的放大扫描质谱和MS/MS谱进行人工检查以消除假阳性鉴定。检查放大扫描MS谱以确认匹配肽的电荷状态和单一同位素质量。为了评估各氧化位点的氧化水平，使用Xcalibur Qual Browser对相应肽的提取离子色谱进行人工积分。之后通过用氧化肽的峰面积除以氧化和非氧化肽的峰面积之和，计算氧化的相对百分比。
结果和讨论
非位点特异性氧化，PTH：
PTH不含有金属结合位点，是研究非位点特异性氧化的模式蛋白质。反应在暴露于溶剂的残基上发生。允许0.1mg/mL的PTH在40℃与氧化剂（均为1mM）反应6和24小时。氧化剂和PTH的摩尔比为41.2。共使用了5种氧化剂，即AAPH,添加或不添加Fe(II)的H2O2和tBHP。反应物总结于表1。样品通过rp-HPLC和胰蛋白酶消化肽片段作图和之后的LC/MS/MS表征，进行了分析。
表1
Figure BDA0000426222280000291
图3显示与H2O2反应的PTH的rp-HPLC色谱，其中检测到Met18-修饰的,Met8-修饰的,和双修饰的PTH类别。此趋势与Chu等人,Biochem43:14139-48(2004))得到的数据一致，其中报导了通过rp-HPLC检测到这3种Met-氧化类别，氧化的Met18多于Met8，之后是双氧化的类别。图4显示了与AAPH反应的PTH的rp-HPLC色谱，并揭示了与图3显示的模式完全不同的模式。在PTH和Met[O]峰之间的保留时间上出现了2组3峰。尽管没有完全表征单个峰，但后来通过胰蛋白酶消化和之后的LC/MS/MS确认这些新的峰为Trp[O]-修饰的PTH类别。对PTH消化物的胰蛋白酶消化肽作图发现，当用AAPH处理PTH时，除了Met氧化产物以外，还产生了3种分子量为M+4,M+32,M+16(其中M是PTH的VGWLR胰蛋白酶消化肽片段的质量)的胰蛋白酶消化肽类别。这些肽类别的MS/MS谱分析将它们确定为3种Trp氧化衍生物，即犬尿氨酸(M+4),N-甲酰犬尿氨酸(M+32)和5-羟色氨酸或氧代吲哚丙氨酸(M+16)。它们的化学结构显示于图5。用3种模式氧化剂（例如H2O2,H2O2+Fe(II)和AAPH）检测PTH的合理性已经在上面讨论。也检测了tBHP和tBHP+铁，因为tBHP目前是降解样品制备方案中选择的氧化剂。
表2总结了在这些降解样品中PTH的Met8和Trp23的总体氧化。总的来说，当用AAPH处理6小时和24小时时，分别PTH的43%和84%的Trp残基被AAPH氧化。因此，将在图2中显示的新峰鉴定为Trp[O]-修饰的PTH类别。在实验中没有观察到His的氧化。含有氧化Met18的胰蛋白酶消化肽段没有在反相柱上保留。表2总结了在这些降解样品中PTH的Met8和Trp23的总体氧化。
表2.通过肽作图定量PTH氧化（Trp23，Met8）
Figure BDA0000426222280000301
从这些结果中得到的关键发现如下：
a.3种条件，添加或不添加铁的tBHP、和H2O2，产生极少量的Trp氧化。
b.3个His残基没有一个受到影响。
c.仅AAPH和芬顿反应，H2O2+Fe(II)，产生了Trp氧化。
d.与其他类别(+4和+32)相比，产生了更多的+16Trp[O]。
e.为了达到相当程度的Trp氧化，AAPH处理6小时产生了43%Trp[O]和29%在Met8的Met[O]，而H2O2/Fe(II)处理24小时产生了35%Trp[O]但大得多的量的(91%)在Met8的Met[O]。此比较显示AAPH处理比芬顿反应更特异地针对Trp氧化。
过氧化物（H2O2,tBHP或其他ROOH类别）氧化硫醚（蛋氨酸）的机制是：硫化物在过氧化物-质子溶剂复合物上的一步亲核攻击，和之后的一系列协调电子位移，这导致氧转移至硫原子上，得到Met亚砜，Met[O](Li等人Biotechnol Bioeng.48:490-500,1995)。此反应机制意味着过氧化物的氧为亲电子的。因此供电子基团例如叔丁基可以通过降低氧的亲电子性而减缓反应。因此，在表2中tBHP产生较少量的氧化这一事实并不令人惊讶。应当指出，tBHP具有仅氧化暴露的蛋氨酸的优势，如Keck(AnalBiochem236:56(1996))在研究重组干扰素γ(rIFN-γ;Actimmune)和重组组织纤溶酶原激活物(rtPA;阿替普酶,
Figure BDA0000426222280000311
)时所最先报导的。因为PTH中存在极少的三级结构，我们预期t-BHP不对PTH中的任何Met造成选择性氧化。
尽管该亲核攻击机制预示了特定的酸催化作用成分，但是在pH2-8的范围中反应速率没有显著地改变，如在PTH中所示的(Chu等人,ProcNatl Acad Sci94:2969-74(2004))。因此，在醋酸缓冲液中使用pH5产生的数据可应用于在蛋白质制剂中存在的典型pH范围，pH5-7。
仅AAPH和芬顿反应产生了Trp的氧化。此结果支持单独的H2O2的亲核反应不能引起Trp氧化的观点。我们惊讶的观察到在我们的实验中根本没有His的氧化。当牛血清白蛋白与Fe(II)/EDTA/抗坏血酸或Cu(II)/抗坏血酸反应时，前者导致在Trp上的更多的氧化，而后者导致更多的His氧化(Uchida等人Agric Biol Chem.53:3285-92(1989))。在另一个实验室中，通过AscA/Cu(II)的松弛素氧化导致了大量的His氧化，通过AscA/Fe(III)的松弛素氧化导致了小量的His氧化，同时，既没有发现Trp也没有发现Tyr的氧化(Li等人,Biochem34:5762-72(1995))。这2个实验室的结果与当使用H2O2+Fe(II)时在PTH中完全没有His的氧化相矛盾。有可能His的氧化取决于铜的存在。
筛选稳定剂，PTH：
基于上面的分析，我们提出蛋白质可能通过表1中显示的任意或所有3种降解机制以及光诱导的氧化而对氧化攻击敏感。与H2O2(没有金属)的亲核反应可以是当蛋白质产物暴露于蒸气H2O2(在隔离器中用作消毒剂)或由Tween降解产生的H2O2时观察到的氧化反应(Jaeger等人,BiophyMethod29:77-81(1994))。当由于与不锈钢接触而在制剂溶液中引入痕量金属（铁、铜或铬）时，芬顿反应——H2O2加Fe(II)——运作。第三种机制是经由可来自Tween降解的烷基过氧化物(Jaeger等人,Biophy Method29:77-81(1994))。在本研究中，使用AAPH模拟由烷基过氧化物导致的活性氧类别（图2）。
蛋氨酸：如预期的，游离Met中和氧化剂H2O2的作用，不管存不存在铁。游离Met显著减轻PTH中的Met残基的氧化，因为没有出现对应于Met[O]-PTH的峰（图6）。游离Met对Trp的氧化没有影响，因为Trp[O]峰仍保留。
甘露醇，蔗糖：甘露醇是众所周知的羟基自由基清除剂。图7显示了甘露醇抵抗芬顿反应的完全保护作用，证据是当用H2O2/Fe(II)胁迫时没有任何Met[O]-和Trp[O]-衍生的PTH。然而，当用AAPH或用H2O2胁迫时，PTH一点也不受甘露醇的保护，因为甘露醇不与烷基过氧化物或H2O2反应。蔗糖产生了类似的结果，只是在保护PTH对抗羟基自由基时其没有甘露醇有效。多元醇被认为是对抗物理和化学降解二者的通用稳定剂。如在Li等人(Biotech Bioeng48:490-500(1995))的综述中提到的，使用某些糖可使血红蛋白冻干而不被氧化。从我们的使用AAPH的模型中得到的结果提示，当面对烷基过氧化物时，多元醇的使用可能不能使蛋白质得到保护。
EDTA：如在图8中所示，当用H2O2/Fe(II)胁迫时，EDTA完全保护了PTH。在此示例中，EDTA不仅减轻了自由基的产生，还减轻了H2O2的氧化作用。当用单独的H2O2胁迫时，EDTA不能保护PTH。EDTA似乎加剧AAPH的氧化，因为存在许多Met[O]-和Trp[O]-PTH峰。有关EDTA或其他金属螯合剂（例如EGTA）的作用的报导是混杂的。金属螯合剂可能增强或抑制金属催化的反应。可以概括地说，EDTA抑制铜催化的反应，因为其有效地螯合铜。因为其不能够覆盖铁的所有5个原子价，EDTA-铁复合物有时非常活跃。不知道为什么当把EDTA加入PTH和AAPH反应混合物时观察到更多的氧化，但这一研究超出了本研究的范畴。
如文献中经常描述的，体内的Met,Trp或His残基的氧化一直被归因于金属催化的氧化（MCO）。在本实验中，不加金属通过AAPH氧化PTH，产生了大量的Met和Trp，提示Met或Trp的氧化都不是仅仅依赖于金属催化的。
游离色氨酸：在文献中，已述及了许多物质作为自由基的清除剂。例如硫脲、甲醇和尿酸，然而，它们不适用于蛋白质制剂。此外，丁羟苯甲醚（BHA）和丁羟甲苯（BHT）为自由基链式反应终止剂，其非常有效的猝灭来自脂质的游离基。因为其低水溶性，它们不适合蛋白质的水性制剂。使用合适量的表面活性剂，可将BHA和BHT引入水性制剂以给予一定的抗氧化保护。
文献中没有提到过在胃肠外制剂中使用游离Trp作为抗氧化剂。类似游离Met的用途，其可保护PTH对抗氧化。图9显示了当用AAPH或芬顿反应胁迫PTH时，游离Trp对PTH中的Trp残基给予了良好的抗氧化保护作用。在AAPH胁迫的情况下，Met[O]-PTH峰很显著，而在芬顿反应的情况下少得多。游离Trp单独不提供对抗H2O2引起的氧化胁迫的保护作用。
色氨酸和蛋氨酸的组合：此组合在所有3种氧化条件下提供了对PTH的几乎完全的保护（图10）。可以推测，游离Trp和Met将分别对抗烷基过氧化物和H2O2的影响。当组合使用Trp和Met时，蛋白质制剂应当能够耐受来自图1所示的所有3种机制以及光诱导的氧化的攻击。
上述分析来源于对相应rp-HPLC色谱上的峰的定性研究。将AAPH和芬顿反应氧化的样品通过胰蛋白酶消化肽作图和LC/MS/MS表征进行了进一步定量和残基特异性分析。根据积分对应EIC（提取离子色谱）质量信号得到的相对定量结果，单独的游离Met显著抑制Met氧化，单独的游离Trp显著抑制Trp氧化（图11）。Trp和Met的组合提供了对抗AAPH（图11）或芬顿反应（图12）氧化的最有效保护。
位点特异性金属催化的氧化：
当合格批次在30℃储存1个月后显示了较高程度的主峰丢失时，第一次注意到抗-VEGF抗体的Trp50氧化。后来证实Trp50的自催化氧化是由不良操作的Tween20导致的，其导致IEC分析中的主峰丢失和碱性峰的增加。进一步的研究显示H2O2不导致抗-VEGF抗体的氧化，因此不导致IEC色谱模式的变化。加入EDTA作为稳定剂和突变邻近的His导致抗-VEGF抗体在Trp氧化方面的提高的稳定性。基于这些数据，抗-VEGF抗体的氧化可能是位点特异性金属催化的反应。
在抗-VEGF抗体溶液中加入AAPH也在IEC色谱的碱性区产生了额外的峰，这些峰代表自由基引起的抗-VEGF抗体降解物，如在有问题的合格批次中所展示的那样（图13）。尽管降解蛋白质的这些峰与来自合格批次的降解峰的位置差不多，但谱不一样。需要进一步的分析以确认这些峰是否与Trp的氧化有关。
在制剂中加入游离色氨酸给予了对抗AAPH的出色保护，证据是在IEC色谱中缺乏碱性峰（图14）。因为在抗-VEGF抗体中的Met残基不能被H2O2氧化，可以合理地预期不需要游离Met用于抗-VEGF抗体。
抗-CD11a抗体，其中预期没有Trp氧化：
抗-CD11a抗体中的Met残基的氧化已被广泛的研究。抗-CD11a抗体具有4个反应性蛋氨酸——Met256,Met432,Met362和Met50（重链）。表3显示H2O2,tBHP和热胁迫导致Met256的氧化和较低程度的Met50的氧化。在金属的存在下（可能来自不锈钢罐的溶解的金属），Met50的氧化增加到与Met256的氧化相当的水平。氧化通过Lys-C肽作图测量。反应性顺序的差异取决于施加的氧化胁迫的类型。
表3
Figure BDA0000426222280000351
当在抗-CD11a抗体中加入AAPH时，Met50的水平提高，提示与AAPH的反应和在不锈钢罐中的反应相当，都导致提高的Met50氧化（表4）。可以想到，当涉及金属或自由基时Met50是氧化的位点。非常重要的一点是，在这些条件下没有Trp、His或Tyr残基被氧化。然而，当使用变性剂时，Trp可在多个位置被氧化。
表4
Figure BDA0000426222280000352
当提高氧化剂和蛋白质的比例和当加入胍扰乱蛋白质的三级结构时，AAPH对Trp残基的氧化是大量的。此外，在这些条件下，没有观察到Met50的优先氧化（数据未显示）。这些结果进一步支持AAPH作为模式氧化剂的使用。当使用合适的氧化剂/蛋白质比例时，AAPH可靠地引起Trp的氧化。当正常操作条件不产生Trp氧化时，AAPH不引起Trp的氧化，如在抗-CD11a抗体的情况中那样。
结论
在此报导中我们证明AAPH是良好的模式氧化剂，其可氧化蛋白质中的Trp残基。使用H2O2,H2O2+铁和AAPH（图1）共同筛选防御Met和Trp残基氧化的稳定剂是明智的。此系统允许对可能在蛋白质药物的制造和储存中发生的所有可能的氧化途径进行改进的模拟。单独地证明了抗-VEGF抗体的降解为金属催化的氧化。
我们还首次证明当在含有蛋白质的制剂中加入游离Trp时，其有效阻止了色氨酸残基的氧化。在使用AAPH模拟的氧化胁迫下，色氨酸有效阻止了在抗-VEGF抗体中的氧化反应。此结果提示游离Trp有效对抗位点特异性金属催化的氧化。为确保所有脆弱氨基酸残基例如Met、Trp和可能地His受到保护，应当考虑Met和Trp的组合。

Claims (32)

1.一种药物制剂，其包含蛋白质，游离蛋氨酸和一种或多种能够防止所述蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的化合物。
2.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质选自肽、蛋白质、抗体和其类似物。
3.权利要求2的制剂，其中所述抗体为单克隆抗体。
4.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质为抗-VEGF单克隆抗体。
5.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质具有抗-血管发生性质。
6.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质为抗-CD20单克隆抗体。
7.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质为抗-CD11a单克隆抗体。
8.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质是氧化敏感的。
9.权利要求1的制剂，其中所述蛋白质是聚集敏感的。
10.权利要求1的制剂，其中在所述蛋白质中的芳香族氨基酸残基选自色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
11.权利要求1的制剂，其为水性的。
12.权利要求1的制剂，其中所述能够防止氧化的化合物适于胃肠外注射。
13.权利要求1的制剂，其中所述化合物不贡献药理学作用。
14.权利要求1的制剂，其中所述化合物包含游离芳香族氨基酸或其类似物。
15.权利要求11的制剂，其中所述芳香族氨基酸选自色氨酸、组氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
16.权利要求1的制剂，其中所述化合物为色氨酸。
17.权利要求13的制剂，其中所述色氨酸以约0.1-10mg/ml范围的量在制剂中存在。
18.权利要求1的制剂，其中游离色氨酸与一种或多种额外的芳香族氨基酸组合。
19.权利要求1的制剂，其中所述化合物包含游离核苷酸或其类似物。
20.权利要求17的制剂，其中游离核苷酸以约0.1至10mg/mL范围的量在制剂中存在。
21.权利要求1的制剂，其中一种或多种游离核苷酸与一种或多种游离芳香族氨基酸组合。
22.权利要求1的制剂，其中所述化合物包含一种或多种维生素或维生素衍生物。
23.权利要求19的制剂，其中所述维生素或维生素衍生物为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。
24.权利要求19的制剂，其中所述维生素或维生素衍生物为吡哆醇。
25.权利要求19的制剂，其中所述抗氧化剂维生素或维生素衍生物以约0.1-10mg/ml范围的量在制剂中存在。
26.权利要求1的制剂，其进一步包含表面活性剂。
27.权利要求1的制剂，其进一步包含甘露醇。
28.一种预防或治疗在哺乳动物中的病症或疾病的方法，其包括对所述哺乳动物以有效预防或治疗所述病症或疾病的量施用权利要求1的制剂。
29.一种制造药物制剂的方法，其包括制备权利要求1的制剂和评估制剂中的蛋白质的物理稳定性、化学稳定剂或生物学活性。
30.一种稳定蛋白质的药物组合物的方法，其包括在所述组合物中以足够抑制所述蛋白质中的芳香族氨基酸残基氧化的量加入蛋氨酸和一种或多种化合物。
31.一种制造药物制剂的方法，其包括在蛋白质组合物中加入一定量的表面活性剂和一定量的足够使由所述表面活性剂的降解产生的氧化类别失效的化合物。
32.一种防止敏感蛋白质中芳香族氨基酸残基氧化的方法，其包括加入蛋氨酸和一种或多种选自芳香族氨基酸、核苷酸和维生素或它们的衍生物的化合物。
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